Summary
Burada biz insan birincil fibroblastlar değiştirilmiş mRNA'ların programlama faktörler kodlama kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre yeniden programlamak için klinik, yüksek verimli, besleyici-Alerjik bir yöntemi açıklamak ve olgun mikroRNA-367/302 taklit eder. Ayrıca programlama verimlilik, değerlendirmek için yöntem klonal IPSC kolonileri genişletin ve pluripotency işaretin TRA-1-60 ifade onaylamak bulunmaktadır.
Abstract
İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan geliştirme ve hastalık eğitim için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Daha fazla iPSCs tedavi edici bir rejeneratif olarak ilerleyen bir güvenli, sağlam ve uygun programlama Protokolü gerektirir. Burada, son derece yüksek verimli insan dermal fibroblastlar sigara entegre bir yaklaşım kullanarak iPSCs yeniden programlama için klinik, adım adım bir iletişim kuralı mevcut. Çekirdek iletişim kuralı pluripotency faktörler ifade oluşturur (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, MİCRORNAS, OCT4-Tanrım füzyon) kopya etmek haberci RNA'ların sentez ile vitro üzerinden değiştiren nükleotit (değiştirilmiş mRNA). Programlama değiştirilmiş mRNA'ların birincil fibroblastlar her 48 h ile birlikte olgun embriyonik kök hücre özel mikroRNA-367/302 taklit eder içine iki hafta boyunca transfected. Elde edilen IPSC kolonileri sonra izole ve doğrudan koşullarda besleyici-Alerjik genişletilmiş. Biz RNA transfection rejimi de dahil olmak üzere çeşitli parametreler optimize verimlilik ve tutarlılık bizim programlama Protokolü'nün fibroblast örnekler üzerindeki en üst düzeye çıkarmak için transfections, kültür koşulları ve tohum yoğunlukları zamanlama. Önemlisi, bizim Yöntem yüksek kaliteli iPSCs tekrar zor hastalıklı, Yaşlı ve/veya senescent örnekleri de dahil olmak üzere çoğu fibroblast kaynaklardan oluşturur.
Introduction
Somatik hücre indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) yeniden programlama pluripotency1,2korumak önemlidir transkripsiyon faktörleri çekirdek kümesi genişletilmiş ifade gerektirir. İPSCs klinik uygulamalar için üretirken, giriş hücrelerindeki mutational yükü işleme sırasında en aza indirilir ve IPSC üretimi verimliliğini nispeten yüksek bir düzeyde sabırlı örnekler üzerindeki korunur önemlidir. Ancak, iletişim kuralları, entegrasyon-alerjik gibi yöntemleri yeniden programlama çoğunluğu bunlar hangi sınırı klinik yararı3yaklaşımlar çok düşük programlama verimliliği uğrar. Düşük programlama verimliliği de önceden varolan mutasyonlar, elde edilen iPSCs mutational yükü artan taşıyan hücrelerin seçici yeniden programlama teşvik. Buna ek olarak, DNA rastgele genom entegre ve zararlı insertional mutagenesis ve istenmeyen (için fırsat oluşturmak emniyet endişe tüm DNA tabanlı programlama yöntemleri, lentivirus ve episomal-tabanlı yaklaşımlar gibi muzdarip akış aşağı doku türevleri4pluripotency genlerin potansiyel olarak oncogenic) ifade.
Somatik hücreler pluripotent verimli indüksiyon ulaşmak ve elde edilen iPSCs mutational yükünü azaltmak için umut verici bir yaklaşım Sentetik kaplama haberci RNA'ların kullanmaktır içeren5yeniden programlama için bazdan (değiştirilmiş mRNA) değiştirilmiş. Değiştirilmiş mRNA tabanlı programlama yaklaşımlar verimliliği-var olmak daha fazla arttırmak embriyonik kök hücre (ESC) ekleyerek-özel mikroRNA (miRNAs)-367/302'leri3somatik hücreler ile yeniden programlamak için gösterilen, artan verimlilik6 ,7. Ancak, bile miRNAs-367/302'leri eklenmesiyle, değiştirilmiş mRNA tabanlı programlama yaklaşımı kez taze izole hasta hücrelerin3başvuru sırasında başarısız olur. Adres tutarsızlıklar için değiştirilmiş bu mRNA tabanlı yaklaşımın, son zamanlarda yüksek başarı oranı ile insan birincil fibroblastlar pluripotency indükler ve her ikisi de değiştirilmiş mRNA'ların kodlama kullanır bir en iyi duruma getirilmiş, entegrasyon-free strateji bildirdin faktörler ve olgun miRNA-367/302 yeniden programlama8taklit eder. Bizim Yöntem, programlama değiştirilmiş mRNA kokteyl Tanrım transactivation (M3O denir)9 ve beş diğer programlama faktörler (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A ve MİCRORNAS) ile erimiş OCT4 değiştirilmiş bir sürümünü içerir. MiRNA pluripotency faktörleriyle kodlama değiştirilmiş mRNA birleştirerek taklit eder verimliliği bu protokolü yeniden programlama üzerinde bir sinerjik etkisi ortaya çıktı. Ek en iyi duruma getirmeleri RNA transfection rejimi, hücre tohum ve kodlamayla koşulları da bir ultra-yüksek seviye8yaklaşım programlama verimliliğini artırmak gerekli idi.
Diğer birçok protokolün programlama yaklaşımımız genellikle sadece birkaç bin giriş fibroblastlar gerektirir. Buna ek olarak, episomal plazmid kullanarak birçok ortak olmayan entegre strateji, Sendai virüs veya kendi kendini kopyalayan RNA içeren oluşturulan iPSCs programlama vektörde sulandırmak için geniş passaging. Bunun tersi olarak, değiştirilmiş mRNA ve olgun miRNA taklit eder kısa bir yarı ömrü var ve hızla hücrelerden ortadan kalkar. Birlikte ele alındığında, hasta örnekleri ve kullanışlı iPSCs nesil toplama arasında toplu hücre kültür süreyi, bu yaklaşım, etkili bir şekilde elde edilen iPSCs mutasyon birikimi sınırlama ve maliyet-etkililik iyileştirilmesi düzeydedir.
Burada, yüksek verimli yetişkin insan fibroblast bizim Kombinatorik değiştirilmiş mRNA/miRNA tabanlı yaklaşım8kullanarak iPSCs yeniden programlama ulaşmak için ayrıntılı adım adım iletişim kuralı mevcut. Bu RNA tabanlı programlama protokolü entegrasyon-Alerjik iPSCs araştırma ve potansiyel klinik uygulamalar oluşturmak için basit, uygun maliyetli ve sağlam bir yöntemdir. Ayrıca, fibroblast satırlarının zor-için-tekrar, hastalığı-ilişkili, dahil olmak üzere çeşitli yaşlı ve senescent fibroblastlar yeniden programlama için geçerlidir. İnsan fibroblast yeniden programlama için protokol şeması Şekil 1' de gösterilen. Protokol, özellikle insan yetişkin birincil fibroblastlar bir 6-şey biçimi plaka üç kuyu yeniden programlama için bir yöntem belirtir. İki kuyu genellikle yüksek kaliteli IPSC kolonileri yeterli sayıda verim. Çoğu durumda, tek kişi de gereklidir ve üçüncü de verimliliği yeniden programlama analizi için kullanılabilir. Gerekirse, kuyu sayısı ölçekli.
