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Immunology and Infection

एक भड़काऊ आंत्र रोग माउस मॉडल में आंत सूजन पर संकेत प्रोटीन समाप्त होने के स्वाद के प्रभाव

Published: November 9, 2018 doi: 10.3791/58668
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1,2
1College of Life Sciences, Zhejiang University, 2Monell Chemical Senses Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम एक dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) माउस मॉडल में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर झोंका संबंधित जीन के nsa के प्रभाव की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

Abstract

भड़काऊ आंत्र रोग (आईबीडी) अल्सरेटिव कोलाइटिस और Crohn रोग, कि दुनिया भर में लाखों लोगों के जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करता है सहित प्रतिरक्षा संबंधी जठरांत्र विकारों में से एक है । आईबीडी लक्षण पेट में दर्द, दस्त, और मलाशय से खून बह रहा है, जो आंत microbiota, खाद्य घटकों, आंत्र उपकला कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत से परिणाम हो सकता शामिल हैं । यह विशेष महत्व का आकलन करने के लिए कैसे प्रत्येक कुंजी जीन आंतों उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में व्यक्त की बृहदांत्र में सूजन को प्रभावित करता है । जी प्रोटीन-युग्मित स्वाद रिसेप्टर्स, सहित जी प्रोटीन उपइकाई α-gustducin और अन्य संकेतन प्रोटीन, आंतों में पाया गया है. यहां, हम एक प्रतिनिधि के रूप में α-gustducin का उपयोग करें और एक dextran सल्फेट सोडियम का वर्णन (DSS)-प्रेरित आईबीडी मॉडल आंत gustatory प्रतिरक्षा और सूजन पर श्लैष्मिक जीन उत्परिवर्तनों के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए । इस विधि रासायनिक प्रेरित आईबीडी मॉडल के साथ जीन नॉकआउट प्रौद्योगिकी को जोड़ती है, और इस प्रकार के लिए gustatory जीन nsa के परिणाम का आकलन के रूप में अच्छी तरह से अंय जीन है कि exuberate या DSS-प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पेट में गीला हो सकता है लागू किया जा सकता है । उत्परिवर्ती चूहों के दौरान एक निश्चित अवधि के लिए DSS के साथ प्रशासित कर रहे हैं, जो उनके शरीर के वजन, मल, और मलाशय से खून बह रहा निगरानी और दर्ज की गई. प्रशासन के दौरान अलग timepoints पर, कुछ चूहों euthanized हैं, तो आकार और उनकी तिल्ली और बृहदांत्र के वजन मापा जाता है और आंत के ऊतकों को एकत्र कर रहे हैं और ऊतकवैज्ञानिक और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए संसाधित. डेटा दिखाने के लिए कि α-gustducin नॉकआउट परिणाम अत्यधिक वजन घटाने, दस्त, आंत्र रक्तस्राव, ऊतक क्षति, और सूजन बनाम जंगली प्रकार चूहों । के बाद से प्रेरित सूजन की गंभीरता माउस उपभेदों, आवास पर्यावरण, और आहार, एक प्रायोगिक प्रयोग में DSS एकाग्रता और प्रशासन की अवधि के अनुकूलन से प्रभावित है विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इन कारकों का समायोजन करके, इस विधि दोनों विरोधी और समर्थक भड़काऊ प्रभाव का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), Crohn की बीमारी (सीडी), और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) के दो प्रमुख रूपों जीर्ण remittent या multifactorial एटियलजि1,2 के साथ आंत के प्रगतिशील भड़काऊ स्थितियों की विशेषता है . आईबीडी के विकास पर निर्भर करता है आनुवंशिक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ पर्यावरणीय कारकों जैसे आहार, एंटीबायोटिक का उपयोग करें, और महत्वपूर्ण बात, रोगजनक संक्रमण । हालांकि, एटियलजि और विनियामक आणविक तंत्र अंतर्निहित आईबीडी अभी भी अस्पष्ट हैं । इसलिए, कई रासायनिक प्रेरित आईबीडी पशु मॉडल का निर्माण किया गया है और रोगजनन और विनियामक तंत्र चित्रित और मानव चिकित्सकीय3की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए लागू होता है ।

