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Developmental Biology

आरएनए-प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल में मानव प्राथमिक Fibroblasts के reprogramminging आधारित

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58687
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Dermatology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Stem Cell Biobank and Disease Modeling Core, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

Summary

यहाँ हम एक नैदानिक प्रासंगिक, उच्च दक्षता, फीडर मुक्त विधि का वर्णन करने के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में मानव प्राथमिक fibroblasts reprograming संशोधित mRNAs एंकोडिंग reprogram कारकों और परिपक्व microRNA-367/ भी शामिल reprogramminging दक्षता का आकलन करने के लिए तरीके हैं, क्लोनल iPSC कालोनियों का विस्तार, और pluripotency मार्कर तर्-1-60 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें ।

Abstract

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) मानव विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है । इसके अलावा आगे बढ़ने के रूप में iPSCs एक अपक्षयी चिकित्सकीय एक सुरक्षित, मजबूत, और समीचीन regenerativeing प्रोटोकॉल की आवश्यकता है । यहां, हम एक गैर-एकीकृत दृष्टिकोण का उपयोग iPSCs में मानव चमड़े का fibroblasts के अत्यंत उच्च दक्षता reprogramminging के लिए एक नैदानिक प्रासंगिक, कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल के कोर pluripotency कारकों व्यक्त करने के होते है (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD संलयन) इन विट्रो से संशोधित RNAs के साथ संश्लेषित दूत न्यूक्लियोटाइड (संशोधित mRNAs) । reprogramminging संशोधित mRNAs प्राथमिक fibroblasts में transfected है हर ४८ घंटे के साथ एक साथ परिपक्व भ्रूण स्टेम सेल-विशिष्ट microRNA-367/ परिणामी iPSC कालोनियों को फिर पृथक किया जा सकता है और सीधे फीडर मुक्त स्थितियों में विस्तारित । दक्षता और fibroblast नमूनों भर में हमारे reprogramminging प्रोटोकॉल की निरंतरता को अधिकतम करने के लिए, हम आरएनए अभिकर्मक आहार, transfections के समय, संस्कृति की स्थिति, और सीडिंग घनत्व सहित विभिन्न मापदंडों को अनुकूलित किया है । महत्वपूर्ण बात, हमारे विधि सबसे fibroblast स्रोतों से उच्च गुणवत्ता वाले iPSCs उत्पंन करता है, जिसमें मुश्किल से पुनः कार्यक्रम रोगग्रस्त, वृद्ध, और/

Introduction

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) में दैहिक कोशिकाओं reprogramminging प्रतिलेखन कारकों का एक कोर सेट है कि pluripotency1,2को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है की विस्तारित अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए iPSCs का निर्माण करते समय, यह आवश्यक है कि इनपुट कोशिकाओं में उत्परिवर्तन का बोझ प्रसंस्करण के दौरान छोटा किया जाता है और iPSC पीढ़ी की कुशलता रोगी नमूनों में अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर बनाए रखी जाती है । हालांकि, एकीकरण-मुक्त प्रोटोकॉल सहित reprogramminging तरीकों के बहुमत, बहुत कम reprogramminging क्षमता है, जो इन3दृष्टिकोण के नैदानिक उपयोगिता की सीमा से ग्रस्त है । कम reprogramminging दक्षता भी मौजूदा उत्परिवर्तनों ले जाने कोशिकाओं के चयनात्मक reprogramminging को बढ़ावा देने, परिणामस्वरूप iPSCs में उत्परिवर्तन बोझ बढ़ सकता है । इसके अलावा, सभी डीएनए आधारित reprogramminging तरीकों, जैसे lentivirus-और episomal आधारित दृष्टिकोण, सुरक्षा चिंता है कि डीएनए बेतरतीब ढंग से जीनोम में एकीकृत कर सकते है और हानिकारक संमिलनत्मक mutagenesis और अवांछित के लिए अवसर बनाने से पीड़ित ( संभावित oncogenic) बहाव ऊतक डेरिवेटिव में pluripotency जीन की अभिव्यक्ति4.

एक होनहार दृष्टिकोण दैहिक कोशिकाओं में pluripotency के कुशल प्रेरण प्राप्त करने और परिणामी iPSCs में उत्परिवर्तन बोझ को कम करने के लिए सिंथेटिक छाया दूत RNAs युक्त संशोधित nucleobases (संशोधित mRNAs)5reprogramminging के लिए उपयोग है । संशोधित mRNA आधारित reprogramminging दृष्टिकोण की दक्षता आगे भ्रूण स्टेम सेल जोड़कर बढ़ाया जा सकता है (ESC)-विशिष्ट microRNAs (miRNAs)-367/302s3, जो वृद्धि की क्षमता 6 के साथ दैहिक कोशिकाओं reprogramming करने के लिए दिखाया गया है ,7. हालांकि, यहां तक कि miRNAs-367/302s के अलावा, संशोधित mRNA-आधारित reprogramminging approach अक्सर अनुप्रयोग के दौरान हौसले से अलग रोगी कक्ष3के लिए विफल रहता है । इस संशोधित mRNA-आधारित दृष्टिकोण की विसंगतियों को संबोधित करने के लिए, हम हाल ही में एक अनुकूलित, एकता मुक्त रणनीति है कि एक उच्च सफलता दर और इस्तेमाल दोनों संशोधित mRNAs एंकोडिंग के साथ मानव प्राथमिक fibroblasts में pluripotency लाती है की सूचना दी है reprogramminging कारकों और परिपक्व miRNA-367/ हमारे विधि में, reprogramminging संशोधित mRNA कॉकटेल OCT4 का एक संशोधित संस्करण शामिल MyoD transactivation डोमेन (एम3ओ कहा जाता है)9 और पांच अंय reprogramminging कारकों (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, और NANOG) के साथ जुड़े । संशोधित mRNA के साथ pluripotency कारकों एंकोडिंग miRNA नकल के संयोजन इस प्रोटोकॉल में reprogramminging क्षमता पर एक synergistic प्रभाव है दिखाई दिया । आरएनए अभिकर्मक आहार के अतिरिक्त अनुकूलन, सेल सीडिंग, और संवर्धन की स्थिति भी एक अल्ट्रा उच्च स्तर8के लिए दृष्टिकोण की reprogramminging दक्षता बढ़ाने के लिए आवश्यक थे ।

कई अंय प्रोटोकॉल के विपरीत, हमारे reprogramminging दृष्टिकोण आमतौर पर केवल कुछ हजार इनपुट fibroblasts की आवश्यकता है । इसके अलावा, कई आम गैर एकीकृत episomal plasmids, सेंडाइ वायरस, या आत्म-नकल आरएनए का उपयोग रणनीति व्यापक passaging उत्पंन iPSCs में reprogramminging वेक्टर पतला शामिल है । इसके विपरीत, संशोधित mRNA और परिपक्व miRNA नकल एक छोटी आधा जीवन है और तेजी से कोशिकाओं से सफाया कर रहे हैं । एक साथ ले लिया, रोगी के नमूनों को इकट्ठा करने और प्रयोग करने योग्य iPSCs की पीढ़ी के बीच संचई सेल संस्कृति समय की राशि इस दृष्टिकोण में कम है, प्रभावी रूप से परिणामी iPSCs में उत्परिवर्तन संचय सीमित है और लागत प्रभावशीलता में सुधार ।

यहां, हम विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल को प्राप्त करने के लिए उच्च-दक्षता reprogramminging वयस्क मानव fibroblasts के iPSCs में हमारे मिश्रित संशोधित mRNA/miRNA-आधारित8दृष्टिकोण का उपयोग कर । इस आरएनए-आधारित reprogramminging प्रोटोकॉल एक सरल, लागत प्रभावी, और मजबूत सृजन के लिए विधि प्रदान करता है-अनुसंधान और संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मुक्त iPSCs । इसके अलावा, यह मुश्किल-reprogramming, रोग से जुड़े, वृद्ध, और वृद्ध होनेवाला fibroblasts सहित fibroblast लाइनों की एक किस्म के reprogramminging के लिए लागू है । मानव fibroblasts reprogramminging के लिए प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट में मानव वयस्क प्राथमिक fibroblasts के तीन कुओं reprogramminging के लिए एक विधि का वर्णन करता है । दो कुओं आमतौर पर उच्च गुणवत्ता iPSC कालोनियों की पर्याप्त संख्या में उपज । कई मामलों में, केवल एक अच्छी तरह से आवश्यक है, और तीसरी अच्छी तरह से reprogramminging दक्षता के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि आवश्यक हो तो कुओं की संख्या को स्केल किया जा सकता है ।

Protocol

RNase के तहत काम-मुक्त शर्तों और जब संभव अपूतित तकनीकों का उपयोग करें । एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सभी सेल संस्कृति से संबंधित जोड़तोड़ प्रदर्शन अपूतित तकनीकों का उपयोग कर । मानव कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए संस्थागत सुरक्षा मानकों का पालन करें ।

