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Biochemistry

कैसे प्रोटीन को स्थिर करने के लिए: थर्मल शिफ्ट परख और वायरस एक्स परियोजना में नैनो अंतर स्कैनिंग Fluorimetry के लिए स्थिरता स्क्रीन

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/58666
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Chemistry, Durham University

Summary

एक प्रोटोकॉल तेजी से थर्मल शिफ्ट परख और नैनो अंतर स्कैनिंग fluorimetry के माध्यम से शर्तों की एक किस्म में प्रोटीन के थर्मल स्थिरता परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया है । बफर सिस्टम, लवण और additives, एक साथ तीन अद्वितीय स्थिरता स्क्रीन शामिल, प्रोटीन के साथ परख के लिए कार्यात्मक और संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयुक्त बफ़र्स की पहचान कर रहे हैं ।

Abstract

Horizon2020 वायरस एक्स परियोजना २०१५ में चयनित चरम biotopes और डिस्कवर उपंयास वायरल प्रोटीन की virosphere का पता लगाने के लिए स्थापित किया गया था । इन प्रोटीन के संभावित तकनीकी मूल्य का मूल्यांकन करने के लिए, प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों का विश्लेषण इस कार्यक्रम में एक केंद्रीय चुनौती है । प्रोटीन के नमूने की स्थिरता के लिए सार्थक परख परिणाम प्रदान करने और लक्ष्यों की सघन वृद्धि आवश्यक है । थर्मल शिफ्ट परख (TSA), एक प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक, उच्च प्रवाह में प्रोटीन स्थिरता के लिए शर्तों के अनुकूलन के लिए एक लोकप्रिय विधि के रूप में स्थापित किया गया है । TSAs में कार्यरत fluorophores बाह्य हैं, पर्यावरण के प्रति संवेदनशील रंजक हैं. एक वैकल्पिक, इसी तरह की तकनीक नैनो अंतर स्कैनिंग fluorimetry (nanoDSF) है, जो प्रोटीन देशी प्रतिदीप्ति पर निर्भर करता है । हम यहां एक उपंयास osmolyte स्क्रीन, जैविक additives के एक ९६ की स्थिति स्क्रीन प्रारंभिक TSA प्रयोगों के माध्यम से क्रिस्टलीकरण परीक्षण के लिए मार्गदर्शन डिजाइन प्रस्तुत करते हैं । पहले से विकसित पीएच और नमक स्क्रीन के साथ, तीन स्क्रीन के सेट बफर सिस्टम और additives की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रोटीन स्थिरता का एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करता है । स्क्रीन की उपयोगिता TSA और lysozyme और प्रोटीन एक्स, वायरस एक्स परियोजना के एक लक्ष्य प्रोटीन के nanoDSF विश्लेषण में प्रदर्शन किया है ।

Introduction

कई प्रौद्योगिकी उपयोगी एंजाइमों वायरल स्रोतों से शुरू, जैसे कि तंबाकू खोदना वायरस (टेव)1 और मानव राइनोवायरस प्रकार 3 सी (HRV 3 सी) को छेड़ो2। Horizon2020 वायरस एक्स परियोजना (चित्रा 1)3. इस कार्यक्रम का उद्देश्य (क) ज्ञात एंजाइम परिवारों के गुणों की सीमा का विस्तार करने के लिए है और (ख) अभी तक अज्ञात समारोह के उपंयास एंजाइमों की विशेषताएं (एंजाइम एक्स) । Crystallographic संरचना निर्धारण लक्ष्य प्रोटीन लक्षण वर्णन में एक निर्णायक भूमिका निभाता है, विशेष रूप से उन मामलों में जहां प्रोटीन अनुक्रम मांयता4से परे विकसित किया है । प्रोटीन स्थिरता क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कारक है; नमूने समरूप और संरचनात्मक रूप से उच्च गुणवत्ता, diffracting क्रिस्टल बनाने के लिए समय की एक अवधि से अधिक ध्वनि होना चाहिए । इसके अलावा, यह गतिविधि परख के लिए आवश्यक है कि प्रोटीन उनके सक्रिय रूप में मौजूद है, जो भी एक अनुकूल आणविक वातावरण की सुविधा हो सकती है ।

crystallographers के लिए उपलब्ध प्रौद्योगिकी के विकास के बावजूद, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण एक समय लेने वाली और श्रम गहन अनुभवजंय प्रक्रिया5रहता है । प्रारंभिक भौतिक प्रयोगों में प्रोटीन स्थिरता में सुधार करने के लिए स्पष्ट रूप से प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक बेहतर प्रारंभिक बिंदु दे और आमतौर पर केवल प्रोटीन नमूना6,7की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि का उपभोग, 8,9. लक्ष्य प्रोटीन की बड़ी संख्या में इस परियोजना में अध्ययन किया जा करने के लिए भी आवश्यक स्केलेबल, उच्च प्रवाह स्थिरता परख । एक पूर्व के लिए सबसे लोकप्रिय तरीकों में से एक-क्रिस्टलीकरण प्रोटीन के भौतिक लक्षण वर्णन थर्मल शिफ्ट परख (भी TSA या अंतर स्कैनिंग fluorimetry, DSF)10,11के रूप में जाना जाता है ।