Protocol
RNase free şartlar altında çalışmayı ve aseptik teknikler mümkün olduğunda kullanın. Tüm hücre kültürü ile ilgili uygulamaları biyolojik Emanet aseptik teknikler kullanarak dolap gerçekleştirin. İnsan hücreleri ile çalışmaları için kurumsal Biyogüvenlik standartlara uygun.
1. reaktifler ve inisiyasyon yeniden programlama hazırlama aygıtları
- Modifiye-mRNA kodlama programlama faktörler kokteyl hazırlamak.
- Vitro transkripsiyon, kapatma, gerçekleştirmek ve yordamlar bireysel programlama faktör kodlama değiştirilmiş her mRNA dephosphorylation için daha önce yayımlanmış Protokolü10 izleyin. Son arıtma adım sonra değiştirilmiş mRNA nükleaz ücretsiz su ile elute, saflaştırılmış değiştirilmiş mRNA çözüm 1 U/µL RNase inhibitörü ile ek, bir spektrofotometre kullanarak değiştirilmiş mRNA'ların quantitate ve 6 aya kadar-80 ° C'de depolayın. Donma-çözülme devir sayısını en aza indirmek için değiştirilmiş her mRNA birden çok aliquots hazırlayın.
Not: Benzer protokoller değiştirilmiş mRNA üretim-si olmak be için başka bir yerde5,8,11bildirdi. Vitro transkripsiyon için şablonlar PCR güçlendirme Malzemeleri tablo önceden yayınlanmış Protokolü10göre listelenen primerler kullanılarak ilgili plazmid şablonları oluşturulabilir. Plazmid şablonları programlama her faktör için (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, MİCRORNAS, LIN28A) ve mWasabi (denetim transfection için) Addgene, bir kar amacı gütmeyen plazmid deposu mevcuttur. - Mix birlikte 3:1:1:1:1:1 molar oranını, değiştirilmiş mRNA (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: MİCRORNAS: LIN28A) ve % 10 içerir mWasabi transfection verimlilik için kontrol olarak mRNA değiştirilmiş. 100 ng/µL son bir konsantrasyon karışıma 1 U/µL RNase inhibitörü ile desteklenmiş nükleaz ücretsiz su ekleyerek yeniden programlama tam değiştirilmiş mRNA konsantrasyonu ayarlayın. Yedi hazırlayın 33 µL aliquots, tam değiştirilme tarihi mRNA kokteyl. Karışık programlama aliquots-80 ° C'de depolayın
Not: her transfection için 1000 ng değiştirilmiş mRNA kokteyl iyi eklenir (Yani, toplam 3000 ng 3 kuyuları için). Her 33 µL aliquot 6-şey biçimi plaka 3 kuyu transfect şekilde boyutlandırılır ve pipetting hatalar için hesabınıza fazla birimin 3 µL içerir. Yedi hazırlanıyor 33 µL aliquots bir tam fibroblast 3 Wells bir 6-şey biçimi plaka yeniden programlama tamamlamak için yeterli.
- Vitro transkripsiyon, kapatma, gerçekleştirmek ve yordamlar bireysel programlama faktör kodlama değiştirilmiş her mRNA dephosphorylation için daha önce yayımlanmış Protokolü10 izleyin. Son arıtma adım sonra değiştirilmiş mRNA nükleaz ücretsiz su ile elute, saflaştırılmış değiştirilmiş mRNA çözüm 1 U/µL RNase inhibitörü ile ek, bir spektrofotometre kullanarak değiştirilmiş mRNA'ların quantitate ve 6 aya kadar-80 ° C'de depolayın. Donma-çözülme devir sayısını en aza indirmek için değiştirilmiş her mRNA birden çok aliquots hazırlayın.
- MiRNA taklit eder yeniden programlama kokteyl hazırlamak.
- Liyofilize erime miRNA taklit eder (Syn-vardır-miR-302a - 3p, Syn-vardır-miR-302b - 3p, Syn-vardır-miR - 302c - 3p, Syn-sahip-miR-302d-3 p, Syn-sahip-miR-367-3 p) 5 pmol/µL (5 mikron) son konsantrasyonu nükleaz ücretsiz su 1 U/µL ile RNase inhibitörü ile desteklenmiştir. Her miRNA taklit birden çok aliquots hazırlamak ve uzun süreli depolama için-80 ° C'de depolayın.
- Tüm miRNA taklit eder bir 1:1:1:1:1 molar oranı 5 pmol/µL (5 mikron) son bir konsantrasyon içinde karıştırın. Yedi hazırlamak miRNA 14 µL aliquots taklit eden karışımı. Karışık aliquots-80 ° C'de depolayın
Not: her transfection için iyi (Yani, toplam 3 kuyuları için 60 pmol) başına 20 pmol miRNA taklit eder karışımı eklenir. Her 14 µL aliquot 6-şey biçimi plaka 3 kuyu transfect şekilde boyutlandırılır ve pipetting hatalar için hesabınıza fazla birimin 2 µL içerir. Yedi hazırlanması 14 µL aliquots bir tam fibroblast 3 Wells bir 6-şey biçimi plaka yeniden programlama tamamlamak için yeterli.
- Transfection arabellek hazırlayın.
- Önceden sıcak bir 500 mL şişe ve taze azaltılmış-serum orta ve oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 2 saat için bir 100 mL şişe. Bir su banyosu kullanmayın.
- PH metre bir Biyogüvenlik kabini aktarın. Taksimetre cam elektrot nükleaz ücretsiz su ile yıkayın. Üretim talimatlara göre pH metre kalibre. Elektrot tekrar nükleaz ücretsiz su ile yıkayın.
- Her iki şişe azaltılmış-serum orta Biyogüvenlik kabini aktarın. 500 mL RT şişe pH ayarlamak için kullanın.
- Azaltılmış-serum orta taban pH pH metre'nın cam elektrot tampon ekleyerek ölçmek. 1 dakikaya kadar pH metre üzerinde okumadan önce bekleyin.
- 3-4 mL 1 M NaOH azaltılmış-serum orta 500 mL ekleyin, şişe kapatın ve iyice karıştırın. 5 dakikaya kadar pH ölçümü için şişe açmadan önce bekleyin. PH metre'nın elektrot arabellek içine yerleştirin ve pH metre üzerinde okuma stabilize kadar bekleyin.
- Azaltılmış-serum orta pH 8,15 – 8,17 ulaşıncaya kadar küçük miktarlar 1 M NaOH ekleyerek devam edin. PH metre işlemi sırasında birkaç kez kalibre edin. Herhangi bir noktada pH 8,18 yüksek olursa, önceden ısıtılmış 100 mL şişe (adım 1.3.1) taze azaltılmış-serum orta ekleyerek azaltmak.
