Summary
在这里, 我们描述了有效染色质免疫沉淀 (chip) 的协议, 然后是从小鼠身上分离出的棕色脂肪组织 (bat) 的高通量 dna 测序 (chip-seq)。该方案既适用于组蛋白修饰的映射, 也适用于研究感兴趣的非组蛋白在体内的全基因组定位。
Abstract
大多数细胞过程是由特定基因程序的转录调控来调节的。这种调制是通过广泛的转录因子 (tf) 和辅因子的联合作用来通过染色质结构的变化介导转录激活或抑制来实现的。染色质免疫沉淀 (chip) 是一种有用的分子生物学方法, 用于绘制组蛋白修饰和分析转录因子与 dna 结合的方法, 从而提供了不同过程中发生的动态核变化的快照。生物过程。
为了研究脂肪组织中的转录调控, 从永生或原代细胞系的体外细胞培养中提取的样本往往受到 chip 检测的青睐, 因为起始材料丰富, 生物变异性降低。然而, 这些模型代表了生物体实际染色质状态的有限快照。因此, 迫切需要优化的协议, 以便对从动物模型中提取的脂肪组织样本执行 chip。
在这里, 我们描述了从小鼠身上分离出的棕色脂肪组织 (bat) 中有效的组蛋白修饰和非组蛋白的 chip-seq 方案。该方案经过优化, 用于研究 bat 中感兴趣的蛋白质和表观遗传标记的全基因组定位, bat 是脂肪仓库中形态和生理上不同的组织。
Introduction
虽然白色脂肪组织 (wat) 是专门用于储能的, 但棕色脂肪组织 (bat) 由于能够通过线粒体解耦1将碳水化合物和脂质转化为热能,以热的形式耗散能量。由于这种专门的功能, 最佳可得技术仓库需要在生理条件下保持体温, 并对冷暴露作出反应。虽然在 bat 分化过程中和热源应激作用下的基因表达变化在体内和体外得到了广泛的研究, 但这些变化背后的分子机制大多在永生细胞系和原代细胞系中被剖析脂肪前细胞, 除了几种体内研究2,3,4,5。
通过转录调控特定基因表达程序的调控是通过不同转录因子和共因作用协调改变染色质结构来实现的。染色质免疫沉淀 (chip) 是一种有价值的分子生物学方法, 用于调查这些因子在 dna 中的吸收情况, 并分析染色质景观中的相关变化。chip 实验成功的关键因素包括在不同样品中优化交联条件和染色质剪切一致性, 提供足够的起始材料, 最显著的是抗体的质量。在从整个组织执行 chip 时, 还必须考虑样品的异质性, 并优化协议, 以提高细胞核分离的效率, 后者是在处理脂肪组织时特别敏感的一步, 因为脂质含量升高。事实上, 由于存在高水平的甘油三酯, 整个脂肪库的分子分离技术变得更加复杂, 必须优化协议以增加染色质分离的量。最后, 当在 chip-dna 分离后进行高通量测序时, 测序深度对于确定自信检测到的峰数至关重要。
在这里, 我们参考 encode 和 modencode 财团为最佳实践推荐的 chip-seq 实验的工作标准和一般准则, 我们重点介绍了从 bat 为 chip-seq 优化的协议的分步描述。所述协议允许从脂肪组织中有效分离染色质, 以便对具有明确定义的峰值和更漫反射信号的组蛋白标记的 dna 结合因子进行全基因组测序。
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Protocol
该协议的动物处理步骤已获得波士顿大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 第1天: 染色质免疫沉淀 (chip) bat 的解剖和制备
- 使用二氧化碳 (co2) 室对小鼠进行安乐死, 并在之后立即进行解剖。切口前用70% 乙醇喷洒小鼠毛皮。将背部朝上的老鼠放在一起, 然后沿着脖子切开皮肤。将 bat 直接放置在肩部之间的皮肤下方 (肩关节间; 它显示为两个裂片, 呈蝴蝶形状, 有一层薄薄的白色脂肪, 需要小心取出7)。
请注意:对于3个月大的 c57bl/6j 小鼠, 喂养的是正常的饮食 (这个年龄的老鼠体重在27至30克之间), 每个 bat 叶大约有1厘米长。在雄性和雌性小鼠中, bat 仓库的总重量约为0.15 克。 - 对 3个 chip 使用 1个 bat 垫。多个 bat 垫可以同时处理, 直到超声。