TSAs एक पर्यावरण के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई को रोजगार के लिए प्रोटीन के नमूनों की थर्मल विकार ट्रैक । कई सामांयतः-रंजक इस्तेमाल अपने पर्यावरण के ध्रुवीकरण के आधार पर चर प्रतिदीप्ति गतिविधि है, अक्सर hydrophobic वातावरण में एक उच्च प्रतिदीप्ति उत्पादन प्रदर्शित लेकिन ध्रुवीय वातावरण12में तेजी से शमन के दौर से गुजर । प्रोटीन आमतौर पर डाई प्रतिदीप्ति में स्पष्ट वृद्धि के कारण के रूप में उनके hydrophobic कोर विकार के दौरान उजागर हो, अक्सर बहुत उच्च तापमान पर डाई प्रतिदीप्ति में कमी के बाद प्रोटीन के रूप में कुल शुरू (चित्रा 2) ।

जबकि एक hydrophobicity-संवेदनशील डाई अक्सर एक सामांय उपयोग TSA डाई के लिए एक अच्छा विकल्प है, यह बड़े, विलायक उजागर hydrophobic क्षेत्रों, जो अक्सर हानिकारक उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रदर्शन के साथ प्रोटीन के लिए अनुपयुक्त हो सकता है । कार्रवाई के वैकल्पिक साधनों के साथ Fluorophores मौजूद (चर्चा देखें), लेकिन यह बजाय nanoDSF के साथ आंतरिक प्रोटीन प्रतिदीप्ति के माध्यम से विकार ट्रैक वांछनीय हो सकता है ।

Tryptophan अवशेषों कि ३३० एनएम के एक उत्सर्जन अधिकतम के साथ एक प्रोटीन fluoresce के ध्रुवीय क्षेत्रों में दफन कर रहे हैं । एक प्रोटीन नमूने के रूप में करेंगी और इन अवशेषों एक ध्रुवीय विलायक को उजागर हो, उनके उत्सर्जन अधिकतम ३५० एनएम13के लिए एक bathochromic बदलाव से गुजरना । nanoDSF बाह्य fluorophores14के लिए आवश्यकता के बिना एक प्रोटीन नमूने का खुलासा जांच करने के लिए उत्सर्जन अधिकतम में इस बदलाव का दोहन ।

पिघल एक विकार कदम दिखा घटता एक बोल्ट्जमान sigmoidal मॉडल के लिए डेटा फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । खुलासा संक्रमण के मोड़ बिंदु पर तापमान (टीएम) प्रोटीन थर्मल स्थिरता और एक बेंचमार्क के एक मात्रात्मक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है विभिंन स्थितियों के पक्ष की तुलना ।

पिघला विभिंन स्थितियों में एक ही प्रोटीन के curves विविधता है कि एक बोल्ट्जमान sigmoidal फिटिंग व्यवहार्य बना सकते है की एक डिग्री के अधिकारी कभी नहीं । डेटा से टीएम मूल्यों विचार है कि क्लासिक वक्र टोपोलॉजी से भटक, संख्यात्मक तरीके ऐसे नामि, एक खुला स्रोत TSA डेटा विश्लेषण कार्यक्रम11में कार्यरत लोगों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक ऊष्मा चौखटे भी ऐसे ProteoPlex15पद्धति के रूप में कई विकार कदम, के साथ और अधिक जटिल curves का विश्लेषण किया जा सकता है ।

स्थिरता स्क्रीन TSA और nanoDSF प्रयोगों में उपयोग के लिए तेजी से एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल परिस्थितियों की पहचान करने के लिए डिजाइन किए गए थे (चित्रा 3, स्क्रीन रचनाओं पूरक जानकारी में उपलब्ध हैं) । जानकारी स्क्रीन के साथ इकट्ठा crystallographic पाइपलाइन के कई चरणों में इस्तेमाल किया जा सकता है सहित: नमूना भंडारण; शुद्धिकरण, प्रोटीन शुद्धिकरण प्रक्रिया के दौरान खुलासा करने के माध्यम से उपज हानि को कम; परख डिजाइन, थर्मल स्थिर बफ़र्स और अंत में क्रिस्टलीकरण के साथ गतिविधि परख में प्रोटीन कार्यक्षमता मजबूत, तर्कसंगत डिजाइन क्रिस्टलीकरण परीक्षण मार्गदर्शक ।

एक प्रोटीन नमूने के लिए एक उपयुक्त बफर सिस्टम के आधार का चयन महत्वपूर्ण है; असंगत पीएच मान एक प्रोटीन की निष्क्रियता या विकार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हालांकि, सह के एक बड़ी संख्या में हल-सघन बफर अणुओं की उपस्थिति एक्स-रे क्रिस्टल संरचनाओं (तालिका 1) भी एक स्थिर प्रभाव है कि सरल पीएच विनियमन के लिए अलग है और इसके बजाय रासायनिक से उपजी का संकेत हो सकता है बफर अणु की विशेषताएँ.

अंय सामांयतः जैविक रूप से संगत बफर सिस्टम के साथ है गुड buffers17,18,19 के कई का उपयोग कर तैयार की, पीएच स्क्रीन पर एक बफर अणु के रासायनिक प्रभाव deconvolute के लिए डिज़ाइन किया गया है परिणामस्वरूप समाधान के वास्तविक पीएच से प्रोटीन स्थिरता । प्रत्येक बफर सिस्टम के लिए तीन पीएच मूल्यों को उपलब्ध कराने और विभिंन प्रणालियों के बीच पीएच मूल्य अतिरेक को शामिल करके, पीएच स्क्रीन दोनों अनुकूल पीएच मूल्यों और एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए अनुकूल बफर सिस्टम की पहचान कर सकते हैं ।

