Summary
En protokoll er presentert for å raskt teste temperaturstabilitet proteiner i en rekke forhold gjennom termisk Skift analyser og nano differensial skanning fluorimetry. Buffer systemer, salter og tilsetningsstoffer, sammen er med tre unike stabilitet skjermer, assayed med proteiner å identifisere egnet bufferne for funksjonell og strukturelle studier.
Abstract
Horizon2020 Virus-X prosjektet ble etablert i 2015 for å utforske virosphere av valgte ekstreme naturtyper og oppdage romanen virale proteiner. For å vurdere den potensielle bioteknologiske verdien av disse proteinene, analyse av protein er strukturer og funksjoner en sentral utfordring i dette programmet. Stabiliteten av protein prøven er viktig å gi meningsfylt analyseresultatene og øke crystallizability av målene. Termisk Skift analysen (TSA), en fluorescens-basert teknikk, er etablert som en populær metode for å optimalisere betingelsene for protein stabilitet i høy gjennomstrømming. I TSAs er de ansatt fluorophores ytre, miljøvennlig fargestoffer. Et alternativ, tilsvarende teknikk er nano differensial skanning fluorimetry (nanoDSF), som er avhengig av protein innfødt fluorescens. Vi presenterer her en roman osmolyte skjerm, en 96-stand skjerm av organisk tilsetningsstoffer utformet for å veilede krystallisering studier gjennom foreløpige TSA eksperimenter. Sammen med tidligere utviklet pH og salt skjermer gir settet med tre skjermer en omfattende analyse av protein stabilitet i en rekke buffer systemer og tilsetningsstoffer. Nytten av skjermene er demonstrert i TSA og nanoDSF analyse av lysozyme og Protein X, et mål protein av viruset-X prosjektet.
Introduction
Mange bioteknologisk nyttig enzymer stammer fra viral kilder, slik som tobakk etch virus (TEV) protease1 og menneskelige rhinovirus type 3 C (HRV 3 C) protease2. Horizon2020 Virus-X prosjekt (figur 1)3. Målet med dette programmet er (a) for å utvide rekkevidden av egenskapene til kjente enzym familier og (b) for å karakterisere romanen enzymer i ennå ukjent funksjon (enzym X). Krystallografisk struktur besluttsomhet spiller en avgjørende rolle i målet protein karakterisering, spesielt i de tilfellene hvor protein sekvensene ha utviklet seg utover anerkjennelse4. Protein stabilitet er en nøkkelfaktor i krystallisering prosessen; prøver må være conformationally homogent og strukturelt lyd over en periode til skjemaet høy kvalitet, diffracting krystaller. Videre er det viktig for aktivitet analyser som proteiner finnes i deres aktive eksteriør, som kan være ledes av et gunstig molekylær miljø.
Til tross for utviklingen i teknologien tilgjengelig for crystallographers forblir protein krystallisering en tidkrevende og arbeidskrevende empirisk prosess5. Foreløpig Biofysiske eksperimenter for å forbedre protein stabiliteten i løsningen gir klart et bedre utgangspunkt for protein krystallisering og bruker vanligvis bare en relativt liten mengde protein eksempel6,7, 8,9. Det store antallet mål proteiner til studeres i dette prosjektet også nødvendiggjør skalerbare, høy gjennomstrømming stabilitet analyser. En av de mest populære metodene for pre krystallisering Biofysiske karakteristikk av proteiner er termisk Skift analysen (også kjent som TSA eller differensial skanning fluorimetry, DSF)10,11.
TSAs benytter en miljøsensitive fluorescerende farge til å spore den termiske denaturering av protein prøver. Mange brukte fargestoffer har variabel fluorescens aktivitet avhengig av polariteten til miljøet, ofte viser en høy fluorescens utgang i hydrofobe miljøer, men gjennomgår rask slukke i polar miljøer12. Proteiner føre generelt uttalt økning i dye fluorescens som sine hydrofobe kjerner bli eksponert under rødsprit, ofte etterfulgt av en nedgang i dye fluorescens ved svært høye temperaturer som proteiner begynner å samlet (figur 2).
Mens en hydrophobicity-sensitive fargestoff er et godt valg for en generell bruk TSA fargestoff, kan det være uegnet for proteiner med store, løsemiddel-eksponerte hydrofobe regioner, som ofte viser detrimentally høye fluorescens. Fluorophores med alternative former for handlingen eksisterer (se diskusjon), men i stedet kan det være ønskelig å spore rødsprit gjennom iboende protein fluorescens med nanoDSF.