1. reagenting दीक्षा की तैयारी के लिए रिएजेंट और उपकरण

  1. संशोधित-mRNA कॉकटेल एंकोडिंग reprogramminging कारकों तैयार करें ।
    1. पहले प्रकाशित किया गया प्रोटोकॉल10 इन विट्रो प्रतिलेखन, कैपिंग, और प्रत्येक संशोधित mRNA एन्कोडिंग व्यक्तिगत reprogramminging कारक के लिए dephosphorylation प्रक्रियाओं में करने के लिए का पालन करें । अंतिम शुद्धि चरण के बाद, nuclease-मुक्त पानी के साथ संशोधित mRNA elute, 1 U/µ l RNase अवरोधक के साथ शुद्ध संशोधित mRNA समाधान के पूरक, quantitate संशोधित mRNAs का उपयोग कर एक spectrophotometer, और स्टोर पर-८० ° c 6 महीनों के लिए. फ्रीज-गल चक्र की संख्या को कम करने के लिए प्रत्येक संशोधित mRNA के कई aliquots तैयार करें ।
      नोट: संशोधित mRNA उत्पादन के लिए समान प्रोटोकॉल कहीं रिपोर्ट किया गया है5,8,11. में इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए टेंपलेट्स संबंधित प्लाज्मिड से पीसीआर प्रवर्धन द्वारा उत्पंन किया जा सकता है पहले से प्रकाशित10प्रोटोकॉल के अनुसार सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध प्राइमरों का उपयोग कर टेंपलेट्स । प्लाज्मिड टेम्पलेट्स प्रत्येक reprogramminging कारक के लिए (एम3ओ9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) और mWasabi (नियंत्रण के लिए अभिकर्मक) Addgene, एक गैर लाभ प्लाज्मिड भंडार से उपलब्ध हैं ।
    2. मिश्रण एक साथ सभी संशोधित mRNAs के एक दाढ़ अनुपात में 3:1:1:1:1:1 (एम3ओ: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) और mWasabi दक्षता के लिए एक नियंत्रण के रूप में 10% mRNA संशोधित अभिकर्मक शामिल हैं । 1 U/µ l RNase अवरोध करनेवाला के साथ पूरक nuclease-नि: शुल्क पानी जोड़कर १०० एनजी/µ एल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूरा संशोधित mRNA reprogramminging मिश्रण की एकाग्रता को समायोजित करें । पूरी संशोधित mRNA कॉकटेल के ७ ३३ µ l aliquots तैयार करें । -८० ° c पर मिश्रित reprogramminging aliquots की दुकान ।
      नोट: प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, १,००० संशोधित mRNA कॉकटेल के एनजी (यानी, 3 कुओं के लिए ३,००० एनजी की कुल) प्रति अच्छी तरह से जोड़ा जाता है । प्रत्येक ३३ µ एल aliquot एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट के transfect 3 कुओं के आकार का है और शामिल है 3 µ एल अतिरिक्त मात्रा के pipetting त्रुटियों के लिए खाते में । तैयारी ७ ३३ µ l aliquots एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट में 3 कुओं का एक पूर्ण fibroblast reprogramminging पूरा करने के लिए पर्याप्त है ।
  2. reprogramminging miRNA नकल की कॉकटेल तैयार करते हैं ।
    1. भंग lyophilized miRNA नकल (Syn-त्यही-मीर-302a-3p, Syn-त्यही-मीर-302b-3p, Syn-त्यही-मीर-302c-3p, Syn-has-मीर-302d-3p, Syn-has-मीर-367-3p) a 5 pmol/µ l (5 µ m) nuclease में अंतिम एकाग्रता-नि: शुल्क पानी के साथ पूरक 1 U/µ अवरोध करनेवाला के एल. लंबी अवधि के भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक miRNA नकल और स्टोर के कई aliquots तैयार करें ।
    2. 5 pmol/µ l (5 µ m) के अंतिम एकाग्रता के लिए एक 1:1:1:1:1 दाढ़ अनुपात में सभी miRNA नकल मिश्रण. तैयार ७ १४ µ l aliquots की miRNA नकल करता मिक्स. -८० डिग्री सेल्सियस पर मिश्रित aliquots स्टोर ।
      नोट: प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, miRNA नकल के 20 pmol मिश्रण के प्रति अच्छी तरह से जोड़ा जाता है (यानी, 3 कुओं के लिए ६० pmol की कुल) । प्रत्येक 14 µ l aliquot एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट के transfect 3 कुओं के आकार का है और pipetting त्रुटियों के लिए खाते के लिए अतिरिक्त मात्रा के 2 µ एल भी शामिल है. तैयारी ७ १४ µ l aliquots एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट में 3 कुओं का एक पूर्ण fibroblast reprogramminging पूरा करने के लिए पर्याप्त है ।
  3. अभिकर्मक बफ़र तैयार करें ।
    1. पूर्व गर्म १ ५०० मिलीलीटर की बोतल और १ १०० मिलीलीटर की बोतल ताजा कम-सीरम मध्यम करने के लिए कमरे के तापमान (RT) के लिए लगभग 2 ज. पानी के नहाने का प्रयोग न करें ।
    2. एक पीएच मीटर एक सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्थानांतरण । nuclease-फ्री वॉटर के साथ मीटर के ग्लास इलेक्ट्रोड को धो लें । है विनिर्माण निर्देशों के अनुसार पीएच मीटर जांचना । nuclease-मुक्त पानी के साथ इलेक्ट्रोड फिर से धोएं ।
    3. कम सीरम मध्यम की दोनों बोतलों को सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित । पीएच को समायोजित करने के लिए ५०० एमएल आरटी बोतल का उपयोग करें ।
    4. बफर में पीएच मीटर के ग्लास इलेक्ट्रोड डालने के द्वारा कम सीरम माध्यम के आधार पीएच उपाय. मीटर पर पीएच पढ़ने से पहले 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।
    5. 1 मीटर NaOH के 3-4 मिलीलीटर कम सीरम मध्यम के ५०० मिलीलीटर में जोड़ें, बोतल बंद, और अच्छी तरह से मिश्रण । पीएच माप के लिए बोतल खोलने से पहले 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें । बफर में पीएच मीटर इलेक्ट्रोड डालें और पीएच मीटर स्थिर पर पढ़ने तक प्रतीक्षा करें ।
    6. 1 मीटर NaOH की छोटी मात्रा में जोड़ने के लिए जारी रखें जब तक कम सीरम माध्यम का पीएच 8.15-8.17 तक पहुंचता है । प्रक्रिया के दौरान पीएच मीटर कई बार जांचना । यदि किसी भी बिंदु पर पीएच ८.१८ से अधिक हो जाता है, यह पूर्व से गर्म १०० मिलीलीटर बोतल (कदम 1.3.1) ताजा कम सीरम माध्यम जोड़कर इसे कम करें ।
      नोट: कम-सीरम मध्यम-आधारित अभिकर्मक बफ़र का पीएच महत्वपूर्ण है । reprogramminging सफल होगा अगर अभिकर्मक बफर के पीएच के बारे में ८.२ ± ०.०५ है, लेकिन अगर पीएच ८.२५ से अधिक है विफल हो सकता है । इसलिए, यह NaOH जोड़ने को रोकने की सलाह दी है एक बार बफर पीएच 8.15-8.17 तक पहुंचता है । यह सुनिश्चित करेगा कि अभिकर्मक बफर के अंतिम पीएच लगभग 8.2-8.22 नसबंदी के बाद है ।
    7. फ़िल्टर एक ०.२२ µm वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर अभिकर्मक बफर निष्फल । Aliquot में निष्फल बफर 5 या 15 मिलीलीटर ट्यूबों ंयूनतम हवा अंतरिक्ष के साथ ।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 महीने के लिए अभिकर्मक बफर के aliquots स्टोर । aliquots के पीएच को समय पर मापने । यदि पीएच ८.२५ से अधिक है, तो aliquots छोड़ें । सीमा aliquot उपयोग 2 transfections केवल अभिकर्मक बफर के वायुमंडलीय हवा के लिए जोखिम के बाद से बफर के पीएच बढ़ जाती है ।
  4. fibroblast विस्तार मध्यम (फेम): न्यूनतम आवश्यक मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1x glutamine अनुपूरक, ५५ µ एम 2-mercaptoethanol, 1x कलम/strep/fungizone के साथ पूरक तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर फेम की दुकान ।
  5. reprogramminging माध्यम तैयार: DMEM/F12 (कोई HEPES) 20% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (KOSR) के साथ पूरक, 0.5 x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 0.5 x glutamine पूरक, ५५ µ एम 2-mercaptoethanol, ५० µ जी/एमएल ascorbic एसिड, 1x पेन/strep/fungizone, १०० एनजी/एमएल bFGF , और २०० एनजी/एमएल B18R । bFGF और B18R बिना reprogramminging की दीक्षा में मध्यम तैयार है, और यह 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । तैयारी के बाद 1 माह से आगे इसका प्रयोग न करें । उस दिन के उपयोग के लिए एक aliquot आकार के प्रत्येक उपयोग से पहले bFGF और B18R तुरंत जोड़ें ।
  6. १.५ कदम से bFGF और B18R बिना 20% KOSR युक्त reprogramminging मध्यम में 5% गर्मी-निष्क्रिय (हाय) FBS जोड़कर चढ़ाना माध्यम तैयार करें । इरादा उपयोग के दिन मध्यम ताजा तैयार करते हैं । reprogramminging के दिन 0 पर उपयोग करने से पहले तुरंत bFGF और B18R जोड़ें ।
  7. निर्माता के निर्देश के अनुसार reprogramminging शुरू करने से पहले ऊतक संस्कृति मशीन जांचना एक handheld डिजिटल CO2 विश्लेषक का उपयोग कर । सफल iPSC पीढ़ी को सुनिश्चित करने के लिए reprogramminging कदम के लिए एक कम-ओ2 मशीन का प्रयोग करें ।

