Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب ذات الصلة سريرياً، ذات الكفاءة العالية، وخالية من علبة التغذية بالورق لإعادة برمجة الخلايا الليفية الأولية البشرية في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام مرناس تعديل الترميز عوامل إعادة برمجة ويحاكي ناضجة microRNA-367/302. يتم أيضا تضمين أساليب لتقييم الكفاءة، وإعادة برمجة توسيع المستعمرات الاستنساخ اللجنة التوجيهية، وتأكيد التعبير عن علامة بلوريبوتينسي هيئة تنظيم الاتصالات-1-60.
Abstract
وأثبتت الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) لتكون أداة قيمة لدراسة التنمية البشرية والمرض. يتطلب مواصلة النهوض إيبسكس التجدد العلاجية آمنة، قوية، وبروتوكول إعادة برمجة المناسب. نقدم هنا، بروتوكول ذات الصلة سريرياً، خطوة بخطوة للغاية ذات الكفاءة العالية إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد البشري في إيبسكس باستخدام نهج غير دمج. يتكون جوهر البروتوكول للتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي (SOX2، KLF4، كميك، LIN28A، نانوج، OCT4-دخولها الانصهار) من في المختبر الكشف رسول يدون توليفها مع تعديل النيوكليوتيدات (مرناس المعدلة). هي transfected مرناس تعديل إعادة برمجة في الخلايا الليفية الأولية كل 48 ساعة إلى جانب ناضجة يقلد microRNA-367/302 الخاصة بالخلايا الجذعية الجنينية لمدة أسبوعين. المستعمرات اللجنة التوجيهية الناتجة يمكن ثم عزل وتوسيع مباشرة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق. لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة والاتساق لدينا بروتوكول إعادة برمجة عبر عينات تنتجها الخلايا الليفية، ونحن قد الأمثل المعلمات المختلفة بما في ذلك نظام تعداء الجيش الملكي النيبالي، توقيت ترانسفيكتيونس وشروط الثقافة وكثافة البذر. الأهم من ذلك، يولد لدينا أسلوب إيبسكس عالية الجودة من معظم المصادر تنتجها الخلايا الليفية، بما في ذلك عينات لإعادة برمجة المريضة، الذين تتراوح أعمارهم بين، و/أو مسن.
Introduction
إعادة برمجة خلايا جسدية في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) يتطلب التعبير الموسعة لمجموعة أساسية من عوامل النسخ التي تعتبر مهمة في الحفاظ على بلوريبوتينسي1،2. عند إنتاج إيبسكس للتطبيقات السريرية، من الضروري أن يتم تصغير عبء حيث في خلايا الإدخال أثناء معالجة وهو الحفاظ على كفاءة توليد اللجنة التوجيهية على مستوى عال نسبيا عبر عينات المرضى. إلا أن الغالبية من إعادة برمجة أساليب، بما في ذلك البروتوكولات خالية من التكامل، تعاني من كفاءات إعادة برمجة منخفضة جداً، أي فائدة السريرية الحد من هذه النهج3. انخفاض كفاءة إعادة برمجة قد تعزز أيضا انتقائية إعادة برمجة الخلايا تحمل الطفرات الموجودة مسبقاً، زيادة العبء حيث في إيبسكس الناجمة عن ذلك. وبالإضافة إلى ذلك، كافة على أساس الحمض النووي إعادة برمجة أساليب، مثل لينتيفيروس وابيسومال--النهج المستندة إلى، يعانون من القلق إزاء سلامة أن الحمض النووي قد عشوائياً دمج الجينوم ويهيئ الفرصة للطفرات insertional الضارة وغير المرغوب فيها ( يحتمل أن تكون النمطان) التعبير عن الجينات بلوريبوتينسي في الأنسجة المصب مشتقات4.
اتباع نهج واعدة لتحقيق كفاءة تنظيم دورات تعريفية بلوريبوتينسي في خلايا جسدية والحد من عبء حيث في إيبسكس الناجمة عن ذلك استخدام الكشف رسول توج الاصطناعية التي تتضمن تعديل نوكليوباسيس (مرناس المعدلة) لإعادة برمجة5. يمكن زيادة تعزيز كفاءة تعديل نهج إعادة برمجة تستند إلى مرناً بإضافة الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)-microRNAs محددة (ميرناس)-367/302s3، التي أظهرت لإعادة برمجة خلايا جسدية مع زيادة كفاءة6 ،7. بيد حتى مع إضافة ميرناس-367/302s، كثيرا ما معدلة مرناً النهج القائم في إعادة برمجة يفشل أثناء التطبيق إلى خلايا المريض معزولة طازجة3. لمعالجة التناقضات لهذا النهج المعدل على أساس مرناً، ونحن قد أبلغت مؤخرا استراتيجية محسنة، وخالية من التكامل الذي يدفع بلوريبوتينسي في الخلايا الليفية الأولية البشرية مع نسبة نجاح عالية، ويستخدم كلا مرناس تعديل الترميز إعادة برمجة العوامل وناضجة ميرنا-367/302 يحاكي8. في أسلوبنا، يتضمن إعادة برمجة مرناً معدلة كوكتيل نسخة معدلة من OCT4 تنصهر مع دخولها المجال (تسمى س م3) ترانساكتيفيشن9 وخمسة عوامل إعادة برمجة أخرى (SOX2، KLF4، كميك، LIN28A، ونانوج). الجمع بين مرناً تعديل الترميز العوامل بلوريبوتينسي مع ميرنا يقلد يبدو أثر تآزري على إعادة برمجة الكفاءات في هذا البروتوكول. تحسينات إضافية لنظام تعداء الجيش الملكي النيبالي، خلية البذر، وتثقيف شروط ضرورية أيضا لزيادة كفاءة إعادة برمجة النهج إلى مستوى فائقة8.
وخلافا للعديد من البروتوكولات الأخرى، يتطلب نهجنا إعادة برمجة عادة سوى بضعة آلاف الإدخال الليفية. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من غير دمج استراتيجيات مشتركة باستخدام البلازميدات ابيسومال، الفيروس سينداي، أو الحمض النووي الريبي ذاتية تنطوي على باساجينج واسعة النطاق تمييع ناقل إعادة برمجة في إيبسكس الذي تم إنشاؤه. على العكس من ذلك، تعديل مرناً ويقلد ميرنا ناضجة لها نصف عمر قصيرة ويتم التخلص سريعاً من الخلايا. أخذت معا، مقدار الوقت ثقافة الخلية التراكمي بين جمع عينات المرضى وتوليد إيبسكس للاستخدام الحد الأدنى في هذا النهج، ويحد من فعالية تراكم الطفرات في إيبسكس الناجمة عن ذلك وتحسين الفعالية من حيث التكلفة.
وهنا، يقدم البروتوكول مفصلة خطوة بخطوة لتحقيق الكفاءة العالية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية الكبار إلى إيبسكس استخدام النهج المعدل اندماجي مرناً/ميرنا القائم لدينا8. يوفر هذا البروتوكول إعادة برمجة تستند إلى الجيش الملكي النيبالي طريقة واضحة وفعالة من حيث التكلفة، وقوية لتوليد إيبسكس خالية من التكامل للبحوث وإمكانات التطبيقات السريرية. وعلاوة على ذلك، أنها تنطبق على إعادة برمجة مجموعة متنوعة من خطوط تنتجها الخلايا الليفية بما في ذلك صعوبة--إلى--إعادة برمجة، المرتبطة بالمرض، الليفية أعمارهم، ومسن. ويرد في الشكل 1تخطيطي للبروتوكول المتعلق بإعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية. ويصف البروتوكول على وجه التحديد طريقة لإعادة برمجة ثلاث آبار للبشرية الليفية الأولية الكبار في لوحة شكل 6-جيدا. بئرين العائد عادة عددا كافياً من المستعمرات اللجنة التوجيهية عالية الجودة. في كثير من الحالات، واحد فقط أيضا ضروري، والثالث أيضا يمكن أن تستخدم لتحليل إعادة برمجة الكفاءة. إذا لزم الأمر، يمكن زيادتها العدد الآبار.