Tryptofan rester som er begravet i upolart regioner i et protein fluoresce med et utslipp maksimalt 330 nm. Som et protein utvalg utfolder seg, og disse rester bli utsatt for en polar løsemiddel gjennomgår utslipp maksimal en bathochromic endring til 350 nm13. nanoDSF utnytter dette skiftet i utslipp maksimal å undersøke utfoldelsen av et protein utvalg uten behov for ytre fluorophores14.
Smelt kurver viser enkelt rødsprit trinn kan analyseres ved å tilpasse dataene til en Boltzmann sigmoidal modell. Temperaturen på vendepunkt unfolding overgangen (Tm) er brukt som et kvantitativt mål for protein termisk stabilitet og en målestokk for å sammenligne favorability av ulike forhold.
Smelt kurver av samme proteinet i ulike forhold har noen ganger en grad av heterogenitet som kan gjøre en Boltzmann sigmoidal passende unfeasible. For å skille Tm verdier fra data som avviker fra klassisk kurve topologi, kan numeriske metoder brukes som ansatt i NAMI, en åpen kildekode TSA data analyse program11. Alternative termodynamisk rammer kan også brukes til å analysere mer komplekse buer med flere rødsprit trinn, for eksempel ProteoPlex metodikk15.
Stabilitet skjermene ble laget for bruk i TSA og nanoDSF eksperimenter å raskt identifisere gunstige vilkår for et mål protein (Figur 3, skjermen komposisjoner er tilgjengelig i ytterligere opplysninger). Informasjonen samlet med skjermene kan brukes på mange stadier av krystallografisk rørledning inkludert: prøve lagringen; rensing, minimere utbytte forlis gjennom protein utspiller seg under en renselsesprosess; analysen design, forsterke protein funksjonalitet i aktivitet analyser med termisk stabilisere buffere og krystallisering, guiding rasjonelt utformet krystallisering prøvelser.
Velge en egnet buffer system basis for et protein utvalg er avgjørende; inkompatibel pH-verdier kan føre til deaktivering eller denaturering av et protein. Men kan tilstedeværelsen av co krystallisert buffer molekyler løst i en rekke X-ray krystall strukturer (tabell 1) også være indikativ av en stabiliserende effekt som separat for enkel pH regulering og i stedet stammer fra kjemiske vise egenskaper av buffer molekylet.
Formulert med flere gods buffere17,18,19 sammen med andre vanligvis biologisk-kompatible buffer systemer, er pH-skjermen utformet for å deconvolute kjemiske effekten av et buffer molekyl på protein stabilitet fra den faktiske pH av resulterende løsningen. Ved å gi tre pH-verdier for hvert buffer system og innlemme pH verdien redundans mellom ulike systemer, kan pH skjermen identifisere både gunstige pH-verdier og gunstige buffer systemer for et mål protein.
Salt skjermen inneholder vanlige laboratorium salter som chaotropes, komplekseringsmidler, tungmetaller og reduksjonsmidler. Skjermen kan gi en generell ytelsesindikator slektskap av et protein utvalg til miljøer med høy ioniske styrke, men hver undergruppe av forbindelser kan også gi informasjon om potensielle strukturen i et protein. For eksempel kunne en chelant betydelig destabilisere et protein være indikativ av viktige strukturelle metaller i utvalget. Hvis prøven også sterkt stabiliseres ved en metall kation i skjermbildet, kan dette gi lovende utgangspunkt for videre strukturelle eksperimenter.
Osmolytes er løselig forbindelser som påvirker osmotisk egenskapene for miljøet. I naturen, kan de brukes som "kjemiske chaperones", håndheve folding av uordnede proteiner og stabilisere dem, spesielt i stress forhold20,21,22. Disse egenskapene gjør dem attraktive tilsetningsstoffer i protein krystallografi; brukes som cryoprotectants i crystal høsting, montering og lagring behandler23. Osmolytes' potensielle bruk strekker seg også til rensing av proteiner. En betydelig andel av rekombinante proteinene i E. coli kan være uløselig og vanskelig å komme i opprinnelig tilstand ved hjelp av standard rensing metoder. Osmolytes kan brukes til å stabilisere og berge proteiner fra uløselig fraksjoner, økende rensing gir24.