नमक स्क्रीन आमतौर पर प्रयोगशाला लवण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से chaotropes, chelants, भारी धातुओं और एजेंटों को कम होता है । स्क्रीन उच्च ईओण ताकत के साथ वातावरण के लिए एक प्रोटीन नमूना के संबध के एक सामांय संकेत दे सकते हैं, लेकिन यौगिकों के प्रत्येक उपसमूह भी एक प्रोटीन की क्षमता संरचना के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, एक chelant काफी एक प्रोटीन स्थिर नमूना के भीतर महत्वपूर्ण संरचनात्मक धातुओं का संकेत हो सकता है । नमूना भी दृढ़ता से स्क्रीन के भीतर एक धातु कटियन द्वारा स्थिर है, तो यह आगे संरचनात्मक प्रयोगों के लिए एक आशाजनक प्रारंभिक बिंदु प्रदान कर सकते हैं ।

Osmolytes घुलनशील यौगिकों कि उनके पर्यावरण के आसमाटिक गुणों को प्रभावित कर रहे हैं । प्रकृति में, वे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है "रासायनिक chaperones", परिक्रमा प्रोटीन की तह लागू करने और उन्हें स्थिर, विशेष रूप से तनाव की स्थिति में20,21,22. ये विशेषताएँ उन्हें प्रोटीन क्रि में आकर्षक additives बनाते हैं; क्रिस्टल संचयन के दौरान cryoprotectants के रूप में प्रयोग करने योग्य, बढ़ते और भंडारण23प्रक्रियाओं । Osmolytes ' संभावित उपयोग भी प्रोटीन की शुद्धि के लिए फैली हुई है. रिकॉमबिनेंट ई. कोलाई में व्यक्त प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण अनुपात अघुलनशील और देशी राज्य में ठीक करने के लिए मुश्किल मानक शोधन विधियों का उपयोग कर सकते हैं । Osmolytes को स्थिर और अघुलनशील भिन्नताओं से प्रोटीन को उबारने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, शुद्धीकरण पैदावार में वृद्धि24.

osmolyte स्क्रीन प्रोटीन डेटा बैंक प्रविष्टियों में वर्तमान स्थापित यौगिकों का उपयोग कर डिजाइन किया गया था25 और Osmoprotection के ड्रैगन एक्सप्लोरर-जुड़े रास्ते (DEOP)26 डाटाबेस और iteratively मानक प्रोटीन का उपयोग कर अनुकूलित । स्क्रीन osmolyte के आठ उपवर्गों के आसपास बनाया गया है: ग्लिसरॉल, शर्करा और polyols, गैर-डिटर्जेंट sulfobetaines (NDSBs), betaines और उनके एनालॉग, organophosphates, dipeptides, अमीनो एसिड और उनके डेरिवेटिव और एक अंतिम विविध समूह । प्रत्येक osmolyte तुलना के लिए अपनी घुलनशीलता और प्रभावी एकाग्रता पर्वतमाला के आधार पर कई सांद्रता में मौजूद है ।

Protocol

1. प्रोटीन सैंपल तैयार करना

  1. ९६-अच्छी तरह से ब्लॉकों और भंडारण के लिए मुहर में ५०० µ l aliquots के रूप में स्थिरता स्क्रीन तैयार करना । स्थानांतरण 10 µ एल एक स्थिरता स्क्रीन की एक ९६-अच्छी तरह से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए समय बचाने के लिए प्लेट की इसी अच्छी तरह से एक शर्त (चित्रा 4ए) ।
  2. एक उचित बफर सिस्टम में लगभग 1 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 प्रोटीन समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें । जबकि एक उपयुक्त बफर की संरचना प्रत्येक प्रोटीन नमूने के साथ बदलता है, की कोशिश करने के लिए एक अच्छा पहला बफर १०० mm NaCl, पीएच ७.२ के साथ 10 मिमी सोडियम फॉस्फेट है ।
    नोट: स्वीकार्य प्रोटीन सांद्रता मामले दर-मामले बदलती हैं, लेकिन ०.५ की एकाग्रता पर्वतमाला-5 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 आम तौर पर विश्लेषण घटता उत्पादन । पतला बफ़र्स प्रत्येक शर्त के प्रभाव मास्किंग से बचने के लिए स्थिरता स्क्रीन के साथ उपयोग के लिए अनुशंसित हैं । विशिष्ट बफ़र रचनाएं लगभग १०० mm NaCl के साथ 10 मिमी बफर हैं ।
  3. एक TSA प्रयोग प्रदर्शन कर रहे हैं, 20x की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन के नमूने के लिए SYPRO ऑरेंज डाई जोड़ें । या तो उलटा या संक्षिप्त भंवर से मिश्रण ।
  4. ९६-अच्छी तरह से १.१ चरण में तैयार की थाली के प्रत्येक कुआं में प्रोटीन समाधान के 10 µ एल स्थानांतरण (चित्रा 4बी) ।
  5. सील और ९६ के लिए अच्छी तरह से प्लेट केंद्रापसारक ६०० एक्स जी में 2 मिनट के लिए सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन का नमूना और स्क्रीन घटक मिश्रित कर रहे है (चित्रा 4सी) ।
  6. फिर से स्थिरता स्क्रीन को सील करें गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक और 4 महीने के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर स्क्रीन की दुकान । अंधेरे में नमक स्क्रीन स्टोर, के रूप में कुछ घटकों सहज हैं ।
  7. एक nanoDSF प्रयोग करते हैं, तो चरण 2 से जारी रखें । एक TSA प्रयोग प्रदर्शन कर रहा है, तो चरण 4 पर जाएं ।

