Summary
هنا يمكننا وصف بروتوكول لكفاءة الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) تليها الفائق تسلسل الحمض النووي (الرقائق-seq) من الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. هذا البروتوكول مناسبة لكل رسم الخرائط هيستون التعديلات والتعريب على نطاق الجينوم من البروتينات غير هيستون لمصلحة فيفو فيالتحقيق.
Abstract
وينظم عمليات الخلوية الأكثر النسخي تحوير الجينات محددة البرامج. ويتحقق هذا التعديل من خلال الإجراءات المشتركة لمجموعة واسعة من عوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة في التوسط للتنشيط النسخي أو القمع عن طريق التغييرات في هيكل الكروماتين. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج مفيدة في مجال بيولوجيا الجزيئية لرسم الخرائط التعديلات هيستون والتنميط النسخ العوامل/العوامل المساعدة ملزمة للحمض النووي، وبالتالي توفير لقطة من التغيرات النووية الدينامية التي تحدث خلال مختلف العمليات البيولوجية.
دراسة تنظيم النسخي في الأنسجة الدهنية والعينات المستمدة من الثقافات الخلايا في المختبر لتخليد أو خطوط الخلايا الأولية هي غالباً ما يفضل في رقاقة فحوصات بسبب وفرة ابتداء من المواد وتقليل التنوع البيولوجي. ومع ذلك، تمثل هذه النماذج لقطة محدودة للدولة الكروماتين الفعلية في الكائنات الحية. ومن ثم، هناك حاجة ماسة للبروتوكولات الأمثل لأداء رقاقة على عينات الأنسجة الدهنية المستمدة من النماذج الحيوانية.
هنا يصف لنا بروتوكول ل seq رقاقة كفاءة التعديلات هيستون والبروتينات غير هستون في الأنسجة الدهنية براون (BAT) المعزولة من ماوس. البروتوكول هو الأمثل للتحقيق في التعريب على نطاق الجينوم من البروتينات للفائدة وعلامات جينية في الخفافيش، التي مستقلة شكلياً وفسيولوجيا أنسجة بين مستودعات الدهون.
Introduction
الأنسجة الدهنية براون (BAT) بينما الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) المتخصصة لتخزين الطاقة، تبدد الطاقة في شكل حرارة نظراً لقدرته على تحويل الكربوهيدرات والدهون إلى طاقة حرارية عن طريق يفصل المتقدرية1. بسبب هذه الوظيفة المتخصصة، ومستودع التقنيات المطلوبة للمحافظة على درجة حرارة الجسم في الظروف الفسيولوجية واستجابة للتعرض للبرد. في حين قد درست التغيرات التعبير الجيني أثناء تمايز الخفافيش وعند الإجهاد حرارة على نطاق واسع في الحية وفي المختبر، الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه التغيرات كانت معظمها تشريح في خطوط الخلايا مخلدة والابتدائي adipocytes المسبق، باستثناء عدة الدراسات المجراة في2،،،من34،5.
تنظيم برامج تعبير الجينات المحددة من خلال تنظيم النسخي يتحقق عن طريق التغييرات المنسقة في الكروماتين الهيكل عن طريق النسخ مختلف العوامل واشتركت عوامل الإجراءات. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهج قيمة بيولوجيا الجزيئية للتحقيق في توظيف هذه العوامل للحمض النووي والتنميط يرتبط بها من التغيرات في المناظر الطبيعية الكروماتين. وتشمل العوامل الرئيسية لنجاح تجارب رقاقة أمثل الظروف crosslinking واتساق القص الكروماتين في أنحاء مختلفة من العينات، توافر انطلاق المادية، والكافية، وأبرزها نوعية الأجسام المضادة. عند أداء رقاقة من الأنسجة كاملة، من المهم أيضا النظر في عدم تجانس العينات وتحسين البروتوكول تحسين كفاءة العزل النوى، ومع هذا الأخير يجري خطوة حساسة بشكل خاص عند العمل مع الأنسجة الدهنية نظراً محتوى الدهون مرتفعة. في الواقع، التقنيات الجزيئية العزلة من مستودعات كله الدهنية تتعقد بسبب وجود مستويات عالية من الدهون الثلاثية، وبروتوكولات يجب أن يكون الأمثل لزيادة مقدار عزل الكروماتين. وأخيراً، عندما يتم إجراء تسلسل الفائق بعد عزلة رقاقة الحمض النووي، عمق التسلسل أمر حاسم لتحديد عدد القمم التي يتم الكشف عنها بثقة.
