Summary
Her vi beskriver en klinisk relevant, høj effektivitet, feeder-fri metode til at omprogrammere menneskelige primære fibroblaster til induceret pluripotente stamceller ved hjælp af modificerede mRNAs kodning omprogrammering faktorer og modne mikroRNA-367/302 efterligner. Også inkluderet er metoder til at vurdere omprogrammering effektivitet, Udvid klonede iPSC kolonier, og bekræfte udtryk pluripotency mærkestof TRA-1-60.
Abstract
Induceret pluripotente stamceller (iPSCs) har vist sig for at være et værdifuldt redskab til at studere menneskelig udvikling og sygdom. Yderligere fremme iPSCs som en regenerativ terapeutiske kræver en sikker, robust, og hensigtsmæssig omprogrammering protokol. Vi præsenterer her, en klinisk relevant, trinvise protokol for den ekstremt høj effektivitet omprogrammering af human dermal fibroblaster i iPSCs ved hjælp af en ikke-integration tilgang. Kernen i protokollen består af udtryk pluripotency faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) fra in vitro- transskriberede messenger RNA'er syntetiseret med modificerede nukleotider (modificeret mRNAs). De omprogrammering modificerede mRNAs er transfekteret i primære fibroblaster hver 48 timer sammen med modne embryonale stamceller-specifikke microRNA-367/302 efterligner for to uger. De resulterende iPSC kolonier kan så isoleret og direkte udvidet i feeder-fri betingelser. For at maksimere effektiviteten og sammenhængen i vores omprogrammering protokol over fibroblast prøver, vi har optimeret forskellige parametre, herunder RNA Transfektion regime, timing af transfections, dyrkningsbetingelserne og seeding tætheder. Vigtigere, genererer vores metode høj-kvalitets iPSCs fra de fleste fibroblast kilder, herunder vanskeligt at omprogrammere syge, ældre og/eller senescent prøver.
Introduction
Omprogrammering somatiske celler til induceret pluripotente stamceller (iPSCs) kræver udvidet udtryk af et kernesæt af transkriptionsfaktorer, der er vigtige for opretholdelsen af pluripotency1,2. Når producerer iPSCs til kliniske anvendelser, er det vigtigt, at den mutationsmønstre byrde i inputcellerne minimeres under behandling og effektiviteten af iPSC generation er fastholdt på et relativt højt niveau på tværs af patientprøver. Men størstedelen af omprogrammering metoder, herunder integration-frie protokoller, lider af meget lavt omprogrammering effektivitetsfordele, som grænse kliniske anvendelighed af disse nærmer sig3. Den lave omprogrammering effektivitet kan også fremme selektive omprogrammering af celler transporterer forudbestående mutationer, øge mutationsmønstre byrde i resulterende iPSCs. Derudover lider alle DNA-baserede omprogrammering metoder såsom lentivirus - og episomal-baserede tilgange, af sikkerhed angå at DNA tilfældigt kan integrere i genomet og skabe mulighed for skadelige pattedyrsceller mutagenese og uønskede ( potentielt muterede) udtryk pluripotency gener i downstream væv derivater4.
En lovende metode til at opnå effektiv induktion af pluripotency i somatiske celler og reducere mutationsmønstre byrde i resulterende iPSCs er at bruge syntetiske udjævnede messenger RNA'er indeholdende modificeret nucleobases (modificeret mRNAs) til omprogrammering af5. Effektiviteten af modificerede mRNA-baserede omprogrammering tilgange kan styrkes yderligere ved at tilføje embryonale stamceller (ESC)-specifikke MicroRNA (miRNAs)-367/302s3, som har vist sig at omprogrammere somatiske celler med øget effektivitet6 ,7. Men selv med tilføjelsen af miRNAs-367/302s, den modificerede mRNA-baserede omprogrammering tilgang ofte mislykkes under ansøgning til frisk isoleret patient celler3. Til adresse uoverensstemmelser af denne ændrede mRNA-baseret tilgang, har vi for nylig rapporteret en optimeret, integration-gratis strategi, der inducerer pluripotency i menneskelige primære fibroblaster med en høj succesrate og udnytter begge modificerede mRNAs kodning omprogrammering faktorer og modne miRNA-367/302 efterligner8. I vores metode omfatter den omprogrammering modificerede mRNA cocktail en modificeret version af OCT4 sammenvokset med MyoD transactivation domæne (kaldet M3O)9 og fem andre omprogrammering faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A og NANOG). Kombinerer den modificerede mRNA kodning pluripotency faktorer med miRNA syntes efterligner at have en synergistisk effekt på omprogrammering effektivitetsgevinster i denne protokol. Yderligere optimeringer af RNA Transfektion regime, celle såning, og dyrkningsbaserede betingelser var også nødvendigt at øge omprogrammering effektiviteten af tilgang til en ultra-høj niveau8.
I modsætning til mange andre protokoller kræver vores omprogrammering tilgang typisk kun et par tusinde input fibroblaster. Derudover indebærer mange fælles ikke-integrere strategier via episomal plasmider, Sendai virus eller selvkopierende RNA, omfattende passaging for at fortynde den omprogrammering vektor i genererede iPSCs. Omvendt, modificerede mRNA og modne miRNA efterligner har en kort halveringstid og er hurtigt elimineret fra celler. Tilsammen, er mængden af kumulative celle kultur tid mellem indsamling patientprøver og generation af brugbare iPSCs minimal i denne tilgang, effektivt begrænser mutation ophobning i resulterende iPSCs og forbedre omkostningseffektiviteten.
Vi præsenterer her, den detaljerede trinvise protokol for at opnå høj effektivitet omprogrammering af voksne humane fibroblaster i iPSCs ved hjælp af vores kombinatorisk modificerede mRNA/miRNA-baseret tilgang8. RNA-baserede omprogrammering protokollen giver en enkel, omkostningseffektiv og robust metode til at generere integration-fri iPSCs for forskning og potentiale kliniske applikationer. Derudover er det relevant at omprogrammering af en bred vifte af fibroblast linjer herunder vanskeligt-at-Arbejd, sygdom-associerede, alderen, og senescent fibroblaster. En skematisk af protokollen for omprogrammering humane fibroblaster er vist i figur 1. Protokollen beskriver specifikt en metode til omprogrammering af tre wells af menneskelige voksen primære fibroblaster i en 6-godt format plade. To brønde give typisk et tilstrækkeligt antal kvalitets iPSC kolonier. I mange tilfælde kun én er godt nødvendig, og tredje godt kan bruges til analyse af omprogrammering effektivitet. Hvis det er påkrævet, kan antallet af brønde skaleres.