Not: Azaltılmış-serum transfection orta tabanlı arabellek pH önemlidir. Transfection arabellek pH yaklaşık 8.2 ± 0,05, ancak pH 8,25 yüksek ise başarısız olabilir yeniden programlama başarılı olacaktır. Bu nedenle, bu tampon pH 8,15 – 8,17 ulaştıktan sonra NaOH ekleyerek durdurmak için tavsiye edilir. Bu transfection arabellek son pH Sterilizasyon sonra yaklaşık 8.2-8,22 olduğunu garanti eder. - Filtre sterilize 0,22 µm vakum filtrasyon sistemi kullanarak transfection arabellek. Aliquot steril arabellek en az hava alanı olan 5 veya 15 mL tüpler içine.
- Mağaza aliquots 4 ° C'de 3 aya kadar için transfection önbellek Aliquots pH düzenli aralıklarla ölçün. PH 8,25 yüksek ise aliquots atın. Yalnızca atmosferik havaya maruz transfection arabellek arabellek pH artar bu yana 2 transfections için aliquot kullanımını sınırlamak.
- Fibroblast genişleme Orta (FEM) hazırlamak: % 10 fetal Sığır serum (FBS), 1 x esansiyel olmayan amino asitler, 1 x glutamin takviyesi, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 x kalem/strep/fungizone ile takıma en az gerekli orta. FEM 4 ° C'de depolayın
- Programlama ortamı hazırlamak: DMEM/F12 (HEPES) takıma % 20 nakavt serumu değiştirme (KOSR), non-gerekli amino asitler x 0.5, 0.5 x glutamin takviyesi, 55 µM 2-mercaptoethanol, 50 µg/mL askorbik asit, 1 x kalem/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF ile ve 200 ng/mL B18R. BFGF ve B18R yeniden programlama başlanmasından orta hazırlamak ve 4 ° C'de saklayın 1 aydan sonra hazırlık takip kullanmayın. BFGF ve B18R her kullanımdan hemen önce o günkü kullanım için boyutlu bir aliquot ekleyin.
- Kaplama orta ısı inaktive %5 (HI) FBS % 20 içeren programlama orta içine ekleyerek hazırlamak KOSR bFGF ve B18R adım 1.5 olmadan. Orta boy taze kullanım amacı gününde hazırlamak. BFGF ve B18R hemen gün 0 yeniden programlama üzerinde kullanmadan önce ekleyin.
- Doku kültürü İnkübatörler bir el dijital CO2 Çözümleyicisi'ni kullanarak üreticinin yönergelerine göre yeniden programlama işlemini başlatmadan önce kalibre. Düşük-O2 kuluçka programlama adımlar için başarılı IPSC üretimi sağlamak için kullanın.
2. kültür fibroblastlar yeniden programlama için
- Fibroblastlar (gün -2) yeniden programlama başlanmasından önce hazırlayın.
- Yeni 10 cm doku kültürü plakalı 5 mL %0,1 jelatin de kat. Dokunun veya tüm yüzeyi kaplanır emin olmak için plaka girdap. 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Jelatin Aspire edin ve 10 mL FEM. kümesinin bir kenara ekleyin. FEM. eklemeden önce kurumasını plaka kaplı yüzey izin verme
- Dikkatle fibroblastlar harcanan ortamından Aspire edin. 5 mL DPBS arta kalan serum kaldırmak için de bir kez hücrelerle durulayın. Tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Yavaşça hücrenin üzerine tam kapsama sağlamak için plaka rock.
- Tripsin ~ 500 µL bırakarak aşırı sıvı Aspire edin. Değil aşırı Aspire edin, çünkü bu kuru ve fibroblastlar öldürmek. Tripsin-EDTA 37 ° C'de 3 dk ile fibroblastlar kuluçkaya
- Plaka da kuluçka kaldır ve nazikçe ama sıkıca hücreleri çıkarmak için plaka yan dokunun. Mikroskop altında hücreleri denetleyin. Müstakil ve yüzen hücreleri, devam edin. Hücreleri hala iliştirilmişse, başka bir 3 dakikadır kuluçkaya.
- Hızlı durulama/5 mL FEM de tripsin-EDTA nötralize etmek için kullanarak müstakil hücreleri toplamak. Fibroblast süspansiyon 15 mL konik tüp içine taşıyın. Hücreleri iyi karışık olduğundan emin olun.
- Hücre süspansiyon hücre büyük kümeleri kırmak, sonra bir hemasitometre Sayın karışımı yavaşça. 2.1.1. adımda hazırlanan jelatin kaplı 10 cm çanak içine transfer 2.5 x 105 hücreleri. 37 ° C, % 5 CO2 oksijen normal doku kültürü kuluçka gecede hücrelerde kuluçkaya.
Not: Bu fibroblastlar sağlıklı ve hızlı bir şekilde ayıran önemli olduğu hücre yoğunluğu yüksek programlama verim elde etmek için önemlidir. 2.5 x 10 kaplama5 hücreleri çoğu fibroblast örnekleri 2 gün sonra % 40-60 confluency verir. Miktar buna göre ayarlamak istediğiniz % 40-60 confluency 48 saat sonra ulaşmak hastalıklı veya senescent hücreler için. - Orta 10 mL taze FEM ile ertesi gün (gün -1) değiştirin.
- (Gün 0) yeniden programlama başlatmak için fibroblastlar plaka.
- Yeniden programlanan fibroblastlar % 40-60 confluency (Şekil 2, gün 0) olduğundan emin olun. Hücreleri üzerinde veya altında birleşmesi ise, fibroblastlar 2.1 adımda anlatıldığı gibi geçiş ve kaplama yoğunluğu buna göre ayarlayın. Kültür başka bir iki gün için.
- DPBS 4 mL 15 mL konik tüp içine aktarın. Rekombinant insan (rh) laminin-521 100 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet iyice karıştırmak için.
- 1 ml sulandırılmış rhLaminin-521 kuyu başına 6-şey plaka 3 kuyu ekleyin. 2 h 37 ° C'de kaplamalı plaka kuluçkaya.
- 6 mL FEM ve orta 37 ° C'ye kaplama 4 mL sıcak Kaplama orta 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için bFGF ve B18R 200 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ek.
- Dikkatle fibroblastlar (adım 2.2.1) harcanan ortamından Aspire edin. DPBS 5 mL hücrelerle durulama ve tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Yavaşça tripsin-EDTA hücrelerle kapsayacak şekilde plaka rock.
- Tripsin, ~ 500 µL adım 2.1.3 yapılır gibi bırakmak aşırı sıvı Aspire edin. Tripsin-EDTA 37 ° C'de 3 dk ile fibroblastlar kuluçkaya Plaka da kuluçka kaldırmak ve nazikçe ama sıkıca hücreleri çıkarmak için plaka yan dokunun. Mikroskop altında hücreleri denetleyin. Müstakil ve yüzen hücreleri, devam edin. Hücreleri hala iliştirilmişse, başka bir 3 dakikadır kuluçkaya.
- Durulama/5 mL FEM de tripsin-EDTA nötralize etmek için kullanarak müstakil hücreleri toplamak. Fibroblast süspansiyon 15 mL konik tüp içine taşıyın. Hücreleri iyi karışık ve bir hemasitometre Sayın emin olun. Pipet 12.000 hücrelere prewarmed kaplama orta adım 2.2.4 4 mL.