هنا، نود أن نشير إلى أن معايير العمل والمبادئ التوجيهية العامة للتجارب رقاقة seq الذي أوصت به ترميز ومودينكودي اتحادات6 لأفضل الممارسات، ونحن نركز على وصف خطوة بخطوة لبروتوكول الأمثل ل seq رقاقة من الخفافيش. يسمح البروتوكول وصف لكفاءة عزل الكروماتين من الأنسجة الدهنية لإجراء تسلسل الجينوم على نطاق المنظومة للحمض النووي--ربط العوامل مع قمم محددة تحديداً جيدا، فضلا عن علامات هستون بإشارات أكثر انتشارا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
خطوات التعامل مع الحيوانات من البروتوكول أقرتها جامعة بوسطن "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك).
1-اليوم الأول: تشريح وإعداد الخفافيش للونين إيمونوبريسيبيتيشن (شريحة)
- Euthanize الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO2) دائرة، وإجراء التشريح فورا بعد ذلك. رش الفراء الماوس مع الإيثانول 70% قبل شق. ضع الماوس مع ظهرها مواجها لأعلى، ثم قطع فتح الجلد على طول الرقبة. تحديد موقع الخفافيش مباشرة تحت الجلد بين الكتفين (إينتيرسكابولار؛ فإنه يظهر الفصوص اثنين، على شكل فراشة، مع طبقة رقيقة من الدهون البيضاء التي يجب أن يكون بعناية إزالة7).
ملاحظة: ماوس C57BL/6J شهرا 3 التي تغذي نظام غذائي تشاو عادية (وزن الماوس في هذا العمر يتراوح بين 27 و 30 g)، كل فلقة بات طولها حوالي 1 سم. الوزن الكلي لمستودع بات حوالي 0.15 غ في الفئران الذكور والإناث على حد سواء. - استخدم 1 بات وسادة لرقائق 3. يمكن معالجة منصات الخفافيش متعددة في وقت واحد حتى sonication.
- التشعب لوح كل الخفافيش في 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) يحتوي على 1% فورمالدهايد لمدة 15 دقيقة بالتناوب في 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- آرو كروسلينكينج عن طريق إضافة جليكاين 2.5 م لتركيز 125 ملم لمدة 5 دقائق، بالتناوب في 150 دورة في الدقيقة في الرايت النهائي
- نقل لوحة بات إلى 500 ميليلتر من تحلل ناقص التوتر المخزن المؤقت (10 ملم حبيس، 1.5 مم مجكل2، 10 مم بوكل، 0.5 مم DTT، 0.2 مم بمسف) وإضافة 2 حبات الفولاذ المقاوم للصدأ (الحجم: 3.2 مم، انظر الجدول للمواد) لكل لوح الخفافيش. استخدام الخالطون نسيج المستندة إلى حبة (انظر الجدول للمواد) اجاد الأنسجة.
- تبدأ مدة 5 دقائق في السلطة كحد أقصى. إذا لزم الأمر، تمديد الوقت حتى يتم تجانس الأنسجة والخلايا المفردة مفصولة. نقل العينات إلى أنبوب جديد وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 16,000 س ز لمدة 10 دقائق.
- بعد الطرد المركزي، نقل المادة طافية في أنبوب جديد وإبقاء بيليه الخلية على الجليد. الطرد المركزي المادة طافية في 4 درجات مئوية في 16,000 س ز لمدة 10 دقيقة لمنع الخسارة العائمة الخلايا. تجاهل المادة طافية النهائي وريسوسبيند كل الكريات الخلايا معا في 300 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي تحلل المخزن المؤقت (الحزب الديمقراطي الصربي 1%؛ 10 يدتا مم؛ تريسهكل pH 8، 50 مم) مع 1 × مثبطات البروتياز (انظر الجدول للمواد). احتضان بالثلج لمدة 10 دقائق.