2. reprogramminging के लिए संवर्धन Fibroblasts

  1. reprogramminging (day-2) की दीक्षा से पहले fibroblasts तैयार करें ।
    1. कोट ०.१% जिलेटिन की 5 मिलीलीटर के साथ एक नया 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट । नल या थाली घूमता सुनिश्चित करें कि पूरी सतह लेपित है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन । महाप्राण जिलेटिन और 10 मिलीलीटर की जोड़ें । अलग सेट । थाली की लेपित सतह की अनुमति के लिए फेम जोड़ने से पहले शुष्क मत करो ।
    2. fibroblasts से गुजारे हुए माध्यम को सावधानीपूर्वक महाप्राण । अवशिष्ट सीरम को हटाने के लिए DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं कुल्ला । trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे कोशिकाओं पर पूरा कवरेज सुनिश्चित करने के लिए प्लेट रॉक ।
    3. महाप्राण अतिरिक्त द्रव, जा ~ ५०० trypsin के µ एल । महाप्राण नहीं है, क्योंकि यह शुष्क और fibroblasts को मार सकता है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए trypsin-EDTA के साथ fibroblasts की मशीन ।
    4. मशीन से थाली निकालें और दृढ़ता से, लेकिन धीरे थाली की ओर नल कोशिकाओं को उखाड़ देना । माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें । यदि कोशिकाएं अलग और तैरते हैं तो आगे बढ़ें । यदि कोशिकाओं को अभी भी संलग्न हैं, एक और 3 मिनट के लिए मशीन ।
    5. जल्दी कुल्ला/trypsin-EDTA बेअसर करने के लिए फेम के 5 मिलीलीटर का उपयोग कर अलग कोशिकाओं को इकट्ठा । fibroblast सस्पेंशन को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ले जाएं । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं ।
    6. धीरे कोशिकाओं के बड़े झुरमुट को तोड़ने के लिए सेल निलंबन मिश्रण है, तो एक hemocytometer पर उन्हें गिनती । स्थानांतरण २.५ x 105 कोशिकाओं में जिलेटिन-लेपित 10-cm पकवान 2.1.1 चरण में तैयार किया । ३७ ° c, 5% सह2 humidified नियमित रूप से ऊतक संस्कृति मशीन में रात भर कोशिकाओं को गर्मी ।
      नोट: सेल घनत्व उच्च reprogramminging दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि fibroblasts स्वस्थ और तेजी से विभाजित कर रहे हैं । चढ़ाना २.५ x 105 कोशिकाओं की पैदावार एक 40-60% प्रवाह 2 दिन बाद सबसे fibroblast नमूनों के लिए । रोग या वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के लिए तदनुसार राशि समायोजित वांछित 40-60% को प्राप्त करने के लिए प्रवाह ४८ ज बाद में ।
    7. 10 मिलीलीटर ताजा स्त्री के साथ मध्यम बदलें (दिन-1) ।
  2. प्लेट reprogramminging शुरू करने के लिए fibroblasts (0 दिन) ।
    1. सत्यापित करें कि reprogramme किया जा करने के लिए 40 – 60% प्रवाह (चित्रा 2, दिन 0) पर हैं । यदि कोशिकाओं को खत्म कर रहे है या के अंतर्गत-धाराप्रवाह, fibroblasts चरण २.१ में वर्णित के रूप में पारित और चढ़ाना घनत्व तदनुसार समायोजित करें । एक और 2 दिनों के लिए संस्कृति ।
    2. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में DPBS के 4 मिलीलीटर स्थानांतरण । रिकॉमबिनेंट ह्यूमन (आरएच) laminin-५२१ के १०० µ एल जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
    3. एक 6-अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं में पतला rhLaminin-५२१ के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें । 2 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर लेपित थाली मशीन
    4. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मध्यम चढ़ाना के 6 मिलीलीटर और 4 मिलीलीटर गर्म । bFGF के साथ चढ़ाना मध्यम १०० एनजी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूरक/एमएल और २०० एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए B18R ।
    5. ध्यान से fibroblasts (कदम 2.2.1) से खर्च मध्यम महाप्राण । DPBS के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और trypsin-EDTA के 3 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे प्लेट रॉक trypsin-EDTA के साथ कोशिकाओं को कवर करने के लिए ।
    6. महाप्राण अतिरिक्त द्रव, जा ~ ५०० trypsin के µ एल, के रूप में कदम 2.1.3 में किया । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए trypsin-EDTA के साथ fibroblasts की मशीन । मशीन से थाली निकालें और दृढ़ता से, लेकिन धीरे थाली की ओर नल कोशिकाओं को हटाना । माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें । यदि कोशिकाएं अलग और तैरते हैं तो आगे बढ़ें । यदि कोशिकाओं को अभी भी संलग्न हैं, एक और 3 मिनट के लिए मशीन ।
    7. कुल्ला/trypsin-EDTA बेअसर करने के लिए अलग कोशिकाओं की 5 मिलीलीटर का उपयोग कर लीजिए । fibroblast सस्पेंशन को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ले जाएं । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे है और उंहें एक hemocytometer पर गिनती । पिपेट १२,००० कोशिकाओं चरण 2.2.4 से गर्म चढ़ाना मध्यम के 4 मिलीलीटर में ।
      नोट: किसी भी बिंदु पर कोशिकाओं को नहीं केंद्रापसारक । मढ़वाया कोशिकाओं की संख्या को समायोजित किया जा सकता है या नीचे के रूप में धीमी गति से या तेजी से बढ़ती लाइनों, क्रमशः के लिए आवश्यक है ।
    8. लेपित कुओं से मशीन और महाप्राण पतला rhLaminin-५२१ से लेपित थाली निकालें । कुएँ की सतह को सूखने नहीं दें. धीरे चढ़ाना माध्यम में कोशिकाओं को स्थगित । पिपेट एक अच्छी तरह से लेपित में सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर (यानी, अच्छी तरह से प्रति ३,००० कोशिकाओं) ।
    9. 5% (कम-o2) के लिए2 सेट के साथ एक त्रिकोणीय गैस ऊतक संस्कृति मशीन में मढ़वाया कोशिकाओं प्लेस । एक बार थाली नीचे सेट, धीरे लेकिन अच्छी तरह से एक ऊपर के बीच बारी से कोशिकाओं को फैलाने/ गति दोहराएं 2 अधिक बार । रात भर कोशिकाओं गर्मी । मिश्रण करने के लिए थाली भंवर मत करो ।
    10. पिपेट एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए मध्यम reprogramminging के 4 मिलीलीटर और यह एक ढीला टोपी के साथ कम-ओ2 मशीन में जगह रात भर equilibrate । अगले दिन तक bFGF और B18R न डालें ।

3. पुनर्प्रोग्रामिंग की दीक्षा (day 1)

नोट: एक बार reprogramminging शुरू की है, दैनिक रखरखाव लगभग 1 महीने के लिए आवश्यक है । तदनुसार योजना सुनिश्चित करें । बाद में सभी सेल मशीन ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% CO 2, 5% ओ2 humidified त्रिकोणीय गैसऊतक संस्कृति मशीन में कम-o2 शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।