Osmolyte skjermen ble utformet med etablerte forbindelser i Protein databank oppføringer25 og26 databasen Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated veier (DEOP) og optimalisert iteratively bruke standard proteiner. Skjermen er bygget rundt åtte underklasser av osmolyte: glyserol, sukker og polyols, ikke-rengjøringsmiddel sulfobetaines (NDSBs), betaines og deres analoger, organophosphates, dipeptides, aminosyrer og deres derivater og en siste diverse gruppe. Hver osmolyte finnes i flere konsentrasjoner basert på løselighet og effektiv konsentrasjon områder for sammenligning.
Protocol
1. forberedelse av Protein prøve
- Formulere stabilitet skjermene som 500 µL dele i 96-brønnen blokker og forsegle for lagring. Overfør 10 µL av hver tilstand av en stabilitet skjerm til den tilsvarende godt av en 96-brønns plate med en flerkanals pipette tidsbesparende (Figur 4A).
- Forberede 1 mL av en ca 1 mg mL-1 protein løsning i et passende buffer system. Sammensetningen av en passende buffer varierer hvert protein utvalg, er en god første buffer prøve 10 mM natrium fosfat med 100 mM NaCl, pH 7.2.
Merk: Akseptabel protein konsentrasjonene varierer etter sak, men konsentrasjon celleområder 0,5 - 5 mg mL-1 vanligvis produserer analyzable kurver. Fortynne buffere anbefales for bruk med stabilitet skjermene å unngå maskering effekten av hver betingelse. Typisk buffer komposisjoner er ca 10 mM buffer med rundt 100 mM NaCl. - Hvis utfører en TSA eksperiment, kan du legge SYPRO oransje farge til protein prøven til en siste konsentrasjon på 20 x. Bland inversjon eller kort vortexing.
- Overfør 10 µL av protein løsningen til hver brønn av 96-brønns plate i trinn 1.1 (Figur 4B).
- Seal og sentrifuge 96-brønns plate i 2 minutter på 600 x g å sikre prøven og skjermen proteinkomponenter blandes (Figur 4C).
- Tette igjen stabilitet skjermen dypt godt blokk og lagre skjermen på 4 ° C for inntil 4 måneder. Lagre salt skjermen i mørket, som noen komponenter er lysfølsom.
- Hvis utfører en nanoDSF eksperiment, kan du fortsette til trinn 2. Hvis utfører en TSA-eksperimentet, går du til trinn 4.
2. klargjør en nanoDSF eksperiment
- Kontroller at utstyret er ren, særlig vekt støv nær eksempel stativet. Hvis systemet har en backscattering speil, rense den med etanol og en lofri vev.
- Åpne eksempel skuffen ved å trykke knappen Åpne skuff . (Figur 5A).
- Laste inn kapillærene med ca 10 µL fra hver brønn av 96-brønns plate rørende en slutten av av kapillær i løsningen og plassere dem i tilsvarende kapillær innehavere av prøven stativet (figur 5B). Vær forsiktig med å forurense midten av kapillærene med fingeravtrykk, osv., som dette kan forstyrre fluorescens opplesninger hele eksperimentet.
- Nakkens kapillærene med tetting magnetstripen (figur 5C).
3. programmering en nanoDSF eksperiment
- Starte en foreløpig scan for å oppdage posisjon og intensiteten av hver kapillær ved å trykke på knappen Start Discovery skanne i kategorien Discovery skanne øke eller redusere hendelsen eksitasjon styrke fra en innledende effekt på 10% før den toppen av hver kapillær skanning er mellom 4000-12 000 enheter (figur 5D).
- For å sikre prøven brettes og tilstrekkelig konsentrert, anbefales en innledende smelte skanning med en bratt temperaturgradient. I kategorien Smelter skanne programmet en smelte skanne ved å sette Temperaturen Slope -alternativet til 7.0 ° C min-1, Starte temperatur 25 ° c og Slutten temperaturen til 95 ° C, og deretter starte nanoDSF eksperimentere ved å trykke på Starte smelter knappen. Hvis den resulterende smelte kurver viser ikke en synlig vendepunkt, vurdere konsentrere prøven videre eller sjekke hvis protein kastes skikkelig.
