Summary
Denne trinvise protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af eksperimentel opsætning og dataanalyse til vurdering af inflammatoriske respons i hiPSC-ECs og analyse af leukocyt adhæsion under fysiologiske flow.
Abstract
Endotelceller (ECs) er essentielle for reguleringen af inflammatoriske respons af enten begrænse eller lette leukocyt rekruttering i berørte væv via en vel karakteriseret kaskade af Pro selvklæbende receptorer, som er upregulated på den leukocyt celleoverfladen på den provokerende trigger. Inflammatoriske respons varierer mellem enkeltpersoner i befolkningen og den genetiske baggrund kan bidrage til disse forskelle. Menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) har vist at være en pålidelig kilde til ECs (hiPSC-ECs), der således repræsenterer en ubegrænset kilde til celler, der fange genetiske identitet og eventuelle genetiske varianter eller mutationer af donor. hiPSC-ECs kan derfor bruges til modellering af inflammatoriske respons i donor-specifikke celler. Inflammatoriske respons kan modelleres ved at bestemme leukocyt adhæsion til hiPSC-ECs under fysiologiske flow. Denne trinvise protokol indeholder en detaljeret beskrivelse af eksperimentel opsætning og dataanalyse til vurdering af inflammatoriske respons i hiPSC-ECs og analyse af leukocyt adhæsion under fysiologiske flow.
Introduction
Inflammation spiller en central rolle i mange patologiske tilstande, herunder hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme, sepsis og bivirkninger svar (ADR). Endotelceller (ECs) spiller en vigtig rolle i reguleringen af inflammatoriske respons via induktion af Pro selvklæbende receptorer, som E-selectin, intercellulære vedhæftning molekyle-1 (ICAM-1) og vaskulære celle vedhæftning molekyle-1 (VCAM-1) på deres overflade 1 , 2. mikrovaskulære ECs i forskellige væv er kendt for at udstille heterogenitet i inflammatoriske respons3,4. Derudover kunne genetiske baggrund eller visse genetiske sygdomme medføre forskelle i inflammatoriske respons mellem enkeltpersoner; Det er derfor vigtigt at have adgang til ECs fra forskellige individer. For nylig, menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs)5, der kan udledes fra stort set enhver enkeltperson, viste sig at fungere som en pålidelig og vedvarende kilde til ECs6,7,8, 9. derfor, vurdering af inflammatoriske respons og leukocyt ansættelse i hiPSC-ECs er værdifuld, ikke kun for modellering af visse genetiske sygdomme, men også at give indikationer af indbyrdes individuelle variation og bruge som et redskab til personlig medicin i fremtiden.
Flow assays være et nyttigt redskab til at studere endotel-leukocyt interaktion. Fremskridt i mikrofluid enheder aktiverer reproduktion af fysiologiske væskestrøm betingelser med præcis styring af vaskulære bed-specifikke shear stress niveauer. Live imaging giver mulighed for overvågning af kaskade af begivenheder i leukocyt opsamling, rullende, kravle, vedhæftning og transmigration. Flere flow assays til at studere endotel-leukocyt interaktion er blevet udviklet, men de alle udnytte primære ECs10,11,12,13. Her vil vi beskrive detaljeret analyse til vurdering af human leukocyt adhæsion til hiPSC-ECs under fysiologiske flow. I denne procedure beskriver vi optimeret betingelserne for hiPSC-EF stimulation med pro-inflammatoriske stimuli, såsom tumor nekrose faktor alfa (TNFα), dissociation, såning i en mikrofluid chip med otte parallelle kanaler. Vi beskriver en trinvis protokol for perfusion af hiPSC-ECs med suspension af fluorescently mærket leukocytter i mikrofluid chips, live celle imaging og automatiseret optælling af vedhængende leukocytter.
Denne protokol er nyttige for vurderingen af inflammatoriske respons i hiPSC-ECs i stof screening, sygdom modellering og personlig regenerativ medicin.