स्वाद रिसेप्टर्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) कर रहे हैं और दो प्रमुख प्रकार के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं: प्रकार मैं (T1Rs), और प्रकार द्वितीय (T2Rs) कि मिठाई, उमामी, और कड़वा यौगिकों का पता लगाने. स्वाद संकेतन कैस्केडिंग tastant बाइंडिंग से T1Rs या T2Rs के द्वारा आरंभ किए जाते हैं, जो α-gustducin और एक Gβγ डिमर से मिलकर heterotrimeric G प्रोटीन को सक्रिय करते हैं और Gβγ उपइकाईयों को रिलीज़ करने के लिए अग्रणी होते हैं । बारी में Gβγ moiety बहाव प्रभाव एंजाइम phospholipase सी-β2 (पीएलसी-β2) को उत्तेजित करता है । सक्रिय पीएलसी-β2 तो hydrolyzes phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate दो intracellular माध्यमिक दूतों में [inositol-1, 4, 5-trisphosphate (आईपी3) और diacylglycerol], और आईपी3 बांध और अपने चैनल रिसेप्टर आईपी3 खोलने R3, endoplasmic जालिका से कैल्शियम आयनों जारी. यह अंततः क्षणिक रिसेप्टर संभावित आयन चैनल Trpm5 और gustatory नसों4,5,6,7पर न्यूरोट्रांसमीटर एटीपी के रिलीज के उद्घाटन की ओर जाता है. फिर भी, नमकीन और खट्टे स्वाद के संकेत रास्ते अलग और मिठाई, उमामी, और कड़वा8स्वाद से स्वतंत्र हैं । इसके अलावा, स्वाद GPCRs और बहाव प्रोटीन के घटक विभिंन अतिरिक्त मौखिक ऊतकों में मौजूद हैं । हाल के अध्ययनों से संकेत दिया कि α-gustducin, स्वाद संकेतन के प्रमुख घटक, आंतों की श्लेष्मा झिल्ली में व्यक्त किया जा पाया है । आगे के अध्ययन के लिए अतिरिक्त मौखिक ऊतकों9,10में इन स्वाद संकेत घटक के कार्यों को समझने की जरूरत है ।

विधि यहां वर्णित gustatory संकेत प्रोटीन अतिरिक्त मौखिक ऊतकों में व्यक्त की कार्यों की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है । हम रासायनिक प्रेरित कोलाइटिस मॉडल के साथ स्वाद कलियों में delineating संकेतन झरने के लिए विकसित एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन गठबंधन । मोटे तौर पर मानव अल्सरेटिव कोलाइटिस के लिए अपनी प्रक्रियात्मक सादगी और रोग समानता के कारण, dextran सल्फेट सोडियम (DSS)-प्रेरित आईबीडी मॉडल सबसे व्यापक रूप से विभिन्न रासायनिक प्रेरित कोलाइटिस मॉडल11के बीच किया गया है । इस अध्ययन में, हम α-gustducin की कमी चूहों एक प्रतिनिधि माउस लाइन α के उपंयास कार्य-gustducin आंत श्लैष्मिक प्रतिरक्षा और सूजन में 1 से प्रकट करने के रूप में इस्तेमाल किया) ऊतक और 2 में रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण) की अभिव्यक्ति में मतभेदों को परख साइटोकिंस बृहदांत्र में सूजन से संबंधित है । इस विधि को मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से gustatory संकेतन प्रोटीन के योगदान को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (और अंय प्रोटीन आंत में व्यक्त) ऊतक क्षति और आंत्र सूजन के लिए, जब आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों के जीन के लिए ब्याज उपलब्ध हैं । इस विधि के लाभ उपयोगकर्ताओं को एकीकृत दोनों रासायनिक DSS और ब्याज की जीन की कमी की क्रियाओं से जिसके परिणामस्वरूप डेटा प्राप्त करने के लिए सक्षम हैं । इस विधि को अपनी संवेदनशीलता बढ़ाने और सेलुलर और आणविक स्तर पर सूक्ष्म आंत्र परिवर्तन प्रकट करने के लिए आगे सुधार किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी प्रयोगों चूहों शामिल की समीक्षा की और झेजियांग विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया । यह इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन से पहले उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनने की सलाह दी है ।