Protocol
العمل في ظروف خالية من رناسي واستخدام تقنيات التعقيم المناسبة عندما يكون ذلك ممكناً. أداء كل خلية ذات الصلة بالثقافة التلاعب في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء باستخدام تقنيات العقيم. اتباع معايير السلامة المؤسسية للعمل مع الخلايا البشرية.
1-الكواشف والمعدات اللازمة للتحضير لإعادة برمجة الشروع
- إعداد كوكتيل مرناً تعديل عوامل إعادة برمجة الترميز.
- اتبع البروتوكول المنشورة سابقا10 القيام بالنسخ في المختبر ، وضع حد أقصى، وديفوسفوريليشن إجراءات لكل تعديل مرناً ترميز الفردية عامل إعادة برمجة. بعد خطوة التنقية النهائية، الوت مرناً معدلة مع المياه خالية من نوكلاس وتكملة الحل مرناً معدلة المنقي مع 1 يو/ميليلتر رناسي المانع وكوانتيتاتي مرناس المعدلة باستخدام جهاز المطياف الضوئي وتخزين في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. تحضير مختبرين متعددة لكل تعديل مرناً التقليل من عدد دورات تجميد أذاب.
ملاحظة: في أي مكان آخر عن بروتوكولات مماثلة لتعديل مرناً وقد تم إنتاج5،،من811. يمكن إنشاء قوالب للنسخ في المختبر بالتضخيم بكر من قوالب بلازميد المقابلة باستخدام كبسولة تفجير المدرجة في الجدول للمواد وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا10. بلازميد قوالب لكل عامل من عوامل إعادة برمجة (م3س9، SOX2، KLF4، كميك، نانج، LIN28A) ومواسابي (عنصر تحكم تعداء) متوفرة من أدجيني، مستودع بلازميد غير هادفة للربح. - مزيج معا جميع مرناس معدلة بنسبة 3:1:1:1:1:1 مولى (م3س: SOX2: KLF4: كميك: نانج: LIN28A)، وتشمل 10% مواسابي تعديل مرناً كعنصر تحكم لكفاءة تعداء. ضبط تركيز مرناً معدلة كاملة إعادة برمجة مزيج لتركيز نهائي من 100 نانوغرام/ميليلتر عن طريق إضافة المياه خالية من نوكلاس تكملة مع 1 يو/ميليلتر رناسي المانع. إعداد سبعة 33 ميليلتر مختبرين لاستكمال تعديل كوكتيل مرناً. تخزين مختبرين إعادة برمجة مختلطة في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: لكل تعداء، 1,000 يضاف نغ كوكتيل مرناً تعديل كل بئر (أي ما مجموعة 3000 نانوغرام لآبار 3). كل ميليلتر 33 الكوة هو الحجم إلى ترانسفيكت 3 آبار للوحة الشكل 6-جيدا، ويتضمن 3 ميليلتر من الحجم الزائد لحساب الأخطاء بيبيتينج. إعداد سبعة 33 ميليلتر مختبرين غير كافية لإكمال إعادة برمجة كاملة تنتجها الخلايا الليفية 3 آبار في لوحة شكل 6-جيدا.
- اتبع البروتوكول المنشورة سابقا10 القيام بالنسخ في المختبر ، وضع حد أقصى، وديفوسفوريليشن إجراءات لكل تعديل مرناً ترميز الفردية عامل إعادة برمجة. بعد خطوة التنقية النهائية، الوت مرناً معدلة مع المياه خالية من نوكلاس وتكملة الحل مرناً معدلة المنقي مع 1 يو/ميليلتر رناسي المانع وكوانتيتاتي مرناس المعدلة باستخدام جهاز المطياف الضوئي وتخزين في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. تحضير مختبرين متعددة لكل تعديل مرناً التقليل من عدد دورات تجميد أذاب.
- إعداد الكوكتيل من إعادة برمجة يقلد ميرنا.
- حل المجففة بالتبريد ميرنا يقلد (Syn-قد-مير-302a-3 ف، Syn-قد-مير-302b-3 ف، اصطناعي قد-مير-302 ج-3 ف، ف Syn-قد-مير-302d-3، ف Syn-قد-مير-367-3) إلى تركيز نهائي 5 pmol/ميليلتر (5 ميكرومتر) في المياه خالية من نوكلاس تستكمل مع يو 1/ميليلتر من رناسي المانع. تحضير مختبرين متعددة من كل تقليد ميرنا وتخزينها في-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- مزيج جميع يقلد ميرنا في نسبة 1:1:1:1:1 مولى لتركيز نهائي من 5 pmol/ميليلتر (5 ميكرون). إعداد سبعة 14 ميليلتر مختبرين لميرنا يحاكي المزيج. تخزين مختبرين مختلطة في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: لكل تعداء، تتم إضافة pmol 20 من مزيج يقلد ميرنا كل بئر (أي ما مجموعة 60 pmol لآبار 3). كل ميليلتر 14 الكوة هو الحجم إلى ترانسفيكت 3 آبار للوحة الشكل 6-جيدا ويشمل 2 ميليلتر من الحجم الزائد لحساب الأخطاء بيبيتينج. إعداد سبعة 14 ميليلتر مختبرين غير كافية لإكمال إعادة برمجة كاملة تنتجها الخلايا الليفية 3 آبار في لوحة شكل 6-جيدا.
- إعداد المخزن المؤقت تعداء.
- قبل حارة واحدة 500 مل زجاجة وزجاجة 100 مل من الطازجة المتوسطة المصل خفض درجة حرارة الغرفة (RT) لما يقرب من 2 ح. يجب عدم استخدام حمام مائي.
- نقل مقياس الأس الهيدروجيني للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء. أغسل الزجاج الكهربائي متر مع المياه خالية من نوكلاس. معايرة مقياس الأس الهيدروجيني وفقا للإرشادات صنعها. أغسل مسرى مرة أخرى مع المياه خالية من نوكلاس.
- نقل كلا زجاجات من المصل انخفاض متوسط في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. استخدام زجاجة 500 مل RT لضبط درجة الحموضة.
- قياس درجة الحموضة قاعدة متوسطة المصل خفض بإدراج الزجاج الكهربائي مقياس الأس الهيدروجيني في في المخزن المؤقت. الانتظار حتى 1 دقيقة قبل قراءة الرقم الهيدروجيني على العداد.
- إضافة 3-4 مل من هيدروكسيد الصوديوم م 1 إلى 500 مل من المصل خفض المتوسطة وإغلاق الزجاجة ومزيج جيد. الانتظار تصل إلى 5 دقائق قبل فتح الزجاجة لقياس درجة الحموضة. إدراج القطب مقياس الأس الهيدروجيني في المخزن المؤقت، والانتظار حتى تستقر القراءة على مقياس الأس الهيدروجيني.
- استمر في إضافة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم م 1 حتى الرقم الهيدروجيني للمصل انخفاض المتوسط يصل إلى 8.15 – 8.17. معايرة مقياس الأس الهيدروجيني عدة مرات أثناء العملية. إذا كان عند أي نقطة يصبح الرقم الهيدروجيني أعلى من 8.18، الحد منه عن طريق إضافة جديدة تخفض مصل المتوسطة من زجاجة دافئة قبل 100 مل (الخطوة 1.3.1).
