Summary
Nous présentons ici un protocole pour étudier l’effet de l’invalidation des gènes reliés à la gustation sur les réponses immunitaires dans un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induit le modèle de souris de maladie inflammatoire de l’intestin.
Abstract
Maladies inflammatoires de l’intestin (MII) est l’un des troubles gastro-intestinaux liées, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, qui affecte la qualité de vie de millions de personnes dans le monde. Les symptômes de l’IBD comprennent des douleurs abdominales, la diarrhée et des saignements rectaux, pouvant résulter de l’interaction entre microbiote intestinal, des composants alimentaires, les cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Il est particulièrement important d’évaluer comment chaque gène clé exprimé dans les cellules épithéliales et immunitaires intestinales affecte l’inflammation du côlon. Les récepteurs de goût couplés aux protéines G, y compris G protéine sous-unité α-gustducin et autres protéines de signalisation, ont été trouvés dans les intestins. Ici, nous utilisons des α-gustducin en tant que représentant et décrire un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induite par le modèle DCI pour évaluer l’effet des mutations du gène gustatif sur immunité mucosale intestinale et l’inflammation. Cette méthode combine la technologie génique knockout avec le modèle DCI induit chimiquement et ainsi peut être appliquée pour évaluer le résultat de l’annulation par le gène gustatif, mais aussi les autres gènes qui peuvent exuberate ou humidifier la réponse immunitaire induite par le DSS dans le côlon. Des souris mutantes sont administrés avec DSS pendant une certaine période au cours de laquelle leur poids corporel, selles et saignements rectaux sont surveillés et enregistrés. À différents intervalles au cours de l’administration, certaines souris sont euthanasiés, puis les dimensions et le poids de leurs spleens et deux-points sont mesurés et les tissus de l’intestin sont collectées et traitées pour histologique et analyses d’expression génique. Les données montrent que les résultats de knockout α-gustducin en perte de poids excessive, diarrhée, hémorragies intestinales, des lésions tissulaires et inflammation vs sauvage souris. Puisque la gravité de l’inflammation induite est affectée par les souches de souris, habitat et l’alimentation, l’optimisation de la durée de concentration et de l’administration DSS dans une expérience pilote est particulièrement importante. En réglant ces facteurs, cette méthode peut être appliquée afin d’évaluer les effets anti - et pro-inflammatoires.
Introduction
Les deux principales formes de la maladie intestinale inflammatoire (MII), maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) sont caractérisés par rémittentes ou progressives inflammatoires chroniques de l’intestin avec étiologie multifactorielle1,2 . Le développement des MICI dépend de la génétiques ainsi que certains facteurs environnementaux comme l’alimentation, l’utilisation des antibiotiques et surtout, les infections pathogènes. Toutefois, l’étiologie et la réglementation mécanismes moléculaires de l’IBD sont encore peu claires. Par conséquent, nombreux modèles animaux induites chimiquement de DCI ont été construits et appliquées pour délimiter la pathogenèse et les mécanismes de régulation et d’évaluer l’efficacité de la thérapeutique humaine3.
Récepteurs gustatifs sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et sont classées dans deux grands types : type I (T1Rs), et type II (T2Rs) qui détectent les composés amers, sucrée et umami. Cascades de signalisation de goût sont initiées par tastant T1Rs ou T2Rs, activant la heterotrimeric G protéines liantes consistant α-gustducin et un dimère Gβγ et conduisant à la libération des sous-unités Gβγ. La portion Gβγ stimule à son tour l’effecteur enzyme phospholipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 activés puis hydrolyse le phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate en deux messagers secondaires intracellulaires [l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) et le diacylglycérol] et IP3 se lie à et ouvrir son canal-récepteur IP3 R3, libérant des ions de calcium du réticulum endoplasmique. Cela conduit finalement à l’ouverture du canal ionique potentiel de récepteur transitoire Trpm5 et la libération de l’ATP de neurotransmetteur sur les nerfs gustatifs4,5,6,7. Pourtant, les voies de signalisation de goût aigre et salé sont différentes et indépendantes du sucré, umami et amertume8. En outre, les composants du goût RCPG et aval protéines existent dans divers tissus extra-orale. Des études récentes ont indiqué que α-gustducin, la principale composante de la signalisation de goût, se trouve à s’exprimer dans la muqueuse intestinale. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les fonctions de ces goût signalisation composants en tissus extra-orale9,10.