Not: herhangi bir noktada hücreleri santrifüj kapasitesi değil. Kaplama hücre sayısı ayarlanabilir yukarı ya da aşağı yavaş - veya hızlı büyüyen satırları için gerekli olarak anılan sıraya göre. - Kaplamalı plaka kuluçka makinesi kaldırmak ve sulandırılmış rhLaminin-521 kaplamalı kuyulardan Aspire edin. Kuyu kuru yüzeyine izin vermez. Yavaşça kaplama orta hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 1 mL pipet kaplı her içine iyi (Yani, 3000 iyi başına hücre).
- Kaplama hücreleri (düşük-O2) % 5 ayarla O2 tri-gaz doku kültürü kuluçka makinesi yerleştirin. Plaka ayarlandıktan sonra yavaşça ama iyice hücreleri yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket arasında değişen tarafından dağıtmak. Hareketleri 2 kez daha tekrarlayın. Hücreleri gecede kuluçkaya. Karıştırmak için plaka girdap değil.
- 15 mL konik tüp ortamına yeniden programlama 4 mL pipet ve düşük-O2 kuluçka gecede equilibrate gevşetti bir kap ile yerleştirin. BFGF ve B18R kadar ertesi gün eklemeyin.
3. inisiyasyon Reprogramming (1 gün)
Not: bir kez yeniden programlama başlatılır, günlük bakım yaklaşık 1 ay için gereklidir. Buna göre plan emin olun. Tüm sonraki hücre incubations 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 oksijen tri-yakıt doku kültürü Ekstraktörü düşük-O2 koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir.
- En az 1 transfection önce s kaplama orta yerine.
- Dengelenmiş programlama orta düşük-O2 kuluçka makinesi kaldırın. BFGF 100 ng/mL ve B18R son bir konsantrasyon 200 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. İyice karıştırın.
- 1 ile de teker teker devam etmeden önce 1 mL pipet harcanan orta kaldırmak ve programlama orta bFGF ve B18R ile 1 mL ile değiştirmek için kullanın. Her şey için bu işlemi yineleyin. Aşırı hücreleri kurur, stres nedenleri ve programlama verimliliği azaltır vakum aspirasyon, kullanmayın. Hücreleri ile plaka geri düşük-O2 kuluçka makinesi taşıyın.
- Fibroblastlar RNAiMax transfection reaktif değiştirilmiş mRNA 1 µg başına 5 µL ile transfect ve transfection transfection reaktif miRNA 6 pmol başına 1 µL taklit eder.
Not: transfections 16-20 h için ilerlediğinizde en iyi sonuçlar elde edilir. Transfection reaktif seyreltilmiş 10 olduğunu x; 100 ng/µL değiştirilmiş mRNA kokteyl mi 5 x seyreltilmiş; ve çok güzel 5 pmol/µL miRNA taklit eder 8,33 x complexation önce transfection arabellek ile seyreltilmiş. Transfection kurulum Özeti için bkz. Tablo 1 .- Transfection hazırlama karışımları iken, potansiyel reaktifler maruz RNase standart laboratuar uygulaması takip ederek en aza indirmek.
- Bir aliquot RT. yaklaşık 1 h için transfection önbellek (adım 1.3) equilibrate 37 ° C su banyosu veya kuluçka transfection arabelleğini ısıtmak için kullanmayın.
- Değiştirilmiş (33 µL) mRNA'ların tek bir aliquot çıkarmak ve miRNA-80 ° C'den (14 µL) taklit eder ve onları RT için yaklaşık 3-5 dk için çözdürülen kadar sıcak. Aliquots 37 ° C'de erimek değil Onları kısa bir süre içinde bir microfuge spin aşağı.
- RT transfection reaktif için yaklaşık 3-5 dk sıcak. 37 ° C su banyosu veya kuluçka makinesi kullanmayın. 2-3 kez kapalı tüp ters reaktif karıştırmak için. Aşağı kısa bir süre içinde bir microfuge sıralayacağız.
- RT transfection arabelleği 279 µL RNase free microcentrifuge tüp içine aktarın. 310 µL. bir son hacmi elde etmek için transfection reaktif 31 µL eklemek pipetting tarafından iyice karıştırın. Değil girdap yapmak. RT at tüp 1 dk. için kuluçkaya.
Not: Bu seyreltilmiş transfection reaktif hacmi için karmaşık yeterli değiştirilmiş mRNA ve miRNA aliquots adım 3.2.3 taklit eder. - RT transfection arabelleği 132 µL değiştirilmiş mRNA 33 µL aliquot ekleyin. Yavaşça karıştırmak için pipet: son 165 µL birimdir.
- RT transfection arabelleği 102.6 µL miRNA taklit eder 14 µL aliquot ekleyin. Yavaşça karıştırmak için pipet: son 116.6 µL birimdir.
- Adım 3.2.5 seyreltilmiş transfection reaktif seyreltilmiş için 165 µL mRNA 3.2.6 adımından değiştirilme tarihi ekleyin. Pipet karıştırmak için: 330 µL son birimdir.
- Seyreltilmiş transfection reaktif 116.6 µL 3.2.5 adımından 3.2.7. adımdaki seyreltilmiş miRNA taklit eder karışıma ekleyin. İyice karıştırın (son hacim ise 233.2 µL). RT transfection arabelleğe değiştirilmiş mRNA'ların ile karmaşık izin vermek için 15 dk için kuluçkaya ve miRNA taklit eder.
- Hücreleri ile plaka düşük-O2 kuluçka kaldırın. 100 µL (1 µg) complexed, mRNA transfection karıştırmak için her şey dropwise iyi değiştirilme tarihi ekleyin. Yavaşça ama iyice yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket ile plaka Tantanacı transfection kompleksleri tarafından dağıtmak. Karıştırmak için plaka girdap değil.
- 66.7 µL (20 pmol), her şey için dropwise arasında iyi complexed miRNA taklit eder transfection karışımı ekleyin. Yavaşça ama iyice yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket ile plaka Tantanacı transfection kompleksleri tarafından dağıtmak. Karıştırmak için plaka girdap değil.
- Transfected hücreleri (düşük-O2) % 5 ayarla O2 tri-Yakıt Ekstraktörü yerleştirin. Plaka ayarlandıktan sonra transfection kompleksleri tarafından tekrar yavaşça iyice yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket ile plaka Tantanacı ama dağıtmak.
- Orta 15 mL konik tüp içine yeniden şekillendirmek için 4 mL pipet ve düşük-O2 kuluçka gevşetti kapaklı bir gecede equilibrate yerleştirin. BFGF ve B18R kadar ertesi gün eklemeyin.
| Tüp 1 - RNAiMax seyreltme (1 mix) | ||
| Reaktif | Konsantrasyon | Birim |
| Transfection arabellek | 279 ΜL | |
| RNAiMax (2 eklemek) | 10 x | 31 ΜL |
| Toplam: 310 µL | ||
| (Oda sıcaklığında 1 dk kuluçkaya) | ||
| Tüp 2 - değiştirilmiş mRNA mix (2 mix) | ||
| Reaktif | Konsantrasyon | Birim |
| değiştirilmiş mRNA mix | 100 ng/µL (5 x) | 33 ΜL |
| Transfection arabellek | 132 ΜL | |
| Toplam Sonuç: 165 µL | ||
| (seyreltilmiş RNAiMax eşit hacimli tüp 1 ekleyin) | ||
| Tüp 3 - miRNA taklit eder mix (3 mix) | ||
| Reaktif | Konsantrasyon | Birim |
| miRNA mix taklit eder. | 5 pmol/µL (8.33 x) | 14 ΜL |
| Transfection arabellek | 102.6 ΜL | |
| Toplam: 116.6 µL | ||
| (seyreltilmiş RNAiMax eşit hacimli tüp 1 ekleyin) | ||
Tablo 1: Hazırlık transfection karıştırın.