- 在室温 (rpm) 下, 在150转/分 (rpm) 下旋转 15分钟, 在10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中交叉链接每个 bat 垫, 其中含有1% 的甲醛。
- 在 125 mm 的最终浓度为 125 mm 的情况下加入 2.5 m 甘氨酸, 在 rpm 以150转/分的速度旋转, 从而在淬火交联。
- 将 bat 垫转移到500μl 的低渗裂解缓冲液 (10 mm hepes, 1.5 mm mmcl2, 10 mm kcl, 0.5 mm dtt, 0.2 mm pmsf), 并为每个 bat 垫添加2个不锈钢珠子 (尺寸: 3.2 毫米, 见材料表)。使用基于珠子的组织均质机 (见材料表) 将组织粉碎。
- 从5分钟开始, 最大功率。如果需要, 延长时间, 直到组织同质化, 单个细胞分离。将样品转移到16000xg 的4°c 下的新管和离心机中, 时间为10分钟。
- 离心后, 将上清液转移到新管中, 并将细胞颗粒保持在冰上。在16000xg 的4°c 下离心液 10分钟, 以防止浮体丢失。丢弃最终上清液, 并在 300μl sds 裂解缓冲液中将两个细胞颗粒重新悬浮在一起 (sds 1%;edta 10 mm;Tris-HCl ph 值 8, 50 mm), 带有1x 蛋白酶抑制剂 (见材料表)。在冰上孵化10分钟。
- 将裂解物状联成, 生成 dna 片段200–500碱基对。超声后, 在 16, 000 x g的温度下, 在4°c 下离心 10分钟, 并在1% 琼脂糖凝胶上通过 dna 电泳检查超声的成功与否。对于中等大小的凝胶, 以 120 v 的速度运行;45分钟后就能实现良好的分离。
请注意:可能需要优化声, 以实现碎片的适当大小。使用所选的声纳器 (参见材料表), 这需要2次在 320 w 输出功率和20千赫频率 10分钟, 使用 30秒/30秒的周期。 - 稀释 chip 稀释缓冲液中的上清剂分数 10倍 (每个 bat 垫的最终体积为3毫升) (sds 0.01%;triton 1.1%;edta 1.2 mm;Tris-HCl ph 值 8, 16.7 mm;用1x 蛋白酶抑制剂与氯化钠 167mm)。保留此染色质溶液的 1% (3 毫升等于 30μl) 作为 chip 输入。将输入保持在 4°c (直到步骤 2.4) 过夜。
注: 上述部分将为免疫沉淀材料的相对定量提供输入参考, 与免疫沉淀前每个样本中的 dna 量进行比较。 - 将 chip 抗体 (见此处使用的抗体材料表) 添加到1毫升的染色质溶液中, 并在4°c 下旋转隔夜孵育。与相应的免疫前 igg (如果有) 或同一物种的正常 igg (例如, 正常的兔 igg, 如果抗体是在兔子体内产生) 进行平行免疫沉淀。或者, 节省1毫升的染色质溶液, 用于无抗体控制。
请注意:如果不知道抗体浓度, 则应通过实验确定每个新抗体的最佳抗体量。否则, 2–5微米的抗体是合理的起始量使用。尽可能使用 chip 级抗体或已验证免疫沉淀的抗体。
2. 第2天: 免疫复合物的收集
- 在免疫复合物中加入50μl 蛋白 a 琼脂糖50% 浆料, 在4°c 下孵育 1小时, 在150转/分旋转。
-
在4°c 条件下, 在 100 x g的情况下离心珠子, 以1分钟的离心速度将珠子颗粒。使用增加严格性的缓冲器对珠子进行顺序清洗。
- 首先, 用低盐洗涤缓冲液 (150 mm 氯化钠) 清洗;Tris-HCl ph 值 8, 20 mm;edta 2 mm;三氯塔-x1%;sds 0.1%), 然后用高盐洗涤缓冲液 (500 mm 氯化钠;Tris-HCl ph 值 8, 20 mm;edta 2 mm, triton-x1%;sds 0.1%), 然后用锂离子清洗 (0.25 m 锂;Tris-HCl ph 值 8, 10 mm;edta 1 mm;igepal 1%;脱氧剂 1%), 最后用 1x te (Tris-HCl ph 值 8, 10 mm;edta)。
- 首先使用500μl 的低盐洗涤缓冲液转移柱中的珠子, 从而在 0.45μm pvdf 离心过滤柱 (材料表) 上进行所有清洗。将柱子上的珠子颗粒 3分钟, 2, 500 x克。放弃流经, 并对步骤2.2.1 中列出的所有洗涤缓冲液重复1次。