Protocol
1. forberedelse af løsninger og reagenser
- Forbered Komplet menneskelige Endothelial-SFM medium (EF-SFM fuld) ved at tilføje trombocyt-fattige plasmaafledte serum (1%), basic fibroblast vækstfaktor (bFGF, 20 ng/mL) og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF, 50 ng/mL) til menneskelige Endothelial-SFM (Se tabel af Materialer). Filtrer medium gennem et 0,22 µm pore filter og gemme det ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Udarbejde komplette RPMI medie ved at tilføje føtal bovint serum (10%), 2-mercaptoethanol (0,05 nM), L-glutamin (1%), Penicillin-Streptomycin (25 U/mL) til RPMI medium (Se Tabel af materialer). Opbevares ved 4 ° C i op til 3 uger.
2. belægning af mikrofluid Chips
- Placer en steril biochip til en steril petriskål 10 cm.
- Forberede fibronektin brugsopløsning af erstatningsgodtgørelse stamopløsning i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden Ca2 +/Mg2 + til en endelig koncentration på 50 µg/mL. Anslå 80 µL af brugsopløsning pr. biochip.
- Injicér 10 µL af fibronektin brugsopløsning til hver kanal af biochip. Bruge en pipette med små 10 µL tips og sørg for at danne en stram kontakt mellem kanal indløb og pipette tip (figur 1 c, venstre).
- Luk låget af petriskålen indeholdende biochip og placere det i en fugtig kammer (figur 2B). Gemme kammer ved 4 ° C natten over. At befugte salen, placere en ren silkepapir på befugtet kammerets bund og tilsættes 5 mL sterilt H2O.
- Næste dag, før analysen, varm pre biochip ved 37 ° C i inkubatoren.
3. forberedelse af hiPSC-ECs
Bemærk: I protokollen beskrevet her, var hiPSC-ECs opdelte, renses, befrugtede og optøet som tidligere beskrevet8.
- Tøvejr og plade hiPSC-ECs i fuldstændig EF-SFM fuld i en 0,1% gelatine-belagt T75 kolbe, tre til fire dage før analysen.
- Natten før analysen, stimulere hiPSC-ECs med TNFα ved at tilføje EF-SFM fuld suppleret med 10 ng/mL TNFα og inkuberes ved 37 ° C, som tidligere beskrevet 7overnatning (~ 12 h).
4. hiPSC-ECs Dissociation og forhåndsudfyldning i mikrofluid Chip
- På dagen for analysen, tage kolbe af hiPSC-ECs fra rugemaskinen og undersøge celler under mikroskop. Sikre, at hiPSC-ECs er 80 – 100% sammenflydende og har en typisk EF-lignende morfologi.
- Overføre kolben til celle kultur hætte.
- Opsug medium fra kolbe af hiPSC-ECs.
- Kort vaske cellekultur ved tilsætning af 10 mL PBS uden Ca2 +/Mg2 +. Opsug PBS.
- Der tilsættes 4 mL pr. kolbe af 1 x dissociation enzym. Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur (RT) (figur 1B).
- Dissociation reaktionen standses ved at tilføje 8 mL af Human Endothelial-SFM medium pr. flaske. Forsigtigt løsne og indsamle hiPSC-ECs suspension i en 15 mL konisk slange ved hjælp af 5 mL pipette.
- Tæl antallet af celler i suspension.
- Centrifugeres celler ved 300 x g i 3 min på RT.
- Opsug supernatanten og celle resuspenderes i EF-SFM fuld til en endelig koncentration på 1,5 x 107 celler/mL.
- Tegne en petriskål med biochip fra rugemaskinen og overføre det til celle kultur hætte.
- Opsug fibronektin løsning fra alle kanaler i mikrofluid chip.
- Injicér 6 µL af cellesuspension til hver kanal ved hjælp af en pipette med en lille 10 µL spids (figur 1 c, midten). Sørg for, at cellesuspension er blandet godt før injektion og undgå celle nedbør.
- Undersøge biochip under mikroskop og sikre, at cellerne er jævnt fordelt, og celle tæthed er høj (figur 2 c).
- Inkuber biochip i 15 min. ved 37 ° C.