4. Transfections arasında Reprogramming orta yerine (2, 4, 6, 8, 10 ve 12 gün)
- Orta 16 – 20 h sonrası transfection 3.1.1–3.1.2 içinde açıklandığı gibi değiştirin. BFGF 100 ng/mL ve B18R son bir konsantrasyon için 200 ng/mL nihai bir konsantrasyon programlama orta aliquots içine ekleyin.
- Transfection kalite EGFP görselleştirmek için yapılandırılmış bir mikroskop kullanarak onaylamak için mWasabi ifade her gün izlemek.
Not: mWasabi ifade 2 günde en az belirgin olmalı ve her ek transfection ile parlaklığı artırmak.
5. diğer-günlük Transfections (3, 5, 7, 9, 11 ve 13 gün)
- Transfection 3.2 adımda anlatıldığı gibi gerçekleştirin. Orta transfection günlerde değiştirmeyin.
- Orta yeniden programlama, 4 mL aliquot hazırlamak ve ertesi gün orta değiştirmek için equilibrate için düşük-O2 kuluçka yerleştirin. BFGF ve B18R kadar ertesi gün eklemeyin.
6. son Transfection sonra gerçekleştirilecek işlemleri
- Günlük orta değişimleri 14 günde yaklaşık gerçekleştirmek gün 17. Orta 37 ° c olarak yeniden programlama 7 mL sıcak BFGF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.
Not: B18R artık son transfection sonra gerekli değildir. Gün 14, bu artık orta gecede düşük-O2 kuluçka equilibrate gereklidir. - Orta serolojik pipet kullanarak bütün kuyulardan kaldırın. Aspirasyon kullanmamak devam edin. Orta bFGF iyi ücret ile takıma yeniden programlama 2 mL ekleyin.
- 17 ve 18 gün üzerinde bir ters veya diseksiyon mikroskop altında programlanmış wells analiz. Koloniler birbirlerine yakın yeniden programlama, yüksek verimlilik nedeniyle oluşan ve el ile izole olamaz, kolonilerin programlanmış Wells aşağıdaki 7. adımda açıklanan bir isteğe bağlı passaging gerçekleştirerek ayırın. El ile kolonileri seyrek ve iyi ayrılmış ise, doğrudan doğruya--dan programlanmış klonlar adım 8 ve alt kültür iPSCs göre standart protokolleri de açıklandığı gibi seç.
7. isteğe bağlı usulü: Hücreleri Reprogrammed EDTA kullanarak kuyulardan Passaging
- 0,5 mM EDTA DPBS (EDTA) 0, 5 M EDTA hisse senedi çözüm sulandrarak hazırlayın. Filtre sterilize EDTA 0,22 µm vakum filtrasyon sistemi kullanarak.
- Besleyici-Alerjik pluripotent kök hücre (PSC) Orta (Örneğin, mTeSR1) üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Önceden sıcak 32 mL PSC orta ile 37 ° c
- Üreticinin yönergelerini izleyerek bütün wells ile hücre dışı matriks (ECM) hESC tam iki 6-şey biçimi plakaların kat. Parafin film ile plakalarının ve onları RT. 1 h için kuluçkaya
- Önceden ısıtılmış tabaklar ECM çözümden Aspire edin ve PSC orta iyi başına 2 mL ile değiştirin. Kuyu kuru yüzeyine izin vermez. Onları bir kenara koyun.
- Ne zaman koloniler büyük ve açıkça kurulan bir günde 2 programlanmış wells programlama ortamından Aspire (genellikle gün 18). Bir kez 1 mL EDTA ve Aspire edin ile yıkayın.
- EDTA 1 mL de başına ekleyin. 4 dk. 37 ° C'de için kuluçkaya
- Yavaşça kuluçka makinesi plaka çıkarın ve biyogüvenlik kabine yerleştirin.
Not: Bu noktada, çok gevşek yapıştırılır ve kolayca yerinden çıkar hücreler olabilir. - Dikkatli bir şekilde her iki kuyulardan EDTA Aspire edin. Her iyi EDTA ile tedavi için önceden ısıtılmış PSC orta 3 mL ekleyin. Yavaşça ama iyice hücreleri her iki kuyulardan çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
- Yavaşça hücre süspansiyon pipette ve büyük kümeleri kadar kırmak için serolojik pipet kullanın. Tüm hücre kümeleri yok olana pipet değil. IPSC kümeleri korumak.
Not: büyük kümeleri kaplama IPSC koloni sonucu etkilemez. Son derece büyük hücre kümeleri varsa, sadece onları sonraki amacına aktarılmasını önlemek. - Serolojik pipet kullanarak, EDTA tedavi her kuyudan hücreleri tarafından pipetting 0.5 mL ECM kaplı 6-şey plaka her kuyuya dağıtabilmenizi.
Not: hücreleri reprogrammed kuyulardan birleştirmek değil (de yeniden programlananYani, 1 eşit olarak dağıtılacak ilk 6-şey plaka ve programlanmış iyi 2 eşit olarak dağıtılacak ikinci 6-şey plaka). - Kaplama hücreleri geri düşük-O2 kuluçka makinesi taşıyın. Hücreler eşit olarak dağıtmak için her plaka ileri geri ve yan yana sallayın. Girdap değil. PSC orta her gün değiştirin.
8. malzeme çekme IPSC kolonileri
- PSC orta ile 37 ° c önceden sıcak 15 mL Tek bir 6-şey plaka tüm kuyu üreticinin yönergeleri izleyerek ECM hESC tam kat. Parafin film ile plakalarının ve onları RT. 1 h için kuluçkaya
- Kuyu iPSCs toplamak için kullanılan kültür ortamından Aspire edin. Bir kez 1 mL EDTA ve Aspire edin ile yıkayın. EDTA 1 mL de başına ekleyin. 4 dk. 37 ° C'de için kuluçkaya Hücreleri kuluçka, önceden ısıtılmış tabaklar ECM çözümden Aspire edin ve PSC orta iyi başına 2 mL ile değiştirin. Tabakları bir kenara koyun.
- Yavaşça iPSCs kuluçka makinesi çekilmesi ve Biyogüvenlik kabini yeri ile plaka çıkarın.
Not: Bu noktada, çok gevşek yapıştırılır ve kolayca yerinden çıkar hücreler olabilir. - Dikkatle EDTA Aspire edin. Çok yavaşça IPSC kolonileri çıkarmak değil için dikkat çekici önceden ısıtılmış PSC orta 3 mL ekleyin.