  1. चढ़ाना मध्यम से कम 1 अभिकर्मक से पहले ज बदलें ।
    1. कम-ओ2 मशीन से equilibrated reprogramminging मध्यम निकालें । १०० एनजी/एमएल और B18R के अंतिम एकाग्रता के लिए bFGF जोड़ें २०० एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए । अच्छी तरह मिलाएं ।
    2. एक बार में 1 अच्छी तरह से आगे बढ़ने, खर्च माध्यम को हटाने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें और यह bFGF और B18R के साथ पूरक reprogramminging मध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित । यह एक अच्छी तरह के लिए दोहराएं । वैक्यूम आकांक्षा, जो जरूरत से ज्यादा सूख कोशिकाओं का उपयोग न करें, तनाव का कारण बनता है, और reprogramminging दक्षता कम कर देता है । कम-O2 मशीन में वापस कोशिकाओं के साथ थाली हटो ।
  2. Transfect fibroblasts के 5 µ l के साथ RNAiMax अभिकर्मक रिएजेंट के प्रति 1 µ g को संशोधित mRNA के, और 1 µ l के अभिकर्मक रिएजेंट प्रति 6 pmol की miRNA नकल की प्रति अभिकर्मक.
    नोट: इष्टतम परिणाम प्राप्त कर रहे है जब transfections के लिए आगे बढ़ना 16 – 20 एच । अभिकर्मक रिएजेंट 10x पतला है; १०० एनजी/µ एल संशोधित mRNA कॉकटेल पतला 5x है; और 5 pmol/µ l miRNA नकल मिश्रण अभिकर्मक बफर के साथ 8.33 एक्स पतला है जटिल करने से पहले । अभिकर्मक सेटअप के किसी सारांश के लिए तालिका 1 देखें ।
    1. अभिकर्मक की तैयारी घोला जा सकता है, जबकि मानक प्रयोगशाला अभ्यास का पालन करके RNase के लिए रिएजेंट के संभावित जोखिम को कम ।
    2. Equilibrate एक aliquot के अभिकर्मक बफर (चरण १.३) के लिए लगभग 1 ज आरटी पर । अभिकर्मक बफर गर्म करने के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान या मशीन का उपयोग न करें ।
    3. संशोधित mRNAs (३३ µ एल) और miRNA की नकल (14 µ एल) के एक एकल aliquot निकालें-८० ° c और उंहें लगभग 3-5 मिनट के लिए आर टी, गल तक गर्म । ३७ डिग्री सेल्सियस पर aliquots गल न करें । उंहें एक microfuge में संक्षिप्त नीचे स्पिन ।
    4. लगभग 3-5 मिनट के लिए आर टी के लिए अभिकर्मक रिएजेंट गर्म । एक ३७ ° c पानी स्नान या मशीन का उपयोग न करें । बंद ट्यूब को पलटना 2-3 बार रिएजेंट मिश्रण करने के लिए । यह एक microfuge में संक्षेप में नीचे स्पिन ।
    5. एक RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब में आरटी अभिकर्मक बफर के २७९ µ एल स्थानांतरण । ३१० µ एल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए अभिकर्मक रिएजेंट के 31 µ l जोड़ें pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । भंवर मत करो । 1 मिनट के लिए आर टी पर ट्यूब मशीन ।
      नोट: पतला अभिकर्मक एजेंट की यह मात्रा जटिल दोनों संशोधित mRNA और miRNA नकल aliquots से कदम 3.2.3 करने के लिए पर्याप्त है ।
    6. १३२ µ l को भ अभिकर्मक बफ़र के ३३ µ l aliquot को संशोधित mRNA के लिए जोड़ें । धीरे पिपेट मिश्रण करने के लिए: अंतिम मात्रा १६५ µ एल है ।
    7. १०२.६ µ l को भ अभिकर्मक बफर के 14 µ l aliquot को miRNA नकल का जोड़. धीरे पिपेट मिश्रण करने के लिए: अंतिम मात्रा ११६.६ µ एल है ।
    8. कदम से पतला संशोधित mRNA के लिए कदम 3.2.5 से पतला अभिकर्मक एजेंट के १६५ µ एल जोड़ें 3.2.6 । पिपेट मिश्रण करने के लिए: अंतिम मात्रा ३३० µ एल है ।
    9. कदम 3.2.7 से पतला miRNA नकल मिश्रण करने के लिए चरण 3.2.5 से पतला अभिकर्मक एजेंट के ११६.६ µ एल जोड़ें । मिश्रण अच्छी तरह से (अंतिम मात्रा २३३.२ µ एल है) । आरटी में 15 मिनट के लिए मशीन संशोधित mRNAs और miRNA नकल के साथ जटिल करने के लिए अभिकर्मक बफर अनुमति देते हैं ।
    10. कम-ओ2 मशीन से कोशिकाओं के साथ प्लेट निकालें । १०० µ l (1 µ g) को एक अच्छी तरह से mRNA अभिकर्मक मिश्रण के साथ, एक कुआं के पार dropwise । धीरे से अभिकर्मक परिसरों फैलाने पर अच्छी तरह से एक के साथ थाली आंदोलन/नीचे तो छोड़ दिया/ मिश्रण करने के लिए थाली भंवर मत करो ।
    11. जोड़ें ६६.७ µ एल (20 pmol) के परिसर में miRNA नकल अभिकर्मक मिश्रण को एक अच्छी तरह से, भर में dropwise । धीरे से अभिकर्मक परिसरों फैलाने पर अच्छी तरह से एक के साथ थाली आंदोलन/नीचे तो छोड़ दिया/ मिश्रण करने के लिए थाली भंवर मत करो ।
    12. transfected कोशिकाओं को 5% (कम-ओ2) के लिए ओ2 सेट के साथ त्रिकोणीय गैस मशीन में रखें । एक बार थाली नीचे सेट है, अभिकर्मक परिसरों फिर से फैलाने से धीरे लेकिन अच्छी तरह से एक के साथ थाली आंदोलन/नीचे तो छोड़ दिया/
    13. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में reprogramminging मध्यम के 4 मिलीलीटर पिपेट और यह रात भर equilibrate को ढीला टोपी के साथ कम ओ2 मशीन में जगह है । अगले दिन तक bFGF और B18R न डालें ।
ट्यूब 1-RNAiMax कमजोर पड़ने (1 मिश्रण)
अभिकर्मक एकाग्रता वॉल्यूम
अभिकर्मक बफर २७९ µ l
RNAiMax (2 जोड़ें) 10x 31 µ l
कुल: ३१० µ एल
(गर्मी कमरे के तापमान पर 1 मिनट)
ट्यूब 2-संशोधित mRNA मिश्रण (2 मिश्रण)
अभिकर्मक एकाग्रता वॉल्यूम
संशोधित mRNA मिश्रण १०० एनजी/µ एल (5x) ३३ µ l
अभिकर्मक बफर १३२ µ l
कुल: १६५ µ एल
(1 ट्यूब से पतला RNAiMax के बराबर मात्रा जोड़ें)
ट्यूब 3-miRNA नकल मिश्रण (3 मिश्रण)
अभिकर्मक एकाग्रता वॉल्यूम
miRNA नकल मिश्रण 5 pmol/µ l (8.33 x) 14 µ l
अभिकर्मक बफर १०२.६ µ l
कुल: ११६.६ µ एल
(1 ट्यूब से पतला RNAiMax के बराबर मात्रा जोड़ें)

तालिका 1: अभिकर्मक मिश्रण की तैयारी ।

4. Transfections (दिन 2, 4, 6, 8, 10, और 12) के बीच replacinging माध्यम की जगह

  1. 3.1.1-3.1.2 में वर्णित के रूप में मध्यम 16 – 20 एच पोस्ट-अभिकर्मक बदलें । १०० एनजी/एमएल और B18R के अंतिम एकाग्रता के लिए bFGF जोड़ें मध्यम aliquots reprogramminging में २०० एनजी/
  2. मॉनिटर mWasabi अभिव्यक्ति दैनिक EGFP कल्पना करने के लिए विन्यस्त एक खुर्दबीन का उपयोग अभिकर्मक गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए.
    नोट: mWasabi अभिव्यक्ति न्यूनतम दिन पर स्पष्ट होना चाहिए 2 और प्रत्येक अतिरिक्त अभिकर्मक के साथ चमक में वृद्धि.