2. एक nanoDSF प्रयोग की तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि उपकरण साफ है, नमूना रैक के पास किसी भी धूल के लिए विशेष रूप से ध्यान दे । यदि प्रणाली एक backscattering दर्पण है, यह इथेनॉल और एक एक प्रकार का वृक्ष मुक्त ऊतक का उपयोग कर साफ ।
  2. खुला दराज बटन दबाकर नमूना दराज खोलें. (चित्रा ५अ).
  3. समाधान में केशिका के एक छोर को छूने से ९६-well थाली की प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग 10 µ एल के साथ केशिकाओं लोड, तो नमूना रैक (चित्रा 5बी) के इसी केशिका धारकों में उन्हें जगह है । इस प्रयोग के दौरान प्रतिदीप्ति रीडिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, के रूप में फिंगरप्रिंट, आदिके साथ केशिकाओं के बीच दूषित करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
  4. चुंबकीय सील पट्टी (चित्रा 5सी) के साथ केशिकाओं को स्थिर ।

3. प्रोग्रामिंग एक nanoDSF प्रयोग

  1. डिस्कवरी स्कैन टैब में डिस्कवरी स्कैन प्रारंभ करें बटन दबाकर प्रत्येक केशिका की स्थिति और तीव्रता का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक स्कैन लॉन्च करें । वृद्धि या घटना उत्तेजना ताकत 10% की एक प्रारंभिक शक्ति से कम हर केशिका स्कैन की चोटी 4000-12000 इकाइयों (चित्रा 5डी) के बीच है ।
  2. सुनिश्चित करने के लिए नमूना जोड़ रहा है और पर्याप्त ध्यान केंद्रित, एक खड़ी तापमान ढाल के साथ एक प्रारंभिक स्कैन पिघल सिफारिश की है । पिघलने स्कैन टैब में, एक प्रोग्राम ७.० ° c न्यूनतम करने के लिए तापमान ढलान विकल्प की स्थापना करके स्कैन पिघल-1, तापमान शुरू करने के लिए 25 ° c और अंत तापमान ९५ ° c करने के लिए, तब दबाकर nanoDSF प्रयोग लांच पिघलने शुरू बटन । यदि परिणामस्वरूप पिघल curves एक detectable मोड़ बिंदु नहीं दिखा है, नमूना आगे ध्यान केंद्रित करने पर विचार या जांच अगर प्रोटीन ठीक से जोड़ रहा है ।
  3. दोहराएं एक पूर्ण प्रयोग के लिए नमूने तैयार करने के लिए 2.1-2.4 कदम ।
  4. पिघलने स्कैन टैब में, प्रोग्राम एक पिघला तापमान ढलान विकल्प की स्थापना के द्वारा स्कैन १.० ° c मिनट-1, तापमान शुरू करने के लिए 25 ° c और अंत तापमान ९५ ° c, तो दबाकर nanoDSF प्रयोग प्रक्षेपण पिघलने शुरू बटन ।

4. एक TSA प्रयोग प्रदर्शन

  1. मजबूती से दराज के दाहिने हाथ की ओर से इंडेंट दबाकर नमूना दराज खोलें. बैक-लेफ्ट (चित्रा 4डी) को अच्छी तरह से A1 के साथ आरटी-पीसीआर सिस्टम में ९६-well ट्रे रखें ।
  2. एक TSA प्रयोग की स्थापना शुरू करने के लिए नया प्रयोग बटन पर क्लिक करें ।
  3. प्रयोग गुण टैब में, जब पूछा जाए कि आप किस प्रकार के प्रयोग को सेट करना चाहते हैं , तो वक्र पिघलने के विकल्प पर क्लिक करें? और दूसरा विकल्प यह पूछे जाने पर कि आप लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के लिए कौन-से एजेंट उपयोग करना चाहते हैं?
  4. में प्लेट सेटअप/लक्ष्य और नमूने टैब को परिभाषित करने के लिए, एक लक्ष्य नाम दर्ज करें तो ROX और शमनकर्ता के रूप में कोई भी रिपोर्टर के रूप में सेट ।
  5. में प्लेट सेटअप/असाइन लक्ष्य और नमूने टैब, पिछले चरण में दर्ज लक्ष्य नाम के लिए ९६-well प्लेट की हर अच्छी तरह से असाइन करें. एक ही टैब में, सेट के रूप में कोई भी निष्क्रिय संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए डाई का चयन करें ।
  6. कोई कुल तीन है जब तक कि विधि चलाएँ टैब में, चरणों को हटाएँ । २५.० डिग्री सेल्सियस, रैंप दर १००%, समय 00:05 के लिए पहला कदम सेट; ९५.० डिग्री सेल्सियस, रैंप दर 1%, समय 01:00 के लिए दूसरा कदम; ९५.० डिग्री सेल्सियस, रैंप दर १००%, समय 00:05 के लिए तीसरे चरण । डेटा एकत्रित करें ड्रॉपडाउन मेनू का उपयोग करके या डेटा संग्रह चिह्न (चित्र 6) दबाकर डेटा एकत्रित करना चुनें.
  7. 20 µ एल के लिए अच्छी तरह से प्रति प्रतिक्रिया मात्रा निर्धारित करें
  8. प्रेस शुरू भागो बटन TSA प्रयोग शुरू करने के लिए ।