ملاحظة: الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت تعداء المصل خفض على أساس المتوسط أمر بالغ الأهمية. إعادة برمجة ستكون ناجحة إذا كان الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت تعداء حوالي 8.2 ± 0.05 ولكن قد تفشل إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 8.25. ولذلك فإنه ينصح بإيقاف إضافة هيدروكسيد الصوديوم حالما تصل درجة الحموضة في المخزن المؤقت إلى 8.15 – 8.17. هذا يضمن أن درجة الحموضة نهائياً من المخزن المؤقت تعداء هو حوالي 8.2 – 8.22 بعد التعقيم. - فلتر تعقيم تعداء المخزن المؤقت باستخدام نظام ترشيح فراغ 0.22 ميكرومتر. قاسمة تعقيم المخزن المؤقت إلى 5 أو 15 مل أنابيب مع الحد الأدنى من الفضاء الجوي.
- تخزين مختبرين تعداء المخزن المؤقت لمدة تصل إلى 3 أشهر في 4 درجات مئوية. قياس درجة الحموضة لمختبرين دورياً. تجاهل في مختبرين إذا كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 8.25. الحد من استخدام الكوة إلى ترانسفيكشنز 2 فقط نظراً لتعرض المخزن المؤقت تعداء للهواء الجوي يزيد الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت.
- إعداد متوسطة التوسع تنتجها الخلايا الليفية (FEM): المتوسطة الأساسية الدنيا وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1 x 1 x القلم/بكتيريا/فونجيزوني، 55 ميكرون 2-mercaptoethanol الأحماض الأمينية غير الضرورية، 1 x الجلوتامين الملحق. تخزين فيم عند 4 درجة مئوية.
- تعد المتوسطة إعادة برمجة: DMEM/F12 (لا حبيس) تستكمل مع خروج المغلوب 20% مصل الاستبدال (قصر)، 0.5 x الأحماض الأمينية غير الضرورية، والملحق الجلوتامين x 0.5، 55 ميكرون 2-mercaptoethanol، 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك، س 1 القلم/بكتيريا/فونجيزوني، بفجف 100 نانوغرام/مليلتر ، و 200 نانوغرام/مل B18R. إعداد المتوسطة في البدء بإعادة برمجة دون بفجف و B18R، وتخزينها في 4 درجات مئوية. عدم استخدامه إلى ما بعد 1 الشهر التالي لإعداد. إضافة بفجف و B18R مباشرة قبل كل استخدام قاسمة الحجم للاستخدام في ذلك اليوم.
- إعداد متوسطة الطلاء بإضافة 5% معطل الحرارة (مرحبا) FBS في إعادة برمجة المتوسط الذي يحتوي على 20% كوسر دون بفجف و B18R من الخطوة 1، 5. إعداد الطازجة المتوسطة اليوم للاستخدام المقصود. إضافة بفجف و B18R مباشرة قبل استخدامها في اليوم 0 من إعادة برمجة.
- معايرة حاضنات زراعة الأنسجة قبل الشروع في إعادة برمجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام محلل2 CO رقمية المحمولة. استخدام حاضنة منخفضة-س2 لخطوات إعادة برمجة لضمان نجاح اللجنة التوجيهية الجيل.
2-استزراع الخلايا الليفية لإعادة برمجة
- إعداد الليفية قبل الشروع في إعادة برمجة (اليوم-2).
- معطف صفيحة 10 سم زراعة الأنسجة جديدة مع 5 مل جيلاتين 0.1%. اضغط أو دوامة اللوحة التأكد من أن كامل السطح هي مغلفة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. نضح الجيلاتين وإضافة 10 مل من مجموعة حركة جانبا. عدم السماح بسطح مصقول من اللوحة لتجف قبل إضافة إلى
- عناية نضح المتوسطة المستهلك من الخلايا الليفية. شطف الخلايا مرة واحدة مع 5 مل دببس لإزالة المصل المتبقي. أضف 3 مل يدتا التربسين. روك بلطف لوحة لضمان تغطية كاملة فوق الخلايا.
- نضح السوائل الزائدة، تاركاً ~ 500 ميليلتر من التربسين. لا نضح الإفراط، نظراً ﻷن هذا جاف وتقتل الخلايا الليفية في. احتضان الليفية مع التربسين-يدتا لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
- إزالة اللوحة من الحاضنة واضغط بحزم ولكن بلطف إلى جانب لوحة لإزاحة الخلايا. فحص الخلايا تحت المجهر. إذا كانت الخلايا المنفصلة والعائمة، المضي قدما. إذا كان لا يزال يتم إرفاق الخلايا، احتضانها لآخر 3 دقائق.
- بسرعة شطف/جمع الخلايا المنفصلة باستخدام 5 مل فيم لتحييد التربسين-يدتا. نقل تعليق تنتجها الخلايا الليفية في أنبوب مخروطي 15 مل. التأكد من وجود الخلايا المختلطة جيدا.
- مزيج تعليق خلية لكسر كتل كبيرة من الخلايا، ثم عد منهم في هيموسيتوميتير بلطف. نقل 2.5 × 105 خلايا في الطبق 10 سم المغلفة بالجيلاتين إعدادها في الخطوة 2.1.1. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة هوميديفيد زراعة الأنسجة العادية.
ملاحظة: كثافة الخلية أمر حاسم لتحقيق كفاءة إعادة برمجة عالية، كما من المهم أن الخلايا الليفية صحية وتقسيم سرعة. تصفيح 2.5 × 105 خلايا غلة كونفلوينسي 40-60 في المائة من يومين في وقت لاحق لمعظم عينات تنتجها الخلايا الليفية. ضبط مقدار تبعاً لذلك للخلايا المريضة أو مسن لتحقيق كونفلوينسي المطلوب 40-60% بعد 48 ساعة. - استبدال المتوسطة مع 10 مل فيم الطازجة في اليوم التالي (يوم-1).
- لوحة الليفية الشروع في إعادة برمجة (يوم 0).
- تحقق من أن الخلايا الليفية إعادة برمجتها في كونفلوينسي 40-60% (الشكل 2، 0 يوم). إذا كانت الخلايا أكثر-أو روافد الناقص، ممر الليفية كما هو موضح في الخطوة 2، 1 وضبط كثافة الطلاء تبعاً لذلك. الثقافة لآخر أيام 2.
- نقل 4 مل دببس في أنبوب مخروطي 15 مل. إضافة 100 ميليلتر للإنسان المؤتلف (rh) لامينين-521. "الماصة؛" صعودا ونزولاً مزيج دقيق.
- أضف 1 مل كل بئر المخفف رهلامينين-521 في آبار 3 من لوحة 6-جيدا. احتضان لوحة المغلفة في 37 درجة مئوية ح 2.
- الحارة 6 مل من فيم و 4 مل من تصفيح المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. الملحق المتوسطة الطلاء مع بفجف بتركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر و B18R بتركيز نهائي من 200 نانوغرام/مليلتر.
- عناية نضح المتوسطة المستهلك من الخلايا الليفية (الخطوة 2.2.1). شطف في الخلايا التي تحتوي على 5 مل دببس وأضف 3 مل يدتا التربسين. روك لوحة لتغطية الخلايا مع التربسين-يدتا بلطف.