- Daha iyi bir ters veya parçalanmış kapsama plakasına görselleştirmek kolonileri taşıyın. 1 mL pipet steril bir ipucu ile hazırlayın. Pistonu tamamen bunalıma girmek sonra pipet ucu hafifçe yavaş yavaş koloni toplamak için belgili tanımlık uç sıvı çizerken bir koloni kazımak için kullanın. Mümkün olduğunca küçük orta olarak IPSC koloni tespit ederken çizin.
- Koloni aktarmak için yukarı ve aşağı 3-4 kez adım 8.2 ECM kaplı plaka tek bir kuyu içinde pipet. 6 kolonileri seçtim ve tek tek kuyu transfer kadar yineleyin. Bir isteğe bağlı 7. adımda açıklanan passaging gerçekleştirilen fazla 2 kolonileri tek herhangi bir kuyudan almak.
- Tüm kalan wells dondurmak için bir standart insan kök hücre protokolünü kullanır. Çözülme ve daha fazla koloniler daha sonra çekilmiş olmalı eğer dondurulmuş stokları yeniden plakası.
9. iPSCs karakterizasyonu
- TRA-1-60 verimliliği (gün 18) yeniden programlama analizi için boyama gerçekleştirmek.
Not: 2 dışarı-in yeniden programlanan 3 kuyu gelecekteki koloni çekilmeye pasajlı. Kalan de kullanılabilir TRA-1-60 boyama için. Bu yordam laboratuvar tezgah üstüne gerçekleştirilebilir.- Programlanmış PBS de 1 mL ile yıkayın. -20 ° c 5 min için buz gibi metanol ile hücreleri tamir.
- Metanol Aspire edin. Kuru kuyu yaklaşık 2 dakika süreyle değil aşırı kuru için dikkatli olun. Hücreleri yeterince şeffaf/örtü rengi olduklarında kurumuş.
- PBS 1 mL ile de 3 kez nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. Yıkama sırasında 3 mL %3 hidrojen peroksit PBS içinde hazırlamak.
- PBS Aspire edin. 2 mL sulandırılmış peroksit çözeltisi ekleyin. Nazik sallayarak ile 15 dakika RT, kuluçkaya. 4 mL engelleme çözeltisi hazırlamak: PBS % 10 Sığır serum albumin (BSA).
- Peroksit çözüm Aspire edin. PBS 1 mL ile de 2 kez 5 dakika yıkayın.
- PBS Aspire edin ve çözüm kuyuya engelleme 2 mL ekleyin. Dik, 1 h için kuluçkaya
- PBS 1 mL ile de 3 kez nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın.
- 1: %100 0.05 sodyum azid ile desteklenmiş engelleme çözümde, birincil anti-TRA-1-60 antikor sulandırmak. 1 mL 1 için antikor seyreltme de, bir 6-iyi biçim yemek hazırlamak. Antikor seyreltme kuyuya ekleyin ve buharlaşma önlemek için parafilm ile plaka sarın. Gecede 4 ° C'de nazik sallayarak ile kuluçkaya.
Not: gerekirse, birincil antikor ile kuluçka RT nazik sallayarak ile 1 h için yapılabilir. Birincil antikor seyreltme ilâ 5 kere yeniden kullanılabilir. - Birincil antikor ile kuluçka sonra PBS 1 mL ile de 3 kez nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın.
- İkincil Anti-fare HRP Birleşik antikor engelleme çözüm 1: 200, seyreltik. RT nazik sallayarak ile 2 h için ikincil antikor seyreltme ile iyi kuluçkaya.
- İkincil antikor seyreltme Aspire edin ve nazik sallayarak ile 5 min için PBS 1 mL ile de 3 kere yıkayın.
- Üçüncü yıkama sırasında üreticinin öğretim takip substrat çözeltisi hazırlamak. Son yıkama sonra PBS Aspire edin. 1 mL substrat çözeltisi ekleyin ve istediğiniz renk (yaklaşık 10 dakika) oluşturuncaya dek kuluçkaya.
- Substrat çözeltisi Aspire edin. Hafifçe sallayarak süre iyi 5 min için su ile durulayın.
- Koloniler, isterseniz Sayın. Verimliliği yeniden programlama = (kolonileri sayısı) / (kaplama fibroblast sayısı) x %100.
- Uzun süreli depolama, su lekeli plaka Aspire edin ve gecede RT. mühür parafilm ile kurutulmuş plaka kurumasına ve programlama verimliliği daha sonra değerlendirmek 2 yıl 4 ° C'de saklarız.
Representative Results
Genellikle yaklaşık 5-6 hafta fibroblast iPSCs (Şekil 1) ilk şişeleri dondurma için yeniden programlama başlanmasından sonra alır. Programlama Protokolü genellikle iki aşamalar halinde kategorize edilebilir. Faz 1 fibroblast kültür içerir ve programlama RNA kokteyl ile her 48 h. Phase 2 gerçekleştirilen yedi transfections yalıtım, genişleme ve karakterizasyonu IPSC kolonileri içerir.
Protokol işlemini başlatmadan önce bu fibroblastlar yeniden programlanan iyi bir kaliteye sahip olduğunu sağlanması. Sağlıklı fibroblastlar seklinde, bipolar, görünmelidir ve yaklaşık 24 h katlama süresi ile refractile. 0 gün, 250.000 hücreleri -2 günde 10 cm çanak içine kaplama % 40-60 confluency (Şekil 1, gün 0) büyümek ve yaklaşık 6-10 x 105 hücre verim gerekir. Daha yavaş bir hızda Proliferasyona hücreleri için kaplama yüksek yoğunluklu, gün -2 ve yeniden programlama için gün 0 tarafından telafi.
Fibroblastlar yeniden programlama için 6-şey biçimi yemeğin bir kuyuya çok seyrek aşağıdaki kaplama görünmelidir (Şekil 2, 1. gün). Yirmi dört saat ilk transfection fibroblastlar iğ şekilleri kaybetmek ve yeniden programlama kalan muhafaza bir daha yuvarlak morfoloji (Şekil 2, 2. gün), evlat. MWasabi gelen yeşil floresans mRNA en az 2 günde gözlemlenebilir olmalı ve parlaklık 4 gün tarafından açıkça görünür olması için sürekli artış. MWasabi floresan algılama yeteneğini kapsam duyarlılık ve kurulum üzerinde bağlıdır. Hücre yoğunluğu yavaş yavaş ve sürekli olarak ilk üç transfections (gün 1-6), 7 ve 8 gün arasında meydana gelen nükleer silahların yayılmasına karşı belirgin bir patlama ile artacaktır. Hücreleri gün 10 (Şekil 2, 10 gün) tarafından büyük ölçüde konfluent görüntülenmesi gerekir. İlk IPSC kolonileri gibi erken gün 11 (Şekil 2, gün 11); görünebilir Ancak, koloniler observable gün 18 kadar kadar olmayabilir. Genel olarak, gün 15-18, orada-ecek var olmak çevre, eksik olarak programlanmış fibroblastlar açıkça farklı olan büyük ve açık IPSC koloniler (Şekil 2, gün 15 ve Şekil 3, gün 17). Immunostaining pluripotency işaretçi TRA-1-60 için programlama verimliliği (Şekil 3, gün 17, TRA-1-60) değerlendirmek için gerçekleştirilebilir. Deneyim, çoğu fibroblast satır koloniler yüzlerce de yeniden programlanan verim (Şekil 3, iç metin B).