5. डेटा विश्लेषण

  1. एक तरंग दैर्ध्य के साथ एक पिघल वक्र साजिश चुनें । nanoDSF प्रयोगों के लिए, ३३० एनएम और ३५० एनएम में प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात (इसी tryptophan के लिए ध्रुवीय और ध्रुवीय वातावरण में, क्रमशः)13 सामांयतः प्रयोग किया जाता है । सबसे TSAs के लिए, डाई उत्सर्जन अधिकतम पिघलने के लिए उपयुक्त है वक्र साजिश रचने (SYPRO ऑरेंज के उत्सर्जन अधिकतम ५६९ एनएम है)12।
  2. प्रत्येक हालत के टीएम मूल्यों की गणना प्रत्येक पिघल वक्र के मोड़ बिंदु (ओं) का निर्धारण करके । अधिकांश nanoDSF प्रणालियों स्वचालित रूप से आंकड़ा अधिग्रहण के बाद पिघल curves के संख्यात्मक भेदभाव से टीएम मूल्यों की गणना । यदि सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया स्वचालित रूप से टीएम मूल्यों की गणना नहीं करता है, मुफ्त, वैकल्पिक जीयूआई-ऐसे नामि11 के रूप में संचालित सॉफ्टवेयर डेटा विश्लेषण और बहाव प्रसंस्करण स्वचालित कर सकते हैं, एक हीटमैप सारांश टीएम उत्पादन का विकल्प दे पूरे ९६ के लिए मान-अच्छी तरह से प्रयोग (साथ संदर्भ के मार्गदर्शन और नामि साथ डेटा प्रोसेसिंग के लिए संसाधन प्रदान करता है) ।
  3. सर्वे की गई सभी शर्तों के टीएम मूल्यों की तुलना करें । स्थिरता स्क्रीन प्रत्येक स्क्रीन (A1 और A2) है कि केवल पानी में दो कुओं होते हैं । पानी लेने केवल एक बेंचमार्क के रूप में मूल्यों ΔTएम मूल्यों की गणना की अनुमति देता है, व्यवस्थित त्रुटियों को संबोधित और प्रभाव स्थिर करने की अनुमति आसान तुलना. उच्च टीएम मूल्यों के बहाव के उपयोग के लिए सिफारिश कर रहे हैं, जो थर्मल स्थिर परिस्थितियों को इंगित । आशाजनक स्थितियां अक्सर उनके स्थिरीकरण में एकाग्रता पर निर्भरता दर्शाती हैं ।

Representative Results

Lysozyme स्थिरता स्क्रीन और प्रोटीन एक्स, वायरस एक्स परियोजना में एक लक्ष्य प्रोटीन के साथ परख की थी, osmolyte स्क्रीन के साथ परख की थी । दोनों के प्रोटीन आम तौर पर दोनों TSA और nanoDSF प्रयोगों में स्पष्ट रूप से परिभाषित विकार संक्रमण के साथ पिघला घटता उत्पादन (प्रतिनिधि curves के लिए आंकड़े के साथ देखें) । कुछ मामलों में, जहां नमूनों कि एक परिभाषित विकार संक्रमण के साथ व्याख्यात्मक घटता उत्पादन नहीं किया विकृत के रूप में व्याख्या की और टीएम तुलना में शामिल नहीं थे ।

चित्रा 7 नमक स्क्रीन से नमूना परिणाम से पता चलता है, lysozyme की ओर अमोनियम क्लोराइड के थर्मल-स्थिर गुणों exemplifying । एकाग्रता निर्भरता ऐसी है कि ऊपर दिखाए गए के रूप में अक्सर होनहार स्थितियों का संकेत कर रहे हैं, लेकिन यह कई अलग लवण के साथ बढ़ती आयन एकाग्रता के परिणामों की तुलना करने के लिए अगर थर्मल स्थिरता आम तौर पर एक से उठता है देखने के लिए उपयोगी हो सकता है बफर ईओण ताकत में वृद्धि या यदि विशिष्ट आयनों की उपस्थिति अतिरिक्त स्थिरता प्रदान ।

पीएच स्क्रीन के साथ lysozyme के टीएम मूल्यों की तुलना (चित्रा 8) जानकारी के दो टुकड़े से पता चलता है । सबसे पहले, वहां पीएच मूल्यों को कम करने के साथ स्थिरता में वृद्धि की एक सामांय प्रवृत्ति है । दूसरे, टीएम मूल्यों की सीमा के समान पीएच मूल्यों के साथ अलग बफर सिस्टम का उपयोग कर प्राप्त महत्वपूर्ण हो सकता है ।

चित्रा 8 में डेटा पता चलता है कि इस प्रयोग में tsa और nanoDSF के बीच समझौते आम तौर पर अच्छा है, लेकिन nanoDSF थोड़ा उच्च टीएम मूल्यों और थोड़ा बड़ा TSA से टीएम पाली की पहचान करने की प्रवृत्ति से पता चलता है । हालांकि, ८.५ ऊपर पीएच मूल्यों के साथ कुछ कुओं टीएम के बीच बड़ी विसंगतियों को दिखाने के TSA और nanoDSF से प्राप्त मूल्यों । मतभेद संभावित विभिंन पीएच मूल्यों पर प्रोटीन के विकार तंत्र के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है; उदाहरण के लिए, एक hydrophobicity-संवेदनशील डाई एक अपेक्षाकृत कम टी पढ़ दे सकता है अगर एक प्रोटीन के hydrophobic क्षेत्रों विलायक काफी तेजी से tryptophan अवशेषों के वातावरण में बदलाव के रूप में उजागर हो ध्रुवीयता में परिवर्तन ।

चित्रा 9 osmolyte स्क्रीन का उपयोग lysozyme के साथ प्राप्त टीएम मूल्यों की एक हीटमैप से पता चलता है. नियंत्रण कुओं की तुलना में उच्चतम टीएम वृद्धि के साथ शर्तों (वेल्स A1 और A2, जल युक्त) गहरे नीले रंग के होते हैं । विशेष रूप से चित्र 9 में पहचान की स्थिति स्थिर ग्लिसरॉल, 1 एम डी-सोर्बिटोल, १०० mm hypotaurine और 10 मिमी अला-Gly (वेल्स A4-A6, A9, E7 और F8 क्रमशः) शामिल हैं ।