- نضح السوائل الزائدة، تاركاً ~ 500 ميليلتر من التربسين، كما فعلت في الخطوة 2.1.3. احتضان الليفية مع التربسين-يدتا لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إزالة اللوحة من الحاضنة واضغط بحزم ولكن بلطف إلى جانب لوحة لإزاحة الخلايا. فحص الخلايا تحت المجهر. إذا كانت الخلايا المنفصلة والعائمة، المضي قدما. إذا كان لا يزال يتم إرفاق الخلايا، احتضانها لآخر 3 دقائق.
- شطف/جمع الخلايا المنفصلة باستخدام 5 مل فيم لتحييد التربسين-يدتا. نقل تعليق تنتجها الخلايا الليفية في أنبوب مخروطي 15 مل. تأكد من أن الخلايا المختلطة جيدا والاعتماد عليها في هيموسيتوميتير. خلايا ماصة 12,000 إلى 4 مل من الطلاء بريوارميد المتوسطة من الخطوة 2.2.4.
ملاحظة: غير الطرد المركزي الخلايا عند أي نقطة. ويمكن تعديل عدد الخلايا مطلي صعودا أو هبوطاً حسب الاقتضاء لخطوط بطيئة-أو سريعة النمو، على التوالي. - إزالة لوحة المغلفة من الحاضنة ونضح 521 رهلامينين المخفف من الآبار المغلفة. لا تسمح لسطح الآبار الجافة. بلطف ريسوسبيند الخلايا في الأجلين المتوسط والطلاء. "الماصة؛" 1 مل تعليق خلية في كل مغلف البئر (أي، 3,000 الخلايا كل بئر).
- وضع الخلايا مطلي في حاضنة استنبات الأنسجة ثلاثية-غاز مع س2 تعيين إلى 5% (المنخفضة-س2). حالما يتم تعيين اللوحة، بلطف ولكن دقة تفريق الخلايا بالتناوب بين حركة أعلى/لأسفل ثم يسار/يمين. تكرار الطلبات 2 مرات أكثر. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها. دوامة لا اللوحة المزيج.
- "الماصة؛" 4 مل من إعادة برمجة المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 مل ووضعه في حاضنة منخفضة-س2 مع قبعة خففت توازن بين عشية وضحاها. لا تقم بإضافة بفجف و B18R حتى اليوم التالي.
3-الشروع في ريبروجرامينج (1 يوم)
ملاحظة: بمجرد بدء إعادة برمجة، الصيانة اليومية مطلوب لمدة شهر واحد تقريبا. من المؤكد أن الخطة وفقا لذلك. يجب أن تتم جميع الخلايا اللاحقة إينكوباتيونس تحت ظروف منخفضة-س2 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، 5% O2 غاز ثلاثي هوميديفيد زراعة الأنسجة حاضنة.
- استبدال المتوسطة الطلاء على الأقل 1 ساعة قبل تعداء.
- إزالة المتوسطة إعادة برمجة متوازن من حاضنة منخفضة-س2 . إضافة بفجف إلى تركيز نهائي 100 نانوغرام/مليلتر و B18R بتركيز نهائي من 200 نانوغرام/مليلتر. مزيج جيد.
- تمضي 1 جيدا في كل مرة، استخدم ماصة 1 مل لإزالة المتوسطة المستهلك واستبدله مع 1 مل من إعادة برمجة المتوسطة وتستكمل مع بفجف و B18R. كرر هذه العملية لكل بئر. يجب عدم استخدام الشفط بالتخلية، الذي يجفف الخلايا مفرطة، وأسباب التوتر ويقلل من كفاءة إعادة برمجة. نقل اللوحة مع الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة منخفضة-س2 .
- ترانسفيكت الليفية مع 5 ميليلتر من رنيم تعداء الكاشف الواحدة 1 ميكروغرام لتعديل مرناً، ويحاكي 1 ميليلتر من الكاشف تعداء الواحد pmol 6 من ميرنا كل تعداء.
ملاحظة: يتم الحصول على النتائج المثلى عند الشروع في ترانسفيكشنز ح 16-20. الكاشف تعداء هو 10 إضعاف العاشر؛ 100 نانوغرام/ميليلتر تعديل مرناً كوكتيل تضعف × 5؛ ويقلد ميرنا pmol/ميليلتر 5 المزيج المخفف x 8.33 مع المخزن المؤقت تعداء قبل كومبليكسيشن. انظر الجدول 1 للاطلاع على موجز من إعداد تعداء.- أثناء إعداد تعداء يمزج، تقليل التعرض المحتمل للمواد الكاشفة رناسي باتباع الممارسة المختبرية القياسية.
- حجته قاسمة تعداء المخزن المؤقت (الخطوة 1، 3) لحوالي 1 ح في الرايت لا تستخدم بحمام الماء 37 درجة مئوية أو حاضنة للاحماء تعداء المخزن المؤقت.
- إزالة من قاسمة واحدة من مرناس المعدلة (33 ميليلتر) وميرنا يقلد (14 ميليلتر) من-80 درجة مئوية والحارة لهم على RT لحوالي 3-5 دقائق، حتى مذاب. عدم ذوبان الجليد مختبرين في 37 درجة مئوية. تدور لهم إلى أسفل بإيجاز في [ميكروفوج].
- حارة الكاشف تعداء على RT لحوالي 3-5 دقائق. لا تستخدم بحمام الماء 37 درجة مئوية أو حاضنة. عكس أنبوب مغلق 2 – 3 مرات لخلط الكاشف. تدور إلى أسفل بإيجاز في [ميكروفوج].
- نقل ميليلتر 279 من المخزن المؤقت تعداء RT في أنبوب ميكروسينتريفوجي رناسي مجاناً. إضافة ميليلتر 31 من الكاشف تعداء لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 310 ميليلتر. مزيج دقيق من قبل بيبيتينج. عدم دوامة. احتضان الأنبوب في RT لمدة 1 دقيقة.
ملاحظة: هذا المجلد من الكاشف تعداء المخفف كاف لمجمع مرناً معدلة وميرنا يحاكي مختبرين من الخطوة 3.2.3. - إضافة ميليلتر 132 من المخزن المؤقت تعداء RT قاسمة ميليلتر 33 من تعديل مرناً. "الماصة؛" بلطف مزيج: الحجم النهائي هو 165 ميليلتر.
- إضافة ميليلتر 102.6 المخزن المؤقت تعداء RT قاسمة ميليلتر 14 من يقلد ميرنا. "الماصة؛" بلطف مزيج: الحجم النهائي هو 116.6 ميليلتر.
- إضافة 165 ميليلتر من الكاشف تعداء المخفف من الخطوة 3.2.5 إلى تضعف تعديل مرناً من الخطوة 3.2.6. ماصة لخلط: الحجم النهائي هو 330 ميليلتر.
- إضافة 116.6 ميليلتر من الكاشف تعداء المخفف من الخطوة 3.2.5 إلى مزيج يقلد ميرنا المخفف من الخطوة 3.2.7. مزيج جيد (الحجم النهائي هو 233.2 ميليلتر). احتضان لمدة 15 دقيقة على RT للسماح للمخزن المؤقت تعداء المعقدة مع مرناس المعدلة ويحاكي ميرنا.
- إزالة اللوحة مع الخلايا من حاضنة منخفضة-س2 . إضافة 100 ميليلتر (1 ميكروغرام) من الرصاصية تعديل مزيج تعداء مرناً لكل بئر، dropwise عبر البئر. تفريق مجمعات تعداء بلطف لكن دقة التحريض اللوحة مع حركة أعلى/لأسفل ثم يسار/يمين. دوامة لا اللوحة المزيج.