- Gjenta 2.1-2,4 å forberede prøvene for en full eksperiment.
- I kategorien Smelter skanne programmet en smelte skanne ved å sette Temperaturen Slope -alternativet til 1,0 ° C min-1, Starte temperatur 25 ° c og Slutten temperaturen til 95 ° C, og deretter starte nanoDSF eksperimenter ved å trykke knappen Start smelter .
4. utføre en TSA eksperiment
- Åpne eksempel skuffen ved fast å trykke innrykk på høyre side av skuffen. Sett skuffen 96-brønnen i RT PCR systemet med godt A1 til tilbake-venstre (Figur 4D).
- Klikk den Nye eksperimentere for å begynne å sette opp en TSA eksperiment.
- I kategorien Eksperimentere egenskaper , klikker du alternativet Smelte kurve spørsmål hva slags eksperimentet vil du definere? og andre spørsmål om som reagenser vil du bruke til å oppdage mål sekvensen?
- I den Plate oppsett / definere mål og prøver kategorien, angi et målnavn så sette Reporter som ROX og avsluttes som ingen.
- I den Plate oppsett / tilordne mål og prøver kategorien, tilordne hver vel i 96-brønnen platen til målnavnet angitt i forrige trinn. I den samme kategorien angir du velger fargestoff bruke som passiv referanse som ingen.
- Slett trinnene inntil det er totalt tre i kategorien Kjøre metoden . Angi det første trinnet til 25.0 ° C, rampen rate 100%, tid 00:05; det andre trinnet 95.0 ° c, rampen rate 1%, tid 01.00; det tredje trinnet 95.0 ° c, rampen rate 100%, tid 00:05. Velge å samle inn data ved hjelp av rullegardinmenyen Samle Data eller ved å trykke på ikonet Datainnsamling (figur 6).
- Angi reaksjon volum Per brønn til 20 µL.
- Trykk på Start Kjør for å starte TSA eksperimentet.
5. analyse
- Velg en bølgelengde å plotte en smelte kurve med. For nanoDSF eksperimenter, forholdet mellom fluorescens intensiteter på 330 nm og 350 nm (tilsvarende tryptofan i forbindelser og polar miljøer, henholdsvis)13 er vanlig. For de fleste TSAs, fargestoff utslipp maksimal er egnet for å smelte kurve plotting (utslipp maksimal SYPRO oransje er 569 nm)12.
- Beregne Tm verdiene for hver tilstand ved å bestemme Bøyning datapunkt hver smelte kurve. De fleste nanoDSF systemer beregne automatisk Tm verdiene av numeriske differensiering av smelte kurver etter datainnsamling. Hvis programvaren brukes ikke automatisk beregner Tm verdier, kan gratis, alternativ GUI-drevet programvare som NAMI11 automatisere dataanalyse og nedstrøms behandling, gir muligheten til å produsere en heatmap oppsummerer Tm verdier for hele 96-brønns eksperimentet (tilhørende referansen gir veiledning og ressurser for databehandling med NAMI).
- Sammenligne Tm verdier for alle forhold kartlagt. Stabilitet skjermene inneholder to brønner i hvert skjermbilde (A1 og A2) som inneholder bare vann. Tar vann-bare verdiene som en målestokk kan beregning av ΔTm verdier, adressering systematiske feil og tillater enkel sammenligning til å stabilisere effekter. Høyere Tm verdiene indikerer termisk stabiliserende som anbefales for nedstrøms bruk. Lovende forhold viser ofte en konsentrasjon avhengighet i deres stabilisering.
Representative Results
Lysozyme var assayed med stabilitet skjermene og Protein X, et mål protein i Virus-X prosjektet, var assayed osmolyte skjermen. Begge proteiner som er vanligvis produsert smelte kurver med klart definerte rødsprit overganger i både TSA og nanoDSF eksperimenter (se medfølgende tall for representant kurver). I noen tilfeller der eksemplene som gjorde ikke produsere interpretable kurver med en definert rødsprit overgang ble tolket som denaturert og ikke inkludert i Tm sammenligninger.
Figur 7 viser prøven resultater fra skjermbildet salt exemplifying egenskapene termisk stabilisere salmiakk mot lysozyme. Konsentrasjon avhengigheter som vist ovenfor er ofte indikativ av lovende, men det kan være nyttig å sammenligne resultatene av økende konsentrasjon med flere forskjellige salter for å se hvis termisk stabilisering vanligvis oppstår fra en økningen i bufferen ioniske styrke eller hvis tilstedeværelse av bestemte ioner gir mer stabilitet.