1. चूहों और DSS की तैयारी

  1. रख-पीटकर (α-gustducin-/-) चूहों और उम्र-, लिंग-, और शरीर के वजन-मिलाए जंगली-प्रकार नियंत्रण (α-gustducin+/C57BL/6 चूहों व्यक्तिगत रूप से साफ पिंजरों में ।
    नोट: नॉकआउट चूहों पर 20 पीढ़ियों के लिए C57BL/6 चूहों के साथ backcrossed किया गया है और एक लगभग १००% C57BL/
  2. autoclaved पानी के 1 एल में dextran सल्फेट सोडियम (DSS) पाउडर के 30 ग्राम भंग । मिश्रण जब तक समाधान सुनिश्चित करने के लिए स्पष्ट हो जाता है कि अंतिम कार्य एकाग्रता है 3% (डब्ल्यू/
    नोट: DSS समाधान कमरे के तापमान पर 1 सप्ताह तक या 4 डिग्री सेल्सियस से कम उपयोग तक संग्रहित किया जा सकता है ।

2. प्रेरण और चूहों में DSS कोलाइटिस का मूल्यांकन

  1. वजन और प्रत्येक माउस के प्रारंभिक शरीर के वजन रिकॉर्ड । व्यक्तिगत रूप से मानक प्लास्टिक पिंजरों में चूहों प्लेस और पिंजरों लेबल ।
  2. एक कुल 7 दिनों के लिए 3% DSS समाधान के साथ नियमित रूप से पीने का पानी बदलें जिससे चूहों के दोनों समूहों के पास ad libitumपहुंच है ।
  3. माउस के शरीर के वजन को मापने, रिकॉर्ड DSS समाधान की खपत, और इकट्ठा करने और प्रत्येक माउस के मल की जांच दैनिक DSS प्रशासन के दौरान । दस्त और मलाशय रक्तस्राव की गंभीरता का निरीक्षण करें और इस DSS प्रेरित रोग सूचकांक12में परिवर्तित ।
  4. प्रयोग के दौरान, प्रारंभिक वजन और रोग सूचकांक की तुलना में वजन घटाने का प्रतिशत कोलाइटिस के लक्षणों का मूल्यांकन करने के लिए गणना कर रहे हैं ।
    नोट: रोग सूचकांक दस्त और मलाशय रक्तस्राव की टिप्पणियों के संयोजन के द्वारा बनाए गए है और इस प्रकार के रूप में परिभाषित कर रहे हैं: 0 (सामांय मल, कोई रक्त), 1 (नरम मल, नहीं रक्त), 2 (नरम मल, थोड़ा रक्त), 3 (बहुत नरम मल, मामूली रक्तस्राव), और 4 (पानी मल, महत्वपूर्ण रक्तस्राव)12. रोग सूचकांक प्रत्येक माउस के लिए दैनिक विश्लेषण किया है ।
  5. ७ दिवसीय DSS उपचार के अंत तक चूहों को ग्रीवा विस्थापन करके त्याग दें और शेष प्रयोगों के साथ आगे बढ़ें.

3. ऊतक नमूनों की तैयारी

  1. लापरवाह पोजीशन में माउस को लगाएं और ७०% इथेनॉल के साथ पेट की त्वचा को साफ करें । उदर गुहा को बेनकाब करने के लिए छोटे कैंची की एक जोड़ी के साथ पेट में 3 सेमी लंबी midline चीरा बनाओ ।
  2. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए ध्यान से अंय ऊतकों से तिल्ली अलग है, तो तिल्ली हटाने और इसके आकार को मापने ।
  3. पहचानें और संदंश के साथ बृहदांत्र लिफ्ट और इसे आसपास के अन्त्रपेशी से अलग । अंधान्त्र और मलाशय दिखाई दे रहे हैं जब तक पूरे बृहदांत्र बाहर खींचो ।
  4. colonocecal मार्जिन पर यह transecting द्वारा बृहदांत्र को अलग और श्रोणि में गहरी और समीपस्थ बाहर बृहदांत्र, क्रमशः मुक्त करने के लिए । फिर, माप और अलग बृहदांत्र की लंबाई रिकॉर्ड । विदारक प्रक्रिया के दौरान कालोनी के ऊतकों को नुकसान न हो इसके लिए सावधान रहें ।
  5. eluate पूरी तरह से स्पष्ट है जब तक मल और रक्त को दूर करने के लिए एक gavage सुई के साथ सुसज्जित एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ बर्फ ठंडा फॉस्फेट के 10 मिलीलीटर-बफर खारा (पंजाब) के साथ बृहदांत्र फ्लश ।
  6. ऊतकवैज्ञानिक पहचान के लिए, ऊतक के नमूनों को समान रूप से तीन भागों में विभाजित करें: समीपस्थ, मध्य और बाहर । फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ ऊतक को ठीक करें ।
  7. cytokine अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए, तरल नाइट्रोजन के साथ तेजी से पूरे बृहदांत्र फ्रीज और यह दुकान पर-८० ° c उपयोग तक ।