- إضافة 66.7 ميليلتر (20 بمول) من مزيج تعداء يقلد ميرنا الرصاصية لكل بئر، dropwise عبر البئر. تفريق مجمعات تعداء بلطف لكن دقة التحريض اللوحة مع حركة أعلى/لأسفل ثم يسار/يمين. دوامة لا اللوحة المزيج.
- ضع transfected الخلايا في الحاضنة ثلاثي-الغاز مع س2 تعيين إلى 5% (المنخفضة-س2). بمجرد تعيين اللوحة، تفريق مجمعات تعداء مرة أخرى لطف لكن دقة التحريض اللوحة مع حركة أعلى/لأسفل ثم يسار/يمين.
- "الماصة؛" 4 مل من إعادة برمجة المتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل ووضعه في حاضنة منخفضة-س2 مع كاب خففت توازن بين عشية وضحاها. لا تقم بإضافة بفجف و B18R حتى اليوم التالي.
| أنبوب 1-تمييع رنيم (ميكس 1) | ||
| كاشف | تركيز | وحدة التخزين |
| تعداء المخزن المؤقت | 279 ميليلتر | |
| رنيم (إضافة 2) | 10 x | 31 ميليلتر |
| المجموع: 310 ميليلتر | ||
| (احتضان 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) | ||
| أنبوب 2-تعديل مرناً مزيج (ميكس الثانية) | ||
| كاشف | تركيز | وحدة التخزين |
| تم التعديل مرناً ميكس | 100 نانوغرام/ميليلتر (5 س) | ميليلتر 33 |
| تعداء المخزن المؤقت | ميليلتر 132 | |
| المجموع: 165 ميليلتر | ||
| (إضافة إلى حجم متساوية من رنيم المخفف من أنبوب 1) | ||
| 3-ميرنا أنبوب يقلد مزيج (3rd ميكس) | ||
| كاشف | تركيز | وحدة التخزين |
| ميرنا يحاكي ميكس | 5 pmol/ميليلتر (8.33 x) | 14 ميليلتر |
| تعداء المخزن المؤقت | 102.6 ميليلتر | |
| المجموع: 116.6 ميليلتر | ||
| (إضافة إلى حجم متساوية من رنيم المخفف من أنبوب 1) | ||
الجدول 1: إعداد مزيج تعداء.
4-الاستعاضة عن ريبروجرامينج المتوسطة بين ترانسفيكشنز (أيام 2 و 4، 6، 8، 10، و 12)
- استبدال تعداء بعد متوسطة 16 – 20 ح كما هو موضح في 3.1.1–3.1.2. إضافة بفجف إلى تركيز نهائي 100 نانوغرام/مليلتر و B18R إلى تركيز نهائي 200 نانوغرام/مل في إعادة برمجة مختبرين المتوسطة.
- رصد مواسابي التعبير يوميا للتأكد من جودة تعداء باستخدام مجهر تكوين تصور اجفب.
ملاحظة: ينبغي أن يكون الحد الأدنى الظاهر في يوم 2 التعبير مواسابي وزيادة السطوع مع كل تعداء إضافية.
5-كل أخرى--يوم "ترانسفيكتيونس" (أيام 3، 5، 7، 9 و 11 و 13)
- أداء تعداء كما هو موضح في الخطوة 3، 2. لا تقم بتغيير في المتوسط في أيام تعداء.
- إعداد قاسمة 4 مل من إعادة برمجة المتوسطة ووضعه في حاضنة منخفضة-س2 حجته للتغيير متوسطة في اليوم التالي. لا تقم بإضافة بفجف و B18R حتى اليوم التالي.
6-الإجراءات التي يتعين القيام بها بعد "تعداء النهائي"
- إجراء التغيرات اليومية المتوسطة من 14 يوم من خلال تقريبا يوم 17. الحارة 7 مل من إعادة برمجة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. إضافة بفجف إلى تركيز نهائي من 100 نانوغرام/مليلتر.
ملاحظة: B18R لم يعد ضروريا بعد تعداء النهائية. إلى ما بعد يوم 14، أنها لم تعد اللازمة لحجته المتوسطة بين عشية وضحاها في الحاضنة منخفضة-س2 . - إزالة المتوسطة من جميع الآبار استخدام ماصة مصلية. الاستمرار في تجنب استخدام الشفط. إضافة 2 مل من إعادة برمجة المتوسطة وتستكمل مع بفجف كل بئر.
- وفي أيام 17 و 18، تحليل الآبار أعيدت برمجتها تحت مجهر المقلوب أو تشريح. إذا كانت مستعمرات تتشكل على مقربة من بعضها البعض بسبب الكفاءة العالية لإعادة برمجة ولا يمكن أن ينعزل يدوياً، فصل المستعمرات قبل تنفيذ باساجينج الاختياري للآبار أعيدت برمجتها الموضحة في الخطوة 7 أدناه. إذا كانت المستعمرات المتفرقة والمشتتة جيدا، يدوياً اختيار المستنسخين من أعيدت برمجتها مباشرة حسنا كما هو موضح في الخطوة 8 وإيبسكس ثقافة فرعية وفقا للبروتوكولات القياسية.
7. الإجراء اختياري: باساجينج خلايا من "آبار برمجتها" باستخدام يدتا
- إعداد 0.5 مم يدتا في دببس (يدتا) بتمييع الحل الأسهم يدتا 0.5 متر. فلتر تعقيم يدتا باستخدام نظام ترشيح فراغ 0.22 ميكرومتر.
- تعد خالية من تغذية pluripotent الخلايا الجذعية (PSC) متوسطة (مثلاً، mTeSR1) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. مل 32 الحارة قبل المتوسطة PSC إلى 37 درجة مئوية.
- معطف جميع الآبار اثنين لوحات الشكل 6-جيدا مع مؤهل هيس المصفوفة خارج الخلية (ECM) اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ختم لوحات مع الفيلم البارافين واحتضانها لهم ح 1 في الرايت
- نضح الحل ECM من لوحات المعالجون مسبقاً واستبداله مع 2 مل من PSC المتوسطة الواحدة وكذلك. لا تسمح لسطح الآبار الجافة. جانبا منها.
- نضح المتوسطة إعادة برمجة من الآبار أعيدت برمجتها 2 في يوم عندما تكون المستعمرات كبيرة ووضوح المشكلة (عادة يوم 18). يشطف مرة واحدة مع 1 مل يدتا وأسبيراتي.
- أضف 1 مل يدتا كل بئر. احتضان لمدة 4 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- بلطف إزالة اللوحة من الحاضنة ووضعه في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
ملاحظة: عند هذه النقطة، قد تكون الخلايا التقيد بها فضفاضة جداً والمزاحة بسهولة. - عناية نضح يدتا من الآبار على حد سواء. أضف 3 مل من حرارة قبل PSC المتوسطة لكل معاملة حسنة مع يدتا. استخدام خلية-مكشطة بلطف ولكن دقة إزاحة الخلايا من الآبار على حد سواء.
- استخدام ماصة مصلية لطف "الماصة؛" تعليق خلية وتفتيت كتل كبيرة. لا "الماصة؛" حتى جميع كتل الخلايا ولت. الحفاظ على مجموعات اللجنة التوجيهية.
ملاحظة: لن يؤثر تصفيح كتل كبيرة على اللجنة التوجيهية ثمرة مستعمرة. إذا كانت هناك كتل خلية كبيرة مفرطة، ببساطة تجنب تحويلها إلى الطبق التالي. - استخدام ماصة مصلية، بالتساوي توزيع الخلايا من كل بئر تعامل يدتا بيبيتينج 0.5 مل في كل بئر من لوحة 6-جيدا المغلفة بإدارة المحتوى في المؤسسة.