Suboptimal kaplama yoğunluğu bizim protokolünde yeniden programlama, azalan verimlilik için en sık nedenidir ve sık sık hastalıklı, senescent, ve/veya yüksek geçit fibroblastlar ile ilişkilidir. Kaplama yoğunluğu çok düşük ise, orada-ecek var olmak büyük acellular çorak yamalar (Şekil 4 c) yeniden programlama sonunda ve IPSC koloniler (Şekil 4 d) formu değil. Programlanmış hücre gün 14 tarafından çok konfluent olmalıdır ( Şekil 4A ve 4B Şekil 2, karşılaştırın gün 14). Hücreleri çok yoğun kaplama veya çok hızlı çoğalırlar, benzer şekilde, yeniden şekillendirmek için verimliliği önemli ölçüde azalır.
İPSCs hasta elde edilen polimerlerin korumak için bir koloni hücre satırlarından genişletmek önemlidir. Verimliliği yeniden programlama bizim protokolünde çok yüksek olduğundan, IPSC kolonileri komşu yakın oluşturmak ve her bir (Şekil 3, gün 15-17) büyür. Bu bazen bir koloni klonal genişleme için mekanik olarak ayırmak zor yapar. Programlanmış bir şey ve daha büyük bir kültür alanı boyunca seyreltik ilk geçiş için yararlı olduğunu bulduk. İyi geçiş oranı eşit olarak iyi bir tüm 6-şey plaka arasında programlanmış bir 6-iyi format plaka yarma oluşur.
Seyreltme geçit iPSCs koloniler büyümek ve fibroblast (Şekil 5, günü 18) kolaylıkla ayırdedilebilir. Başlangıçta, IPSC kolonileri gevşek dolu ve tek tek hücreler nispeten büyük bir sitoplazmik alanına sahiptir. 4-7 gün boyunca, iPSCs çoğalırlar ve karakteristik bir sıkı paketlenmiş koloni ile tanımlanan kenarları oluşturur. Koloni içinde tek tek hücreler belirgin nükleulus (Şekil 5, gün 22) ile büyük bir nükleer kesir var. Her kuyuya oluşturan birçok koloniler olmalıdır ve yalnızca bu klasik IPSC morfolojisi ile genişleme için çekilmesi gereken.
Resim 1 : İnsan fibroblast, yeniden programlama indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs). İnsan fibroblast yeniden programlama için şematik bir protokol sunulmuştur. Fibroblastlar ilk 48 saat aralıklarla gerçekleştirilen yedi transfections ardından bir 6-şey biçimi yemeğin bir kuyuya düşük yoğunluklu, pasajlı. Her transfection sonra değiştirilen 16 – 20 h ortamıdır. Programlanmış iPSCs ilk pasajlı 18 ve klonal kolonileri gün yaklaşık 26 gün tarafından toplanır. Genellikle, fibroblast kaynaklı IPSC satırları gün 38 uzun süreli depolama için donmuş olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Yeniden programlama her gün sırasında temsilcisi günlük görüntüler. Fibroblastlar yeniden programlama başlatmak için geçiş zaman yaklaşık % 40-60 birleşmesi olmalıdır (gün 0, hücreleri bir 10 cm tabak içinde kaplama). İlk transfection (T1) 1 gün oluşur ve hücreleri bu noktada çok seyrek görünmesi gerekir. Ertesi gün (2. gün) daha yuvarlak bir morfoloji belirgin hale gelmelidir. Hücreleri (kırmızı daire içinde) gün 11 gibi erken görünmesini başlayan IPSC kümeleriyle yoğunluğundaki protokol boyunca artmaya devam edecektir. Gün 15, IPSC koloniler ile gizli sınırları büyük olacaktır. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Transfections yeniden programlama ile takip koloni oluşumu değiştirilen mRNA'ların ve miRNA taklit eder. Düşük-büyütme görüntüleri gün 15-17 yeniden programlama bir temsilcisi alındı. Son transfection, programlanmış iPSCs boyutu genişletilmesi ve eksik olarak programlanmış çevreleyen fibroblastlar açıkça farklı olmak için yoğunlaşmak tanımlanmış sınırları ile açık kolonileri oluşturacak. Pluripotent işaretçi TRA-1-60 için Immunostaining iPSCs (a ilave) varlığını gösterir ve verimliliği tek bir kuyu (iç B, örnek metin sayılabilir kolonileri yeşil daire içine alınmış) içinde tüm kolonileri sayılarak yeniden şekillendirmek için hesaplama için kullanılır. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Yeniden programlama için alt-optimal kaplama yoğunluğu temsilcisi görüntüler. (A, B) Tarafından gün 14-yeniden programlama, çok seyrek fibroblastlar örnekleri ( Şekil 2, karşılaştırın gün 14). (C) düşük büyütme görüntü gün 17 büyük, çorak yama ile yeniden programlama üzerinde kırmızı daire içine alınmış. (D) aynı şey sabit ve TRA-1-Genel yoksul onaylamanız için 60 lekeli verimliliği düşük hücre yoğunluğu nedeniyle yeniden programlama. Ölçek Bar = 200 µm (A, B) ve 1 mm (C, D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : İPSCs ilk geçiş sonra temsilcisi görüntülerini. Yeniden programlama değiştirilmiş mRNA'ların ve miRNA taklit eder, programlanmış hücreler ile transfections tamamladıktan sonra gün 17 – 20 pasajlı. iPSCs bir büyüme avantajı PSC ortamda var ve hızlı bir şekilde eksik olarak yeniden programlanan herhangi bir fibroblastlar sollamak. Başlangıçta, iPSCs ile kötü belirlenen sınırlar gevşek görünebilir kolonileri oluşturacak. Birkaç gün içinde hücreleri hızlı bir şekilde çoğalırlar ve sıkıca koloniler ayrı kenarlıklı içine kümeleme yüksek bir çekirdek sitoplazma oranı ile sıkıca paketlenmiş hücre karakteristik morfoloji almak. Ölçek çubuğu 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu iletişim kuralı normal ve hastalık ilişkili insan fibroblast satır içine iPSCs bir ultra-yüksek verimlilik, yeniden programlama için sağlar bir klinik olarak ilgili, Sigara-entegre, RNA tabanlı yöntemini açıklar. Bugüne kadar açıklanan protokol ile yeniden programlamak için çalıştılar her insan fibroblast satır aşağı akım uygulamaları için yüksek kaliteli iPSCs tatmin edici bir dizi vermiştir. Elde edilen iPSCs hemen transfer ve besleyici-Alerjik kültür koşullarda genişletilmiş.