Protocol
Arbejde under RNase-fri betingelser og bruge aseptisk teknik når det er muligt. Udføre alle celle kultur-relaterede manipulationer i en biologisk sikkerhed kabinet med aseptisk teknik. Følg institutionelle biosikkerhed standarder for arbejde med humane celler.
1. reagenser og udstyr til fremstilling af omprogrammering indledning
- Forberede ændret mRNA cocktail kodning omprogrammering faktorer.
- Følg de tidligere udgivne protokol10 for at udføre i vitro transskription, udjævningen, og dephosphorylation procedurer for hver modificeret mRNA kodning enkelte omprogrammering faktor. Efter den endelige rensning skridt, elueres den modificerede mRNA med nukleasen-gratis vand, supplere den rensede modificerede mRNA løsning med 1 U/µL RNase inhibitor, kvantificere den modificerede mRNAs bruger et spektrofotometer og opbevares ved-80 ° C i op til 6 måneder. Forbered flere delprøver af hver modificeret mRNA at minimere antallet af fryse-tø cykler.
Bemærk: Lignende protokoller for modificerede mRNA produktion har været rapporteret et andet sted5,8,11. Skabeloner til in vitro- transskription kan genereres ved PCR-amplifikation fra tilsvarende plasmid skabeloner ved hjælp af primere, der er anført i Tabel af materialer ifølge tidligere udgivne protokol10. Plasmid skabeloner for hver omprogrammering faktor (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) og mWasabi (kontrol for Transfektion) er tilgængelige fra Addgene, en non-profit plasmid repository. - Bland alle de modificerede mRNAs på en kindtand forholdet mellem 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) og omfatter 10% mWasabi modificeret mRNA som kontrol for Transfektion effektivitet. Justere koncentrationen af den komplette modificerede mRNA omprogrammering blanding til en endelig koncentration på 100 ng/µL ved at tilføje nukleasen-gratis vand tilsat 1 U/µL RNase inhibitor. Forbered syv 33 µL delprøver af den komplette modificerede mRNA cocktail. Gemme de blandede omprogrammering alikvoter ved-80 ° C.
Bemærk: For hver Transfektion 1.000 ng af den modificerede mRNA cocktail er tilføjet pr. brønd (dvs. i alt 3.000 ng for 3 boringer). Hver 33 µL alikvot er dimensioneret til at transfect 3 wells af en 6-godt format plade og indeholder 3 µL af overskydende volumen for at tage højde for pipettering fejl. Forberede syv 33 µL delprøver er tilstrækkeligt til at fuldføre en fuld fibroblast omprogrammering af 3 brønde i en 6-godt format plade.
- Følg de tidligere udgivne protokol10 for at udføre i vitro transskription, udjævningen, og dephosphorylation procedurer for hver modificeret mRNA kodning enkelte omprogrammering faktor. Efter den endelige rensning skridt, elueres den modificerede mRNA med nukleasen-gratis vand, supplere den rensede modificerede mRNA løsning med 1 U/µL RNase inhibitor, kvantificere den modificerede mRNAs bruger et spektrofotometer og opbevares ved-80 ° C i op til 6 måneder. Forbered flere delprøver af hver modificeret mRNA at minimere antallet af fryse-tø cykler.
- Forberede Cocktailen af omprogrammering miRNA efterligner.
- Opløs frysetørret miRNA efterligner (Syn-har-miR-302a - 3p, Syn-har-miR-302b - 3p, Syn-har-miR - 302c - 3p, Syn-har-miR-302d-3 p, Syn-har-miR-367-3 p) til en 5 pmol/µL (5 µM) endelige koncentration i nukleasen-gratis vand tilsat 1 U/µL af RNase hæmmer. Forbered flere delprøver af hver miRNA efterligner og opbevares ved-80 ° C til langtidsopbevaring.
- Bland alle miRNA efterligner i forholdet 1:1:1:1:1 kindtand til en endelig koncentration på 5 pmol/µL (5 µM). Forbered syv 14 µL delprøver af miRNA efterligner mix. Gemme de blandede alikvoter ved-80 ° C.
Bemærk: For hver Transfektion føjes 20 pmol miRNA efterligner mix pr. brønd (dvs. ialt 60 pmol for 3 boringer). Hver 14 µL alikvot er dimensioneret til at transfect 3 huller i en 6-godt format pladen og omfatter 2 µL af overskydende volumen for at tage højde for pipettering fejl. Forberede syv 14 µL delprøver er tilstrækkeligt til at fuldføre en fuld fibroblast omprogrammering af 3 brønde i en 6-godt format plade.
- Forberede Transfektion buffer.
- Pre varm en 500 mL flaske og en 100 mL flaske frisk reduceret serum medium til stuetemperatur (RT) i ca 2 timer. Brug ikke et vandbad.
- Overføre et pH-meter til en biosikkerhed kabinet. Vask målerens glas elektrode med nukleasen-gratis vand. Kalibrering af pH-meter efter producentens anvisninger. Vask elektrode igen med nukleasen-gratis vand.
- Overføre begge flasker af nedsat serum medium til biosikkerhed kabinet. Bruge 500 mL RT flasken til at justere pH.
- Måle reduceret serum medium base pH ved at indsætte pH-meteret glas elektrode i bufferen. Vent op til 1 min før du læser pH-værdien på måleren.
- Tilsæt 3-4 mL 1 M NaOH i 500 mL af nedsat serum medium, Luk flasken og bland godt. Vent op til 5 min før du åbner flasken for pH-måling. Indsæt pH-meteret elektrode i bufferen og vente, indtil læsning på pH-meteret stabiliserer.
- Fortsæt med at tilføje små mængder af 1 M NaOH, indtil pH-værdi nedsat serum medium når 8.15-8.17. Kalibrering af pH-meter flere gange i løbet af processen. På ethvert tidspunkt pH bliver højere end 8.18, reducere det ved at tilføje friske reduceret serum medium fra pre varmede 100 mL flaske (trin 1.3.1).
Bemærk: Nedsat serum medium-baserede Transfektion buffer pH-værdi er afgørende. Omprogrammering vil være vellykket, hvis Transfektion buffer pH-værdi er omkring 8,2 ± 0,05 men kan mislykkes, hvis pH-værdien er højere end 8.25. Derfor, det tilrådes at stoppe tilføje NaOH, når den buffer pH når 8.15-8.17. Dette vil sikre, at den endelige pH Transfektion buffer er cirka 8.2-8,22 efter sterilisation. - Filter sterilisere Transfektion bufferen ved hjælp af et 0,22 µm vakuum filtreringssystem. Alikvot steriliseret bufferen til 5 eller 15 mL rør med minimal luftrum.