- Sonicate ليساتيس لتوليد دنا شظايا 200 – 500 قاعدة أزواج طويلة. بعد سونيكاتيون، إزالة الحطام بالطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في س 16,000 ز في 4 درجات مئوية والتحقق من نجاح سونيكاتيون عن طريق التفريد الحمض النووي على 1% [اغروس] هلام. لجل متوسطة الحجم، قم بتشغيل في 120 الخامس؛ ويتحقق فصل جيدة بعد 45 دقيقة.
ملاحظة: Sonication الأمثل قد يكون ضروريا لتحقيق الحجم المناسب من الشظايا. مع سونيكاتور المختارة (انظر الجدول للمواد)، وهذا يتطلب 2 مرات في 320 ث إنتاج الطاقة وتواتر 20 كيلو هرتز لمدة 10 دقائق، باستخدام دورات 30/30 ق ق قبالة. - تمييع الكسر طاف 10 إضعاف (الحجم النهائي 3 مل لكل لوح الخفافيش) في المخزن المؤقت لتمييع رقاقة (الحزب الديمقراطي الصربي 0.01 في المائة؛ تريتون 1.1 في المائة؛ يدتا 1.2 مم؛ تريس-HCl pH 8، 16.7 مم؛ كلوريد الصوديوم 167 ملم) مع 1 × مثبطات البروتياز. نضع جانبا 1% من هذا الحل الكروماتين (يعادل 30 ميليلتر لمل 3) كإدخال شريحة. الحفاظ المدخلات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (حتى الخطوة 2، 4).
ملاحظة: ستقدم الكسر أعلاه إشارة الإدخال للتحديد الكمي النسبي للمواد إيمونوبريسيبيتاتيد مقارنة بكمية الحمض النووي الموجودة في كل عينة قبل إيمونوبريسيبيتيشن. - إضافة جسم رقاقة (انظر الجدول للمواد للأجسام المضادة التي تستخدم هنا كمثال) إلى 1 مل من محلول الكروماتين واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية بالتناوب. أداء إيمونوبريسيبيتيشن متوازية مع المناعي المطابق قبل مفتش، إذا كانت متوفرة، أو مفتش عادي من نفس النوع (على سبيل المثال. العادية أرنب مفتش إذا كان ينتج في الجسم في أرنب). وبدلاً من ذلك، حفظ 1 مل من محلول الكروماتين لعنصر تحكم لا الضد.
ملاحظة: ينبغي أن تحدد مقدار الأمثل لجسم تجريبيا لكل جسم جديد، إذا كان تركيز الأجسام المضادة غير معروف. خلاف ذلك، 2-5 ميكروغرام لجسم كمية بداية معقولة لاستخدام. استخدام الأجسام المضادة رقاقة الدرجة كلما كان ذلك ممكناً، أو الأجسام المضادة التي تم التحقق من صحتها إيمونوبريسيبيتيشن.
2-يوم 2: مجموعة من المجمعات المناعة
- إضافة 50 ميليلتر من الطين 50% بروتين A [اغروس] إلى مجمعات محصنة واحتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية مع تناوب 150 لفة في الدقيقة.
-
بيليه الخرز بالطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 100 x ز في 4 درجات مئوية. أداء يغسل متسلسلة من الخرز مع المخازن المؤقتة لزيادة صرامة.
- أولاً، أغسل مع الغسيل منخفضة الملح المخزن المؤقت (150 مم كلوريد الصوديوم؛ تريس-HCl pH 8، 20 مم؛ 2 يدتا مم؛ تريتون-X 1%؛ الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%)، ثم مع المخزن المؤقت ليغسل الملح عالية (500 ملم كلوريد الصوديوم؛ تريس-HCl pH 8، 20 مم؛ يدتا 2 مم، تريتون-X1%؛ الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%)، ثم مع الغسيل ليكل (0.25 م ليكل؛ تريس-HCl pH 8، 10 مم؛ يدتا 1 مم؛ إيجيبال 1%؛ ديوكسيتشولاتي 1%)، وأخيراً مع 1 x TE (HCl تريس pH 8، 10 مم؛ يدتا).