La méthode décrite ici est utilisée pour caractériser les fonctions des protéines signalisation gustatives exprimées dans les tissus extra-orale. Nous combinons une lignée de souris transgéniques développée pour délimiter des cascades de signalisation dans les papilles avec le modèle de colite induite chimiquement. En grande partie en raison de sa simplicité procédurale et similitudes pathologiques à la colite ulcéreuse humaine, le dextran sulfate de sodium (DSS)-induite DCI modèle a été utilisé plus largement parmi les divers colite induite chimiquement modèles11. Dans cette étude, nous avons utilisé des α-gustducin-deficient mice comme une lignée de souris représentant pour révéler les nouvelles fonctions des α-gustducin en immunité mucosale intestinale et l’inflammation en 1) analysant les changements morphologiques dans les tissus et 2) analyse les différences dans l’expression de cytokines liées à l’inflammation du côlon. Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement et qualitativement déterminer la contribution des protéines de signalisation gustatifs (et autres protéines exprimées dans le tube digestif) à des lésions tissulaires et de l’inflammation intestinale, quand les lignes pour les gènes de souris génétiquement modifiée intérêt sont disponibles. Avantages de cette méthode permettent aux utilisateurs d’obtenir des données intégrées résultant d’actions de la DSS chimique et la déficience du gène d’intérêt. Cette méthode peut encore être améliorée pour augmenter sa sensibilité et de révéler des changements subtils intestinaux au niveau cellulaire et moléculaire.
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Protocol
Toutes les expériences portant sur des souris ont été examinées et approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation comités de l’Université de Zhejiang. Il est conseillé de porter des équipements de protection individuelle appropriés avant d’effectuer ce protocole.
1. préparation des souris et DSS
- Garder la souris (α-gustducin- / -) et âge, sexe et témoins de type sauvage de même poids de corps (α-gustducin+ / +) souris C57BL/6 individuellement dans des cages propres.
Remarque : Les souris génétiquement déficientes ont été rétrocroisés avec souris C57BL/6 depuis plus de 20 générations et ont un presque 100 % C57BL/6 fond génétique. - Dissoudre 30 g de dextran sulfate de sodium (DSS) en poudre dans 1 L d’eau stérilisés à l’autoclave. Mélanger jusqu'à ce que la solution devienne claire pour s’assurer que la concentration finale de travail est de 3 % (p/v).
Remarque : La solution DSS peut être stockée à température ambiante pendant 1 semaine ou à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. induction et évaluation de colite DSS chez la souris
- Pesez et consignez le poids corporel initial de chaque souris. Placez les souris individuellement dans des cages en plastique standards et étiqueter les cages.
- Remplacez régulièrement l’eau potable par solution DSS 3 % pour un total de 7 jours, à laquelle les deux groupes de souris ont accès ad libitum.
- Mesurer le poids du corps de la souris, enregistrer la consommation de solution DSS et recueillir et examiner les selles de chaque souris tous les jours pendant l’administration de DSS. Observez la gravité de la diarrhée et des saignements rectaux et convertir cette maladie induite par le DSS indice12.
- Pendant l’expérience, le pourcentage de perte de poids par rapport au poids initial et l’index de la maladie sont calculées afin d’évaluer les symptômes de la colite.
NOTE : L’indice de la maladie est obtenu en combinant les observations des diarrhées et des saignements rectaux et sont définis comme suit : 0 (selles normales, pas de sang), 1 (selles molles, pas de sang), 2 (selles molles, peu de sang), 3 (selles très molles, saignement modeste) et 4 (selles liquides, saignements importants)12. L’indice de la maladie est analysée chaque jour pour chaque souris. - La fin du traitement de 7 jours DSS, sacrifier les souris par dislocation cervicale et aller de l’avant avec les autres expériences.