चित्रा 10 Osmolyte स्क्रीन के साथ प्रोटीन एक्स TSA और nanoDSF प्रयोगों के साथ प्राप्त टीएम मूल्यों की एक हीटमैप से पता चलता है कि osmolytes परीक्षण के बहुमत या तो टीएम में एक छोटी सी वृद्धि (1 डिग्री सेल्सियस के भीतर) दे या एक हानिकारक प्रभाव है प्रोटीन एक्स की स्थिरता पर । विशेष रूप से, 10 मिमी (अच्छी तरह से D1) की एकाग्रता में dipicolinic एसिड कमरे के तापमान पर नमूना विकृत करने के लिए प्रकट होता है । TSA और nanoDSF परिणाम जल्दी प्रोटीन एक्स के लिए एक असंगत additive के रूप में dipicolinic एसिड की पहचान है जो बचा जाना चाहिए जब प्रोटीन के साथ काम कर रहे । फिर भी, D-सोर्बिटोल और arabinose के उच्च सांद्रता (वेल्स A9 और B9, दोनों में 1 M) के रूप में अच्छी तरह के रूप में ग्लिसरॉल और TMAO (वेल्स A4-A6 और E1, क्रमशः) के रूप में की पहचान की गई थर्मल-स्थिर ।

lysozyme के लिए, प्रत्येक स्थिरता स्क्रीन से उच्चतम टीएम मूल्यों उपज की शर्तों का संयोजन एक synergistic संयुक्त प्रभाव के लिए जांच करने के लिए परीक्षण किया गया । चित्र 11 बफ़र सिस्टम (पीएच, नमक और osmolyte) के अधिक घटकों के रूप में टीएम मूल्यों में एक सामांय वृद्धि से पता चलता है जोड़ रहे हैं । एमईएस, अमोनियम सल्फेट और डी-सोर्बिटोल के मामले में, एक टीएम वृद्धि के रूप में बड़े रूप में 10 डिग्री सेल्सियस देखा जा सकता है जब सभी घटक अकेले एमईएस की तुलना में मौजूद हैं । चित्र 11 दिखाता है कि एक नजर synergistic प्रभाव हो सकता है जब एक बफर के व्यक्तिगत घटकों को अनुकूलित कर रहे है और स्थिरता स्क्रीन के साथ संयुक्त ।

एक अधिक सामांय नोट पर, चित्र 11 भी ΔTमीटर मूल्यों है कि TSA और nanoDSF प्रयोगों में मनाया जा सकता है की भयावहता दिखाता है । ΔTm प्राप्त की भयावहता काफी प्रोटीन प्रणाली के आधार पर निर्भर करता है, लेकिन किसी भी ΔTएम मूल्य के आसपास और 5 डिग्री सेल्सियस से अधिक अक्सर एक लाभकारी स्थिर प्रभाव का संकेत है.