- Store delprøver af Transfektion buffer i op til 3 måneder ved 4 ° C. Måle pH-værdien af delprøver med jævne mellemrum. Kassér delprøver, hvis pH-værdien er højere end 8.25. Begrænse alikvot skik at 2 transfections kun da udsættelse af Transfektion buffer for atmosfærisk luft øger pH i bufferen.
- Forberede fibroblast ekspansion medium (FEM): minimum afgørende medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 1 x ikke-essentielle aminosyrer, 1 x Glutamin supplement, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 x pen/strep/fungizone. Butik Five ved 4 ° C.
- Forberede den omprogrammering medium: DMEM/F12 (ingen HEPES) suppleret med 20% knockout serum udskiftning (KOSR), 0,5 x ikke-essentielle aminosyrer, 0,5 x Glutamin supplement, 55 µM 2-mercaptoethanol, 50 µg/mL ascorbinsyre, 1 x pen/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF , og 200 ng/mL B18R. Forberede medium ved indledningen af omprogrammering uden bFGF og B18R, og opbevares ved 4 ° C. Brug det ikke ud over 1 måned efter forberedelse. Tilføje bFGF og B18R umiddelbart før hver anvendelse til en alikvot størrelse for at dagen brug.
- Forbered plating medium ved tilsætning af 5% varme-inaktiverede (HI) FBS i den omprogrammering medium indeholdende 20% KOSR uden bFGF og B18R fra trin 1,5. Forberede den medium friske dag af anvendelsesformål. Tilsæt bFGF og B18R umiddelbart før brugen på dag 0, omprogrammering.
- Kalibrere vævskultur væksthuse før indlede omprogrammering ifølge producentens anvisninger ved hjælp af en håndholdt digital CO2 analyzer. Bruge en lav-O2 inkubator for omprogrammering trin for at sikre vellykket iPSC generation.
2. dyrkning fibroblaster for omprogrammering
- Forberede fibroblaster forud for indledningen af omprogrammering (dag -2).
- Coat en ny 10 cm vævskultur plade med 5 mL af 0,1% gelatine. Tryk på eller swirl plade for at sikre, at hele overfladen er belagt. Inkuber i 15 min. ved 37 ° C. Opsug gelatine og der tilsættes 10 mL af FEM. sæt til side. Tillad ikke belagt overfladen af pladen til tørre, før du tilføjer FEM.
- Omhyggeligt Opsug den brugte medium fra fibroblaster. Skyl cellerne en gang med 5 mL af DPBS til at fjerne de resterende serum. Tilføj 3 mL trypsin-EDTA. Forsigtigt rock plade for at sikre fuldstændig dækning over cellerne.
- Aspirat overskydende væske, forlader ~ 500 µL af trypsin. Ikke over Aspirér, da dette kan tørre og dræbe fibroblaster. Inkuber fibroblaster med trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C.
- Fjerne pladen fra rugemaskinen og fast, men forsigtigt Tryk på siden af pladen til at løsne cellerne. Se celler under mikroskop. Hvis cellerne er fritliggende og flydende, fortsætte. Hvis celler er stadig knyttet, inkuberes i en anden 3 min.
- Hurtigt skylles/indsamle de fritliggende celler ved hjælp af 5 mL af Five til at neutralisere trypsin-EDTA. Flytte fibroblast suspension i en 15 mL konisk slange. Sikre, at cellerne er godt blandet.
- Forsigtigt blandes cellesuspension til at bryde store klumper af celler og derefter regne dem med en hemocytometer. Overførsel 2,5 x 105 celler i gelatine-belagt 10-cm parabol forberedt i trin 2.1.1. Inkuber celler overnatning i 37 ° C, 5% CO2 befugtet regelmæssig vævskultur inkubator.
Bemærk: Celle massefylde er afgørende for at opnå høj omprogrammering effektivitet, da det er vigtigt, at fibroblaster er sundt og hurtigt delende. Plating 2,5 x 105 celler giver en 40-60% confluency 2 dage senere til de fleste fibroblast prøver. Justere beløbet i overensstemmelse hermed for syge eller senescent celler til at nå den ønskede 40-60% confluency 48 timer senere. - Udskift mediet med 10 mL frisk Five den følgende dag (dag -1).
- Plade fibroblaster for at indlede en omprogrammering (dag 0).
- Kontrollere, at fibroblaster skal omprogrammeres på 40 – 60% confluency (figur 2, dag 0). Hvis cellerne er over- eller under sammenflydende, passage af fibroblaster, som beskrevet i trin 2.1 og justere plating tæthed i overensstemmelse hermed. Kultur i endnu 2 dage.
- 4 mL af DPBS overføres til en 15 mL konisk slange. Tilsæt 100 µL af rekombinant human (rh) laminin-521. Pipetteres op og ned for at blandes grundigt.
- Tilsæt 1 ml pr. brønd af fortyndede rhLaminin-521 i 3 brønd af et 6-godt plade. Inkuber belagt pladen ved 37 ° C i 2 timer.
- Varm 6 mL af Five og 4 mL plating medium til 37 ° C. Supplere plating medium med bFGF til en endelig koncentration på 100 ng/mL og B18R til en endelig koncentration på 200 ng/mL.
- Omhyggeligt Opsug den brugte medium fra fibroblaster (trin 2.2.1). Skyl celler med 5 mL af DPBS og tilsættes 3 mL trypsin-EDTA. Forsigtigt rock plade for at dække celler med trypsin-EDTA.
- Suges overskydende væske, forlader ~ 500 µL af trypsin, som gjort i trin 2.1.3. Inkuber fibroblaster med trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C. Fjerne pladen fra rugemaskinen og fast, men forsigtigt Tryk på siden af pladen til at løsne celler. Se celler under mikroskop. Hvis cellerne er fritliggende og flydende, fortsætte. Hvis celler er stadig knyttet, inkuberes i en anden 3 min.
- Skyl/indsamle de fritliggende celler ved hjælp af 5 mL af Five til at neutralisere trypsin-EDTA. Flytte fibroblast suspension i en 15 mL konisk slange. Sikre at cellerne er godt blandet og regne dem med en hemocytometer. Der afpipetteres 12.000 celler i 4 mL af forvarmet plating medium fra trin 2.2.4.