5. हर-दूसरे दिन Transfections (दिन 3, 5, 7, 9, 11, और 13)

  1. चरण ३.२ में वर्णित के रूप में अभिकर्मक निष्पादित करें । अभिकर्मक के दिनों पर यम को न बदलें ।
  2. reprogramminging मध्यम के एक 4 मिलीलीटर aliquot तैयार है और यह निम्न दिन पर मध्यम परिवर्तन के लिए equilibrate करने के लिए कम ओ2 मशीन में जगह है । अगले दिन तक bFGF और B18R न डालें ।

6. अंतिम अभिकर्मक के बाद निष्पादित की जाने वाली प्रक्रियाएँ

  1. दैनिक माध्यम से 14 दिन से लगभग 17 दिन के माध्यम से परिवर्तन करते हैं । ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए reprogramminging मध्यम के 7 मिलीलीटर गर्म । १०० एनजी/एमएल के अंतिम एकाग्रता के लिए bFGF जोड़ें ।
    नोट: अंतिम अभिकर्मक के बाद B18R अब आवश्यक नहीं है । 14 दिन के अलावा, यह अब कम-ओ2 मशीन में रात के माध्यम equilibrate करने के लिए आवश्यक है ।
  2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर सभी कुओं से मध्यम निकालें । आकांक्षा के उपयोग से बचने के लिए जारी रखें । अच्छी तरह से प्रति bFGF के साथ पूरक reprogramminging मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. 17 और 18 दिनों में, एक उल्टे या विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पुनर्कार्यक्रमित कुओं का विश्लेषण करें । यदि कालोनियों में reprogramminging की उच्च दक्षता के कारण एक दूसरे के करीब निकटता में गठन कर रहे है और मैंयुअल रूप से अलग नहीं किया जा सकता, नीचे दिए गए चरण 7 में वर्णित reprogramminged कुओं की एक वैकल्पिक passaging प्रदर्शन से कालोनियों अलग । यदि कालोनियों विरल और अच्छी तरह से अलग हैं, मैंयुअल रूप से reprogramme से सीधे क्लोन लेने के रूप में अच्छी तरह से चरण 8 और उपसंस्कृति में वर्णित मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ।

7. वैकल्पिक प्रक्रिया: reprogramme का उपयोग करके reprogramme कोशिकाओं

  1. ०.५ मीटर EDTA शेयर सॉल्यूशन को कमजोर करके DPBS (EDTA) में ०.५ mM EDTA तैयार करें । एक ०.२२ µm वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली का उपयोग कर EDTA निष्फल फिल्टर ।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार फीडर-फ्री pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) मीडियम (उदा., mTeSR1) तैयार करें । पीएससी मध्यम से ३७ डिग्री सेल्सियस के पूर्व गर्म ३२ मिलीलीटर ।
  3. कोट दो 6 के सभी कुओं-अच्छी तरह से hESC-योग्य extracellular मैट्रिक्स के साथ प्रारूप प्लेटों (ECM) निर्माता के निर्देशों का पालन । आयल फिल्म के साथ सील प्लेटें और आरटी में 1 ज के लिए उंहें मशीन ।
  4. प्री-वार्म प्लेट्स से ECM सॉल्यूशन को महाप्राण और इसकी जगह 2 एमएल प्रति पीएससी मीडियम से अच्छी तरह से बदल दें । कुएँ की सतह को सूखने नहीं दें. उंहें एक तरफ सेट करें ।
  5. महाप्राण 2 reprogramminged कुओं से एक दिन जब कालोनियों बड़े है और स्पष्ट रूप से (आमतौर पर 18 दिन) का गठन किया । EDTA और महाप्राण के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला ।
  6. EDTA के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए मशीन ।
  7. धीरे मशीन से प्लेट हटाने और यह सुरक्षा कैबिनेट में जगह है ।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं बहुत शिथिल पालन और आसानी से उखाड़ फेंकना हो सकता है ।
  8. जतन से दोनों कुओं से महाप्राण EDTA । EDTA के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इलाज के लिए पूर्व गर्म पीएससी मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें । एक सेल खुरचनी का उपयोग करने के लिए धीरे लेकिन अच्छी तरह से दोनों कुओं से कोशिकाओं को उखाड़ देना ।
  9. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग धीरे सेल निलंबन पिपेट और बड़े झुरमुट को तोड़ने के लिए । जब तक सभी सेल के झुरमुट नहीं चले जाते तब तक मत पिपेट । iPSC क्लस्टर्स रक्षित ।
    नोट: बड़े झुरमुट चढ़ाना iPSC कॉलोनी वृद्धि को प्रभावित नहीं करेगा । अगर वहां जरूरत से ज्यादा बड़े सेल के झुरमुट हैं, बस उंहें अगले पकवान में स्थानांतरित से बचें ।
  10. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, समान रूप से प्रत्येक EDTA से कोशिकाओं को वितरित-ECM-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं में pipetting ०.५ मिलीलीटर द्वारा अच्छी तरह से इलाज किया ।
    नोट: reprogrammeed कुओं से कोशिकाओं को गठबंधन नहीं है (यानी, अच्छी तरह से फिर से कार्यक्रम 1 समान रूप से पहले 6 अच्छी तरह से थाली में वितरित किया जाना चाहिए, और अच्छी तरह से reprogrammeed 2 समान रूप से दूसरी 6 में वितरित किया जाना चाहिए अच्छी तरह से थाली) ।
  11. मढ़वाया कोशिकाओं को कम-ओ2 मशीन में वापस ले जाएं । समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए, प्रत्येक थाली को वापस हिला और आगे और पक्ष के पक्ष में । घूमता नहीं । पीएससी मीडियम को रोजाना बदलें ।

8. उठा iPSC कालोनियां

  1. पीएससी मध्यम से ३७ डिग्री सेल्सियस के पूर्व गर्म 15 मिलीलीटर । कोट hESC-योग्य ECM के साथ एक एकल 6 अच्छी प्लेट के सभी कुओं निर्माता के निर्देशों का पालन । आयल फिल्म के साथ प्लेटें सील और आरटी में 1 ज के लिए उंहें मशीन ।
  2. कुओं से संस्कृति माध्यम महाप्राण iPSCs इकट्ठा किया जा रहा है. EDTA और महाप्राण के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कुल्ला । EDTA के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें । 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए मशीन । जबकि कोशिकाओं की गर्मी है, महाप्राण से ECM समाधान पूर्व गर्म प्लेटों और प्रति अच्छी तरह से पीएससी मध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित । प्लेटें अलग सेट करें ।
  3. धीरे iPSCs के साथ प्लेट को दूर करने के लिए मशीन से उठाया जाएगा और यह सुरक्षा कैबिनेट में जगह है ।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं बहुत शिथिल पालन और आसानी से उखाड़ फेंकना हो सकता है ।
  4. जतन महाप्राण EDTA. बहुत धीरे पूर्व गर्म पीएससी माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, ध्यान iPSC कालोनियों को बेदखल करने के लिए नहीं ले ।
  5. कालोनियों को बेहतर ढंग से विज़ुअलाइज़ करने के लिए प्लेट को उल्टे या विदारक दायरे में ले जाएं । एक बाँझ टिप के साथ एक 1 मिलीलीटर पिपेट तैयार करें । दबाना गोताख़ोर पूरी तरह से, तो पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए धीरे एक कॉलोनी परिमार्जन जबकि धीरे टिप में तरल ड्राइंग को कॉलोनी इकट्ठा । iPSC कॉलोनी उठा जबकि संभव के रूप में छोटे माध्यम के रूप में ड्रा.
  6. इस कॉलोनी का हस्तांतरण करने के लिए, पिपेट ऊपर और नीचे 3-4 बार ८.२ कदम से ECM लेपित प्लेट की एक भी अच्छी तरह से । 6 कालोनियों उठाया और व्यक्तिगत कुओं में स्थानांतरित कर दिया गया है जब तक दोहराएँ । चरण 7 में वर्णित एक वैकल्पिक passaging का प्रदर्शन किया गया है, तो कोई भी एक अच्छी तरह से 2 से अधिक कालोनियों उठाओ ।
  7. एक मानक मानव स्टेम सेल प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए नीचे सभी शेष कुओं फ्रीज । गल और फिर से प्लेट जमे हुए शेयरों अगर और अधिक कालोनियों बाद में उठाया जाना चाहिए ।