4. DSS-प्रेरित कोलाइटिस की गंभीरता का आकलन ऊतकवैज्ञानिक

  1. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला
    1. निर्धारण के बाद, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में रातोंरात 1x पंजाब में 30% सुक्रोज के नमूनों को cryoprotect के लिए एक समाधान में ऊतक जलमग्न ।
    2. इष्टतम काटने के तापमान (oct) यौगिक में ऊतक एंबेड करें और अक्टूबर सख्त जब तक-20 डिग्री सेल्सियस पर यह जगह है ।
    3. अक्टूबर एक cryostat को ऊतक युक्त ब्लॉक हस्तांतरण, cryostat में 12 µm के लिए मोटाई डायल सेट, और टुकड़ा और 12 µm-मोटी जमे हुए वर्गों को इकट्ठा ।
    4. एक गर्म थाली पर 20 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat से एकत्र ऊतक वर्गों गर्मी ।
    5. आसुत जल में संक्षेप वर्गों धो लो । 5 मिनट के लिए hematoxylin धुंधला समाधान के साथ उंहें दाग और बाद में 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के साथ कुल्ला ।
    6. ०.५% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ वर्गों अंतर-30 एस के लिए इथेनॉल और उंहें 1 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में कुल्ला । फिर, 1 मिनट के लिए 1x पंजाब में धोने प्रदर्शन और बाद में 5 मिनट के लिए नल का पानी चलाने के साथ कुल्ला ।
    7. ७०%, ७५%, ८०%, और ९५% शराब, में 10 एस Counterstain के लिए प्रत्येक के लिए eosin धुंधला समाधान में ऊतक वर्गों के धोने प्रदर्शन 2 मिनट ।
    8. ९५% शराब और 5 मिनट के लिए निरपेक्ष शराब के 2 परिवर्तन के माध्यम से निर्जलीकरण प्रदर्शन हर बार । 5 मिनट के लिए xylene के 2 परिवर्तन में स्पष्ट है ।
    9. स्कोर ऊतक क्षति के समीपस्थ, मध्य, और दोनों जीन नॉकआउट और जंगली प्रकार के समूहों के लिए प्रत्येक माउस के बाहर बृहदांत्र के परिणाम के आधार पर ऊपर एच और ई धुंधलाना ।
      नोट: रोग सूचकांक उपकला क्षति और म्यूकोसा, उपम्यूकोसा, muscularis, और serosa क्षेत्रों है, जो निम्नानुसार परिभाषित किया गया है में सूजन का एक संयुक्त स्कोर है: 0 (कोई ऊतक क्षति और सूजन), 1 (फोकल ऊतक क्षति और सूजन), 2 (patche ऊतक क्षति और सूजन), और 3 (ऊतक नुकसान और सूजन फैलाना)12,13. समीपस्थ, मध्य, और बृहदांत्र के बाहर भागों के लिए माउस प्रति तीन स्कोर तो प्रत्येक जानवर के लिए एक कुल स्कोर प्राप्त करने के लिए अभिव्यक्त कर रहे हैं । इसके बाद प्रत्येक समूह के लिए औसत स्कोर परिकलित किए जाते हैं.
  2. Immunohistochemistry14
    1. एक गर्म थाली पर 20 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat से एकत्र ऊतक वर्गों गर्मी । 1x पंजाब में वर्गों 3 बार धो 10 मिनट के लिए प्रत्येक । अंतर्जात peroxidase को खत्म करने के लिए 10 मिनट के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में ऊतक वर्गों की मशीन । 3 वर्गों को और अधिक बार धो लें । अवरुद्ध बफर के साथ ऊतकों ब्लॉक (3% BSA, ०.३% गैर ईओण डिटर्जेंट, 2% बकरी सीरम, 1x पंजाब में ०.१% सोडियम azide) 1 ज या अधिक के लिए कमरे के तापमान पर ।
    2. ब्लॉकिंग बफ़र को निम्न प्रतिरक्षा कक्ष प्रकार-विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें: ल्यूकोसाइट्स के लिए CD45, CD3 टी कोशिकाओं के लिए, बी कोशिकाओं के लिए B220, CD11b के मैक्रोफेज के लिए, और Ly6G न्यूट्रोफिल के लिए. 4 ° c रात भर में मशीन ।
    3. आकांक्षा द्वारा ऊतक वर्गों से प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें. 3 बार 1x पंजाबियों के साथ वर्गों धो 10 मिनट के लिए प्रत्येक । biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी कमरे के तापमान पर streptavidin-एचआरपी परिसर के साथ गर्मी के बाद के साथ वर्गों की मशीन ।
    4. 3 के साथ वर्गों की मशीन, 3 '-diaminobenziding (ढाब) समाधान एक हल्के या गहरे भूरे रंग का विकास और immunoreactive कोशिकाओं कल्पना ।
    5. hematoxylin और ०.३% (v/v) पतला अमोनिया के साथ वर्गों Counterstain । एक खुर्दबीन के नीचे 10x आवर्धन पर उज्ज्वल क्षेत्र छवियों ले लो ।
    6. 2 मास्क सेट करके उपकला और लेमिना propria (उपकला के नीचे) में चिह्नित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की पहचान और मात्रा को पहचानने के लिए एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम का प्रयोग करें: रंग का पता लगाने सेट करने के लिए कलर-क्यूब-आधारित सुविधा में पहले मास्क का उपयोग करें दहलीज और रंग का ढाब-प्रतिक्रियाशील क्षेत्रों को मापने; जांच अनुभाग में उपकला और लामिना propria के कुल क्षेत्रों का निर्धारण करने के लिए दूसरा मुखौटा का प्रयोग करें । घुसपैठ कोशिकाओं के दाग क्षेत्र की जांच की ऊतक के कुल क्षेत्र के अनुपात के रूप में immunoreactive सेल जनसंख्या व्यक्त करते हैं ।