Bemærk: Ikke centrifugeres celler på ethvert tidspunkt. Antallet af forgyldt celler kan justeres op eller ned efter behov for langsomt - eller hurtigtvoksende linjer, henholdsvis. - Fjerne den coatede plade fra rugemaskinen og Opsug fortyndet rhLaminin-521 fra til belagte brønde. Lad ikke brøndene tørre overflade. Forsigtigt resuspend celler i plating medium. Afpipetteres 1 mL cellesuspension til hver belagt godt (dvs. 3.000 celler pr. brønd).
- Placere forgyldt cellerne i en tri-gas vævskultur kuvøse med O2 sat til 5% (lav-O2). Når pladen er sat, forsigtigt, men grundigt sprede celler ved vekslende mellem en op/ned og venstre/højre bevægelse. Gentage bevægelser 2 gange mere. Inkuber cellerne natten over. Ikke swirl plade til at blande.
- Der afpipetteres 4 mL omprogrammering medium til en 15 mL konisk slange og placere det i lav-O2 kuvøse med en løsnede hætten til blandingen henstår natten over. Læg ikke bFGF og B18R indtil den følgende dag.
3. indledning af omprogrammeringer (dag 1)
Bemærk: Når den omprogrammering initieres, daglig vedligeholdelse er nødvendig for ca 1 måned. Sørg for at planlægge i overensstemmelse hermed. Alle efterfølgende celle inkubationer skal udføres under lav-O2 betingelser i 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 befugtet tri-gas vævskultur inkubator.
- Erstatte plating medium mindst 1 h før Transfektion.
- Fjerne den afbalancerede omprogrammering medium fra lav-O2 inkubator. Føje bFGF til en endelig koncentration på 100 ng/mL og B18R til en endelig koncentration på 200 ng/mL. Bland godt.
- Fortsætter med 1 godt på et tidspunkt, brug 1 mL pipette til at fjerne en brugt medium og erstatte det med 1 mL af omprogrammering medium suppleret med bFGF og B18R. Gentag dette for hver brønd. Brug ikke vakuum aspiration, som overdrevent tørrer cellerne, der forårsager stress, og reducerer omprogrammering effektivitet. Flytte pladen med celler tilbage i lav-O2 inkubator.
- Transfect fibroblaster med 5 µL RNAiMax Transfektion reagens per 1 µg af modificerede mRNA, og 1 µL af Transfektion reagens pr. 6 pmol af miRNA efterligner pr. Transfektion.
Bemærk: Optimale resultater er opnået, når transfections Fortsæt til 16 – 20 h. Transfektion reagens er fortyndet 10 x; de 100 ng/µL modificerede mRNA cocktail er fortyndet 5 x; og de 5 pmol/µL miRNA efterligner mix er fortyndet 8,33 x med Transfektion buffer inden kompleks. Se tabel 1 for en oversigt over opsætningen Transfektion.- Mens forbereder Transfektion blander, minimere potentielle eksponering af reagenser for RNase ved at følge standard laboratoriepraksis.
- Blandingen henstår en alikvot af Transfektion buffer (trin 1.3) for ca. 1 h på RT. Brug ikke et 37 ° C vandbad eller varmeskab til at varme op Transfektion buffer.
- Fjerne et enkelt alikvot af modificerede mRNAs (33 µL) og miRNA efterligner (14 µL) fra-80 ° C og varm dem til RT i ca 3-5 min, indtil optøet. Ikke tø alikvoter ved 37 ° C. Spin dem ned kort i en mikrofuge.
- Varm Transfektion reagens til RT i ca 3-5 min. Brug ikke et 37 ° C vandbad eller varmeskab. Vend det lukkede rør 2-3 gange at blande reagenset. Spinde det ned kort i en mikrofuge.
- Overføre 279 µL af RT Transfektion buffer ind i en RNase-fri microcentrifuge rør. Tilføje 31 µL Transfektion reagens til at opnå en endelige mængden af 310 µL. blandes grundigt ved pipettering. Gør ikke vortex. Inkuber tube på RT for 1 min.
Bemærk: Denne volumen af den fortyndede Transfektion reagens er tilstrækkelig til komplekse både den modificerede mRNA og miRNA efterligner delprøver fra trin 3.2.3. - Tilføje 132 µL af RT Transfektion buffer til 33 µL alikvot af modificerede mRNA. Forsigtigt afpipetteres for at blande: endelige rumfang er 165 µL.
- Tilføje 102.6 µL af RT Transfektion buffer til 14 µL alikvot af miRNA efterligner. Forsigtigt afpipetteres for at blande: endelige rumfang er 116.6 µL.
- Tilføje 165 µL af de fortyndede Transfektion reagens fra trin 3.2.5 til den fortyndede ændret mRNA fra trin 3.2.6. Pipette til mix: endelige rumfang er 330 µL.
- Tilføj 116.6 µL af de fortyndede Transfektion reagens fra trin 3.2.5 til fortyndede miRNA efterligner mix fra trin 3.2.7. Bland godt (endelige rumfang er 233.2 µL). Inkuber i 15 min. ved RT at tillade Transfektion buffer til kompleks med den modificerede mRNAs og miRNA efterligner.
- Fjern pladen med celler fra lav-O2 inkubator. Tilsæt 100 µL (1 µg) af den kompleksbundet ændret mRNA Transfektion mix til hver brønd, dråbevis på tværs af brønden. Sprede Transfektion komplekser af forsigtigt men grundigt agiterer pladen med en op/ned og venstre/højre bevægelse. Ikke swirl plade til at blande.
- Tilføje 66,7 µL (20 pmol) kompleksbundet miRNA efterligner Transfektion mix til hver brønd, dråbevis på tværs af brønden. Sprede Transfektion komplekser af forsigtigt men grundigt agiterer pladen med en op/ned og venstre/højre bevægelse. Ikke swirl plade til at blande.
- Læg de transfected celler i tri-gas kuvøse med O2 sat til 5% (lav-O2). Når pladen er sat, sprede Transfektion komplekser igen ved forsigtigt men grundigt agiterer pladen med en op/ned og venstre/højre bevægelse.