Sammenligning av Tm verdier av lysozyme pH-skjermen (Figur 8) avslører to deler av informasjon. Først, det er en generell trend med økende stabilitet med minkende pH-verdier. For det andre kan området Tm verdiene får forskjellige buffer systemer med identiske pH-verdier bli betydelige.
Dataene i Figur 8 tyder på at avtalen mellom TSA og nanoDSF i dette eksperimentet er generelt god, men nanoDSF viser en tendens til å identifisere litt høyere Tm verdier og litt større Tm skift enn TSA. Men viser noen brønner med pH-verdier over 8.5 store avvik mellom Tm verdier Hentet fra TSA og nanoDSF. Forskjellene kan potensielt tilskrives rødsprit mekanisme protein på ulike pH-verdier. en hydrophobicity-sensitive fargestoff kan for eksempel gi en forholdsvis lave Tm lese hvis hydrofobe regioner av et protein blitt utsatt for løsemidler betydelig raskere enn miljøet av tryptofan rester endringer i polaritet.
Figur 9 viser en heatmap av Tm verdiene med lysozyme bruke osmolyte skjermen. Forhold med høyeste Tm økning sammenlignet med kontrollen brønnene (wells A1 og A2, som inneholder deionisert vann) er farget mørk blå. Spesielt stabiliserende forhold i figur 9 inkluderer glyserol, 1 M D-sorbitol, 100 mM hypotaurine og 10 mM Ala-Gly (brønner A4-A6, A9, E7 og F8, henholdsvis).
Figur 10 viser en heatmap av Tm verdiene med Protein X. TSA og nanoDSF eksperimenter med Osmolyte skjermen avslører at flertallet av osmolytes testet gi enten en liten økning i Tm (innen 1 ° C) eller virkning på Protein kryss stabilitet. Spesielt synes dipicolinic syre i en konsentrasjon av 10 mM (godt D1) å denature prøven ved romtemperatur. TSA og nanoDSF resultatene identifisere raskt dipicolinic syre som tilsetningsstoff inkompatible Protein x som bør unngås når du arbeider med protein. Likevel, høye konsentrasjoner av D-sorbitol og arabinose (wells A9 og B9, både på 1 M) og glyserol og TMAO (brønner A4-A6 og E1, henholdsvis) ble identifisert som termisk stabilisere.
For lysozyme, ble kombinasjoner av vilkår gir høyeste Tm verdiene fra hver stabilitet skjermen testet for å undersøke en synergistisk kombinert effekt. Figur 11 viser en generell økning i Tm verdier som flere komponenter av buffer (pH, salt og osmolyte). Ved MES, ammoniumsulfat og D-sorbitol, en Tm øke så stort som 10 ° C kan observeres når alle komponentene finnes i forhold til MES alene. Figur 11 viser at en merkbar synergistisk effekt kan oppstå når enkeltkomponenter i en buffer er optimalisert og kombinert med stabilitet skjermene.
På en mer generell note illustrerer Figur 11 også omfanget av ΔTm verdier som kan observeres i TSA og nanoDSF eksperimenter. Omfanget av ΔTm oppnåelig varierer betydelig basert på protein system, men noen ΔTm verdi rundt og over 5 ° C er ofte et tegn på en gunstig stabiliserende effekt.