5. DSS-प्रेरित कोलाइटिस के जीन अभिव्यक्ति मूल्यांकन

  1. DSS से पेट के ऊतकों को पुनः प्राप्त जीन नॉकआउट और जंगली प्रकार के चूहों से एक-८० ° c फ्रीजर से और lysis बफर के ०.६ एमएल के लिए 25 मिलीग्राम ऊतक जोड़ें, तो एक homogenizer में homogenize ।
  2. कुल आरएनए निकालने के लिए आरएनए निष्कर्षण किट के प्रोटोकॉल का पालन करें, और DNase मैं किसी भी दूषित जीनोमिक डीएनए को खत्म करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  3. निकाली आरएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए एक agarose जेल भागो । यदि इसकी 28S आरएनए बैंड 18S बैंड से उज्जवल है, तो यह प्रयोग करने योग्य है । एक microspectrophotometer पर आरएनए एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए आरएनए नमूना के 1 µ एल ले लो.
  4. कुल आरएनए के 1 µ g को २.५ µ l के साथ मिलाकर 20 mMoligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 प्राइमर्स और 1 µ l की Moloney murine ल्यूकेमिया वायरस (MMLV) रिवर्स transcriptase । सीडीएनए तैयार करने के लिए ६० मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  5. TNF के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स qPCR प्राइमरों के ०.५ µ एल के साथ सीडीएनए के 1 µ l को मिलाकर रीयल-टाइम पीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें, IFN-γ, आईएल-5, आईएल-13, आईएल-10, TGF-β1, और β-Actin के अलावा एक नियंत्रण के रूप में 2x फ्लोरोसेंट हरी डाई ।
  6. निंन पैरामीटर के साथ qPCR चलाएं: ९५ ° c 10 मिनट के लिए, ९५ ° c के ४५ चक्र के बाद 10 s, के लिए ५० ° c 25 s, और के लिए ७२ ° c 20 s.
  7. 2-ΔΔCt विधि15का उपयोग करके जीन व्यंजक के सापेक्षिक ठहराव की गणना करें । अपेक्षाकृत नॉकआउट बनाममें जीन अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण जंगली प्रकार चूहों ।