- Der afpipetteres 4 mL omprogrammering medium i en 15 mL konisk slange og placere det i lav-O2 kuvøse med løsnede hætten til blandingen henstår natten over. Læg ikke bFGF og B18R indtil den følgende dag.
| Rør 1 - RNAiMax fortynding (1. mix) | ||
| Reagens | Koncentration | Volumen |
| Transfektion Buffer | 279 ΜL | |
| RNAiMax (Tilføj 2.) | 10 x | 31 ΜL |
| Total: 310 µL | ||
| (Inkubér 1 minut ved stuetemperatur) | ||
| Rør 2 - modificerede mRNA mix (2nd mix) | ||
| Reagens | Koncentration | Volumen |
| modificerede mRNA mix | 100 ng/µL (5 x) | 33 ΜL |
| Transfektion Buffer | 132 ΜL | |
| Total: 165 µL | ||
| (tilføje lige saa stort volumen af fortyndet RNAiMax fra Tube 1) | ||
| Rør 3 - miRNA efterligner mix (3rd mix) | ||
| Reagens | Koncentration | Volumen |
| miRNA efterligner mix | 5 pmol/µL (8,33 x) | 14 ΜL |
| Transfektion Buffer | 102.6 ΜL | |
| Total: 116.6 µL | ||
| (tilføje lige saa stort volumen af fortyndet RNAiMax fra Tube 1) | ||
Tabel 1: Forberedelse af Transfektion mix.
4. udskiftning omprogrammeringer Medium mellem Transfections (dage 2, 4, 6, 8, 10 og 12)
- Erstatte medium 16 – 20 h efter Transfektion, som beskrevet i 3.1.1–3.1.2. Føje bFGF til en endelig koncentration på 100 ng/mL og B18R til en endelig koncentration på 200 ng/mL i omprogrammering medium delprøver.
- Overvåge mWasabi udtryk dagligt for at bekræfte Transfektion kvalitet ved hjælp af et mikroskop, der er konfigureret til at visualisere EGFP.
Bemærk: mWasabi udtryk skal være minimalt tilsyneladende på dag 2 og stige i lysstyrke med hver ekstra Transfektion.
5. hver-andre-dag Transfections (dage 3, 5, 7, 9, 11 og 13)
- Udføre Transfektion, som beskrevet i trin 3.2. Ændre ikke mediet på dage efter Transfektion.
- Forberede en 4 mL alikvot af omprogrammering medium og placere det i lav-O2 rugemaskine til blandingen henstår i medium ændringen på den følgende dag. Læg ikke bFGF og B18R indtil den følgende dag.
6. de procedurer, der skal udføres efter sidste Transfektion
- Udføre daglige medium ændringer fra dag 14 gennem ca dag 17. Varm 7 mL omprogrammering medium til 37 ° C. Føje bFGF til en endelig koncentration på 100 ng/mL.
Bemærk: B18R er ikke længere nødvendigt efter den endelige Transfektion. Ud over dag 14 er det ikke længere nødvendigt at reagensglasset medium natten over i lav-O2 inkubator. - Fjern mediet fra alle brønde ved hjælp af en serologisk pipette. Fortsætte med at undgå at bruge aspiration. Der tilsættes 2 mL omprogrammering medium suppleret med bFGF pr. brønd.
- På dage 17 og 18, analysere de omprogrammerede brønde under en inverteret eller dissekere mikroskop. Hvis kolonier er dannet i umiddelbar nærhed af hinanden på grund af høj effektivitet af omprogrammering og kan ikke isoleres manuelt, skal du adskille kolonierne ved at udføre en valgfri passaging omprogrammerede brønde beskrevet taktfast 7 nedenfor. Hvis kolonier er sparsom og godt adskilt, manuelt vælge kloner direkte fra den omprogrammerede godt som beskrevet i trin 8 og subkultur iPSCs ifølge standardprotokoller.
7. valgfri Procedure: Passaging celler fra omprogrammeret brønde ved hjælp af EDTA
- Forberede 0,5 mM EDTA i DPBS (EDTA) ved fortynding af stamopløsningen 0,5 M EDTA. Filter sterilisere EDTA bruger et 0,22 µm vakuum filtreringssystem.
- Forberede feeder-fri pluripotente stamceller (PSC) medium (f.eks. mTeSR1) ifølge producentens anvisninger. Pre varm 32 mL af PSC medium til 37 ° C.
- Coat alle brønde i to 6-godt format plader med menneskelige stamceller-kvalificeret ekstracellulære matrix (ECM) efter fabrikantens anvisninger. Forsegle plader med paraffin film og Inkuber i 1 time på RT.
- Opsug ECM-løsningen fra pre varmede plader og erstatte det med 2 mL af PSC medium pr. brønd. Lad ikke brøndene tørre overflade. Sæt dem til side.
- Opsug den omprogrammering medium fra 2 omprogrammeret brønde på en dag, da kolonierne er stort og klart formet (normalt dag 18). Skyl en gang med 1 mL af EDTA og aspirat.
- Der tilsættes 1 mL af EDTA pr. brønd. Inkuber i 4 min ved 37 ° C.
- Forsigtigt fjerne pladen fra rugemaskinen, og placere den i biosikkerhed kabinet.
Bemærk: på dette tidspunkt celler kan være meget løst overholdt og nemt forrykke. - Omhyggeligt Aspirér EDTA fra både brønde. Tilføj 3 mL af pre varmede PSC medium til hver godt behandlet med EDTA. Brug en celle-skraber til at forsigtigt, men grundigt løsne celler fra både brønde.
- Bruge en serologisk pipette til forsigtigt afpipetteres cellesuspension og bryde op store klumper. Ikke afpipetteres indtil alle celle klumper er væk. Bevare iPSC klynger.
Bemærk: Plating store klumper vil ikke påvirke iPSC koloni udvækst. Hvis der er alt for stor celle klumper, bare undgå at overføre dem til den næste parabol. - Bruger en serologisk pipette, jævnt distribuere celler fra hver EDTA-behandlet godt af pipettering 0,5 mL i hver brønd af ECM-belagt 6-godt plade.
Bemærk: Ikke kombinere celler fra omprogrammeret brøndene (dvs. omprogrammeret godt 1 bør være jævnt fordelt i de første 6-godt plade, og omprogrammeret godt 2 bør fordeles jævnt i anden 6-godt pladen). - Flyt forgyldt cellerne tilbage til lav-O2 inkubator. For at jævnt distribuere celler, ryst hver plade og tilbage og side til side. Ikke swirl. Erstatte PSC medium dagligt.
8. pluk iPSC kolonier
- Pre varm 15 mL af PSC medium til 37 ° C. Coat alle brønde med en enkelt 6-godt plade med menneskelige stamceller-kvalificeret ECM efter fabrikantens anvisninger. Forsegle plader med paraffin film og Inkuber i 1 time på RT.
- Opsug næringssubstratet fra wells bliver brugt til at indsamle iPSCs. Skyl en gang med 1 mL af EDTA og aspirat. Der tilsættes 1 mL af EDTA pr. brønd. Inkuber i 4 min ved 37° C. Mens cellerne inkubere, Aspirér ECM-løsningen fra pre varmede plader og erstatte med 2 mL af PSC medium pr. brønd. Pladerne afsat.