- Tilføje 40 µL af EF-SFM fuld i medium reservoirerne fra begge sider af hver kanal.
- Inkuber biochip i 1 timer ved 37 ° C (figur 1 c, højre).
- Tilføje en anden 50 µL af EF-SFM fuld i reservoirerne fra begge sider af hver kanal.
5. forberedelse af menneskelige leukocytter
Bemærk: I protokollen beskrevet her, blev der brugt en kommercielt tilgængelig monocytic cellelinje (THP-1). Alternativt, perifert blod mononukleære celler eller neutrofiler kan bruges. Isolering af perifert blod monocytter og neutrofile kan udføres ved hjælp af standardproceduren11. Udføre alle trin, der beskrives i dette afsnit i en celle kultur hætte.
- Indsamle leukocytter i en 50 mL konisk slange.
- Vask leukocytter med 10 mL PBS uden Ca2 +/Mg2 +. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 3 min på RT (fig. 1 d).
- Opsug supernatanten og celle resuspenderes i 1 mL PBS med DiOC6 farvestof (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Inkuber celler i mørke i 10 min på RT.
- Vask leukocytter med 10 mL PBS uden Ca2 +/Mg2 +. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 3 min på RT. Gentag trinnet vask en gang mere.
- Tæl antallet af celler i suspension.
- Opsug supernatanten og resuspenderes celle i komplet RPMI medium til en endelig koncentration på 2,5 x 106 celler/mL.
6. forberedelse af mikrofluid pumpe
- Samle mikrofluid pumpen med 8-kanals manifold.
- Tilslutte pumpen til en PC med de installerede driver software.
- Start mikrofluid software og indlæse protokollen ved at klikke på Open Protocol og navigere på pc'en til at vælge mikrofluid-protokollen.
- Tilslut softwaren og pumpen ved at vælge Setup mappen og klikke på Kør Assay trin.
- Definerer geometrien af kanaler for korrekte flow sats kontrol: Vælg Opdater geometri i Geometri Setup mappen og klik på Kør Assay trin.
Bemærk: Sørg for, at geometri detaljer svarer sprøjte og kanaler anvendes (geometri ID = 1, antallet af kanaler = 8, kanal bredde = 800.0 µm, kanal dybde = 120,0 µm, sprøjte volumen = 250 µL) og viskositet af prøven (flydende viskositet = 1,0). - Vaske pumpen ved at placere inlet kabel (orange) i 50 mL konisk røret indeholder 80% ethanol. Placer outlet kabel (grøn) i 50 mL konisk tomme rør (spildbakken).
- Vælg mappen Udvaskning/pumpe udvaskning og klik på Kør Assay trin (vaske volumen = 2000 µL, vask volumen trin = 250 µL, udvaskning retning = Output). Gentag trinnet vask en gang mere.
- Gentag pumpen vaske trin (trin 6.6-6.7) med celle kultur klasse vand og menneskelige Endothelial-SFM næringssubstratet.
- Fortsætte med at vaske trin mangfoldighedens.
- Manuelt åbne ventilen mellem sprøjten og Mangfoldighedens ved at placere 3-vejs-adapter i den korrekte position (indikator OFF er aktiveret til venstre).
- Vælg Sæt aktuelle kanal/Open trin i mappen Udvaskning/Manifold vask og klik på Kør Assay trin for at åbne alle ventiler mangfoldighedens.
- Vaske manifolden manuelt ved at skubbe 5 mL 80% ethanol fra sprøjten, efterfulgt af 5 mL celle kultur grade vand.
- Vaske manifolden ved at skubbe 5 mL af Human Endothelial-SFM næringssubstratet fra sprøjten.
- Fjern alle store luftbobler, der er fanget i manifolden. For at gøre dette, placere 8-godt pin adapteren til 10 cm petriskål med mellemlang og udføre skubbe/trække med sprøjten, indtil alle store luftboblerne er væk (små bobler er ikke et problem).
- Vælg Sæt aktuelle kanal/lukke trin i mappen Udvaskning/Manifold vask og klik på Kør Assay skridt for at lukke alle ventiler mangfoldighedens.