9. iPSCs का लक्षण वर्णन

  1. (18 दिन) reprogramminging दक्षता के विश्लेषण के लिए तर्-1-60 धुंधला प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: 3 में से 2 पुनर्कार्यक्रम कुओं भविष्य कॉलोनी उठा के लिए पारित कर रहे हैं । शेष अच्छी तरह से तर्-1-60 धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह प्रक्रिया प्रयोगशाला पीठ शीर्ष पर किया जा सकता है ।
    1. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से धो reprogramme । 5 मिनट के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ ठंडा मेथनॉल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
    2. महाप्राण मेथनॉल. लगभग 2 मिनट के लिए अच्छी तरह से सूखी अधिक सूखी नहीं सावधान रहना । कोशिकाओं को काफी सूख गया है जब वे एक पारदर्शी/
    3. अच्छे झटकों के साथ 5 मिनट के लिए पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से 3 बार धो लें । धोने के दौरान, पंजाब में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 3 मिलीलीटर तैयार करते हैं ।
    4. पंजाबियों को महाप्राण । पतला पेरोक्साइड समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें । कोमल मिलाते के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए मशीन । ब्लॉकिंग समाधान के 4 मिलीलीटर तैयार: पंजाब में 10% गोजातीय-सीरम एल्ब्युमिन (BSA) ।
    5. पेरोक्साइड समाधान महाप्राण । 5 मिनट के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से 2 बार धो लें ।
    6. महाप्राण पंजाबियों और अच्छी तरह से में अवरुद्ध समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आरटी पर 1 एच के लिए मशीन ।
    7. अच्छे झटकों के साथ 5 मिनट के लिए पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से 3 बार धो लें ।
    8. कमजोर प्राथमिक विरोधी-तर्-1-60 एंटीबॉडी में 1:100 अवरुद्ध समाधान में ०.०५% सोडियम azide के साथ पूरक । एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप पकवान के 1 अच्छी तरह के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने की 1 मिलीलीटर तैयार करें । अच्छी तरह से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने जोड़ें और वाष्पीकरण से बचने के लिए parafilm के साथ प्लेट लपेट । कोमल मिलाते के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन कोमल मिलाते के साथ आरटी पर 1 एच के लिए किया जा सकता है । प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने से 5 बार फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    9. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन के बाद, अच्छी तरह से धो 3 बार के साथ 1 पंजाबियों की मिलीलीटर कोमल झटकों के साथ 5 मिनट के लिए ।
    10. द्वितीयक एंटी-माउस एचआरपी-संयुग्मित एंटीबॉडी अवरोध समाधान में 1:200 पर पतला है । कोमल मिलाते के साथ आर टी पर 2 एच के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ अच्छी तरह से मशीन ।
    11. माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने महाप्राण और अच्छी तरह से धोने के साथ 3 बार 5 मिनट के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ कोमल मिलाते हुए ।
    12. तीसरे धोने के दौरान, निर्माता के निर्देश के बाद सब्सट्रेट समाधान तैयार करते हैं । फाइनल वॉश के बाद महाप्राण ने पंजाबियों. सब्सट्रेट समाधान और मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें जब तक वांछित रंग विकसित (लगभग 10 मिनट).
    13. महाप्राण सब्सट्रेट समाधान. कुल्ला 5 मिनट के लिए पानी के साथ अच्छी तरह से जबकि धीरे मिलाते हुए ।
    14. कालोनियों गिनती, यदि वांछित । reprogramminging दक्षता = (कालोनियों की संख्या)/(मढ़वाया fibroblasts की संख्या) x १००% ।
    15. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, महाप्राण पानी से सना हुआ प्लेट और हवा में रात भर के लिए आर टी पर सूखी parafilm और स्टोर के साथ सूख थाली सील 4 ° c पर 2 साल तक के लिए reprogramminging दक्षता का आकलन करने के लिए बाद में ।

Representative Results

यह आमतौर पर लगभग लेता है 5-6 सप्ताह fibroblast reprogramminging की दीक्षा से iPSCs की पहली शीशियों के जमने के लिए (चित्रा 1) । reprogramminging प्रोटोकॉल आम तौर पर दो चरणों में वर्गीकृत किया जा सकता है । चरण 1 fibroblast संस्कृति और सात transfections, reprogramminging आरएनए कॉकटेल के साथ शामिल किया गया हर ४८ एच. 2 चरण में अलगाव, विस्तार, और iPSC कालोनियों के लक्षण वर्णन भी शामिल है ।

प्रोटोकॉल की शुरुआत करने से पहले यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि fibroblasts का पुनर्कार्यक्रम किया जाना अच्छी गुणवत्ता का हो । स्वस्थ fibroblasts धुरी के आकार का, द्विध्रुवी, और लगभग 24 घंटे के एक दोहरीकरण समय के साथ refractile प्रकट होना चाहिए । 0 दिन तक, २५०,००० दिन पर एक 10 सेमी डिश में मढ़वाया कोशिकाओं-2 40 के लिए जाना चाहिए-60% प्रवाह (1 चित्रा, दिन 0) और लगभग उपज 6-10 x 105 कोशिकाओं । एक धीमी दर पर proliferating कोशिकाओं दिन-2 पर एक उच्च घनत्व पर चढ़ाना और 0 दिन पर reprogramminging के लिए के लिए क्षतिपूर्ति किया जा सकता है ।

Fibroblasts (चित्रा 2, दिन 1) reprogramminging के लिए एक 6 अच्छी तरह से प्रारूप पकवान की एक अच्छी तरह से चढ़ाना के बाद बहुत विरल दिखाई देना चाहिए । चौबीस घंटे पहले अभिकर्मक के बाद, fibroblasts उनके धुरी आकार खो देंगे और एक और अधिक गोल आकृति विज्ञान (चित्रा 2, दिन 2), जो remaindering के शेष के माध्यम से बनाए रखा है को अपनाने । mWasabi mRNA से हरी प्रतिदीप्ति 2 दिन पर ंयूनतम चौकस होना चाहिए और चमक में लगातार वृद्धि 4 दिन से स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकता है । mWasabi प्रतिदीप्ति का पता लगाने की क्षमता गुंजाइश संवेदनशीलता और सेटअप पर निर्भर कर सकते हैं । सेल घनत्व धीरे और लगातार पहले तीन transfections (दिन 1-6) भर में वृद्धि होगी, 7 और 8 दिनों के बीच होने वाले प्रसार में एक स्पष्ट फट के साथ । कोशिकाओं को मोटे तौर पर 10 दिन (चित्रा 2, 10 दिन) से धाराप्रवाह दिखाई देना चाहिए । पहले iPSC कालोनियों के रूप में 11 दिन के रूप में जल्दी प्रकट कर सकते है (चित्रा 2, दिन 11); हालांकि, कालोनियों 18 दिन के रूप में देर के रूप में जब तक चौकस नहीं हो सकता है । आम तौर पर, 15 दिनों तक-18, वहां बड़े और स्पष्ट iPSC कालोनियों कि आसपास से स्पष्ट रूप से अलग कर रहे हैं, पूरी तरह से reprogramme (चित्रा 2, दिन 15 और चित्रा 3, 17 दिन) होगा । pluripotency मार्कर के लिए Immunostaining तर्-1-60 reprogramminging दक्षता (चित्रा 3, 17 दिन, तर्-1-60) का आकलन करने के लिए किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, सबसे fibroblast लाइनों (चित्रा 3, इनसेट बी) पुनर्नियोजित प्रति कालोनियों के सैकड़ों उपज ।

इष्टतम चढ़ाना घनत्व हमारे प्रोटोकॉल में reprogramminging के कम दक्षता के लिए सबसे आम कारण है और अक्सर fibroblasts है कि रोगग्रस्त हैं, वृद्ध होनेवाला के साथ जुड़ा हुआ है, और/ अगर चढ़ाना घनत्व बहुत कम है, वहां reprogramminging के अंत में बड़े acellular बंजर पैच होगा (आंकड़ा 4c), और iPSC कालोनियों (चित्रा 4d) फार्म नहीं हो सकता है । reprogrammeed बहुत दिन 14 से धाराप्रवाह होना चाहिए ( चित्रा 4a और 4B की तुलना चित्रा 2, दिन 14) । इसी तरह, अगर कोशिकाओं को भी घनी या पैदा करना भी जल्दी से चढ़ाया जाता है, reprogramminging दक्षता नाटकीय रूप से कम है ।

रोगी व्युत्पंन iPSCs की एकरूपता बनाए रखने के लिए, यह एक एकल कॉलोनी से सेल लाइनों का विस्तार करने के लिए महत्वपूर्ण है । reprogramminging दक्षता हमारे प्रोटोकॉल में बहुत अधिक है के बाद से, पड़ोसी iPSC कालोनियों के करीब निकटता में फार्म का हो सकता है और एक दूसरे में विकसित (चित्रा 3, दिन 15-17) । यह कई बार क्लोनिंग विस्तार के लिए एक एकल कॉलोनी को यांत्रिक रूप से अलग करना कठिन बना देता है । हमने पाया है कि यह पहली यात्रा एक अच्छी तरह से कार्यक्रम और यह एक बड़ा संस्कृति क्षेत्र भर में पतला करने के लिए उपयोगी है । एक अच्छा मार्ग अनुपात समान रूप से विभाजन के होते है एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट अच्छी तरह से एक पूरे 6 अच्छी तरह से थाली में ।

कमजोर पड़ने बीतने के बाद, iPSCs कालोनियों के रूप में विकसित और आसानी से fibroblasts से अलग कर रहे है (चित्रा 5, 18 दिन) । शुरू में, iPSC कालोनियों ढीला पैक किया जा सकता है, और व्यक्तिगत कोशिकाओं को एक अपेक्षाकृत बड़े cytoplasmic क्षेत्र है । 4 के दौरान-7 दिन, iPSCs पैदा करना और परिभाषित किनारों के साथ एक विशेषता कसकर-पैक कॉलोनी के रूप में । कॉलोनी के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं प्रमुख nucleoli (चित्रा 5, दिन 22) के साथ एक बड़े परमाणु अंश है । वहाँ कई कॉलोनियों होना चाहिए कि एक अच्छी तरह से फार्म, और केवल क्लासिक iPSC आकृति विज्ञान के साथ उन विस्तार के लिए उठाया जाना चाहिए.