- Forsigtigt fjerne pladen med iPSCs til at blive plukket fra rugemaskinen, og Placer den i biosikkerhed kabinet.
Bemærk: på dette tidspunkt celler kan være meget løst overholdt og nemt forrykke. - Omhyggeligt Aspirér EDTA. Meget forsigtigt tilsættes 3 mL pre varmede PSC medium, pas på ikke for at løsne iPSC kolonier.
- Flytte pladen til en omvendt eller dissekere anvendelsesområdet for bedre at visualisere kolonier. Forberede en 1 mL pipette med en steril spids. Presse stemplet fuldt og derefter bruge pipetten tip at forsigtigt skrabe en koloni mens langsomt trækker væske ind i spidsen til at indsamle kolonien. Tegne som lille medium som muligt mens picking iPSC koloni.
- Hvis du vil overføre kolonien, pipetteres op og ned 3-4 gange i et enkelt godt af ECM-belagt pladen fra skridt 8,2. Gentag indtil 6 kolonier har plukket og overført til individuelle brønde. Pluk ikke mere end 2 kolonier fra enhver enkelt brønd, hvis en valgfri passaging beskrevet i trin 7 er blevet udført.
- Brug en standard menneskelige stamceller protokol til at fryse ned alle resterende brønde. Tø og re plade frossen bestande, hvis flere kolonier skal plukkes senere.
9. karakterisering af iPSCs
- Udføre TRA-1-60 farvning for analyse af omprogrammering effektivitet (dag 18).
Bemærk: 2 ud af 3 omprogrammeret brønde er passaged for fremtidige koloni plukning. De resterende godt kan bruges til TRA-1-60 farvning. Denne procedure kan udføres på laboratorium bænk toppen.- Vaske den omprogrammerede godt med 1 mL PBS. Fix celler med iskold methanol ved-20 ° C i 5 min.
- Aspirat methanol. Tør godt for ca 2 min. Vær omhyggelig med ikke at over tørre. Cellerne har tørret nok når de bliver en transparent/mat farve.
- Vask de godt 3 gange med 1 mL PBS for 5 min med blid ryster. Under vasker, forberede 3 mL 3% brintoverilte i PBS.
- Opsug PBS. Der tilsættes 2 mL fortyndet peroxid løsning. Inkuber i 15 min. ved RT med blid ryster. Forbered 4 mL af blokering: 10% kvæg-serum albumin (BSA) i PBS.
- Opsug den peroxid løsning. Vask de godt 2 gange med 1 mL PBS i 5 min.
- Opsug PBS og der tilsættes 2 mL blokerende løsning i brønden. Inkuber i 1 time på RT.
- Vask de godt 3 gange med 1 mL PBS for 5 min med blid ryster.
- Fortynd primære anti-TRA-1-60 antistof på 1: 100 i blokerende løsning suppleres med 0,05% natriumazid. Forberede 1 mL af antistof til 1 godt af en 6-godt format parabol. Tilføj antistof fortynding til brønden og Pak pladen med parafilm at undgå fordampning. Der inkuberes natten over ved 4 ° C med blid ryster.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, inkubation med det primære antistof kan gøres for 1 h i RT med blid ryster. Den primære antistof fortynding kan genbruges op til 5 gange. - Efter inkubering med det primære antistof, vaske de godt 3 gange med 1 mL PBS for 5 min med blid ryster.
- Fortynd den sekundære anti-mus HRP-konjugerede antistoffer på 1:200 i den blokerende løsning. Inkuber godt med sekundær antistof fortynding for 2 h i RT med blid ryster.
- Opsug sekundær antistof fortyndingen og vaske de godt 3 gange med 1 mL PBS for 5 min med blid ryster.
- Under den tredje vask, forberede substratopløsning efter fabrikantens anvisninger. Efter den sidste vask, Aspirér PBS. Der tilsættes 1 mL substratopløsning og inkuberes indtil ønskede farve udvikler (ca 10 min).
- Opsug substratopløsningen. Skyl godt med vand i 5 min. mens forsigtigt ryste.
- Kolonierne, hvis det ønskes. Omprogrammering effektivitet = (antal kolonier) / (antal forgyldt fibroblaster) x 100%.
- Til langtidsopbevaring, Aspirér vand fra de farvede plade og lufttørre natten over på RT. Seal tørrede pladen med parafilm og opbevares ved 4 ° C i op til 2 år at vurdere omprogrammering effektivitet senere.
Representative Results
Det tager typisk ca 5-6 uger efter indledningen af fibroblast omprogrammering til indefrysning af de første hætteglas med iPSCs (figur 1). Omprogrammering protokollen kan generelt inddeles i to faser. Fase 1 omfatter fibroblast kultur og syv transfections, med den omprogrammering RNA cocktail udføres hver 48 h. fase 2 inkluderer isolation, ekspansion og karakterisering af iPSC kolonierne.
Før indledning af protokollen, bør det sikres, at fibroblaster skal omprogrammeres er af god kvalitet. Sund fibroblaster skal vises spindel-formet, bipolar, og refractile med en fordobling tid på ca 24 timer. Dag 0, bør 250.000 celler belagt i en 10 cm parabol på dag -2 vokse til 40 – 60% confluency (figur 1, dag 0) og give ca 6-10 x 105 celler. Celler prolifererende langsommere kan udlignes ved plettering på en højere densitet på dag -2 og på dag 0 til omprogrammering.
Fibroblaster skal vises meget sparsomme følgende guldbelægning i en brønd på en 6-godt format parabol for omprogrammering (figur 2, dag 1). Fireogtyve timer efter den første Transfektion vil fibroblaster miste deres spindel form og vedtage en mere afrundet morfologi (figur 2, dag 2), som vedligeholdes gennem resten af omprogrammering. Grøn fluorescens fra mWasabi mRNA skal være minimalt observerbare på dag 2 og støt stigning i lysstyrke skal være klart synlige ved dagen 4. Evnen til at opdage mWasabi fluorescens kan afhænge af omfanget følsomhed og opsætning. Celle tæthed vil gradvist og konsekvent øge overalt i de første tre transfections (dage 1-6), med en tilsyneladende brast i spredning mellem dage 7 og 8. Cellerne skal vises i vid udstrækning sammenflydende ved dag 10 (figur 2, dag 10). De første iPSC kolonier kan vises så tidligt som i dag 11 (figur 2, dag 11); kolonier kan dog ikke være observerbare indtil så sent som i dag 18. Generelt, af dage 15-18, vil der være store og indlysende iPSC kolonier, der klart adskiller sig fra de omkringliggende, ufuldstændigt omprogrammeret fibroblaster (figur 2, dag 15 og figur 3, dag 17). Immunfarvning for pluripotency markør TRA-1-60 kan udføres for at vurdere omprogrammering effektivitet (figur 3, dag 17, TRA-1-60). Vores erfaring, de fleste fibroblast linjer udbytte hundredvis af kolonier pr. omprogrammeret godt (figur 3, indsat B).