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Representative Results

एक DSS प्रेरित आईबीडी प्रक्रिया एडमिनिस्ट्रेटिंग 3% DSS पीने के पानी में α-gustducin-पीटकर (KO) और जंगली प्रकार (WT) चूहों द्वारा स्थापित किया गया था । WT चूहों की तुलना में, नॉकआउट चूहों अत्यधिक वजन घटाने, दस्त, और आंत्र रक्तस्राव (चित्रा 1) के साथ और अधिक गंभीर कोलाइटिस का प्रदर्शन किया । एक दिन 7 DSS प्रशासन के बाद, ऊतक अखंडता में मतभेद एच एंड ई ऊतकवैज्ञानिक विधि के रूप में धुंधला का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था, और अधिक बढ़ ऊतक क्षति समीपस्थ, मध्य में पाया गया था, और WT चूहों में से नॉकआउट चूहों के बाहर की कालोनियों ( चित्रा 2) । इसके अलावा, अत्यधिक प्रतिरक्षा सक्रियण जैसे मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के रूप में विभिन्न भड़काऊ कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ कोलाइटिस के लिए नेतृत्व किया । Immunohistochemical विश्लेषण प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए मार्करों के एक नंबर का उपयोग कर बाहर किया गया था कि क्या α-gustducin कमी प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ प्रभावित निर्धारित करते हैं । तुलनात्मक विश्लेषण से पता चला है कि ल्यूकोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, और मैक्रोफेज की घुसपैठ को नॉकआउट चूहों में WT कंट्रोल चूहों (चित्रा ३) की तुलना में काफी बढ़ गया था. अंत में, DSS-प्रेरित कोलाइटिस चूहों की कालोनियों में कुछ cytokine अभिव्यक्ति का स्तर जीन विशिष्ट प्राइमरों के साथ qPCR का उपयोग कर निर्धारित किया गया । परिणामों से पता चला कि WT चूहों की तुलना में, नॉकआउट चूहों TNF और IFN-γ के उच्च अभिव्यक्ति का स्तर था लेकिन आईएल-5, आईएल-13, और आईएल-10 के निचले अभिव्यक्ति स्तर; हालांकि, नॉकआउट और WT चूहों (चित्रा 4) के बीच TGF-β1 के एक्सप्रेशन स्तर में कोई अंतर नहीं देखा गया ।