- 洗完后, 在列中的颗粒珠中加入300μl 洗脱缓冲液 1% sds, 0.1 m nhco3), 以洗脱免疫复合物。在 rpm 上, 在每分钟400转的时间在振动台上加产30分钟。收集洗脱液通过纺下柱 3分钟, 在 2, 500 x克在一个新鲜的管。
- 在65°c 下, 通过在步骤1.9 中隔夜孵育洗脱液和步骤1.9 中收集的输入来反转交联。
3. 第3天: 用酚醛/氯仿萃取法回收 dna
- 添加300μl 苯酚: 氯仿: iaa, 1: 1 至洗脱液和输入。10秒的漩涡。
- 在4°c 下旋转 15分钟, 在 21, 000 x g。将上清液转移到新鲜的管子上。加入3μl 的糖原, 30μl 的 3 m 醋酸钠, 750μl 的冷100% 乙醇。涡流 10秒, 在-80°c 下存储2小时。
- 在4°c 下, 在 21, 000 x 克的温度下旋转 20分钟, 保留颗粒, 并丢弃上清液。用1毫升的冷 70% etoh 清洗颗粒, 然后在 21,000 x 克的4°c 下旋转 5分钟, 丢弃上清液, 风干颗粒。
- 在70μl 的无 dnα水中重新填充颗粒。
- 继续执行步骤 4, 通过定量聚合酶链反应 (qpcr) 检测特定基因组区域的染色质占用率, 或执行步骤 5, 准备进行测序的样品。
4. 利用 qpcr (单基因/多基因读数) 分析 chip
- 稀释步骤3.4 中的输入 dna, 生成标准参考曲线。串行稀释的1/10、1百次和半1000通常足以捕捉线性范围, 但对于更集中的样品, 可能需要进一步的稀释。
- 对于每一对引物 (在这里, 我们使用了针对 ndffv1 和 tomm20 启动子的引物), 准备两组 qpcr 反应: 一套使用步骤4.1 中稀释的输入样本, 另一组通过步骤3.4 中的免疫沉淀分离 dna 样本。执行每个反应一式三份。
请注意:对于使用96个或384个井板的多个基因, 可以同时设置反应。 - 使用5μl 的 2x pcr 混合物 (材料表)、1μl 引物混合物 (1μm 正向底漆和1μm 反向底漆) 和来自 chip (或输入控制) 的 4μl dna, 设置每口10μl 的反应体积。
- 简单地旋转下来的盘子。
- 使用制造商推荐的试剂检测协议 (材料表) 在实时 pcr 系统上运行 qpcr 反应。在这里, 我们使用了以下条件: 1) 1) 1 在 95°C 1个周期;2) 95°c 时 1秒, 60°c 时 20秒, 45次循环;3) 95°c 时 15秒, 60°c 时 60秒, 95°c 时 15秒, 1个周期15秒。
请注意:检查离解曲线: 热解离图中存在一个峰值, 表明 pcr 反应产生了一个单一的放大器。如果显示了多个峰值, 这可能表示存在多个非特定的放大器; 如果显示多个峰值, 则可能表示存在多个非特定的放大器。在这种情况下, 我们建议设计替代引物对。 - 通过使用步骤4.1 中的一系列稀释基因组 dna 计算标准曲线, 确定每个引物组 pcr 反应的指数扩增的线性阶段。根据 ct (周期阈值) 值。
- 如果 chip 和输入控制的 dna ct 值在 ct 值的线性范围内, 根据 chip dna 的稀释因子和步骤4.1 中的输入控制, 计算出 chip 的 dna 相对于输入的富集量。
5. 放大 chip dna, 以实现高通量测序 (全基因组读数)
请注意:当内部没有测序功能时, 可以将此步骤外包给学术核心设施或商业测序公司。
- 按照制造商的说明, 使用适当的 chip 库准备工具包 (参见材料表) 准备从提取的 dna 中提取的 dna 中提取 dna 库。
- 在高通量测序系统上对库进行排序, 使用 50 bp 单端作为读出 (请参见材料表)。
请注意:根据 encode6建议的 chip-seq 指南, 建议对哺乳动物基因组至少进行 1 000万次读取。
6. 原始数据分析
- 使用 fastqc 8 对原始测序读数进行质量控制。
请注意:常见的排序质量指标包括每个基本序列质量、每个基本序列内容、每个序列 gc 内容、序列长度和序列复制级别。通常, 每个基本位置的读取质量评分为 q & gt; 30 表示高质量的测序结果。gc 内容在所有读取中的分布大致应类似于正态分布, 峰值以物种的实际基因组 gc 含量百分比为中心。 - 通过读取修剪实用程序修剪9删除任何测序适配器污染和低质量读取.