Suboptimal plating tæthed er den mest almindelige årsag til nedsat effektivitet af omprogrammering i vores protokol og er ofte forbundet med fibroblaster, der er syge, senescent og high-passage. Hvis plating tæthed er for lavt, vil der være store acellulær golde patches for enden af omprogrammering (figur 4 c), og iPSC kolonier kan ikke danne (figur 4D). Omprogrammerede celler bør være meget sammenflydende inden dag 14 (Sammenlign figur 4A og 4B til figur 2, dag 14). Tilsvarende, hvis celler er belagt for tæt eller formere sig for hurtigt, omprogrammering effektivitet er drastisk reduceret.
For at opretholde ensartethed af patient-afledte iPSCs, er det vigtigt at udvide cellelinjer fra en enkelt koloni. Da omprogrammering effektivitet er meget høj i vores protokol, kan tilstødende iPSC kolonier danne i umiddelbar nærhed af og vokse ind i hver en anden (figur 3, dage 15-17). Dette gør det undertiden vanskeligt at mekanisk adskille en enkelt koloni for klonal ekspansion. Vi har fundet, at det er nyttigt at første passage en omprogrammeret godt og fortynd det på tværs af en større kultur område. En god passage forholdet består af jævnt opdele en omprogrammeret 6-godt-format plade godt på tværs af en hel 6-godt plade.
Efter fortynding passage, iPSCs vokse som kolonier og er let kan skelnes fra fibroblaster (figur 5, dag 18). I første omgang, iPSC kolonier kan være løst pakket, og enkelte celler har en relativt stor cytoplasmatisk område. I løbet af 4-7 dage, iPSCs formere sig og danne en karakteristisk tæt pakket koloni med definerede kanter. Individuelle celler i kolonien har en stor nukleare fraktion med fremtrædende nucleoli (figur 5, dag 22). Der skal være mange kolonier, der danner i hver brønd, og kun dem med klassiske iPSC morfologi skal plukkes til ekspansion.
Figur 1 : Omprogrammering af humane fibroblaster til induceret pluripotente stamceller (iPSCs). En skematisk protokol for omprogrammering af humane fibroblaster præsenteres. Fibroblaster er første passaged på en lav densitet i en brønd på en 6-godt format parabol, efterfulgt af syv transfections udføres mindst 48 timer. Medium er erstattet 16 – 20 h efter hver Transfektion. Omprogrammerede iPSCs er første passaged på ca dag 18, og klonede kolonier samles ved dag 26. Typisk, fibroblast-afledte iPSC linjer kan fryses til langtidsopbevaring af dagen 38. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant daglige billeder under hver dag af omprogrammering. Fibroblaster bør være ca 40-60% sammenflydende på tidspunktet for passage at indlede omprogrammering (dag 0, celler er belagt i en 10 cm parabol). Den første Transfektion (T1) opstår på dag 1, og cellerne vises meget sparsom på dette punkt. Den følgende dag (dag 2), bør en mere afrundet morfologi blive synlige. Celler vil fortsætte med at stige i tæthed i hele protokollen med iPSC klynger begynder at dukke op så tidligt som i dag 11 (rød cirkel). Dag 15 bliver iPSC kolonier store med diskret grænser. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Koloni dannelsen efter transfections med omprogrammering ændret mRNAs og miRNA efterligner. Lav forstørrelse billeder blev taget af en repræsentant for omprogrammering på dage 15-17. Efter den endelige Transfektion vil omprogrammeret iPSCs danne klart kolonier med definerede grænser, at ekspandere i størrelse og kondensere bliver klart adskiller sig fra ufuldstændigt omprogrammeret omkringliggende fibroblaster. Immunfarvning for pluripotency markør TRA-1-60 indikerer tilstedeværelsen af iPSCs (inset A) og kan bruges til beregning af omprogrammering effektivitet ved at tælle alle kolonier inden for en enkelt brønd (inset B, eksempler af tællelig kolonier kredsede i grøn). Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant billeder af sub-optimale plating tæthed for omprogrammering. (A, B) Eksempler på fibroblaster, der er alt for sparsomme af dag 14 af omprogrammering (Sammenlign med figur 2, dag 14). (C) lav forstørrelse billede på dag 17 af omprogrammering med en stor, golde patch rød cirkel. (D) den samme godt var fast og farvet for TRA-1-60 til at bekræfte samlede fattige omprogrammering effektivitet på grund af lav celle tæthed. Skalere barer = 200 µm (A, B), og 1 mm (C, D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentant billeder af iPSCs efter første passage. Efter endt transfections med omprogrammering modificerede mRNAs og miRNA efterligner, omprogrammerede celler er passaged af dage 17-20. iPSCs har en fordel i vækst i PSC medium og overhale hurtigt enhver fibroblaster, der var ufuldstændigt omprogrammeret. IPSCs vil i første omgang danne kolonier, der kan vises løs med dårligt definerede grænser. I flere dage, cellerne hurtigt formere sig og tage på den karakteristiske morfologi af tætpakkede celler med en høj kernen til cytoplasmaet ratio, stramt klyngedannelse i kolonier med forskellige grænser. Skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne protokol beskriver en klinisk relevant, ikke-integrering, RNA-baserede metode, der giver mulighed for omprogrammering af normale og sygdom-associerede menneskelige fibroblast linjer i iPSCs på en ultra-høj effektivitet. Til dato har har alle menneskelige fibroblast linje har vi forsøgt at omprogrammere med den beskrevne protokol givet et tilfredsstillende antal højkvalitets iPSCs for efterfølgende ansøgninger. Resulterende iPSCs kan umiddelbart overføres og udvidet i feeder-fri kultur betingelser.