- أداء جميع يغسل 0.45 ميكرومتر PVDF الأعمدة تصفية الطرد المركزي (جدول المواد) بأول نقل الخرز في أعمدة باستخدام 500 ميليلتر من المخزن المؤقت ليغسل الملح منخفضة. بيليه الخرز في الأعمدة لمدة 3 دقائق في س 2,500 ز. تجاهل-التدفق عبر وكرر مرة واحدة لكافة المخازن المؤقتة يغسل المسردة في الخطوة رقم 2.2.1.
- بعد الانتهاء من يغسل، الوت مجمعات محصنة بإضافة 300 ميليلتر شطف المخزن المؤقت 1% من مخزونات النشر الاستراتيجي، 0.1 "ناكو م"3) الخرز الأعلاف في الأعمدة. تبني على RT لمدة 30 دقيقة على شاكر 400 لفة في الدقيقة. جمع النذرة بالغزل أسفل الأعمدة لمدة 3 دقائق في س 2,500 ز في أنبوب جديد.
- عكس كروسلينكس التي تفرخ النذرة والمدخلات التي تم جمعها في الخطوة 1، 9 في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3-اليوم الثالث: الاسترداد من الحمض النووي مع استخراج الفينول/كلوروفورم
- إضافة 300 ميليلتر الفينول: كلوروفورم: الأكاديمية، 1:1 النذرة والمدخلات. دوامة لمدة 10 ق.
- تدور عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في س 21,000 ز. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. إضافة 3 ميليلتر من الجليكوجين و 30 ميليلتر من خلات الصوديوم م 3 ميليلتر 750 الباردة 100 ٪ الإيثانول. دوامة متجر س. 10-80 درجة مئوية ح 2.
- زيادة ونقصان لأسفل في س 21,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وإبقاء بيليه، وتجاهل المادة طافية. بيليه يغسل مع 1 مل من البرد 70% EtOH، ثم تدور إلى أسفل في س 21,000 ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية وأيردري بيليه.
- ريسوسبيند بيليه في 70 ميليلتر من الماء خالية من الدناز.
- انتقل إلى الخطوة 4 لاختبار شغل الكروماتين في مناطق الجينوم محددة بالكمية البلمرة المتسلسل (qPCR) أو إلى الخطوة 5 لإعداد العينات للتسلسل.
4-تحليل شرائح باستخدام قبكر (Single/Multiple الجينات قراءات)
- تمييع الإدخال الحمض النووي من الخطوة 3، 4 لإنشاء منحنى مرجعية قياسية. تخفيف المسلسل من 1/10، 1/100، 1/1000 تكفي عادة لالتقاط مجموعة الخطي، وكذلك تخفيف قد يكون مطلوباً لعينات أكثر تركيزاً.
- لكل زوج التمهيدي (هنا، وقد استخدمنا كبسولة تفجير تستهدف المروجين NDUFV1 و TOMM20)، إعداد مجموعتين من التفاعلات قبكر: واحد باستخدام نماذج الإدخال المخفف من الخطوة 4، 1، وثانية مع عينات الحمض النووي تم عزلة بواسطة إيمونوبريسيبيتيشن من الخطوة 3، 4. أداء كل رد فعل في ثلاث نسخ.
ملاحظة: يمكن إعداد ردود الفعل بالتوازي للجينات متعددة باستخدام لوحات 96-أو 384 جيدا. - قم بإعداد حجم رد فعل 10 ميكروليتر الواحدة جيدا مع 5 ميكروليتر من مزيج x PCR 2 (جدول المواد)، مزيج 1 ميكروليتر من التمهيدي (1 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام وعكس التمهيدي 1 ميكرومتر)، و 4 ميكروليتر من الحمض النووي من شرائح (أو عنصر تحكم الإدخال).
- باختصار تدور أسفل اللوحة.
- تشغيل ردود الفعل قبكر على نظام PCR الوقت الحقيقي باستخدام البروتوكول الذي أوصت به الشركة المصنعة للكشف عن الكاشف (جدول المواد). هنا استخدمنا الشروط التالية: 1) 1s عند 95 درجة مئوية لدورة 1؛ 2) 1 s عند 95 درجة مئوية تليها 20 s عند 60 درجة مئوية للدورات 45؛ 3) 15 ثانية عند 95 درجة مئوية تليها 60 s عند 60 درجة مئوية تليها 15 s عند 95 درجة مئوية لدورة 1.