Figure 1
चित्रा 1 : पूर्वेक्षण । वायरस-X प्रोजेक्ट में एक अति वातावरण से नमूना संग्रह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: TSA योजनाबद्ध । एक ठेठ पिघल वक्र एक TSA प्रयोग से प्राप्त की व्याख्या उदाहरण । इस वक्र क्लासिक "दो राज्य" प्रोटीन का खुलासा है, जहां नमूना जनसंख्या संक्रमण का पता लगाने के आंशिक रूप से मुड़े हुए मध्यवर्ती के बिना विकृत करने के लिए जोड़ की विशेषता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : स्थिरता स्क्रीन कार्यप्रवाह । स्थिरता स्क्रीन का उपयोग कर बफ़र ऑप्टिमाइज़ेशन के मानक वर्कफ़्लो । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : स्थिरता स्क्रीन के साथ एक मानक TSA प्रयोग के कार्यप्रवाह । बाएं से दाएं: (a) एक ९६-वेल प्लेट में स्थिरता स्क्रीन के Pipetting aliquots । (ख) थाली में फ्लोरोसेंट डाई के साथ Pipetting प्रोटीन नमूना । (ग) केंद्रापसारक से पहले प्लेट सील । (घ) प्लेट को आरटी-पीसीआर सिस्टम में डालना । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक मानक nanoDSF प्रयोग के कार्यप्रवाह । (क) केशिका लोडिंग रैक खोलने । (ख) रैक में केशिकाओं लोड हो रहा है । (ग) चुंबकीय सील पट्टी के साथ केशिकाओं को स्थिर करना । (घ) एक प्रयोग प्रोग्रामिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : आरटी-पीसीआर प्रणाली के लिए यूजर इंटरफेस । एक TSA प्रयोग क्रमादेशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : नमक स्क्रीन नमूना डेटा । (एक) lysozyme के साथ एक लेबल मुक्त nanoDSF प्रयोग के लिए ३५० एनएम बनाम ३३० एनएम में प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुपात । नमूनों को C7-C12 नमक स्क्रीन (१.५ एम-०.२ एम अमोनियम क्लोराइड) से संबंधित हैं । प्रत्येक शर्त के लिए परिकलित Tm मान प्लॉट पर आरोपित होते हैं । (ख) चित्रा ७एमें प्रस्तुत आंकड़ों से गणना की गई टीएम मूल्यों का सारांश (ग) एक TSA एक hydrophobicity-संवेदनशील रिपोर्टर डाई के साथ lysozyme का उपयोग प्रयोग के लिए ५९० एनएम में प्रतिदीप्ति तीव्रता । चित्रा 7एकी तरह, नमूने नमक स्क्रीन के कुओं C7-C12 के अनुरूप हैं । परिकलित Tm मान ग्राफ़ पर आरोपित होते हैं । (घ) चित्रा ७सीमें उपस्थित आंकड़ों से गणना की गई टीएम मूल्यों का सारांश. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: पीएच स्क्रीन नमूना डेटा । टीएम lysozyme और पीएच स्क्रीन के साथ प्राप्त की पाली का सारांश । प्रत्येक बिंदु एक स्वतंत्र स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है; एक ही पीएच मूल्य पर अंक अलग बफर सिस्टम के एक ही पीएच में हैं । टीएम पाली TSA प्रयोगों के लिए ६८.० डिग्री सेल्सियस के एक नियंत्रण टीएम के सापेक्ष गणना कर रहे हैं और nanoDSF प्रयोगों के लिए ७१.९ डिग्री सेल्सियस. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 9
चित्र 9 : Osmolyte स्क्रीन नमूना डेटा (lysozyme) । lysozyme और osmolyte स्क्रीन के प्रत्येक कुआं के साथ एक लेबल से मुक्त nanoDSF प्रयोग से प्राप्त टीएम मूल्यों का सारांश । Tm मान (° c में) वेल्स A1 और A2 जो एक नियंत्रण के रूप में पानी होते हैं की तुलना कर रहे हैं । एक हीटमैप ΔTएम मूल्यों की तुलना में (ब्लू एक टीएम वृद्धि और लाल ए टीएम कमी) के आधार पर उत्पंन किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्रा 10: Osmolyte स्क्रीन नमूना डेटा (प्रोटीन एक्स). (क) प्रोटीन एक्स और osmolyte स्क्रीन के साथ एक लेबल से मुक्त nanoDSF प्रयोग से प्राप्त टीएम मूल्यों का सारांश. टीएम मूल्यों वेल्स A1 और A2 जो एक नियंत्रण के रूप में पानी होते है की तुलना में हैं । एक हीटमैप ΔTएम मूल्यों की तुलना में (ब्लू एक टीएम वृद्धि और लाल ए टीएम कमी) के आधार पर उत्पंन किया गया था । (ख) अच्छी तरह से A9 (1 एम डी-सोर्बिटोल, एक स्थिर हालत) और D1 (10 मिमी dipicolinic एसिड, एक स्थिर हालत) से प्राप्त nanoDSF घटता. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 : बफर ऑप्टिमाइज़ेशन प्रभाव टीएमपर lysozyme के TSA टीएम मूल्यों प्रत्येक स्क्रीन है कि टीएममें सबसे बड़ी वृद्धि afford की शर्तों के साथ संयुक्त । १०० मिमी एसिटिक एसिड, पीएच ४.२, और १०० मिमी एमईएस, पीएच ५.६, बफर सिस्टम के रूप में चुना गया था, नमक के रूप में १.५ मीटर अमोनियम सल्फेट के साथ । Osmolyte सांद्रता Osmolyte स्क्रीन में पाया उन लोगों के लिए समान थे: 10 मिमी अला-Gly, 1 एम डी-सोर्बिटोल, ५० मिमी एल-lysine और १०० मिमी hypotaurine. त्रुटि पट्टियां छह प्रतिकृति के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अणु PDB कोड कं crystallisation की आवृति
फॉस्फेट PO4 ५१३२
एसीटेट अधिनियम ४५२१
2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic एसिड (एमईएस) एमईएस १३३४
Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) टीआरएस ११५५
फोरमेट Fmt १०७२

तालिका 1: प्रोटीन डेटा बैंक (PDB) प्रविष्टियों में बफर अणु सह क्रिस्टलीकरण आवृत्ति का सारांश. १४४,८६८ प्रविष्टियों की कुल से PDBsum16 के माध्यम से प्राप्त डेटा (12-5-18 के रूप में सही) ।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण पहलुओं में शामिल है केंद्रापसारक कदम और ९६ के उचित सील-TSA प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से थाली (१.५ कदम) । केंद्रापसारक सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन का नमूना और स्क्रीन हालत संपर्क और मिश्रण में आते हैं । इसके अतिरिक्त, एक सील प्लेट एक TSA प्रयोग के लिए प्रयोग किया जाता है, तो प्रयोग भर में विलायक वाष्पीकरण का एक महत्वपूर्ण जोखिम है, नमूना एकाग्रता में वृद्धि के कारण और समय से पहले प्रोटीन एकत्रीकरण की संभावना बढ़ रही है ।

TSAs और nanoDSF प्रोटीन नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदायी हैं; नमूनों की विशाल बहुमत एक hydrophobicity आधारित रिपोर्टर डाई के साथ या डाई मुक्त nanoDSF के माध्यम से व्याख्यात्मक पिघल घटता उत्पादन कर सकते हैं. यदि मानक प्रतिदीप्ति सूत्रों अपने प्रोटीन के लिए उपयुक्त नहीं हैं, प्रोटोकॉल है कि पता लगाया जा सकता है के लिए सरलतम संशोधन fluorophore की पसंद है । कई वैकल्पिक रंजक TSA प्रयोगों के लिए उपयुक्त हो सकता है । उदाहरणों में शामिल है N-[4-(7-diethylamino-4-मिथाइल-3-coumarinyl) फिनाइल] maleimide (सीपीएम), एक यौगिक है कि एक fluoresces27के साथ प्रतिक्रिया करने के बाद thiol, और 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), एक यौगिक है कि अपने प्रतिदीप्ति के आधार पर बदलता है अपने पर्यावरण की कठोरता, एक प्रोटीन नमूने के रूप में अपनी प्रतिदीप्ति में वृद्धि28,29 (उत्तरार्द्ध डाई अक्सर नमूना के उच्च सांद्रता की आवश्यकता है) करेंगी ।