Kvaliteten af fibroblaster til omprogrammering af:
Omprogrammering succes er stærkt afhængig af kvaliteten af starter fibroblaster. Ideelt set bør omprogrammering indledes med de laveste passage fibroblaster tilgængeligt til at opnå den højeste effektivitet. Omprogrammering effektivitet er bedst med fibroblaster af passage 2-4. Omprogrammeringen kan stadig arbejde med high-passage (passage 5-8), selv senescent fibroblaster, omend med en reduceret effektivitet. Sommetider lav-passage fibroblaster er ikke tilgængelig eller patientprøver har en genetisk mutation, der forhindrer sund vækst. I dette tilfælde, kan optimering af indledende plating tæthed være påkrævet. Omprogrammering af kompromitterede fibroblast linjer er normalt forbundet med øget celledød i RNA transfections. Som et resultat, vil celler i den omprogrammering godt synes at være sparsom med dage 10 – 14 af omprogrammering. Store acellulær områder vil også være synlige i brønden. Hvis dette er tilfældet, skal omprogrammering protokollen være igen indledte med en højere indledende startnummer af fibroblaster. Plating 3.000 inputceller pr. brønd af et 6-godt format parabol virker konsekvent for de fleste voksne fibroblast linjer. Imidlertid kan øge plating antallet til 5.000 – 10.000 (50.000 for senescent linjer) bidrage til at forbedre omprogrammering af sygdom-associerede prøver, som er blevet rapporteret i vores tidligere publikation8. Omvendt, celler at nå confluency for tidligt kan også blive resistente over for omprogrammering. Hvis celler gennemgår transfections med omprogrammering RNA'er formere sig for hurtigt (som undertiden er tilfældet med primære neonatal fibroblaster), indleder omprogrammering med 500 fibroblaster pr. brønd af et 6-godt format parabol8.
Håndtering af Transfektion buffer:
PH af Transfektion buffer (nedsat serum medium justeres til pH i 8.2) er altafgørende for at opnå de optimale Transfektion effektivitetsfordele kræves for denne omprogrammering protokol. Derfor anbefales flere forholdsregler vedrørende håndtering af Transfektion buffer. Vi har fundet, at selv korte eksponering Transfektion buffer for atmosfærisk luft påvirker pH i bufferen. Transfektion buffer bør derfor aliquoted i et skruelåg beholder med minimal luft rum (vi bruger enten 5 eller 15 mL skruelåg koniske rør). For at reducere yderligere luft eksponering, skal du bruge hver Transfektion buffer alikvot for højst to transfections. Endelig siden temperatur virkninger pH er det kritisk at Transfektion buffer er ekvilibreres til RT til montering af Transfektion komplekser. Det tilrådes at ikke varme Transfektion buffer til 37 ° C.
Passaging af iPSCs:
Mens mange tidligere offentliggjorte protokoller anbefale plukke enkelte iPSC kolonier i slutningen af omprogrammering, dette kan være vanskeligt at opnå, når effektiviteten af omprogrammering er meget høj, eller hvis kolonierne klynge sammen, som det ofte er tilfældet i vores protokol. Hvis iPSC kolonier i umiddelbar nærhed af hinanden, anbefaler vi derfor først passaging celler til at sprede ud omprogrammeret iPSCs før manuelt picking kolonier. Der er flere fordele ved at udføre trinnet tidlige passage. Breder sig ud i kolonier giver dem mere plads til at vokse, hvilket giver meget større kolonier til pluk end ellers kunne være opnået i den oprindelige godt. Dette forbedrer succesrate i at etablere en iPSC linje fra en plukket klon. Vi finder også, at yderligere kultur tid med fibroblaster, omend på en fortyndet ratio, vises den gennemsnitlige kvalitetsforbedring af plukkede iPSC kolonier. Ufuldstændigt omprogrammeret fibroblaster kan give understøttende paracrine faktorer, som fortsat vil hjælpe med at etablere iPSCs og lette den direkte overgang til feeder-gratis celle kultur betingelser. Fibroblaster har tilfældigvis en selektiv vækst ulempe i forhold til iPSCs når kulturperler i mTeSR1. Derfor, kontaminerende fibroblast cellen befolkningen hurtigt fortyndes til ubetydelige mængder inden for 3-4 passager.
ROCK hæmmere såsom Y-27632 anvendes ofte til rutinemæssig kultur af menneskelige iPSCs. Vi har fundet, at hyppige og/eller udvidet kultur af nogle iPSC linjer med Y-27632 kan have skadelige virkninger på overordnede kvalitet. Når du bruger en klump passaging metode, er som med EDTA, Y-27632 ikke nødvendigt at bevare iPSC levedygtighed efter opdeling. Vi har fuldstændig elimineret supplerende medier med Y-27632 til alle iPSC isolation, udvidelse eller rutinemæssig kultur.
Protokollens begrænsninger:
Én begrænsning for den beskrevne RNA-baserede omprogrammering tilgang er indledende omkostningerne og kompleksiteten forbundet med udarbejdelsen af de omprogrammering reagenser. Selv om forberedende procedurer til at generere mRNA reagenser er alle rutine og tidligere har været beskrevet (PCR, in vitro- transskription, DNase behandling, udjævningen, dephosphorylation, rensning), er kumulativt produktion af mRNA reagenser en forholdsvis lange og ikke-triviel proces. Den anden store udfordring i denne protokol er behovet for at transfect celler hver 48 h, øge labor intensiteten af omprogrammering protokollen. Disse overvejelser kan være uoverkommelige hvis omprogrammering af kun et par patientprøver ønskes. Men hvis de primære overvejelser er generation af klinisk relevante iPSCs eller meget høj omprogrammering effektivitet, den beskrevne RNA-baserede omprogrammering tilgang er ideel.
Sammenfattende afhænger beskrevet højeffektiv RNA-baserede omprogrammering metoden af optimeret Transfektion effektivitet af typen somatisk skal omprogrammeres som beskrevet i vores tidligere publikation8. RNA Transfektion protokollen præsenteret i denne undersøgelse er meget indstillet til menneskelige primære fibroblaster men kan potentielt være skræddersyet til andre celletyper effektivitetsforbedringerne omprogrammering af forskellige somatiske celler.
Disclosures
I.K. og G.B. er co opfindere på en patentansøgning med titlen "Metoder og kompositioner for omprogrammering celler", PCT ansøgning nr. PCT/US2016/063258.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for finansiering støtte fra National Institutes of Health (T32AR007411-33) og University of Colorado hud sygdomme forskning Core Center (P30AR057212). Vi takker også de Epidermolysis Bullosa (EB) forskningspartnerskab, EB Medical Research Foundation, kur EB velgørenhed, dystrofe Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) International, Koning Boudewijn-Stichting Vlinderkindje fond, og låger Grænser fond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