3. préparation des échantillons de tissu
- Placez votre souris en décubitus dorsal et nettoyer la peau de l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Faire une incision de 3 cm de long médiane de l’abdomen avec une paire de petits ciseaux pour exposer la cavité abdominale.
- Utilisez une paire de pinces pour séparer la rate des autres tissus, puis retirez délicatement la rate et mesurer sa taille.
- Identifier et lever le côlon avec une pince et séparer le mésentère environnant. Retirer le côlon entier jusqu'à ce que le caecum et le rectum sont visibles.
- Isoler le côlon en sectionnant il à la marge de colonocecal et profondément dans le bassin pour libérer le côlon proximal et distal, respectivement. Ensuite, mesurer et enregistrer la longueur du côlon isolé. Veillez à ne pas endommager les tissus du côlon au cours de la procédure de dissection.
- Rincer le côlon avec 10 mL de glacee solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une seringue de 10 mL équipée d’une aiguille de gavage pour enlever les excréments et le sang, jusqu'à ce que l’éluat soit complètement claire.
- Pour l’identification histologique, divisent également les échantillons de tissus en trois parties : proximale, moyen et distal. Puis, fixer le tissu avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) durant la nuit à 4 ° C.
- Pour l’analyse de l’expression de cytokines, geler tout le côlon rapidement avec de l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
4. histologique évaluation de la gravité de la colite induite par le DSS
- L’hématoxyline et éosine (H & E) coloration
- Après fixation, plonger le tissu dans une solution de sucrose à 30 % dans du PBS 1 x du jour au lendemain dans un tube de 15 mL à cryoprotect les échantillons.
- Incorporer le tissu dans la température de coupe optimale (OCT) composée et placez-le à-20 ° C jusqu'à ce que l’outil OPO durcisse.
- Transférer le bloc OCT contenant le tissu à un cryostat, régler la molette de l’épaisseur dans le cryostat à 12 µm et tranche et recueillir 12 coupes congelées µm d’épaisseur.
- Faire chauffer les sections de tissus prélevés depuis un cryostat à 65 ° C pendant 20 min sur une plaque chauffante.
- Laver les sections brièvement dans l’eau distillée. Leur coloration à l’hématoxyline coloration solution pendant 5 min et ensuite rincer à l’eau courante pendant 5 min.
- Différencier les sections avec 0,5 % d’acide chlorhydrique-éthanol pendant 30 s et les rincer en course tap eau pendant 1 minute. Ensuite, effectuer le lavage dans du PBS 1 x pendant 1 min et ensuite rincer à l’eau courante pendant 5 min.
- Effectuer lavage des sections tissulaires en alcool 70 %, 75 %, 80 % et 95 %, chacun pour 10 s. contre-colorant dans éosine coloration solution pendant 2 min.
- Déshydratation par 95 % d’alcool et 2 changements d’alcool absolu s’exécuter pendant 5 min chaque fois. Clairement dans les 2 changements de xylène pendant 5 min.
- Marquer des lésions tissulaires du côlon proximal, moyenne et distale de chaque souris le Knock-out du gène et des classes de type sauvage issus des résultats de la ci-dessus coloration H & E.
NOTE : L’indice de la maladie est une note combinée de lésions épithéliales et l’inflammation dans les régions de la muqueuse, sous-muqueuse, musculeuse et la séreuse, qui est définie comme suit : 0 (pas de lésions tissulaires et inflammation), 1 (lésions tissulaires focal et l’inflammation), 2 (en talles des lésions tissulaires et l’inflammation) et 3 (lésions tissulaires diffuses et inflammation)12,13. Trois scores par souris pour les pièces, milieu, proximales et distales du côlon sont ensuite additionnés pour obtenir une note totale pour chaque animal. Les scores moyens pour chaque groupe sont ensuite calculées.