ملاحظة: لا تجمع الخلايا من الآبار أعيدت برمجتها (أي إعادة برمجتها جيدا 1 يجب أن تكون موزعة بالتساوي في لوحة 6-البئر الأولى، وأعيدت برمجتها 2 جيدا يجب أن تكون موزعة بالتساوي في اللوحة الثانية 6-جيدا). - نقل الخلايا مطلي العودة إلى الحاضنة منخفضة-س2 . لتوزيع الخلايا بالتساوي، يهز كل لوحة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب. لا دوامة. استبدال المتوسطة PSC يوميا.
8-انتقاء اللجنة التوجيهية المستعمرات
- قبل الحارة 15 مل المتوسطة PSC إلى 37 درجة مئوية. معطف جميع الآبار من لوحة 6-بئر واحدة مع إدارة المحتوى في المؤسسة مؤهل هيس اتباع إرشادات الشركة المصنعة. ختم اللوحات مع الفيلم البارافين واحتضانها لهم ح 1 في الرايت
- نضح المتوسطة الثقافة من الآبار المستخدمة لجمع إيبسكس. يشطف مرة واحدة مع 1 مل يدتا وأسبيراتي. أضف 1 مل يدتا كل بئر. احتضان لمدة 4 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بينما هي تفرخ الخلايا، نضح الحل ECM من لوحات المعالجون مسبقاً واستبدال مع 2 مل من PSC المتوسطة كل بئر. اللوحات جانبا.
- إزالة اللوحة مع إيبسكس أن يتم التقاطها من الحاضنة ووضعه في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء بلطف.
ملاحظة: عند هذه النقطة، قد تكون الخلايا التقيد بها فضفاضة جداً والمزاحة بسهولة. - نضح يدتا بعناية. بلطف جداً أضف 3 مل من حرارة قبل PSC المتوسطة، مع الحرص على عدم إزاحة المستعمرات اللجنة التوجيهية.
- نقل اللوحة ليكون نطاق المقلوب أو تشريح لأفضل تصور المستعمرات. إعداد ماصة 1 مل مع تلميح عقيمة. خفض المكبس تماما، ثم استخدام تلميح ماصة للطف كشط مستعمرة أثناء الرسم السائل ببطء في التلميح جمع هذه المستعمرة. رسم كالمتوسطة قليلة قدر الإمكان أثناء التقاط هذه المستعمرة اللجنة التوجيهية.
- لنقل هذه المستعمرة، "الماصة؛" صعودا وهبوطاً 3 – 4 مرات في بئر واحدة لصفيحة المغلفة بإدارة المحتوى في المؤسسة من الخطوة 8، 2. كرر حتى تم انتقاؤها المستعمرات 6 وتحويلها إلى الآبار الفردية. اختيار المستعمرات لا يزيد عن 2 من أي بئر واحدة إذا تم أداؤه باساجينج الاختياري هو موضح في الخطوة 7.
- استخدام بروتوكول قياسي خلايا الجذعية بشرية لتجميد أسفل جميع الآبار المتبقية. ذوبان الجليد وإعادة لوحة الأرصدة المجمدة إذا يجب انتقاء أكثر المستعمرات في وقت لاحق.
9-وصف إيبسكس
- أداء هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 تلطيخ لتحليل إعادة برمجة الكفاءة (اليوم 18).
ملاحظة: يتم باساجيد الآبار 2 من أصل 3 برمجة للانتقاء مستعمرة مستقبلا. المتبقية يمكن استخدامها لتلطيخ هيئة تنظيم الاتصالات-1-60. يمكن تنفيذ هذا الإجراء على أعلى مقاعد البدلاء المختبر.- أغسل أعيدت برمجتها جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع الميثانول المثلج في-20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- نضح الميثانول. الجافة جيدا لحوالي 2 دقيقة ينبغي الحرص على عدم الإفراط الجاف. وقد تجفف الخلايا ما يكفي عندما أصبح لون شفاف/ماتي.
- أغسل مرات 3 جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف. خلال يغسل، إعداد 3 مل بيروكسيد الهيدروجين 3% في برنامج تلفزيوني.
- نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 2 مل من محلول بيروكسايد المخفف. احتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت مع الهز لطيف. إعداد 4 مل من عرقلة الحل: 10% مصل بقرى الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني.
- نضح الحل بيروكسايد. تغسل مرتين جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من عرقلة الحل في البئر. احتضانها ح 1 في الرايت
- أغسل مرات 3 جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
- تضعف جسم المضادة-هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 الأولية في 1: 100 في حل حظر تستكمل مع أزيد الصوديوم 0.05%. إعداد 1 مل إضعاف جسم 1 كذلك طبق الشكل 6-جيدا. إضافة إضعاف جسم إلى البئر والتفاف اللوحة مع بارافيلم لتجنب التبخر. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الهز لطيف.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن يتم في الحضانة مع جسم الأولية ح 1 في الرايت مع الهز لطيف. تمييع جسم الأولية يمكن إعادة استخدام تصل إلى 5 مرات. - بعد الحضانة مع جسم الأولية، يغسل مرات 3 جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
- تضعف جسم مترافق HRP المضادة الماوس الثانوي الساعة 1: 200 في عرقلة الحل. احتضان جيدا مع إضعاف جسم الثانوية ح 2 في الرايت مع الهز لطيف.
- نضح إضعاف جسم الثانوية ويغسل مرات 3 جيدا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع الهز لطيف.
- أثناء الغسيل الثالث، إعداد الحل الركازة اتباع إرشادات الشركة المصنعة. بعد الغسيل النهائي، نضح PBS. أضف 1 مل الحل الركيزة واحتضان حتى يتطور اللون المطلوب (حوالي 10 دقائق).
- نضح الحل الركازة. أشطف جيدا بالماء لمدة 5 دقائق بينما تهز برفق.
- عد المستعمرات، إذا رغبت في ذلك. إعادة برمجة الكفاءة = (عدد المستعمرات)/(عدد الخلايا الليفية مطلي) × 100%.
- للتخزين على المدى الطويل، نضح الماء من لوحة ملطخة وأيردري بين عشية وضحاها في ختم الرايت لوحة المجففة مع بارافيلم وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين لتقييم كفاءة إعادة برمجة في وقت لاحق.
Representative Results
عادة ما يستغرق حوالي 5-6 أسابيع من البدء بإعادة برمجة تنتجها الخلايا الليفية لتجميد قارورة أول من إيبسكس (الشكل 1). ويمكن عموما تصنيف بروتوكول إعادة برمجة إلى مرحلتين. المرحلة الأولى تشمل ثقافة تنتجها الخلايا الليفية ويشمل سبعة ترانسفيكشنز، مع إعادة برمجة الجيش الملكي النيبالي كوكتيل يؤديها كل حاء 48 2 مرحلة العزلة والتوسع، وتوصيف للمستعمرات اللجنة التوجيهية.
قبل البدء البروتوكول، ينبغي التأكد من أن الخلايا الليفية إعادة برمجة ذات نوعية جيدة. الليفية صحية ينبغي أن تظهر على شكل عمود الدوران، وبين القطبين، وريفراكتيلي مع وقت مضاعفة ما يقرب من 24 ساعة. اليوم 0، خلايا 250,000 مطلي في طبق 10 سم في اليوم-2 ينبغي أن تنمو إلى 40-60% كونفلوينسي (الشكل 1، يوم 0) وتسفر عن حوالي 6 – 10 × 105 خلايا. يمكن تعويضه بالطلاء في كثافة أعلى في اليوم-2 وفي اليوم 0 لإعادة برمجة خلايا تنتشر بمعدل أبطأ.