ملاحظة: تحقق من منحنى تفارق: تقترح وجود ذروة واحدة في مؤامرة الانفصال الحرارية يتم إنشاؤها أمبليكون واحد من رد فعل PCR. إذا هو تصور ذروة واحدة أو أكثر، وهذا دلالة يحتمل أن تكون متعددة وغير محددة أمبليكونس؛ في هذه الحالة، من المستحسن تصميم أزواج بديلة التمهيدي. - تحديد المرحلة الخطية من التضخيم الهائل لتفاعل PCR التمهيدي كل مجموعة بحساب المنحنى القياسي باستخدام السلسلة من الحمض النووي المخفف في الخطوة 4، 1. ووفقا لقيمة الأشعة المقطعية (دورة العتبة).
- إذا كانت قيمة الأشعة المقطعية للحمض النووي من الرقائق وعنصر تحكم الإدخال ضمن قيمة مجموعة الخطي للأشعة المقطعية، حساب إثراء الحمض النووي من الرقائق بالنسبة للمدخلات، وفقا لعامل تخفيف للحمض النووي من الرقائق وإدخال عنصر التحكم في الخطوة 4، 1.
5-تضخيم الحمض النووي من الرقائق للتسلسل (قراءات على نطاق الجينوم) الفائق
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن الاستعانة بمصادر خارجية للمرافق الأساسية الأكاديمية أو شركة تجارية التسلسل عند تسلسل قدرات لا تتوفر داخل المنظمة.
- إعداد مكتبة الحمض النووي من الحمض النووي المستخرج إعداد مكتبة شرائح مناسبة كيت (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- تسلسل المكتبة على نظام تسلسل الفائق، استخدام 50 بي بي واحد-نهاية كقراءات (انظر الجدول للمواد).
ملاحظة: وفقا للمبادئ التوجيهية seq رقاقة اقترحها ترميز6، ينصح بالحد أدنى من 10 مليون على ما يلي للجينوم الثدييات.
6. تحليل البيانات الخام
- أداء مراقبة الجودة في ما يلي تسلسل الخام باستخدام فاستقك8.
ملاحظة: مقاييس جودة تسلسل مشتركة تشمل كل نوعية قاعدة التسلسل، كل محتوى قاعدة التسلسل، كل محتوى تسلسل GC وطول التسلسل ومستويات التسلسل الازدواجية. وبصفة عامة، على نقاط جودة قراءة Q > 30 عبر كل الموقف الأساسي مؤشرا على النتائج تسلسل عالية الجودة. يجب أن يشابه توزيع المحتوى GC عبر كل القراءات تقريبا توزيع الطبيعي، مع ذروة تتمحور حول الأنواع الجينية GC المحتوى النسبة المئوية الفعلية. - قم بإزالة أي تسلسل محول التلوث ويقرأ منخفضة الجودة من خلال قراءة التشذيب الأداة المساعدة تريموماتيك9.
ملاحظة: تحديد المعلمات الافتراضية المنفذة إزالة محولات تعتمد منصة، وإزالة القواعد منخفضة الجودة الرائدة وزائدة، واستخدام نافذة 4-قاعدة واسعة الانزلاق تريم يقرأ عند جودة متوسط كل قطرات قاعدة أدنى من عتبة معينة. - محاذاة يقرأ المجهزة ل الجينوم إشارة الماوس MM1010 مع راصفة Bowtie211 استخدام المعلمات الافتراضية.
- تصفية القراءات المنحازة بإزالة تلك مع نوعية رسم خرائط Bowtie2 نقاط (مابق) من أقل من 10 باستخدام سامتولس12.
- تحديد مقاييس الجودة المحاذاة بعد مختلف مثل قراءة ما يلي النسبة المئوية المعينة، حبلا عبر الارتباط، التراكمي التغطية، ونموذج النسخ المتماثل إمكانية تكرار نتائج.
ملاحظة: حزم مختلفة بما في ذلك SPP13، تشيبقك14، و15 من ديبتولس متاحة لحساب هذه المقاييس النوعية. - إجراء تحليل ذروة الاستدعاء مع عنصر تحكم الإدخال أو عينة كو المناسبة باستخدام خوارزمية (MACS2) أجهزة ماكينتوش16 مع المعلمات الافتراضية.