Figur 1 : Bioprospecting. Prøvetaking fra et ekstremt miljø i Virus-X prosjektet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: TSA skjematisk. Kommentert eksempel på en typisk smelte kurve fra en TSA eksperiment. Denne kurven er karakteristisk for klassiske "to-state" protein utspiller seg, hvor populasjonsutvalg overganger fra brettet til denaturert uten synlig delvis-brettet intermediater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Stabilitet skjermer arbeidsflyten. Standard arbeidsflyten buffer optimalisering benytter stabilitet skjermene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Arbeidsflyt standard TSA eksperimentere med stabilitet skjermene. Fra venstre til høyre: (A) Pipetting dele stabilitet skjermene i en 96-brønns plate. (B) pipettering protein utvalg med fluorescerende fargestoff inn platen. (C) tetting platen før sentrifugering. (D) å plassere platen i en RT PCR-system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: arbeidsflyten for et standard nanoDSF eksperiment. (A) åpning av kapillær lasting rack. (B) lasting kapillærene i stativet. (C) immobilizing kapillærene med tetting magnetstripen. (D) programmering et eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Brukergrensesnitt for RT PCR systemet. En TSA eksperiment har blitt programmert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Salt skjermen eksempeldata. (A) forholdet mellom fluorescens intensiteter på 350 nm vs 330 nm for en etikett uten nanoDSF eksperimentere med lysozyme. Musikkeksempler tilsvarer brønnene C7-C12 av salt skjermen (1,5 M - 0,2 M salmiakk). Beregnede Tm verdiene for hver tilstand er superimposed på tomten. (B) Sammendrag av Tm verdiene beregnes ut fra dataene som vises i figur 7et. (C) fluorescens intensiteter på 590 nm for en TSA eksperiment med en hydrophobicity-sensitive reporter fargestoff lysozyme. Som figur 7ettilsvarer prøvene brønnene C7-C12 av salt skjermen. Beregnet Tm -verdiene er superimposed på grafen. (D) Sammendrag av Tm verdiene beregnes fra dataene i figur 7C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: pH skjermen eksempeldata. Sammendrag av Tm Skift med lysozyme og pH skjermen. Hvert punkt representerer en uavhengig tilstand; punktene er lik pH-verdien er av forskjellige buffer på samme pH. Tm Skift beregnes i forhold til en kontroll Tm 68.0 ° C for TSA eksperimenter og 71.9 ° C i nanoDSF eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Osmolyte skjermen eksempeldata (lysozyme). Sammendrag av Tm verdier Hentet fra en etikett uten nanoDSF eksperimentere med lysozyme og hver brønn på osmolyte skjermen. Tm verdier (i ° C) sammenlignes fordelt A1 og A2 inneholder vann som en kontroll. En heatmap ble generert basert på ΔTm verdier forhold (blå angir en Tm økning og red en Tm nedgang). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Osmolyte skjerm eksempeldata (Protein X). (A) Sammendrag av Tm verdier Hentet fra en etikett uten nanoDSF eksperimentere med Protein X og osmolyte skjermen. Tm verdier sammenlignes brønner A1 og A2 inneholder vann som en kontroll. En heatmap ble generert basert på ΔTm verdier forhold (blå angir en Tm økning og red en Tm nedgang). (B) nanoDSF kurver innhentet fra godt A9 (1 M D-sorbitol, en stabiliserende tilstand) og D1 (10 mM dipicolinic syre, en destabiliserende tilstand). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11 : Buffer optimalisering effekt på Tm. TSA Tm verdiene av lysozyme kombinert med betingelsene for hver skjerm som gis den største økningen i Tm. 100 mM eddiksyre, pH 4.2 og 100 mM MES, pH 5.6, ble valgt som buffer systemene, sammen med 1,5 M ammoniumsulfat som salt. Osmolyte konsentrasjoner var identisk med de som finnes i skjermbildet osmolyte: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50 mM L-lysine og 100 mM hypotaurine. Feilfelt representerer standardavviket for seks gjentak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Molekyl | PDB-kode | Hyppigheten av co crystallisation |
| Fosfat | PO4 | 5132 |
| Acetate | ACT | 4521 |
| 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic Acid (MES) | MES | 1334 |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris) | TRS | 1155 |
| Formiat | FMT | 1072 |
Tabell 1: Sammendrag av buffer molekyl co-krystallisering frekvens i Protein databank (PDB) oppføringer. Data innhentet gjennom PDBsum16 fra totalt 144,868 oppføringer (riktig i 12-5-18).
Tilleggsinformasjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 2. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 3. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Viktige sider i protokollen inkludere sentrifugering trinn og skikkelig tetting av 96-brønns plate for TSA eksperimenter (trinn 1.5). Sentrifugering sikrer at betingelsen protein prøven og skjermen komme i kontakt og bland. I tillegg hvis en utette plate brukes for en TSA eksperimentet, er det en betydelig risiko løsemiddel fordamper hele eksperimentet, forårsaker en økning i prøven konsentrasjon og øke sjansen for tidlig protein aggregering.