Figure 1
चित्रा 1 : DSS प्रशासन α-gustducin नॉकआउट (KO) में और अधिक गंभीर कोलाइटिस renders । (एक) शरीर के वजन में कमी का प्रतिशत: KO चूहों काफी अधिक शरीर के वजन कम 3 दिन से शुरू प्रदर्शित । (ख) कोलाइटिस रोग सूचकांक दस्त और मलाशय रक्तस्राव की गंभीरता पर आधारित: KO चूहों WT नियंत्रण से काफी अधिक रोग सूचकांक दिखाया । (ग) बृहदांत्र (ऊपरी पैनल) और तिल्ली (निचले पैनलों) प्रतिनिधि WT और KO चूहों से 7 दिनों के बाद DSS प्रशासन: KO चूहों काफी कम बृहदांत्र और बड़ी तिल्ली था । त्रुटि पट्टियां SEM का प्रतिनिधित्व करते है (* p < ०.०५, * * p < ०.००५, * * * p < ०.०००५; पोस्ट हॉक टी-टेस्ट्स के साथ ANOVA) । स्केल बार = 1 सेमी । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : α-gustducin KO चूहों DSS उपचार के बाद अधिक गंभीर ऊतक नुकसान दिखा । (क) WT और α से पेट के ऊतकों के दाग-gustducin KO चूहों DSS (पानी) के साथ इलाज नहीं है या 7 दिनों के लिए DSS (DSS) के साथ इलाज किया । (ख) ऊतक चोट ऊतकवैज्ञानिक WT और KO चूहों से पेट के ऊतकों के दाग के आधार पर 7 दिन DSS प्रशासन के बाद स्कोर । DSS उपचार WT कालोनियों में कुछ ऊतक क्षति प्रेरित है, जो KO नमूना में बहुत बुरा था । त्रुटि पट्टियां SEM (* p < ०.०५) का प्रतिनिधित्व करते हैं । स्केल बार = ५० µm । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : α-gustducin KO चूहों DSS प्रेरित कोलाइटिस में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की वृद्धि की घुसपैठ प्रदर्शित करते हैं । (क) DSS की कालोनियों में बड़े पैमाने पर प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ-इलाज KO चूहों । (ख) प्रतिरक्षा कोशिका संख्याओं का ठहराव: छवि विश्लेषणों के आधार पर मापा ऊतक के कुल क्षेत्र द्वारा विभाजित immunostained क्षेत्रों का प्रतिशत. त्रुटि पट्टियां SEM. स्केल बार = ५० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : α-gustducin KO चूहों DSS-प्रेरित कोलाइटिस में प्रतिरक्षा साइटोकिंस के विभिन्न अभिव्यक्ति स्तर प्रदर्शित करते हैं । DSS उपचार TNF और IFN-γ की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई और आईएल-5, आईएल-13, और आईएल-10 के KO चूहों बृहदांत्र में WT चूहों की तुलना में कम अभिव्यक्ति की । वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । β-actin एक आंतरिक नियंत्रण जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था । त्रुटि पट्टियां SEM (* p < ०.०५, * * p < ०.००५) का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन13से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: प्रयुक्त प्राइमरों की सूची ।

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Discussion

इस विधि quantitively एक DSS प्रेरित आईबीडी माउस मॉडल में सूजन पर विशिष्ट gustatory जीन के उत्परिवर्तन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । पूरा लाभ लेने के लिए, आईबीडी की इष्टतम प्रेरण एक महत्वपूर्ण कदम है । कोलाइटिस के विकास के कई कारकों से प्रभावित है, माउस तनाव, आवास पर्यावरण, आंत्र माइक्रोफ्लोरा, साथ ही साथ ब्याज की जीन भी शामिल है । यह विभिन्न खुराकों और DSS प्रशासन की अवधि का परीक्षण करने के लिए चूहों की एक छोटी संख्या के साथ एक पायलट प्रयोग करने के लिए सिफारिश की है. पायलट प्रयोग के दौरान, वजन घटाने के रूप में सकल लक्षण, दस्त, आंत्र रक्तस्राव, और कुछ सूक्ष्म परिवर्तन जैसे ऊतक क्षति, सूजन प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के साथ जुड़े, और अभिव्यक्ति-साइटोकिंस के स्तर में परिवर्तन होना चाहिए विश्लेषण और नियंत्रण समूहों है कि DSS16,17,18,19के बिना पीने के पानी की तुलना में । प्रेरित कोलाइटिस की गंभीरता DSS-उपचार अवधि के दौरान माउस शरीर के वजन और एकत्र मल के स्कोर में दैनिक परिवर्तन का विश्लेषण करके निगरानी की जा सकती है । DSS उपचार के बाद, ऊतक क्षति के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता एच एंड ई बृहदांत्र के जमे हुए वर्गों पर धुंधला, जबकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं और साइटोकिंस की अभिव्यक्ति के स्तर की घुसपैठ की पहचान की जा सकती है और immunohistochemistry और qPCR का उपयोग quantified । DSS खुराक, प्रशासन की अवधि, और आहार बृहदांत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर gustatory जीन उत्परिवर्तनों के सूक्ष्म प्रभाव प्रकट समायोजित किया जा सकता है । हालांकि, इस विधि की संवेदनशीलता अभी भी कुछ अन्य जीनों के न्यूनतम प्रभाव पर अध्ययन करने के लिए अपने आवेदन को सीमित कर सकते हैं. इस मामले में, कुछ संशोधनों को अपनाया जा सकता है; उदाहरण के लिए, एडमिनिस्ट्रेटिंग एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा व्यक्तिगत विशिष्ट आंत्र माइक्रोफ्लोरा से चर को कम करके ।