- قم بإزالة أي قمم تسمى التي تتداخل مع المناطق القائمة السوداء المعروفة17 من الشرح mm10 باستخدام بيدتولس18.
ملاحظة: المناطق القائمة السوداء هي مناطق الجينوم التي أظهرت الإشارات عالية أو قراءة التهم الموجهة إليه مستقلة عن خط الخلية أو تقنية التسلسل. عرض هذه المناطق إشارات أثرية ارتفاع مصطنع في مناطق معينة من الجينوم التي يمكن أن تتم تصفيته من تجارب تسلسل الجينوم الوظيفي. ينبغي معالجتها بشكل مستقل عن طريق خط الأنابيب replicates جميع ويمكن أن تستخدم بعد ذلك لمعدل اكتشاف إيريبرودوسيبيليتي (IDR). وتستخدم الاستعراضات المتعمقة لقياس إمكانية تكرار نتائج النتائج بين replicates من خلال الأسلوب كما وصفها لي براون، هوانغ وبيكيل19،20. الأسلوب IDR يقيم التناسق بين replicates كمياً، ويوصي بترميز ومودينكودي كجزء من مبادئها التوجيهية المتعلقة بالرقائق seq. - استخدام قمم يعتد به إحصائيا لمختلف التحليلات المصب مثل21،علم الوجود الجينات22أو تخصيب اليورانيوم، أو فكرة تحليل23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
رقم 1: رقاقة التحقق من قبكر- تحليل الرقائق-قبكر GPS2 ممثل استهداف جينات NDUFV1 (يسار) و TOMM20 (يمين) في الخفافيش الفئران WT واكو GPS2، عرض التغيرات النسبية في مستوى مثلايشن H3K9 و GPS2 و Pol2 الملزمة. شريط الرسوم البيانية تمثل متوسط العينة من replicates 3 مع * ف < 0.05 و * * ف < 0.01 محسوبة باختبار t للطالب. يتم تعديل هذا الرقم من كارداموني et al.2. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
أمثلة من رقاقة قبكر استخدام بات معزولاً عن الفئران WT أو GPS2-إكو مبينة في الشكل 12. بعد أن تبين أن هناك حاجة للتعبير عن النووي ترميز الجينات المتقدرية في خلية مختلفة خطوط2إلى GPS2، اختبرنا تجنيد GPS2 في اثنين المرمزة النووية المتقدرية جينات معينة، NDUFV1 و TOMM20، في BAT من الفئران كمثال على نسيج عالي التخصيب في الميتوكوندريا. أولاً نحن مقارنة GPS2 مروج الأشغال في الفئران GPS2-إكو والبرية من نوع ليتيرماتيس، مراقبة انخفاض المتوقع في GPS2 ملزم للجينات المستهدفة انتقائية في الخفافيش من الفئران GPS2-إكو. استخدام بروتوكول الموصوفة هنا، نحن أيضا سجلت زيادة ربط الحمض النووي الريبي بوليميراز 2 (Pol2) وعلامة هيستون القمعية H3K9me3 في الخفافيش من الفئران GPS2-إكو مقارنة بالبرية من نوع ليتيرماتيس. لجميع الأجسام المضادة، كان الربط كبيرة بالمقارنة مع الإشارات الخلفية لاحظت في عينة مراقبة مفتش. هذه النتائج تؤكد تجنيد GPS2 في جينات الميتوكوندريا المحدد النووية ترميز وإظهار أن GPS2 المطلوبة لمنع تراكم H3K9me3، وهكذا المطلوبة لتوقف النشاط الترانسكربتي Pol2 على المروجين الهدف. انظر الجدول للمواد اللازمة لمزيد من التفاصيل عن الأجسام المضادة والمنشور الأصلي لبيانات إضافية ومناقشة أشمل لهذه النتائج2.