TSAs og nanoDSF er mottakelig for et bredt spekter av protein prøver; de aller fleste av prøver kan produsere interpretable smelte kurver med en hydrophobicity-baserte reporter fargestoff eller gjennom dye-ledig nanoDSF. Hvis standard fluorescens kilder ikke er egnet for protein, er den enkleste endringen protokollen som kan utforskes valg av fluorophore. Flere alternative fargestoffer kan være egnet for TSA eksperimenter. Eksempler inkluderer N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), en forbindelse som fluoresces etter reagere med en thiol27, og 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), et stoff som varierer sin fluorescens basert på den stivhet av omgivelsene, øke sin fluorescens som et protein eksempel utfolder seg28,29 (sistnevnte fargestoff krever ofte høye konsentrasjoner av utvalg).
Alternative metoder for smelte curve analyse er tilgjengelige hvis Tm ikke automatisk beregnes av instrumentet. Hvis dataene er homogen og eneste rødsprit trinn er tydelig i smelte kurvene, kan avkortet dataset monteres i en Boltzmann sigmoid med følgende ligning:
Der F er fluorescens intensiteten temperatur T, Fmin og Fmax fluorescens intensiteten før og etter rødsprit overgangen, Tm er henholdsvis midtpunktet temperaturen av rødsprit overgang og C er skråningen på Tm. Denne metoden fungerer bra for enkel totrinns rødsprit prosesser, er det uegnet for komplekse smelte kurver med flere overganger.
En av de store fordelene med TSA er dens tilgjengelighet; TSA eksperimenter kan utføres i ethvert RT PCR-system med filtre på egnet bølgelengder for fluorescens fargestoff ansatt. Dette kombinert med den lave kostnaden for forbruksvarer, betjening og relativt lav mengde protein trengs, gjør TSA en verdifull teknikk for et bredt spekter av prosjektet skalaer, både i industrien og akademia.
Og angir gunstige buffer forhold, inneholder skjermene noen brønner som kan gi hint til tilstedeværelsen av strukturelle metaller i et eksempel protein. Brønner som kan være av spesiell interesse i skjermbildet salt er G6 og G7, som inneholder 5 mM EDTA og 5 mM EGTA, henholdsvis. Betydelig termisk destabilisering i disse brønnene kan være tegn på viktig metall ioner i protein som er sequestered av komplekseringsmidler. Forbindelser i skjermbildet osmolyte kan også potensielt tilby ledetråder til funksjonen av et protein. Mange av forbindelsene i skjermen tilhører klasser av molekyl som er vanlige underlag av enzymer. For eksempel tilskrives generell stabilisering by av saccharides (finnes i brønner A11-B10) for lysozyme deres strukturelle likhet med etablerte underlag av enzym, N-acetylglucosamine oligomers30.
TSA og nanoDSF protokollene skissert ovenfor kan også tilpasses til å studere protein-ligand interaksjoner. Ligander som binder seg spesifikt til et protein kan øke sin termisk stabilitet ved å innføre nye samhandlinger i komplekset. En doseavhengig positiv endring i protein Tm er en lovende tegn på en vellykket protein-ligand interaksjon. Hastighet, gjennomstrømning og lav pris av screening sammensatte biblioteker med TSAs har gjort det en svært populær metode i tidlig stadium medisiner.
Optimaliserer buffer betingelsene målet proteiner og deres ligand komplekser kan være avgjørende for prosjektets suksess, som mange litteratur eksemplene viser31,32,33,34. Med en typisk analysen tar under 2t inkludert oppstillingstid, representerer TSAs og nanoDSF kombinert med stabilitet skjermer en rask, billig teknikk for bufferen optimaliseringer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet har mottatt finansiering fra europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet (grant avtalen n ° 685778). Dette arbeidet ble støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC, gi tall BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB takk til BBSRC doktor trening partnerskap Newcastle-Liverpool-Durham for en studentship og Durham University avdeling av biovitenskap for å bidra mot finansiering dette arbeidet. Vi takker Ian Edwards for hans hjelp og Durham University avdeling av kjemi massespektrometri avdelingen for instrumental analyse av Protein X. Vi er takknemlige for Arnthor Ævarsson for sitt arbeid med Virus-X prosjekt og takk også til Claire Hatty og NanoTemper GmbH for utlån og bistå med Prometheus NT.48 system for dette prosjektet. Til slutt, takk til Frances Gawthrop og Tozer frø for deres støtte som en del av BBSRC iCASE award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
| The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
| SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
| 96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
| Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
| Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |
References
- Kapust, R. B., Waugh, D. S. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expression and Purification. 19 (2), 312-318 (2000).