- Tilslut grønne outlet kabel fra pumpen til de mangfoldige adapter.
- Skifte 3-vejs ventilen tilbage til positionen OFF at lukke sprøjten.
- Vælg Nedtonet/kabel udvaskning mappe og klik på Kør Assay trin til at vaske hver port med RPMI medium individuelt, at sikre, at alle bobler er fjernet fra hvert kabel (dispensere volumen = 100 µL).
Bemærk: Hver ventil mangfoldighedens er åbnet én efter én, 1 til 8, og 100 μL af mediet er udleveret gennem hver enkelt kanal, mens at holde de andre kanaler lukket. Sørg for, at væsken løber fra hver pin. Hvis der er nogen væske kommer ud, er det en indikation af en luftboble eller en træsko.
7. fremstilling af mikrofluid-Chip for Live Imaging
- Sikre at mikrofluid opsætninger er klar, og live imaging salen er pre afbalancerede til 37 ° C og niveauet af CO2 når 5% (figur 3A, B).
- Tage biochip fra rugemaskinen, og Placer den i mikroskop chip indehaveren. Mount indehaveren chip på mikroskopet imaging fase (figur 3 c).
- For at forbinde biochip til pumpen via manifolden, placere den 8-pin adapter tæt på outlet reservoirer chip og uddybe alle pins på mellemlang (men Tilslut ikke helt).
- Vælg udvaskning | Oprette forbindelse til Chip mappen og klik Køre analysen skridt at give afkald på RPMI medium før der forbindes chippen (dispensere volumen = 30 mL). Når mediet er udleveret, indsætte 8-pin adapter til stikkontakt i biochip.
Bemærk: Under dette trin alle kanaler er indstillet til på (åben) og 30 µL af mediet er udleveret gennem hver kanal og herefter kanalerne er indstillet til Off (lukket). Dette sikrer, at ingen luft bobler vil blive indført i kanaler mikrofluid chip. - Manuelt Aspirér medium fra alle inlet reservoirer for biochip med en pipette.
- Vælg udvaskning | Chip udvaskning mappen og klik Kør Assay skridt til perfuse 40 mL af EF-SFM fuld medium gennem hver af kanalerne en ad gangen for at slippe af døde celler/resterne fra kanalen (udvaskning volumen = 40 µL, maksimalt udvaskning shear = 40 Dynerne/cm2).
8. flow vedhæftning Assay og billed tilegnelse
- Manuelt Aspirér medium fra fjorden reservoir af kanal af interesse med en pipette.
- Tilføje 100 µL af leukocytter fra trin 5.6 til indløb reservoir af kanal af interesse.
Bemærk: Forsigtigt blandes celler for at gøre en enkelt celle suspension. - I celle Assay | Trin beskrivelse mappe, Vælg Sæt aktuelle kanal/trin beskrivelse og, i listen over kanaler, Vælg kun den aktuelle kanal af interesse og indstillet til On (åben) og indstille alle andre syv kanaler til Off (lukket).
- Vælg celle Assay | Trin beskrivelse mappen og klik Kør Assay trin.
Bemærk: Sørg for, at Variable Flow sats udlevering gælder konstant undertryk at trække leukocyt suspension fra fjorden reservoir gennem kanalen for 5 min (Shear sæt = konstant, Shear stress = -0,5 dyne/cm2, varighed = 00:05:00, Skan forsinkelse = 00:00:00). Den negative værdi af shear stress sikrer den korrekte retning af strømmen. - Opsug de resterende leukocytter fra fjorden reservoir.
- Tilføje 100 µL af komplet RPMI medium til indløb reservoir. Vælg celle Assay/trin beskrivelse mappe og klik på Kør Assay skridt for at perfuse kanalen for 5 min med RPMI medium for at udviske alle ikke-tilhænger leukocytter (Shear sæt = konstant, Shear stress = -0,5 dyne/cm2, varighed = 00: 05:00, scanning forsinkelse = 00:00:00).