رقم 2: مؤامرة نوعية عشرات من يقرأ التسلسل الخام معزولة عن BAT. (أ) تعكس درجات الجودة تنبؤ باحتمال حدوث خطأ أثناء استدعاء قاعدة. عادة يتم التعبير عنه كقيمة عدد صحيح، Q =-10log10(P)، الذي ف هو احتمال حدوث خطأ في استدعاء قاعدة. الموضح أعلاه هو كل تسلسل قاعدة نوعية الأرض التي تم إنشاؤها بواسطة فاستقك استناداً إلى تسلسل الخام، غير المجهزة القراءات المتولدة من الخفافيش. (ب) GC توزيع المحتوى لما يلي بعد إزالة المحول وقراءة التشذيب من عينات الخفافيش. يجب أن يشابه المحتوى GC تقريبا توزيع العادي مع ذروة تتمحور حول الأنواع الفعلية جزء من محتوى الجينوم GC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
وترد في الشكل 2، تسلسل الجودة عشرات في كل مستوى القاعدة، وربما عن معالجة ما يلي: التشذيب أي تلوث محول المتبقية وإزالة ما يلي حيث تقل درجة متوسط الجودة عبر نافذة منزلقة العتبة المحددة. كما هو موضح هو توزيع المحتوى GC عبر ما يلي بعد إزالة المحول واقتطاع للقراءة. نوعية التسلسل و GC المحتوى هما التوزيع على نطاق واسع تستخدم مقاييس لتقييم البيانات تسلسل الجيل القادم قبل أن يتم إجراء تحليلات حسابية. وتبين هذه النتائج أن البروتوكول تنتج كمية كافية من الكروماتين عالية الجودة معزولة من الخفافيش متوافق مع تكنولوجيات المصب الجيل التالي التسلسل.
الشكل 3: تطبيع نتأمل الملفات التي تم إنشاؤها من البيانات seq رقاقة من الخفافيش الفئران WT واكو GPS2. يعرض هذا الشكل تغطية قراءة طبيعية على طول محور الجينات Slc25a25 مع ذروة دعا إلى حد كبير في منطقة المروج. وأبدى GPS2 لتنظيم الجينات المتقدرية النووية المشفرة بتغيير حالة الكروماتين مروجي الجينات المستهدفة. عرض هذه النتائج التصور من ذروة بلغت درجة كبيرة تسمى على جينات المتقدرية ممثل النووية المشفرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
هو مبين في الشكل 3 مسارات نتأمل الوزن واكو GPS2 الانحياز ملفات أم تطبيع إلى 1 × العمق (قراءة كل التغطية الجينوم) كما نفذت في ديبتولس. سيظهر هو وجود ذروة إحصائيا يقع في منطقة المروج الجينات المتقدرية Slc25a25. المسارات الموحدة السماح التصور لإثراء ما يلي المقابلة لذروة يسمى والحد من يقرأ في هذا الموقع من الخفافيش من الفئران GPS2-إكو بالنسبة إلى البرية من نوع ليتيرماتيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمثل البروتوكول الموصوفة هنا هي أداة قيمة لأداء رقاقة من الأنسجة مورين، وعلى وجه التحديد الأمثل للنسيج الدهني البنى. واحدة من أكبر التحديات في أداء رقاقة من الأنسجة يتعافى بعدد كاف من الخلايا أثناء إعداد عينة. القص بات استخدام خلاط الخالطون أنسجة مقترنة بحبات الفولاذ المقاوم للصدأ بدلاً من مدقة زجاج الكنسي درجة كبيرة يقلل من عدد الخلايا التي فقدت بسبب الأنسجة دون انقطاع. وعلاوة على ذلك، المجانسة الأنسجة مباشرة في المخزن مؤقت ناقص التوتر يساعد على الإفراج عن الدهون التي يمكن بسهولة فصل وإزالتها من نويات عالية السرعة عن طريق الطرد المركزي.
سونيكيشن السليم أيضا ذات أهمية حاسمة لإجراء فحوصات رقاقة متسقة واستنساخه. يتيح استخدام المياه حمام الترا-سونيكاتور للمعالجة المتزامنة لعينات متعددة، مما يؤدي إلى تحسين إمكانية تكرار نتائج الكروماتين القص، والحد من مخاطر التلوث عبر عينة. وباﻹضافة إلى ذلك، يقلل استخدام نظام التحكم في درجة الحرارة sonication المحموم للعينات، التي ينبغي تجنبها لمنع تدهور عينة وفقدان حانمه الاعتراف بالجسم (انظر الجدول للمواد للحصول على التفاصيل).