يجب أن تظهر الخلايا الليفية الطلاء التالي ضئيلة جداً في بئر طبق الشكل 6-جيدا لإعادة برمجة (الشكل 2، 1 يوم). أربع وعشرين ساعة عقب تعداء الأولى، سوف تفقد شكلها المغزل الليفية واعتماد مورفولوجيا أكثر تقريب (الشكل 2، 2 في اليوم)، التي يتم الاحتفاظ بها من خلال ما تبقى من إعادة برمجة. الفلورية الخضراء من مواسابي مرناً ينبغي أن يكون الحد الأدنى يمكن ملاحظتها في يوم 2 وزيادة مطردة في سطوع لتكون واضحة للعيان يوم 4. يمكن أن تعتمد القدرة على اكتشاف الأسفار مواسابي على نطاق حساسية والإعداد. كثافة الخلية تدريجيا وباستمرار ستزيد في جميع أنحاء ترانسفيكتيونس الثلاثة الأولى (1-6 أيام)، مع انفجار الظاهرة في الانتشار التي تحدث بين يومي 7 و 8. يجب أن تظهر الخلايا إلى حد كبير المتلاقية يوم 10 (الشكل 2، يوم 10). يمكن أن تظهر المستعمرات اللجنة التوجيهية الأولى لها في أقرب وقت يوم 11 (الشكل 2، يوم 11)؛ ومع ذلك، قد لا تكون مستعمرات يمكن ملاحظته حتى وقت متأخر يوم 18. عموما، قبل أيام 15 – 18، يكون هناك مستعمرات كبيرة وواضحة من اللجنة التوجيهية التي اختلافاً واضحا عن المحيطة، أعيدت برمجتها غير كامل الليفية (الشكل 2، يوم 15 و الرقم 3، يوم 17). يمكن إجراء إيمونوستاينينج لعلامة بلوريبوتينسي هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 لتقييم كفاءة إعادة برمجة (الشكل 3، 17، هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 يوما). في تجربتنا، تعطي معظم تنتجها الخلايا الليفية خطوط مئات المستعمرات الواحدة وبرمجتها جيدا (الشكل 3، اقحم ب).
كثافة الطلاء دون المستوى الأمثل هو السبب الأكثر شيوعاً لانخفاض كفاءة إعادة برمجة لدينا بروتوكول، وكثيراً ما يرتبط مع الليفية المريضة ومسن، و/أو مرور عالية. إذا كان الطلاء كثافة منخفضة جداً، سوف يكون هناك بقع جرداء اللاخلوي كبيرة في نهاية إعادة برمجة (الشكل 4)، وقد لا تشكل مستعمرات اللجنة التوجيهية (الشكل 4). يجب أن تكون الخلايا أعيدت برمجتها المتلاقية جداً قبل يوم 14 (قارن الشكل 4A و 4B إلى الشكل 2، 14 يوم). وبالمثل، إذا هي مطلي أيضا كثافة الخلايا أو تتكاثر بسرعة كبيرة جداً، إعادة برمجة كفاءة هائلة ينخفض.
للحفاظ على تجانس إيبسكس المستمدة من المريض، من المهم توسيع خطوط الخلايا من مستعمرة واحدة. نظراً لإعادة برمجة كفاءة عالية جداً في أعمالنا البروتوكول، المجاورة للمستعمرات اللجنة التوجيهية قد تشكل على مقربة وتنمو لتصبح كل آخر (الشكل 3أيام 15-17). هذا في بعض الأحيان يجعل من الصعب فصل ميكانيكيا مستعمرة واحدة للتوسع في الاستنساخ. وقد وجدنا أنه من المفيد لمرور الأول أعيدت برمجتها جيدا وتمييع عبر منطقة أوسع لثقافة. نسبة مرور جيدة يتكون من تقسيم لوحة 6-جيدا-تنسيق أعيدت برمجتها بالتساوي جيدا عبر صفيحة جيدا 6 أسرة.
وعقب مرور تمييع، تنمو كمستعمرات إيبسكس ويمكن تمييزها بسهولة عن الخلايا الليفية (الشكل 5، يوم 18). في البداية، قد تكون معبأة فضفاضة في المستعمرات اللجنة التوجيهية، وخلايا فردية منطقة هيولى كبيرة نسبيا. على مدى أيام 4 – 7، إيبسكس تتكاثر وتشكل مستعمرة معبأة بأحكام مميزة مع حواف محددة. الخلايا الفردية داخل المستعمرة قد كسر نووية كبيرة مع نوكليولي بارزة (الشكل 5، يوم 22). وينبغي أن يكون هناك العديد من المستعمرات التي تشكل في كل بئر، وفقط تلك مع اللجنة التوجيهية الكلاسيكية مورفولوجيا يجب انتقاء للتوسع.
الشكل 1 : إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية إلى فعل الخلايا الجذعية pluripotent (إيبسكس)- ويقدم بروتوكول تخطيطي لإعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية. الأولى هي باساجيد الليفية في كثافة منخفضة في بئر طبق الشكل 6--حسنا، تليها سبع ترانسفيكشنز يقوم على فترات ح 48. المتوسط استبدال 16 – 20 ح بعد كل تعداء. الأولى هي باساجيد إيبسكس أعيدت برمجتها في يوم من المستعمرات 18، والاستنساخ يتم انتقاؤها من قبل يوم 26. عادة، يمكن تجميد الخطوط التوجيهية المستمدة من تنتجها الخلايا الليفية للتخزين طويل الأجل بيوم 38. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الممثل صوراً يومية خلال كل يوم من إعادة برمجة- الليفية ينبغي أن تكون روافد 40-60 في المائة تقريبا في وقت مرور الشروع في إعادة برمجة (اليوم 0، يتم مطلي الخلايا في صحن 10 سم). تعداء الأول (T1) يحدث في اليوم 1، وينبغي أن تظهر الخلايا ضئيلة جداً في هذه المرحلة. في اليوم التالي (اليوم الثاني)، مورفولوجيا أكثر تقريب ينبغي أن تصبح واضحة. سوف تستمر الخلايا زيادة في كثافة في جميع أنحاء البروتوكول مع مجموعات اللجنة التوجيهية التي بدأت تظهر في أقرب وقت يوم 11 (دائري باللون الأحمر). يوم 15، سوف تكون المستعمرات اللجنة التوجيهية كبير مع حدود غير ظاهر. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تعديل تشكيل مستعمرة بعد ترانسفيكشنز مع إعادة برمجة مرناس ويحاكي ميرنا. تم أخذ صور منخفضة-التكبير ممثل إعادة برمجة في أيام 15-17. بعد تعداء النهائي، ستشكل إيبسكس أعيدت برمجتها المستعمرات واضحة مع حدود المعرفة التي توسع في الحجم وتتكثف لتصبح اختلافاً واضحا عن الخلايا الليفية المحيطة غير كامل أعيدت برمجتها. يدل على وجود إيبسكس (اقحم A) إيمونوستاينينج لعلامة بلوريبوتينسي هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 ويمكن استخدامها لحساب إعادة برمجة الكفاءة عن طريق العد جميع المستعمرات داخل بئر واحدة (اقحم ب، أمثلة لعد المستعمرات دائري باللون الأخضر). مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : صور الممثل لكثافة الطلاء دون المستوى الأمثل لإعادة برمجة- (أ وب) أمثلة على الخلايا الليفية التي قليلة جداً قبل 14 يوم من إعادة برمجة (مقارنة الرقم 2يوم 14). صورة تضخم منخفضة (ج) في يوم 17 من إعادة برمجة مع تصحيح الكبيرة، جرداء دائري باللون الأحمر. (د) البئر نفسها كانت ثابتة والملون لهيئة تنظيم الاتصالات-1-60 لتأكيد الفقراء عموما إعادة برمجة الكفاءة بسبب كثافة الخلية منخفضة. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر (أ، ب)، و 1 مم (ج، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : صور الممثل من إيبسكس بعد مرور الأولية. بعد الانتهاء من ترانسفيكشنز بإعادة برمجة مرناس المعدلة ويقلد ميرنا، والخلايا التي أعيدت برمجتها هي باساجيد قبل أيام 17 – 20. إيبسكس تتمتع بميزة نمو في المتوسط PSC وسرعة تجاوز أي الليفية التي تم برمجتها غير كامل. في البداية، سوف تشكل إيبسكس المستعمرات التي قد تبدو فضفاضة مع حدود محددة بشكل سيئ. في غضون عدة أيام، الخلايا تتكاثر سريعاً ويأخذ على مورفولوجية مميزة من الخلايا محكم معبأة مع ارتفاع نسبة النواة إلى السيتوبلازم، تجميع أحكام في المستعمرات مع حدود مميزة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هذا البروتوكول وصف أسلوب ذات الصلة سريرياً، وعدم إدماج، المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي الذي يسمح بإعادة برمجة خطوط تنتجها الخلايا الليفية البشرية العادية والمرتبطة بالمرض في إيبسكس في كفاءة فائقة. وحتى الآن، أثمر كل سطر البشرية تنتجها الخلايا الليفية حاولنا إعادة برمجة مع بروتوكول وصف عددا مرضيا من إيبسكس عالية الجودة لتطبيقات المتلقين للمعلومات. يمكن فورا نقل إيبسكس الناجمة عن ذلك وتوسعت في ظروف خالية من تغذية الثقافة.