- Erhverve billeder fra mindst tre til fire forskellige positioner af kanal til at afbilde de overholdt leukocytter (for at sikre, at repræsentative områder er fanget).
- Gentag trin 8,1-8,7 for funktionel vurdering af alle øvrige kanaler.
Bemærk: Det er muligt at køre flere kanaler på én gang. For at gøre det, skal du åbne alle kanaler af interesse under trin 8.3. og udføre alle ovennævnte trin 8,4 –8.7 for flere kanaler af interesse.
9. at færdiggøre analysen og rengøring mikrofluid pumpe
- Efter endt eksperimentet, eksportere og gemme alle billeder i RAW-format.
- Samtidig spare resultaterne, køre mikrofluid pumpe og manifold rengøring protokol.
- For mikrofluid pumpe, først køre mappen Udvaskning/pumpe udvaskning af perfusing 4 mL af celle kultur grade vand, efterfulgt af 4 mL 80% ethanol som beskrevet i trin 6.6-6.7 tør pumpen ved at køre luft i flere minutter.
- For at rense manifolden, køre Udvaskning/Manifold Wash skridt med sprøjten. Følg trinene for at åbne sprøjten og de mangfoldige ventiler som beskrevet i trin 6.10-6.11 vask først med 80% ethanol og næste med celle kultur grade vand. Tør manifolden ved at skubbe luft via sprøjten. Luk sprøjte valve og de mangfoldige ventiler, som beskrevet i trin 6.10 og 6.15.
10. optælling af vedhængende leukocytter
- Hent og Installer den billedbehandling software14 fra http://cellprofiler.org.
Bemærk: Billedbehandling i denne undersøgelse blev udført ved hjælp af software version 2.1.1. Hvis du bruger en nyere version, kan rørledningen kræve mindre tilpasning. - Download pipeline Count_leukocytes.cpipe. Klik på fil | Import | Rørledningen fra filen og navigere på PC til vælger rørledningen Count_leukocytes.cpipe.
- Træk-og-slip en mappe med erhvervede RAW billeder af vedhængende leukocytter til vinduet fil liste i modulerne Input | Billeder sektion for analyse.
- Angiv den typiske størrelse af leukocytter via analyse moduler | IdentifyPrimaryObjects. Angiv den minimale og maksimale diameter af vedhængende leukocytter i pixels.
- Vælg filterkriterierne via analyse moduler | FilterObjects. Angive den minimalt accepterede område af objekter i pixels.
- Starte analysen ved at trykke på knappen analysere billeder .
Bemærk: Alle de rå billeder vil blive behandlet, og resultatet vil blive gemt i en standard outputmappe. Filen Image.txt indeholder antallet af vedhængende leukocytter i hver forarbejdede billedet (hvert tal svarer til ét billede, dvs. hver erhvervede synsfelt).
Representative Results
For det første beskrevet svar på hiPSC-ECs stimulation med pro-inflammatoriske agent TNFα bør undersøges, som tidligere7. TNFα behandling for 12t udløser opregulering af E-selectin med peak på 6 h efter behandlingen påbegyndes. Derudover er ICAM-1 upregulated 6-12 h efter behandling. Selv om vi ikke har overholdt den forventede opregulering af VCAM-1, er det typisk observeret i primære menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs). Vi fandt natten over (12 h) TNFα behandling skal være den mest bekvemme for leukocyt adhæsion assay.
Optimal hiPSC-ECs dissociation bør resultere i en enkelt celle suspension gratis celle klumper. Figur 2 c illustrerer den optimale hiPSC-EF tæthed lige efter injektion. Typisk 15 min efter injektion, hiPSC-ECs tillægger bunden af kanalen og begynde at sprede (figur 2D). 1 h efter injektion, hiPSC-ECs danner et godt spredt éncellelag langs kanalen og vil være klar til at starte flow analyse (figur 2E).
Mærkning af leukocytter med fluorescerende tracer er gavnlige for fase kontrast billeder i automatiseret billede kvantificering, da det gør celle identifikation trin lettere, især fordi leukocytter overholder éncellelag af ECs og det er ofte svært for software at skelne forskellige celletyper.