Fibroblastlar yeniden programlama için kalite:
Başarı yeniden programlama ağır fibroblastlar başlayan kalitesine bağlıdır. İdeal olarak, yeniden programlama en yüksek verimliliği elde etmek kullanılabilir en düşük geçiş fibroblastlar ile başlatılması. Verimliliği yeniden programlama ile geçiş 2 – 4 fibroblastlar en iyisidir. Yeniden programlama hala yüksek-geçit ile (geçit 5-8), hatta senescent fibroblastlar, de olsa düşük verimlilik ile çalışabilirsiniz. Bazen düşük geçiş fibroblastlar kullanılamaz veya hasta numuneleri sağlıklı büyüme engelleyen bir genetik mutasyon var. Bu durumda, ilk kaplama yoğunluğu duruma getirilmesi gerekebilir. Güvenliği aşılan fibroblast satırları yeniden programlama genellikle artan hücre ölümü sırasında RNA transfections ilişkilidir. Sonuç olarak, iyi yeniden programlama hücreler tarafından gün 10 – 14-yeniden programlama, seyrek olarak görünür. Ayrıca geniş acellular alanlar kuyuda görünür hale gelir. Bu durumda programlama protokolü yeniden bir daha yüksek başlangıç başlangıç sayısını fibroblastlar ile başlatılan olmak gerekir. İyi bir 6-şey biçimi yemeğin başına 3.000 giriş hücreleri kaplama en yetişkin fibroblast satırları için sürekli olarak çalışır. Ancak, kaplama 5.000 – 10.000 (50.000 senescent satırları için) artırıldığında hastalık ilişkili örnekleri, yeniden programlama olarak rapor bizim önceki yayın8' geliştirmek için yardımcı olabilir. Tersine, confluency çok erken ulaşan hücreler de yeniden programlama için dayanıklı olabilir. Transfections RNA'ların yeniden programlama ile geçiren hücreleri çok hızlı çoğalırlar (bazen birincil yenidoğan fibroblastlar modelinde olduğu gibi), bir 6-şey biçimi çanak8kuyu başına 500 fibroblastlar ile yeniden programlama başlatmak.
Transfection arabellek işleme:
Transfection arabellek (8.2 pH için düzeltilmiş azaltılmış-serum orta) pH için bu protokolü yeniden şekillendirmek için gerekli optimum transfection verimliliği ulaşmak için her şeyden önemlidir. Bu nedenle, çeşitli önlemler transfection arabellek kullanımı ile ilgili tavsiye edilir. Biz bile kısa maruz atmosferik hava transfection arabellek arabellek pH etkiler bulduk. Bu nedenle, transfection arabellek en az hava alanı (5 veya 15 mL vidalı kapak konik boru kullanın) olan bir vidalı kapak kaba bölünmemeli olmalıdır. Daha fazla hava pozlandırmayı en aza indirmek için en fazla iki transfections için her transfection tampon aliquot kullanın. Son olarak, sıcaklık etkileri pH beri bu transfection tampon transfection kompleksleri montaj için RT equilibrated önemlidir. Transfection arabellek ile 37 ° c sıcak değil tavsiye edilir
İPSCs passaging:
Çok daha önce bireysel IPSC kolonileri yeniden programlama sonunda malzeme çekme iletişim kuralları tavsiye yayınlandı iken, bu yeniden programlama verimliliği çok yüksek olduğunda veya sık sık olduğu gibi koloniler birlikte, kümelerseniz elde etmek zor olabilir bizim iletişim kuralı. Bu nedenle, IPSC kolonileri birbirlerine yakın iseniz, önce el ile kolonileri toplama önce programlanmış iPSCs yaymak için hücreleri passaging öneririz. Bu erken geçiş adımı gerçekleştirmek için çeşitli yararları vardır. Koloniler yayılan onları büyümeye, daha çok yer Aksi takdirde özgün kuyuda elde edilebilir daha çok daha büyük koloniler çekilmeye getirisi sağlar. Bu çekilen bir klon bir IPSC satırından kurulmasında başarı oranı büyük ölçüde artırır. Biz de fibroblastlar, ek kültür zamanla oranında sulandırılmış de olsa, çekilen IPSC kolonilerin ortalama kalitesini artırmak için görünür olduğunu bulmak. Eksik olarak programlanmış fibroblastlar iPSCs kurmak ve besleyici-Alerjik hücre kültür koşullar içine doğrudan geçişi kolaylaştırmak yardımcı olmaya devam destek parakrin faktörler sağlayabilir. Fibroblastlar tesadüfen mTeSR1 içinde kültürlü zaman iPSCs göre bir seçici büyüme dezavantajı var. Bu nedenle, bulaşıcı fibroblast hücre nüfusu hızlı bir şekilde 3-4 pasajlar içinde ihmal edilebilir miktarlar için seyreltilmiş.
ROCK inhibitörleri gibi Y-27632 insan iPSCs rutin kültür için sık sık kullanılır. Biz sık sık ve/veya genişletilmiş kültür Y-27632 ile bazı IPSC satırlarının genel kalitesi üzerinde zararlı etkileri olabilir bulduk. Yöntem passaging bir yığın kullanırken, gibi EDTA ile Y-27632 bölme sonra IPSC canlılığı korumak için gerekli değildir. Biz tamamen ortadan Y-27632 getirilerini ortamla tüm IPSC yalıtım, genişleme veya rutin kültür.
İletişim kuralı sınırlamaları:
Başlangıç maliyeti ve karmaşıklığı programlama reaktifler hazırlanması ile ilişkili açıklanan RNA tabanlı programlama yaklaşımı bir kısıtlamadır. Her ne kadar tüm rutin vardır ve daha önce olmuştur reaktifler mRNA oluşturmak için hazırlık işlemleri (PCR, vitro transkripsiyon, DNaz tedavi, kapatma, dephosphorylation, arıtma) açıklanan, kümülatif mRNA reaktifler yapımıdır nispeten uzun ve olmayan önemsiz bir süreç. Bu iletişim kuralı için diğer büyük sorun hücreleri programlama Protokolü emek yoğunluğu artan her 48 h transfect gerek olduğunu. Bunu göz önünde sadece bir kaç hasta örnekleri yeniden programlama isteniyorsa engelleyici olabilir. Temel düşüncedir klinik iPSCs veya çok yüksek programlama verimlilik sağlanması olduğunu, ancak, açıklanan RNA tabanlı programlama yaklaşımı idealdir.
Özet olarak, açıklanan yüksek verimli RNA tabanlı programlama yöntemi somatik hücre tipi bizim önceki yayın8' de açıklandığı gibi yeniden programlanan verimliliğini optimize edilmiş transfection bağlı. Bu çalışmada sunulan RNA transfection iletişim kuralı çok insan birincil fibroblastlar için ayarlanmış ancak potansiyel olarak programlama çeşitli somatik hücrelerin verimliliğini artırmak için diğer hücre tipleri için uygun olabilir.
Disclosures
I.K. ve G.B. yardımcı mucitler "Yöntemleri ve besteleri için yeniden programlama hücreleri", PCT başvuru no başlıklı bir patent başvurusu üzerine vardır PCT/US2016/063258.
Acknowledgments
Ulusal Sağlık Enstitüleri (T32AR007411-33) ve Colorado Üniversitesi cilt hastalıkları araştırma çekirdek Merkezi (P30AR057212) destek finansmanı için sana şükrediyoruz. Epidermolysis Bullosa (EB) araştırma ortaklığı, EB Tıbbi Araştırma Vakfı, tedavi EB sadaka, distrofik Epidermolysis Bullosa Araştırma Derneği (DEBRA) Uluslararası, King Baudouin Vakfı'nın Vlinderkindje fon ve Gates ayrıca teşekkür ediyoruz Ufuklar fonu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