请注意:实现的默认参数指定删除平台相关的适配器, 删除领先和尾随低质量的基础, 并使用4基宽滑动窗口修剪读取时, 每个碱基的平均质量下降到指定的阈值以下。 - 使用默认参数将已处理的读取与使用的 bowtie2aligner 11 对齐到鼠标 mm10 参考基因组10 。
- 筛选器对齐读取, 使用 samtools12删除具有低于10的 bowtie2 映射质量得分 (mapq) 的读数。
- 确定各种对齐后质量指标, 如映射的读取百分比、链相互相关、累积读取覆盖率和样本复制重现性。
注意: 可以使用各种软件包 (包括 spp13、chipqc14和 deeptools15 ) 来计算这些质量指标。 - 使用带有默认参数的 acs 算法 (macs2)16 , 使用输入控件或适当的 ko 样本执行峰值调用分析。
- 使用 bedtools18从 mm10 批注中删除与已知列入黑名单的区域重叠的任何被称为峰值17。
请注意:黑名单区域是基因组中被证明具有高信号或读计数的区域, 独立于细胞系或测序技术。这些区域在基因组的某些区域显示人为的高伪影信号, 这些信号可以从功能基因组测序实验中过滤出来。所有复制都应通过管道独立处理, 然后可用于不可重复的发现率 (idr)。idr 用于测量通过李、布朗、黄和 bnickel19(20) 所述的方法在复制之间的重复性。idr 方法定量地评估复制之间的一致性, encode 和 modencode 建议作为其 chip-seq 指南的一部分。 - 使用具有统计学意义的峰值进行各种下游分析, 如基因本体21、22、富集或母题分析 23。
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Representative Results
图 1: qpcr 的 chip 验证.chip-qpcr 分析 wt 和 gps2-ako 小鼠 bat 中具有代表性的 gps2 靶向基因 ndufv1 (左) 和tomm20 (右), 显示 h3k9 甲基化和 gps2 和 pol2 结合水平的相对变化. 条形图表示3个副本的样本平均值, 其样本平均值为 * p & lt; 0.05 和 * * p & lt; 0.01, 与学生的 t 检验方法进行了计算。这一数字是根据 cardamone 等人的。请点击这里查看此图的较大版本.
图 12 显示了使用从 wt 或 gps2-ako 小鼠中分离的 bat 的 chip-qpcr 实例.在发现 gps2 在不同细胞系2中表达核编码线粒体基因所必需之后, 我们测试了在两个特定的核编码线粒体基因 ndv1 和tomm20上招募 gps2 的方法。小鼠的 bat 作为线粒体中高度丰富的组织的一个例子。我们首先比较了 gps2 启动子在 gps2-ako 小鼠和野生类型的垃圾中的占用率, 观察到 gps2-ako 小鼠在 bat 中的选择性靶向基因的 gps2 结合预期会减少。使用这里描述的协议, 我们还记录了 gps2-ako 小鼠在 bat 中增加的 rna 聚合酶 2 (pol2) 和抑制性组蛋白标记 h3k9me3, 而不是野生类型的垃圾。对于所有抗体, 与在 igg 控制样本中观察到的背景信号相比, 结合意义重大。这些结果证实了在选定的核编码线粒体基因上招募 gps2, 并表明 gps2 是防止 h3k9me3 积累所必需的, 因此对于目标促进剂的 pol2 转录活性的停滞是必需的。有关抗体和原始出版物的更多详细信息, 请参见材料表, 以获取更多数据和对这些结果的更全面讨论2。
图 2: 从 bat 分离出的原始测序读取的质量分数图.(a) 质量得分反映了对基调用过程中错误概率的预测。它通常表示为整数值 q =-10log10(P), 其中 p 是基调用中出错的概率。上面显示的是 fastqc 基于最佳可得技术生成的未经处理的原始排序读取生成的每个基本序列质量图。(b) 适配器去除后读取的 gc 内容分布, 并从 bat 样品中读取修剪。gc 含量应大致类似于以物种实际占基因组含量为中心的正态分布。请点击这里查看此图的较大版本.