Gratis open source billedbehandling software er meget nyttig for automatiseret kvantificering af vedhængende leukocytter. Rørledningen beskrevet i protokol her er baseret på primære objekt identifikation ved hjælp af adaptive tærskel af fluorescerende billeder af leukocytter (figur 4A). Filtrering af identificerede objekter baseret på en minimal området Desuden filtrerer fejlagtigt identificerede objekter, såsom celle debris, autofluorescence eller nogen andre uspecifikke fluorescerende signal (figur 4 C, D).
En mikrofluid chip med otte parallelle kanaler giver mulighed for sammenligning af to uafhængige grupper, eksempelvis ECs differentieret fra uafhængige hiPSCs, som raske donorer eller patienter med genetiske sygdomme. Yderligere kontrol, som ubehandlet ECs eller forbehandling med en ICAM-1 blokering antistof kan medtages som godt10,11. To til tre mikrofluid chips kan behandles på et tidspunkt. Robusthed i konklusionerne anbefales et minimum af tre uafhængige biologiske eksperimenter udført på uafhængige dage.
Figur 1 : Udarbejdelse af hiPSC-ECs og leukocytter for flow assay. (A) forbehandling af hiPSC-ECs med det pro-inflammatoriske stimulus (TNFα). (B) skematisk fremstilling af hiPSC-ECs enzymatisk dissociation, centrifugering og resuspension. (C) skematisk gengivelse af belægning af kanaler (C, venstre), injektion af hiPSC-EF suspension (C, midten) og celle næringssubstratet tilsætning efter hiPSC-ECs vedhæftet fil i mikrofluid chippen. (D) skematisk gengivelse af trinnet leukocyt vask, mærkning med fluorescerende farvestof DiOC6 og resuspension. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mikrofluid chip med hiPSC-ECs. (A) mikrofluid chip i en 10 cm petriskål. (B) det befugtet kammeret brugt til inkubation. (C, D, E) Repræsentative billeder af hiPSC-ECs i mikrofluid kanal 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) efter injektion. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksperimentel opsætning af den levende celle imaging og leukocyt perfusion assay. (A, B) Foto (A) og skematisk repræsentation (B) af den levende celle imaging og flow assay eksperimentel opsætning: (1) - inverteret fluorescerende mikroskop med monteret live imaging kammer (5% CO2, 37 ° C, fugtet), (2) - mikrofluid pumpe, (3) - 8-kanal manifold, (4) - PC til mikroskop kontrol og image erhvervelse, (5) - PC for mikrofluid pumpe kontrol. (C) mikrofluid chip med indsatte slangen af 8-kanals manifold fast i en plade holder og monteret i den motoriserede stadium af mikroskopet. (D) skematisk fremstilling af de vigtigste trin i flow-analysen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Image analyse og automatiseret påvisning af vedhængende leukocytter. (A) dialog rude af billedbehandling software med angivne indstillinger til identifikation af leukocytter. (B) dialog rude af billedbehandlingsprogram med angivne filtrering kriterier identificerede objekter baseret på minimalt accepteret areal (SAmin = 70 px). (C) eksempel på korrekt identifikation af leukocytter og filtrering af ikke-specifikke objekter af den lille areal (SA) (typisk diameter i pixel (Min, Max) = (9, 15); Filtrering kriterier SAmin = 70 px). Accepterede objekter er afbildet i grøn og kasserede objekter er afbildet i violet. (D) eksempel på forkert identifikation af leukocytter på grund af den forkerte række typiske diameter (typisk diameter i pixel (Min, Max) = (3, 15); Filtrering kriterier SAmin = 70 px). Accepterede objekter er afbildet i grøn og kasserede objekter er afbildet i violet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver karakterisering af hiPSC-EF behandling med pro-inflammatoriske stimuli, såsom TNFα, funktionel vurdering af leukocyt adhæsion til hiPSC-ECs i flow analyse ved hjælp af live imaging og automatiseret optælling af vedhængende leukocytter.