- Cordingley, M. G., Register, R. B., Callahan, P. L., Garsky, V. M., Colonno, R. J. Cleavage of small peptides in vitro by human rhinovirus 14 3C protease expressed in Escherichia coli. Journal of Virology. 63 (12), 5037-5045 (1989).
- Hjorleifsdottir, S., Aevarsson, A., Hreggvidsson, G. O., Fridjonsson, O. H., Kristjansson, J. K. Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage. Extremophiles. 18 (2), 261-270 (2014).
- Alva, V., Nam, S. Z., Söding, J., Lupas, A. N. The MPI bioinformatics Toolkit as an integrative platform for advanced protein sequence and structure analysis. Nucleic Acids Research. 44, Issue W1 410-415 (2016).
- McPherson, A.
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. IUCr Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 69 (2), 209-214 (2013).
- Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
- Kozak, S., Lercher, L., Karanth, M. N., Meijers, R., Carlomagno, T., Boivin, S. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular NMR. 64 (4), 281-289 (2016).
- Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Razgulyaev, O. I., Uversky, V. N., Gripas', A. F., Gilmanshin, R. I. Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers. 31 (1), 119-128 (1991).
- Grøftehauge, M. K., Hajizadeh, N. R., Swann, M. J., Pohl, E. Protein-ligand interactions investigated by thermal shift assays (TSA) and dual polarization interferometry (DPI). Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 71, 36-44 (2015).
- Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. SYPRO Orange and SYPRO Red Protein Gel Stains: One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detection of Nanogram Levels of Protein. Analytical biochemistry. 239, 223-237 (1996).
- Burstein, E. A., Vedenkina, N. S., Ivkova, M. N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochemistry and Photobiology. 18 (4), 263-279 (1973).
- Haffke, M., Rummel, G., Boivineau, J., Münch, A., Jaakola, V. -P. nanoDSF: label-free thermal unfolding assay of G-protein-coupled receptors for compound screening and buffer composition optimization. Application Note NT-PR-008. , (2016).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparsematrix screening of chemical space. Nature Methods. 12 (9), 859-865 (2015).
- Laskowski, R. A. PDBsum: summaries and analyses of PDB structures. Nucleic Acids Research. 29 (1), 221-222 (2001).
- Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S., Singh, R. M. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
- Good, N. E., Izawa, S.
- Ferguson, W. J., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Analytical biochemistry. 104 (2), 300-310 (1980).
- Welch, W. J., Brown, C. R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell stress & chaperones. 1 (2), 109-115 (1996).
- Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., Goloubinoff, P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. The Journal of biological chemistry. 276 (43), 39586-39591 (2001).
- Yancey, P. H. Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses. Journal of Experimental Biology. 208 (15), 2819-2830 (2005).
- Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 32-47 (2006).
- de Marco, A., Vigh, L., Diamant, S., Goloubinoff, P. Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol- overexpressed molecular chaperones. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 329 (2005).
- Berman, H. M., et al.
- Bougouffa, S., Radovanovic, A., Essack, M., Bajic, V. B. DEOP: A database on osmoprotectants and associated pathways. Database. 2014 (0), 1-13 (2014).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Kung, C. E., Reed, J. K. Fluorescent molecular rotors: a new class of probes for tubulin structure and assembly. Biochemistry. 28 (16), 6678 (1989).
- Iio, T., Itakura, M., Takahashi, S., Sawada, S. 9-(Dicyanovinyl)julolidine binding to bovine brain calmodulin. Journal of biochemistry. 109 (4), 499-502 (1991).
- Veros, C. T., Oldham, N. J. Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (21), 3505-3510 (2007).
- Kean, J., Cleverley, R. M., O'Ryan, L., Ford, R. C., Prince, S. M., Derrick, J. P. Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay. Molecular membrane biology. 25 (8), 653-661 (2008).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallographica Section F. 68 (5), 596-600 (2012).
- Morgan, H. P., Zhong, W., McNae, I. W., Michels, P. A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies. Royal Society open science. 1 (140120), (2014).
- Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid. Scientific reports. 6 (35710), (2016).