Figure 1
चित्रा 1 : मानव fibroblasts की reprogramminging में प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) । मानव fibroblasts के reprogramminging के लिए एक योजनाबद्ध प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । Fibroblasts पहले एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप पकवान, सात ४८ ज अंतराल पर प्रदर्शन transfections के बाद की एक अच्छी तरह से एक कम घनत्व पर पारित कर रहे हैं । मध्यम प्रत्येक अभिकर्मक के बाद 16 – 20 ज की जगह है । reprogrammeed पहले लगभग 18 दिन में पारित कर रहे हैं, और क्लोन कालोनियों 26 दिन से उठाया जाता है । आमतौर पर, fibroblast-व्युत्पंन iPSC लाइनों दिन ३८ द्वारा लंबी अवधि के भंडारण के लिए जम सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि दैनिक reprogramminging के प्रत्येक दिन के दौरान छवियां । Fibroblasts लगभग 40-60% के लिए पुनर्प्रोग्रामिंग शुरू करने के लिए पारित होने के समय में धाराप्रवाह होना चाहिए (0 दिन, कोशिकाओं को एक 10 सेमी डिश में चढ़ाया जाता है) । पहली अभिकर्मक (T1) दिन 1 पर होता है, और कोशिकाओं को इस बिंदु पर बहुत विरल दिखाई देना चाहिए. अगले दिन (दिन 2), एक और अधिक गोल आकृति विज्ञान स्पष्ट हो जाना चाहिए । कोशिकाओं को iPSC के रूप में 11 दिन के रूप में जल्दी प्रकट शुरू समूहों के साथ प्रोटोकॉल भर में घनत्व में वृद्धि जारी रहेगा (लाल रंग में घेरे) । 15 दिन तक, iPSC कालोनियों विचारशील सीमाओं के साथ बड़े हो जाएगा । स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : कॉलोनी गठन reprogramminging संशोधित mRNAs और miRNA नकल के साथ निंनलिखित transfections । कम आवर्धन छवियों को 15 दिनों में एक प्रतिनिधि reprogramminging के लिया गया था-17 । अंतिम अभिकर्मक के बाद, reprogrammeed निर्धारित सीमाओं के साथ स्पष्ट कालोनियों कि आकार में विस्तार और गाढ़ा करने के लिए स्पष्ट रूप से fibroblasts आसपास के reprogrammeed से अलग हो गया होगा । pluripotency मार्कर के लिए Immunostaining तर्-1-60 iPSCs (इनसेट ए) की उपस्थिति को इंगित करता है और एक ही अच्छी तरह से (इनसेट बी, हरी में घेरे बेशुमार कालोनियों के उदाहरण) के भीतर सभी कालोनियों की गिनती से reprogramminging दक्षता की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : reprogramminging के लिए उप इष्टतम चढ़ाना घनत्व के प्रतिनिधि छवियां । (A, B) fibroblasts के उदाहरण है कि reprogramminging के 14 दिन से भी विरले हैं ( चित्रा 2, दिन 14) की तुलना करें । (ग) एक बड़े, बंजर पैच लाल रंग में घेरे के साथ reprogramminging के 17 दिन पर कम आवर्धन छवि । (घ) एक ही अच्छी तरह से तय किया गया था और के लिए दाग तर्-1-60 कम सेल घनत्व के कारण समग्र गरीब reprogramminging दक्षता की पुष्टि करने के लिए । स्केल पट्टियां = २०० µm (A, B), और 1 mm (C, D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : iPSCs के प्रतिनिधि छवियां प्रारंभिक बीतने के बाद । reprogramminging संशोधित mRNAs और miRNA नकल के साथ transfections पूरा करने के बाद, reprogramminged कोशिकाओं को 17 दिनों के द्वारा पारित कर रहे है-20 । iPSCs पीएससी माध्यम में वृद्धि लाभ है और तेजी से किसी भी fibroblasts है कि पूरी तरह से reprogrammeed थे आगे निकल । शुरू में, iPSCs कालोनियों कि खराब परिभाषित सीमाओं के साथ ढीला दिखाई दे सकता है फार्म होगा । कई दिनों के भीतर, कोशिकाओं को तेजी से पैदा करना और एक उच्च नाभिक से कोशिका द्रव्य अनुपात के साथ कसकर पैक कोशिकाओं की विशेषता आकृति विज्ञान पर ले, कसकर अलग सीमाओं के साथ कालोनियों में clustering । स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक नैदानिक-प्रासंगिक, गैर एकीकृत, आरएनए-आधारित विधि है कि एक अल्ट्रा उच्च दक्षता पर iPSCs में सामांय और रोग से जुड़े मानव fibroblast लाइनों के reprogramminging के लिए अनुमति देता है । तारीख करने के लिए, हर मानव fibroblast लाइन हम वर्णित प्रोटोकॉल के साथ reprogram करने का प्रयास किया है बहाव अनुप्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता iPSCs की एक संतोषजनक संख्या में झुकेंगे । परिणामस्वरूप iPSCs तुरंत स्थानांतरित किया जा सकता है और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति में विस्तार ।

reprogramminging के लिए fibroblasts की गुणवत्ता:

reprogramminging सफलता भारी fibroblasts शुरू करने की गुणवत्ता पर निर्भर है । आदर्श रूप में, reprogramminging सबसे कम बीतने fibroblasts उपलब्ध उच्चतम दक्षता प्राप्त करने के साथ शुरू किया जाना चाहिए । reprogramminging दक्षता बीतने के fibroblasts के साथ सबसे अच्छा है 2-4 । reprogramminging अभी भी उच्च बीतने के साथ काम कर सकते है (5 गद्यांश-8), यहां तक कि वृद्ध होनेवाला fibroblasts, हालांकि एक कम दक्षता के साथ । कई बार कम बीतने fibroblasts अनुपलब्ध है या रोगी के नमूने एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन है कि स्वस्थ विकास को रोकता है । इस मामले में, प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । समझौता fibroblast लाइनों के reprogramminging आमतौर पर आरएनए transfections के दौरान वृद्धि की कोशिका मृत्यु के साथ जुड़ा हुआ है । नतीजतन, reprogramminging में कोशिकाओं को अच्छी तरह से 10 दिनों से विरल होना दिखाई देगा reprogramminging के 14 । बड़े acellular क्षेत्रों में भी गजब के दृश्य दिखेंगे । यदि यह स्थिति है, reprogramminging प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी fibroblasts की एक उच्च प्रारंभिक प्रारंभ संख्या के साथ पुन: प्रारंभ करने के लिए । चढ़ाना ३,००० इनपुट कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 6-well प्रारूप पकवान सबसे वयस्क fibroblast लाइनों के लिए लगातार काम करता है । हालांकि, 5000-10000 (वृद्ध होनेवाला लाइनों के लिए ५०,०००) के लिए चढ़ाना संख्या में वृद्धि रोग से जुड़े नमूनों की reprogramminging में सुधार करने में मदद कर सकते हैं, हमारे पिछले8प्रकाशन में सूचित किया गया है के रूप में । इसके विपरीत, भी जल्दी reprogramminging के लिए प्रतिरोधी किया जा सकता है प्रवाह तक पहुंचने कोशिकाओं । यदि कोशिकाओं reprogramminging RNAs पैदा करना के साथ भी तेजी से transfections के दौर से गुजर (के रूप में प्राथमिक नवजात fibroblasts के साथ कभी-कभार मामला है), एक 6 अच्छी तरह से प्रारूप8डिश के प्रति ५०० fibroblasts के साथ reprogramminging शुरू ।

अभिकर्मक बफ़र की हैंडलिंग:

अभिकर्मक बफर के पीएच (कम सीरम ८.२ के पीएच को समायोजित मध्यम) इष्टतम अभिकर्मक इस reprogramminging प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक क्षमता को प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है । इस कारण से, अभिकर्मक बफ़र की हैंडलिंग के बारे में कई सावधानियों की सिफारिश की है । हमने पाया है कि अभिकर्मक बफर के वायुमंडलीय हवा के लिए भी कम जोखिम बफर के पीएच को प्रभावित करता है । इसलिए, अभिकर्मक बफर एक पेंच कैप कंटेनर में ंयूनतम हवा अंतरिक्ष के साथ aliquoted होना चाहिए (हम या तो 5 या 15 मिलीलीटर पेंच टोपी शंकु ट्यूबों का उपयोग करें) । आगे हवा जोखिम को कम करने के लिए, दो transfections की एक अधिकतम के लिए प्रत्येक अभिकर्मक बफर aliquot का उपयोग करें । अंत में, के बाद से तापमान प्रभावों पीएच, यह महत्वपूर्ण है कि अभिकर्मक बफर अभिकर्मक परिसरों के विधानसभा के लिए आर टी equilibrated है । यह ३७ ° c करने के लिए अभिकर्मक बफर गर्म नहीं करने की सलाह दी है ।

Passaging of iPSCs:

जबकि कई पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल reprogramminging के अंत में व्यक्तिगत iPSC कालोनियों उठा सिफारिश, यह जब reprogramminging की दक्षता बहुत अधिक है या यदि एक साथ कालोनियों क्लस्टर, के रूप में अक्सर मामला है प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है हमारे प्रोटोकॉल. इसलिए, यदि iPSC कालोनियां एक-दूसरे से निकटता में हैं, तो हम अनुशंसा करते है कि पहले मैंयुअल रूप से चुनने से पहले reprogrammeed iPSCs को फैलाने के लिए कक्षों का पता करें । इस जल्दी बीतने कदम प्रदर्शन करने के लिए कई फायदे हैं । कालोनियों के बाहर फैल उंहें और अधिक विकसित करने के लिए कमरे देता है, से उठा के लिए बहुत बड़ा कालोनियों उपज अंयथा मूल अच्छी तरह से प्राप्त किया जा सकता है । यह बहुत एक उठाया क्लोन से एक iPSC लाइन की स्थापना में सफलता की दर में सुधार । हम यह भी पाते है कि fibroblasts के साथ अतिरिक्त संस्कृति समय, हालांकि एक पतला अनुपात में, उठाया iPSC कालोनियों की औसत गुणवत्ता में सुधार करने के लिए प्रकट होता है । पूरी तरह से reprogrammeed reprogramme कारक है, जो मदद iPSCs स्थापित करने और फीडर मुक्त सेल संस्कृति की स्थिति में सीधे संक्रमण को कम करने के लिए जारी समर्थन प्रदान कर सकते हैं । Fibroblasts अनायास एक चयनात्मक विकास नुकसान iPSCs की तुलना में जब mTeSR1 में संस्कृति है । इसलिए, प्रदूषित fibroblast कोशिका जनसंख्या जल्दी से 3 के भीतर नगण्य मात्रा को पतला है-4 मार्ग ।

ऐसे Y-२७६३२ के रूप में रॉक अवरोधकों अक्सर मानव iPSCs की दिनचर्या संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हमने पाया है कि अक्सर और/Y-२७६३२ के साथ कुछ iPSC लाइनों की विस्तारित संस्कृति समग्र गुणवत्ता पर बचके प्रभाव हो सकता है । जब एक का झुरमुट passaging विधि का उपयोग कर, जैसे EDTA के साथ, Y-२७६३२ के बंटवारे के बाद iPSC व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं है । हम पूरी तरह से सभी iPSC अलगाव, विस्तार, या नियमित संस्कृति के लिए Y-२७६३२ के साथ पूरक मीडिया को खत्म कर दिया है ।

प्रोटोकॉल सीमाएं:

वर्णित आरएनए-आधारित reprogramminging दृष्टिकोण करने के लिए एक सीमा प्रारंभिक लागत और reprogramminging रिएजेंट की तैयारी के साथ जुड़े जटिलता है । हालांकि प्रारंभिक प्रक्रियाओं mRNA एजेंट उत्पन्न करने के लिए सभी नियमित हैं और पहले से वर्णित किया गया है (पीसीआर, इन विट्रो प्रतिलेखन, DNase उपचार, कैपिंग, dephosphorylation, शुद्धि), संचयी mRNA एजेंट का उत्पादन है एक अपेक्षाकृत लंबी और गैर तुच्छ प्रक्रिया । इस प्रोटोकॉल के लिए अंय प्रमुख चुनौती transfect कोशिकाओं हर ४८ एच की जरूरत है, reprogramminging प्रोटोकॉल के श्रम तीव्रता में वृद्धि । इन विचारों को प्रतिबंधित किया जा सकता है अगर केवल कुछ रोगी नमूनों की reprogramminging वांछित है । हालांकि, अगर प्राथमिक विचार नैदानिक प्रासंगिक iPSCs की पीढ़ी है या बहुत उच्च reprogramminging दक्षता प्राप्त करने, वर्णित आरएनए-आधारित reprogramminging दृष्टिकोण आदर्श है ।

संक्षेप में, वर्णित उच्च क्षमता आरएनए-आधारित reprogramminging विधि दैहिक कोशिका प्रकार के अनुकूलित अभिकर्मक क्षमता पर टिका के रूप में हमारे पिछले प्रकाशन8में वर्णित के रूप में reprogramminged किया जाएगा । आरएनए अभिकर्मक प्रोटोकॉल इस अध्ययन में प्रस्तुत अत्यधिक मानव प्राथमिक fibroblasts के लिए देखते हैं, लेकिन संभावित रूप से विभिन्न दैहिक कोशिकाओं की reprogramminging दक्षता में सुधार करने के लिए अन्य कोशिका प्रकार के अनुरूप किया जा सकता है ।

Disclosures

I.K. और G.B. एक पेटेंट आवेदन "तरीकों और reprogramminging कोशिकाओं के लिए रचनाओं" हकदार पर सह अंवेषकों हैं, पीसीटी आवेदन सं । पीसीटी/US2016/063258.

Acknowledgments

हम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से सहायता अनुदान के लिए आभारी है (T32AR007411-33) और कोलोराडो त्वचा रोगों के विश्वविद्यालय के अनुसंधान कोर सेंटर (P30AR057212) । हम Epidermolysis Bullosa (EB) रिसर्च पार्टनरशिप, EB मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, ईलाज EB चैरिटी, अपक्षयी Epidermolysis Bullosa रिसर्च एसोसिएशन (डेबरा) इंटरनेशनल, किंग Baudouin फाउंडेशन के Vlinderkindje फंड, और गेट्स का भी शुक्रिया अदा करते हैं । फ्रंटियर्स फंड.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid templates for PCR
pcDNA3.3_KLF4 Addgene 26815
pcDNA3.3_SOX2 Addgene 26817
pcDNA3.3_c-MYC Addgene 26818
pcDNA3.3_LIN28A Addgene 26819
pCR-Blunt_hM3O Addgene 112638
pCR-Blunt_hNANOG Addgene 112639
pCR-Blunt_mWasabi Addgene 112640
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics
Forward Primer Integrated DNA Technologies TTGGACCCTCGTACAGAAGC
TAATACG
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) Integrated DNA Technologies TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA
AAGACCA
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G  New England Biolabs S1411S
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix Agilent 600850-51
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate Trilink Biotechnologies N-1014
Antarctic Phosphatase New England Biolabs M0289L
DNase I NEB M0303S
MEGAscript T7 Transcription Kit ThermoFisher Scientific AM1334
Pseudouridine-5'-Triphosphate Trilink Biotechnologies N-1019
Riboguard RNase Inhibitor Lucigen RG90910K
RNA Clean & Concentrator ZymoResearch R1019
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic Qiagen MSY0000684
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic Qiagen MSY0000715
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic Qiagen MSY0000717
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic Qiagen MSY0000718
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic Qiagen MSY0000719
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) Fisher AM9937 Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics
Fibroblast culture and reprogramming
0.1% Gelatin in H2O StemCell technologies #07903
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System EMD Millipore SCGVU05RE Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 21985023
6-well plates (tissue culture treated) Corning 3516
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033
Fetal Bovine Serum Fisher 26-140-079
FGF Basic ThermoFisher Scientific phg0263
GlutaMax Supplement ThermoFisher Scientific 35050061 Glutamine supplement used for the prepration of media
Heat Inactivated FBS Gibco Technologies 10438026
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828010
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778500 The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent
MEM ThermoFisher Scientific 11095080
MEM Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140050
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985070 Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 31985062 Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL
10 M NaOH Sigma-Aldrich 72068 Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) Fisher AM9932  Use to dilute NaOH and wash a pH meter
Pen/Strep/Fungizone GE Healthcare SV30079.01
rhLaminin-521 ThermoFisher Scientific A29248 Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Life Technologies 14190144
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red Life Technologies 2520056
Vaccinia Virus B18R (CF) ThermoFisher Scientific 34-8185-86
iPSC culture
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs
EDTA, 0.5 M stock solution K&D Medical  RGF-3130 Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging
mTeSR1 StemCell Technologies 85850 Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts
Antibodies and Detection
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) Abcam ab97046
Tra-1-60 (mouse anti human) Stemgent 09-0010
Hydrogen Peroxide (30%) LabChem LC154301 Dilute to 3% with PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703100
Phosphate-buffered salin (PBS)  Hyclone SH30258.02 Supplied as 10x, dilute to 1x
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit Vector Laboratories SK-4800
Special Equipment
Description Notes
Biological safety cabinet
Regular humidified tissue culture incubator Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C.
Tri-gas humidified tissue culture incubator Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure.
pH Meter Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible.
Inverted microscope Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency.

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References

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  2. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
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  4. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
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  9. Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
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  11. Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).

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विकास जीवविज्ञान अंक १४१ प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) reprogramminging मानव संशोधित mRNAs चिकित्सकीय प्रासंगिक microRNAs (miRNAs) fibroblasts
आरएनए-प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल में मानव प्राथमिक Fibroblasts के reprogramminging आधारित
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McGrath, P. S., Diette, N., Kogut,… More

McGrath, P. S., Diette, N., Kogut, I., Bilousova, G. RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (141), e58687, doi:10.3791/58687 (2018).

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