- Immunohistochemistry14
- Faire chauffer les sections de tissus prélevés depuis un cryostat à 65 ° C pendant 20 min sur une plaque chauffante. Laver les sections dans 1 x PBS 3 fois, pendant 10 min chaque. Incuber les coupes de tissus en peroxyde d’hydrogène 3 % pendant 10 min éliminer la peroxydase endogène. Laver les sections 3 fois plus. Bloquer les tissus avec blocage tampon (3 % de BSA, 0,3 % de détergent non ionique, sérum de chèvre de 2 %, 0,1 % d’azide de sodium dans du PBS 1 x) à température ambiante pendant 1 h ou plus.
- Remplacer le tampon de blocage avec une solution contenant les anticorps primaires de suivant des cellules immunitaires spécifiques au type : CD45 pour les leucocytes, CD3 pour les lymphocytes T, B220 pour les lymphocytes B, CD11b pour les macrophages et Ly6G pour les neutrophiles. Incuber une nuit à 4 ° C.
- Retirez les anticorps primaires de coupes de tissus par aspiration. Laver les sections avec 1 x PBS 3 fois, pendant 10 min chaque. Incuber les sections avec l’anticorps secondaire biotinylé suivie d’incubation avec le complexe streptavidine-HRP à température ambiante.
- Incuber les sections 3, 3'-diaminobenziding (DAB) solution pour développer une couleur brun-clair ou foncé et visualiser les cellules immunoréactives.
- Contre-coloration les sections à l’hématoxyline et 0,3 % (v/v) dilué ammoniaque. Prendre des images de champ lumineux à un grossissement de X 10 sous un microscope.
- Utiliser un programme de traitement d’image pour identifier et quantifier la population des cellules immunitaires marquées dans l’épithélium et de la lamina propria (en dessous de l’épithélium) en définissant des 2 masques : utilisez le premier masque la couleur cube-fonction pour régler une détection de couleur seuil et mesurer les surfaces des DAB-réactif colorés ; le second masque permet de déterminer les superficies totales de l’épithélium et propria laminaire dans la section examinée. Exprimer la population de cellules immunoréactives en proportion de la zone de coloration des cellules infiltrés à la superficie totale des tissus examinés.
5. Gene Expression évaluation de colite induite par le DSS
- Récupérer les tissus du côlon du knock-out du gène DSS imprégnées d’insecticide et les souris de type sauvage d’un congélateur à-80 ° C et ajouter 0,6 mL de tampon de lyse à 25 mg de tissu, puis homogénéiser dans un homogénéisateur.
- Suivre le protocole du kit RNA extraction pour extraire l’ARN total et la DNase I est utilisée pour éliminer toute contamination de l’ADN génomique.
- Exécuter un gel d’agarose pour vérifier la qualité de l’ARN extrait. Si sa bande de RNA 28 s est plus brillant que celui de la bande de 18 ans, il est utilisable. Prendre 1 µL de l’échantillon de RNA pour déterminer la concentration d’ARN sur un microspectrophotomètre.
- Mélanger 1 µg d’ARN total avec 2,5 µL de 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 amorces et 1 µL de la leucémie murine Moloney virus (MMLV) de la transcriptase inverse. Incuber à 42 ° C pendant 60 min préparer l’ADNc.
- Mettre en place des réactions de PCR en temps réel en mélangeant 1 µl du cDNA avec 0,5 µL d’amorces de qPCR et inverses pour TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 et β-actine sous forme de contrôle en plus 2 x colorant vert fluorescent.
- Exécutez le qPCR avec les paramètres suivants : 95 ° C pendant 10 min, suivie de 45 cycles de 95 ° C pendant 10 s, 50 ° C pendant 25 s et 72 ° C pendant 20 s.
- Calculer la quantification relative de l’expression génique en utilisant la méthode deΔΔCt 2–15. D’analyser comparativement les niveaux d’expression de gène dans l' élimination directe vs. souris de type sauvage.