Overnight stimulation af hiPSC-ECs med TNFα resulterer i det aflange udseende, der typisk angiver en aktiveret pro-inflammatoriske fænotype i ECs. Stadiet optimering udtryk niveauer af E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 skal verificeres ved FACs7,8, og primære menneskelige umbilical vene ECs (HUVECs) er tilrådeligt at være medtaget som positive kontroller.
Optimal hiPSC-ECs dissociation og såning tæthed skal nås for at opnå en sammenflydende éncellelag uden at danne celle klumper og kanal træsko. Det er afgørende at genopslæmmes leukocytter lige før perfusion for at undgå celle nedbør og opretholde en konstant koncentration når boltpistoler hver kanal. Humant perifert blod leukocytter, monocytter og neutrofile kan bruges, eller etableret monocytic cellelinjer, såsom THP-1 eller HL-60 kan bruges som et alternativ.
Under montagen af opsætningen af mikrofluid og under flow-analysen er det afgørende at undgå luftbobler fra at blive fanget i mikrofluid rør og kanaler, som de kan resultere i detachement af hiPSC-ECs og/eller vedhængende leukocytter. Væske til væske grænseflade eller indarbejdelse af ekstra vask trin under udarbejdelsen af opsætningen af mikrofluid kunne bidrage til at undgå luftbobler.
Det er tilrådeligt, at protokollen er drevet af to operatører hvor man forbereder cellerne og for det andet forbereder mikrofluid system og flow assay. Dette sikrer, at ECs er forgyldt mikrofluid chips inden for en konstant tidsvindue inden forarbejdning og forbedrer nøjagtigheden og reproducerbarhed af resultaterne. Desuden giver dette også opsætning af blindet forsøg at undgå bias i resultaterne.
For vellykket celle opdagelse hos den automatiserede billedbehandling pipeline, er det vigtigt at erhverve billeder i fokus med en høj signal-støj-forhold og for at undgå autofluorescence af ikke-specifikke objekter, såsom celle klumper. Er minimal og maksimal grænserne for den typiske størrelse af vedhængende leukocytter, der skal identificeres korrekt specifikation af afgørende betydning. Man kan vurdere den typiske størrelse af leukocytter ved hjælp af en line måling værktøj i ImageJ. For eksempel, i vores analyse brugte vi den vifte af 9 – 15 pixel, hvilket svarer til den fysiske størrelse af 10.3 – 17,1 µm (figur 4 c). Når du bruger en forkert vifte, fx 3-15 pixel (3.4 – 17,1 µm), en enkelt leukocyt identificeres ikke som én celle, men snarere dens subpart er identificeret som separate objekter (figur 4D). Dette fører til falsk antallet af objekter kan identificeres.
Mange objekter af en lav intensitet og mindre areal end leukocytter kan påvises ved hjælp af metoden forudsat adaptive tærskel. Dette kan tage plads på grund af autofluorescence eller nogen andre uspecifikke fluorescerende signaler. Disse ikke-specifikke objekter, kan hvis deres område er lavere end den typiske område af en enkelt leukocyt, ikke desto mindre, filtreres ved at definere den minimalt accepterede areal (fig. 4 c).
Flow analysen beskrives her tillader direkte vurdering af leukocyt adhæsion til en EF-éncellelag, belyse samspillet mellem disse to celle typer, men tager ikke hensyn til andre celler typer, såsom pericytes, der er til stede i det vaskulære væg og måske også deltage i reguleringen af leukocyt ekstravasation15. Integrere en 3D kultur mikromiljø med andre celletyper kunne forbedre fysiologiske relevansen af systemet. På trods af disse begrænsninger giver flow analyse til vurdering af inflammatoriske respons beskrevet her et værdifuldt værktøj til grundlæggende karakterisering og sygdom modellering ansøgninger af hiPSC-ECs.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende de følgende tilskud: European Research Council (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Holland orgel-on-Chip initiativ, en NWO Gravitation projekt finansieret af Ministeriet for uddannelse, kultur og videnskab af regeringen i Nederlandene (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C.
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W.
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