الخطوة تحديا آخر هو انتعاش المجمعات إيمونوبريسيبيتاتيد. حبات المغناطيسي غالباً المفضل لهذه الخطوة لأنها تسمح ليغسل أسرع وأكثر فعالية عندما تستخدم جنبا إلى جنب مع رف مغناطيسية. ومع ذلك، لديهم انخفاض معدل الاسترداد الحمض النووي مقارنة بالبروتين A [اغروس]، الذي يمكن أن يكون قيداً خطيرا عند العمل مع كمية صغيرة من ابتداء من المواد. أننا نجد أن مزيج الملاط البروتين A [اغروس] مع الأعمدة تصفية الطرد المركزي 0.45 ميكرومتر PVDF حلاً رائعا لتحقيق أقصى الحمض النووي العائد مع الوقت الغسيل الحد الأدنى وإمكانية تكرار نتائج أعلى.
وفيما يتعلق بعزل الحمض النووي، يمكن أن تستخدم الكثير من مجموعات عزل الحمض النووي القائم على الأعمدة. في تجربتنا، واحد الحد من هذا النهج هو قدرة الأعمدة يكون لها تأثير على عائد الانتعاش الحمض النووي. للتغلب على هذه المشكلة، ونحن نفضل استخدام أسلوب أكثر تقليدية الفينول/كلوروفورم لاستخراج الحمض النووي.
خط الأنابيب رقاقة seq المدرجين في القائمة يتضمن عددا من الأدوات المقبولة على نطاق واسع، والمرافق للجيل التالي تسلسل تجارب. بإيجاز، ما يلي: تخضع لمراقبة الجودة الأساسية باستخدام فاستقك وتريموماتيك، ثم الانحياز للجينوم MM10 الماوس باستخدام Bowtie2. تتم تصفية الباقين على قيد الحياة على ما يلي عن طريق تعيين جودة قبل استخدامها لاستدعاء الذروة من خلال خوارزمية MACS2. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه يمكن أيضا أن تستخدم أدوات أخرى متوفرة وتم التحقق من صحتها تبعاً لطبيعة التجربة والبيانات التي يتم إنشاؤها. استخدام أي تخصيص المعلمات أثناء المعالجة التمهيدية، المحاذاة، أو استدعاء الذروة قد يكون من المناسب أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. , (2004).
- Cardamone, M. D., et al. Mitochondrial Retrograde Signaling in Mammals Is Mediated by the Transcriptional Cofactor GPS2 via Direct Mitochondria-to-Nucleus Translocation. Molecular Cell. 69, (2018).
- Emmett, M. J., et al. Histone deacetylase 3 prepares brown adipose tissue for acute thermogenic challenge. Nature. , (2017).
- Harms, M. J., et al. PRDM16 binds MED1 and controls chromatin architecture to determine a brown fat transcriptional program. Genes & Development. , (2015).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes & Development. , (2017).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).
- Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. Journal of Visualized Experiments. , e50191 (2013).
- Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
- Genome Browser Gateway. , Available from: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm10 (2018).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. , 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence alignment/map (SAM) format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nature Biotechnology. 26, 1351-1359 (2008).
- Carroll, T. S., Liang, Z., Salama, R., Stark, R., de Santiago, I. Impact of artifact removal on ChIP quality metrics in ChIP-seq and ChIP-exo data. Frontiers in Genetics. 5, 75 (2014).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: A next Generation Web Server for Deep-Sequencing Data Analysis. Nucleic Acids Research. , (2016).
- Zhang, Y., et al.
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Li, Q., Brown, J. B., Huang, H., Bickel, P. J.
- Irreproducible Discovery Rate (IDR). , Available from: https://github.com/nboley/idr (2018).
- The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology Knowledgebase and Resources. Nucleic Acids Research. 45, D331-D338 (2017).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature Genetics. 25, 25-29 (2000).
- Boeva, V. Analysis of Genomic Sequence Motifs for Deciphering Transcription Factor Binding and Transcriptional Regulation in Eukaryotic Cells. Frontiers in Genetics. 7, 24 (2016).