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Representative Results
Une procédure IBD induite par le DSS a été créée par administrer 3 % DSS dans l’eau potable à le α-gustducin-knockout (KO) et les souris de type sauvage (WT). Par rapport aux souris WT, les souris génétiquement déficientes exposé plus des colites avec perte de poids excessive, diarrhée et des saignements intestinaux (Figure 1). Après une administration de DSS de 7 jours, les différences dans l’intégrité des tissus ont été analysés en utilisant la coloration H & E comme la méthode histologique, et plus les lésions tissulaires aggravé a été trouvée dans les deux-points, milieu, proximales et distales des souris que chez les souris WT ( Figure 2). En outre, l’activation immunitaire excessive conduit à une colite avec infiltration de cellules inflammatoires divers tels que les macrophages et les neutrophiles. Des analyses immunohistochimiques utilisant un certain nombre de marqueurs pour les cellules immunitaires ont été effectuées pour déterminer si le déficit en α-gustducin infiltration de cellules immunitaires. L’analyse comparative montre que l’infiltration de leucocytes, polynucléaires neutrophiles et les macrophages a notablement augmentée chez les souris génétiquement déficientes par rapport aux souris témoins WT (Figure 3). Enfin, certains niveaux d’expression de cytokines dans les colones de souris de la colite induite par le DSS ont été déterminées à l’aide de qPCR avec des amorces de gène-spécifique. Les résultats ont montré que, comparativement aux souris WT, les souris génétiquement déficientes ont des niveaux plus élevés d’expression du TNF et IFN-γ mais plus bas niveaux d’expression de l’IL-5, IL-13 et IL-10 ; Cependant, aucune différence n’a été observée dans le niveau d’expression de TGF-β1 entre le masquage et la souris WT (Figure 4).
Figure 1 : Administration de DSS rend plus des colites à débouchures de α-gustducin (KO). (A) pourcentage de perte de poids de corps : souris KO affichent beaucoup plus perte de poids corporel à partir de J3. (B) Indice de maladie ulcéreuse selon la gravité de la diarrhée et des saignements rectaux : souris KO a montré les indices de maladie significativement plus élevées que les témoins WT. (C) du côlon (du haut) et la rate (panneaux inférieurs) représentant WT et KO souris 7 jours post-DSS administration : souris KO avaient deux-points significativement plus courts et plus gros rate. Barres d’erreur représentent SEM (* p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005 ; Analyse de la variance avec post-hoc t-tests). Echelle = 1 cm. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Α-gustducin KO souris montrent plus graves lésions tissulaires après traitement DSS. (A) H & E, coloration des tissus du colon chez des souris KO WT et α-gustducin ne pas traités avec DSS (eau) ou traités avec DSS pendant 7 jours (DSS). (B) scores de blessure de tissu issu de coloration histologique des tissus du colon chez des souris WT et KO 7 jours après l’administration de DSS. DSS traitement induit des lésions tissulaires en colones WT, qui a été bien pire dans le spécimen de KO. Barres d’erreur représentent SEM (* p < 0,05). Echelle = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Α-gustducin KO souris affichent une infiltration de cellules immunitaires dans la colite induite par le DSS. (A) l’infiltration Massive de cellules immunitaires dans les colones de souris traitées DSS KO. (B) Quantification du nombre de cellules immunitaires : le pourcentage des superficies d’immunomarquage divisée par la superficie totale du tissu mesurée basée sur l’analyse de l’image. Barres d’erreur représentent SEM. échelle bar = 50 µm. Ce chiffre a été modifié par une précédente publication13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Α-gustducin KO souris affichent des niveaux d’expression différents des cytokines immunitaires dans la colite induite par le DSS. Traitement de la DSS a augmenté l’expression de TNF et IFN-γ et a diminué l’expression d’IL-5, IL-13 et IL-10 dans les colones de souris KO par rapport aux souris WT. RT-PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l’aide d’amorces spécifiques aux gènes. Β-actine a été utilisé comme un gène contrôle interne. Barres d’erreur représentent SEM (* p < 0,05, ** p < 0,005). Ce chiffre a été modifié par une précédente publication13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Liste des amorces utilisées.