DSS-प्रेरित कोलाइटिस मॉडल काफी हद तक अपनी सादगी, तेजी, reproducibility, नियंत्रण, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह मानव अल्सरेटिव कोलाइटिस, जो है के लिए अपनी समानताएं के कारण रासायनिक एजेंट प्रेरित आईबीडी मॉडल के बीच इस्तेमाल किया गया है मानव चिकित्सकीय के प्रभाव का मूल्यांकन करने में उपयोगी2. एक नुकसान शोधकर्ताओं के बारे में पता होना चाहिए कि टी और बी कोशिकाओं कोलाइटिस के विकास के लिए आवश्यक नहीं हैं, जो मानव में रोग के विकास से अलग है । हालांकि, यह तीव्र कोलाइटिस2के विकास में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।

इस अध्ययन में α-gustducin की कमी वाले चूहों का उपयोग करके एक DSS-प्रेरित आईबीडी मॉडल की स्थापना की गई है, जो आंत α प्रतिरक्षा और सूजन में जी प्रोटीन श्लैष्मिक उपइकाई के उपंयास कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परिणाम बताते हैं कि चूहों की कमी α-gustducin अधिक DSS-प्रेरित कोलाइटिस के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और अधिक गंभीर लक्षण, ऊतक नुकसान सहित, अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, और शक्तिशाली साइटोकिंस13की बदल अभिव्यक्ति के साथ कर रहे हैं । हाल के निष्कर्षों के साथ समझौते में स्वाद की भागीदारी का संकेत-प्रकार द्वितीय में chemosensory मार्ग की तरह प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पेट परजीवी20, α-gustducin और अन्य स्वाद संकेतन प्रोटीन आंतों में उपन्यास और महत्वपूर्ण कार्य हो सकता है प्रतिरक्षा संतुलन । हालांकि, सटीक आणविक तंत्र अंतर्निहित इन विषम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लिए खुला रहना होगा ।

इसके अलावा, इस विधि के अंय gustatory जीन है कि बृहदांत्र में व्यक्त कर रहे है के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है (जैसे, क्षणिक रिसेप्टर संभावित आयन चैनल Trpm5, जो मीठे के लिए महत्वपूर्ण है, कड़वा है, और उमामी स्वाद और मानव कालोनी में व्यक्त कक्ष7) । अंत में, एक ही रणनीति आंतों प्रतिरक्षा में प्रमुख प्रोटीन और कारकों के नए कार्यों की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और मदद कुछ मानव रोगों के उपंयास उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१६७१०१६, ३१४७१००८, और ३१६६११४३०३०) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DC010012, DC015819) और Siyuan फाउंडेशन द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody
CD45 BD Biosciences 550539
CD3 BD Biosciences 555273
B220 BD Biosciences 550286
CD11b BD Biosciences 550282
Ly6G BD Biosciences 551459
Reagent
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) MP Biomedicals 2160110
Streptavidin-HRP complex BD Pharmingen 551011
H&E Staining Kit BBI Life Sciences E607318
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) Roche 4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPR Clontech,TaKaRa 639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit  TaKaRa 9767
BD 10 mL Syringe BD Biosciences 309604
Instruments and equipment
balance
scissors 
forceps
centrifuge
qPCR machine
staining jars
Software
Imag-Pro Plus  Media Cybernetics, Inc. 

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १४१ भड़काऊ आंत्र रोग आंत्र बीमारी स्वाद रिसेप्टर्स जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स α-gustducin संकेतन मार्ग dextran सल्फेट सोडियम प्रतिरक्षा सूजन
एक भड़काऊ आंत्र रोग माउस मॉडल में आंत सूजन पर संकेत प्रोटीन समाप्त होने के स्वाद के प्रभाव
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Du, Y. W., Liu, Q., Luo, X. C.,… More

Du, Y. W., Liu, Q., Luo, X. C., Zhao, D. X., Xue, J. B., Feng, P., Margolskee, R. F., Wang, H., Huang, L. Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model. J. Vis. Exp. (141), e58668, doi:10.3791/58668 (2018).

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