在图 2中,测序质量得分显示在每个基别的水平, 读取可以通过修剪任何剩余适配器污染和删除读取, 其中平均质量分数低于指定的阈值。还显示了适配器删除和读取修剪后跨读取的 gc 内容分布。序列质量和 gc 内容分布是在执行计算分析之前评估下一代测序数据的两个广泛使用的指标。这些结果表明, 该协议产生了与 bat 分离的足够数量的与下一代测序技术兼容的高质量染色质。
图 3: 从 wt 和 gps2-ako 小鼠的 bat-seq 数据生成的规范化大文件.这个图显示了沿slc25a25 基因位点的归一化读取覆盖率, 在启动子区域有一个明显的称为峰值。gps2 通过改变目标基因启动子的染色质状态来调节核编码线粒体基因的表达。这些结果显示了一个显著称为峰值的代表性核编码线粒体基因的可视化。请点击这里查看此图的较大版本.
如图 3所示, 是 wt 和 gps2-ako 对齐面 bam 文件的大图格轨道, 这些文件已归一化到1x 深度 (按基因组覆盖读取), 在深度工具中实现。显示的是位于线粒体基因slc25a25 启动子区域的统计显著峰的存在。归一化轨道允许可视化的读取与所谓的峰值相对应的内容, 并减少在 gps2-ako 小鼠的 bat 上的读数。
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Discussion
这里描述的协议是一个有价值的工具, 执行 chip 从小鼠组织, 专门针对棕色脂肪组织进行优化。在从组织中执行 chip 时面临的更大挑战之一是在样品制备过程中恢复足够数量的细胞。使用组织均质器搅拌机与不锈钢珠子代替规范的玻璃牙, 将 bat 剪切, 可显著减少因未破裂的组织而丢失的细胞数量。此外, 将组织直接在低渗缓冲液中均质, 有助于释放脂质, 然后通过高速离心轻松分离并从细胞核中取出。
正确的超声对于执行一致且可重现的 chip 检测也至关重要。使用水浴超声纳可以同时处理多个样品, 从而提高染色质剪切的重现性, 并降低样品交叉污染的风险。此外, 使用温控超声系统可减少样品过热, 应避免这样做, 以防止样品降解和抗体丧失表位识别 (详见材料表)。
另一个具有挑战性的步骤是免疫沉淀复合物的恢复。磁珠通常是此步骤的首选, 因为它们允许在与磁性机架一起使用时更快、更有效地进行清洗。然而, 与蛋白质 a 琼脂糖相比, 它们的 dna 回收率较低, 这在使用少量起始材料时可能是一个严重的限制。我们发现, 蛋白质 a 琼脂糖浆料与 pvdf 0.45μm 离心滤柱的组合是一个伟大的解决方案, 以最小的洗涤时间和更高的重现性实现最大的 dna 产量。
关于 dna 分离, 可以使用大量基于列的 dna 分离试剂盒。根据我们的经验, 这种方法的一个局限性是柱对 dna 恢复的产量有影响的能力。为了克服这个问题, 我们更喜欢使用更传统的方法作为表热氯仿提取 dna。
列出的 chip-seq 管道包含了许多广泛接受的工具和实用程序, 用于下一代测序实验。简单地说, 读取将使用 fastqc 和三叉戟进行基本质量控制, 然后使用 bowtie2 与小鼠 mm10 基因组对齐。在通过 macs2 算法进行峰值调用之前, 将通过映射质量对生存读取进行筛选。但是, 应当指出, 还可以根据实验的性质和正在生成的数据, 使用其他可用和经过验证的工具。在预处理、对齐或峰值调用过程中使用任何自定义参数也可能是适当的。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advence | BBX24 | |
| Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter | Next Advence | SSB32 | |
| Bioruptor Sonicator | Diagenode | ||
| 1.5 mL Micro Tube TPX Plastic | Diagenode | C30010010-5 | |
| Complete-Protease inhibitor | Roche | 11836145001 | |
| Protein A Agarose Slurry | Invitrogen | 101041 | |
| GPS2 antibody | In house | Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018) | |
| Pol2 antibody | Diagenode | C15100055 | |
| h3K9me3 antibody | Millipore | 05-1242 | |
| Fast Syber Green Master Mix | Aplied Biosytem | 4385612 | |
| ViiA7 | Aplied Biosytem | ||
| TruSeq ChIP Library Preparation Kit | Illumina | IP-202-1012 | |
| HiSeq 2000 | Illumina |
References
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