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Discussion
Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement déterminer l’effet de mutations des gènes gustatives spécifiques sur l’inflammation dans un modèle murin d’EIA induite par le DSS. Pour tirer pleinement parti, induction optimale des MICI est une étape clé. Le développement de la colite est affecté par plusieurs facteurs, dont la souche de souris, habitat, la microflore intestinale, ainsi que les gènes d’intérêt. Il est recommandé d’effectuer une expérience pilote avec un petit nombre de souris pour tester différents dosages et durées d’administration DSS. Au cours de l’expérience pilote, bruts symptômes tels que perte de poids, diarrhée, saignements intestinaux et certains changements microscopiques tels que les lésions tissulaires, l’inflammation associée à l’infiltration des cellules immunitaires, et des changements de niveau de l’expression des cytokines devraient être analysés et comparés à des groupes de contrôle disposant de l’eau potable sans SSD16,17,18,19. Gravité de la colite induite peut être surveillée en analysant les changements quotidiens dans le poids corporel de souris et les scores des selles recueillies pendant le DSS-traitement. Après le traitement de la DSS, la lésion tissulaire peut être évaluée par H & E coloration sur coupes congelées du côlon, tandis que l’infiltration de cellules immunitaires et les niveaux d’expression des cytokines peuvent être identifiées et quantifiées par immunohistochimie et qPCR. Dosage DSS, durée de l’administration et l’alimentation est réglable pour révéler des effets subtils des mutations du gène gustatif sur la réponse immunitaire du côlon. Cependant, la sensibilité de cette méthode peut-être toujours limiter son application aux études sur les effets d’un minimum de certains autres gènes. Dans ce cas, certaines modifications peuvent être adoptées ; par exemple, en réduisant au minimum les variables de la microflore intestinale individu spécifique en administrant des antibiotiques.
Le modèle de colite induite par le DSS a été utilisé le plus largement parmi les chimique induite par l’agent IBD modèles, en grande partie en raison de sa simplicité, rapidité, reproductibilité, contrôlabilité et surtout ses similarités avec la colite ulcéreuse humaine, qui est utile pour évaluer l’efficacité de la thérapeutique humaine2. Les chercheurs doivent être conscients de l’un des inconvénients sont que T et cellules B ne sont pas nécessaires pour le développement de la colite, qui est différent du développement de la maladie chez les humains. Toutefois, il peut être utile pour étudier le rôle du système immunitaire inné dans le développement de colite aiguë2.
Cette étude a établi un modèle d’EIA induite par le DSS en utilisant la souris α-gustducin-déficientes, qui peuvent être utilisés pour enquêter sur les nouvelles fonctions de la sous-unité α de G protéine en immunité mucosale intestinale et l’inflammation. Les résultats montrent que les souris dépourvues de α-gustducin sont plus sensibles à la colite induite par le DSS et sont accompagnés par des symptômes plus graves, y compris les lésions tissulaires, des réactions inflammatoires excessives et une expression altérée de cytokines puissant13. En accord avec les récentes découvertes indiquant l’implication des voies chemosensoriels goût semblable au type II des réponses immunitaires à l’intestin de parasites20, α-gustducin et autres saveurs signalisation protéines peuvent avoir de roman et importantes fonctions dans l’intestin équilibre immunitaire. Cependant, les mécanismes moléculaires exactes ces réponses immunitaires asymétriques restent à être découvertes.
En outre, cette méthode peut être appliquée pour étudier les effets d’autres gènes gustatives qui sont exprimées dans le côlon (p. ex., le récepteur transitoire potentiels canal ionique Trpm5, qui est crucial aux goûts sucré, amer et umami et exprimé sous forme de l’homme du côlon cellules7). Enfin, la même stratégie permet de découvrir les nouvelles fonctions des protéines clés et facteurs dans l’immunité intestinale et aider à évaluer l’efficacité des nouveaux traitements de certaines maladies humaines.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation de Sciences naturelles nationales de la Chine (81671016, 31471008 et 31661143030) et le National Institutes of Health (DC010012, DC015819) et par la Fondation d’éléments.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
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