पिघल वक्र विश्लेषण के वैकल्पिक तरीकों उपलब्ध है अगर टीएम स्वचालित रूप से साधन सॉफ्टवेयर द्वारा गणना नहीं है । यदि डेटा समरूप है और केवल एक विकार चरण में पिघल curves स्पष्ट है, तो एक छोटा dataset बोल्ट्जमान अवग्रह के साथ निंन समीकरण के लिए फ़िट किया जा सकता:

Equation 1

जहां च तापमान टी, एफमिनट और एफमैक्स पर प्रतिदीप्ति तीव्रता है प्रतिदीप्ति तनाव से पहले और बाद विकार संक्रमण, क्रमशः, टीएम विकार संक्रमण और सी के मध्यबिंदु तापमान है टीएमपर ढलान है । हालांकि इस विधि सरल दो कदम विकार प्रक्रियाओं के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यह कई संक्रमण के साथ जटिल पिघल curves के लिए अनुपयुक्त है ।

TSA के प्रमुख लाभों में से एक इसकी पहुंच है; TSA प्रयोगों प्रतिदीप्ति डाई कार्यरत के लिए उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर फिल्टर के साथ किसी भी आरटी-पीसीआर प्रणाली में किया जा सकता है । यह उपभोग्य सामग्रियों की कम लागत के साथ युग्मित, ऑपरेशन की आसानी और प्रोटीन की जरूरत अपेक्षाकृत कम राशि, TSA परियोजना तराजू की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक मूल्यवान तकनीक बनाने, दोनों उद्योग और शिक्षा में ।

के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुकूल बफर शर्तों का संकेत है, स्क्रीन कुछ कुओं कि एक नमूना प्रोटीन के भीतर संरचनात्मक धातुओं की उपस्थिति के लिए सुराग दे सकता है होते हैं । कुओं कि नमक स्क्रीन में विशेष रुचि के हो सकता है G6 और G7, जो क्रमशः 5 मिमी EDTA और 5 मिमी EGTA होते हैं । महत्वपूर्ण इन कुओं में थर्मल स्थिरीकरण प्रोटीन है कि chelants द्वारा तनहा है में महत्वपूर्ण धातु आयनों का संकेत हो सकता है । osmolyte स्क्रीन के भीतर यौगिकों भी संभावित एक प्रोटीन के समारोह के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं । स्क्रीन में यौगिकों के कई अणु की कक्षाएं है कि एंजाइमों की आम सब्सट्रेट कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, सामांय स्थिरीकरण saccharides द्वारा afforded (वेल्स A11-B10 में मौजूद) lysozyme के लिए उनके संरचनात्मक समानता एंजाइम की स्थापित सब्सट्रेट करने के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है, N-acetylglucosamine oligomers30।

TSA और nanoDSF प्रोटोकॉल ऊपर उल्लिखित भी प्रोटीन ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । लाइगैंडों कि विशेष रूप से एक प्रोटीन को बांध परिसर के भीतर नई बातचीत शुरू करने से अपने थर्मल स्थिरता में वृद्धि कर सकते हैं । प्रोटीन टीएम में एक खुराक पर निर्भर सकारात्मक बदलाव एक सफल प्रोटीन-ligand बातचीत का एक आशाजनक संकेत है । गति, प्रवाह और TSAs के साथ यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के कम लागत यह प्रारंभिक चरण दवा खोज में एक बहुत लोकप्रिय तरीका बना दिया है ।

लक्ष्य प्रोटीन और उनके ligand परिसरों के बफर शर्तों के अनुकूलन एक परियोजना की सफलता के लिए आवश्यक हो सकता है, के रूप में कई साहित्य उदाहरण31,३२,३३,३४का प्रदर्शन । एक ठेठ सेटअप समय, TSAs और स्थिरता स्क्रीन के साथ मिलकर nanoDSF सहित 2 एच के तहत ले परख के साथ बफर अनुकूलन के लिए एक तेजी से, सस्ती तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान करार n ° ६८५७७८) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है. यह काम जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था (BBSRC, अनुदान संख्या बी ओ/M011186/1, bb/J014516/ DB धंयवाद BBSRC डॉक्टरेट प्रशिक्षण भागीदारी न्यूकैसल-लिवरपूल-डरहम के लिए एक छात्र और डरहम विश्वविद्यालय के वित्त पोषण की ओर योगदान के लिए इस काम के लिए विज्ञान विभाग । हम उनकी मदद के लिए इयान एडवर्ड्स और रसायन विज्ञान मास स्पेक्ट्रोमेट्री विभाग के डरहम विश्वविद्यालय के विभाग उनके वाद्य प्रोटीन एक्स के विश्लेषण के लिए धंयवाद । हम वायरस के साथ अपने काम के लिए Arnthor Ævarsson के लिए आभारी है एक्स परियोजना, और धंयवाद भी क्लेयर Hatty और NanoTemper GmbH को ऋण देने के लिए और इस परियोजना के लिए प्रोमेथियस NT. 48 प्रणाली के साथ सहायता । अंत में, आप BBSRC iCASE पुरस्कार के भाग के रूप में उनके समर्थन के लिए फ्रांसिस Gawthrop और Tozer बीज के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lysozyme Melford Laboratories L38100 Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen Molecular Dimensions MD1-101 96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen Molecular Dimensions MD1-102 96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen Various #N/A 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange Invitrogen S6651 Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate Starlab 1403-7700 Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System Applied Biosystems 4362143 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48 NanoTemper Technologies #N/A Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries NanoTemper Technologies PR-C002 Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1).

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Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project. J. Vis. Exp. (144), e58666, doi:10.3791/58666 (2019).

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