نوعية الخلايا الليفية لإعادة البرمجة:
إعادة برمجة النجاح يعتمد اعتماداً كبيرا على نوعية ابتداء من الخلايا الليفية. ومن الناحية المثالية، ينبغي بدء إعادة برمجة مع أدنى الليفية مرور المتاحة لتحقيق كفاءة أعلى. من الأفضل إعادة برمجة الكفاءة مع الخلايا الليفية لمرور 2 – 4. إعادة برمجة يمكن أن لا تزال تعمل مع عالية-المرور (مرور 5 – 8)، الليفية حتى مسن، أن كان ذلك مع انخفاض الكفاءة. في بعض الأحيان الليفية مرور منخفضة غير متوفرة أو عينات المرضى طفرة جينية تمنع نمو صحي. وفي هذه الحالة، قد يلزم الاستفادة المثلى كثافة الطلاء الأولى. إعادة برمجة خطوط الخطر تنتجها الخلايا الليفية يرتبط عادة بموت الخلية زيادة خلال ترانسفيكشنز الحمض النووي الريبي. كنتيجة لذلك، سوف تظهر الخلايا في إعادة برمجة جيدا يكون متفرق بأيام 10-14 إعادة برمجة. المناطق اللاخلوي الكبيرة ستكون أيضا مرئية في البئر. إذا كان هذا هو الحال، سوف تحتاج بروتوكول إعادة برمجة لتكون إعادة بدأت مع ارتفاع عدد انطلاق أولية الليفية. تصفيح خلايا الإدخال 3,000 كل من طبق الشكل 6-جيدا جيدا يعمل باستمرار لمعظم البالغين تنتجها الخلايا الليفية خطوط. ومع ذلك، زيادة عدد الطلاء إلى 5,000 – 10000 (50,000 لخطوط مسن) قد تساعد على تحسين إعادة برمجة للعينات المرتبطة بالمرض، كما أفيد في أعمالنا المنشور السابق8. على العكس من ذلك، كما يمكن مقاومة لإعادة برمجة الخلايا التوصل إلى كونفلوينسي في وقت مبكر جداً. إذا كانت الخلايا التي تمر ترانسفيكشنز مع إعادة برمجة الكشف تنتشر سريعاً جداً (كما الحال بالنسبة للابتدائي الليفية الولدان أحياناً)، والشروع في إعادة برمجة مع الليفية 500 كل بئر طبق الشكل 6-بئر8.
التعامل مع تعداء المخزن المؤقت:
الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت تعداء (المصل خفض متوسط تعديلها لدرجة حموضة 8.2) أمر بالغ الأهمية لتحقيق الكفاءة المثلى تعداء المطلوبة لهذا إعادة برمجة البروتوكول. لهذا السبب، ينصح احتياطات عديدة فيما يتعلق بالتعامل مع المخزن المؤقت تعداء. وقد وجدنا أن التعرض القصير حتى المخزن المؤقت تعداء إلى الهواء الجوي يؤثر على درجة الحموضة من المخزن المؤقت. ولذلك، ينبغي أن يكون المخزن المؤقت تعداء اليكووتيد في وعاء ملولبة مع الحد الأدنى من الفضاء الجوي (ونحن نستخدم 5 أو 15 مل مخروطية أنابيب ملولبة). كذلك تقليل التعرض للهواء، استخدام كل تعداء المخزن المؤقت الكوة لمدة أقصاها سنتين ترانسفيكشنز. وأخيراً، منذ الحموضة آثار درجة الحرارة، من الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت تعداء هو اكويليبراتيد إلى RT لجمعية المجمعات تعداء. وينصح الحارة لا تعداء المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية.
باساجينج من إيبسكس:
بينما كثير نشر قبل التوصية بروتوكولات الانتقاء المستعمرات اللجنة التوجيهية الفردية في نهاية إعادة برمجة، هذا قد يكون من الصعب تحقيق عند كفاءة إعادة برمجة مرتفع جداً أو إذا كانت المستعمرات العنقودية معا، كما الحال في كثير من الأحيان لدينا البروتوكول. ولذلك، إذا كانت مستعمرات اللجنة التوجيهية على مقربة من بعضها البعض، نوصي أولاً باساجينج الخلايا انتشرت إيبسكس أعيدت برمجتها قبل الانتقاء يدوياً المستعمرات. وهناك العديد من المزايا لإجراء هذه الخطوة المرور المبكر. يتباعد المستعمرات يمنحهم مجالاً أكبر النمو، تدر أكبر بكثير من المستعمرات للانتقاء مما يمكن تحقيقه إلا في البئر الأصلي. وهذا يحسن إلى حد كبير معدل النجاح في إنشاء خط اللجنة التوجيهية من استنساخ المنتقاة. ونجد أيضا أن يظهر الوقت ثقافة إضافية مع الخلايا الليفية، أن كان ذلك بنسبة مخففة، لتحسين جودة متوسط المستعمرات المنتقاة في اللجنة التوجيهية. قد توفر الليفية غير كامل أعيدت برمجتها عوامل paracrine الدعم، التي تواصل المساعدة في إنشاء إيبسكس وتسهيل الانتقال مباشرة إلى الخلية خالية من تغذية ثقافة الظروف. وقد الليفية مصادفة عيب نمو انتقائي مقارنة إيبسكس عند مثقف في mTeSR1. ولذلك، هو بسرعة تضعف السكان خلية تنتجها الخلايا الليفية تلويث لكميات ضئيلة داخل الممرات 3 – 4.
مثبطات روك مثل Y-27632 تستخدم بشكل متكرر للثقافة الروتينية من إيبسكس البشرية. وقد وجدنا أن الثقافة متكررة و/أو الموسعة لبعض الخطوط التوجيهية مع Y-27632 يمكن أن يكون آثار ضارة على الجودة الشاملة. عند استخدام أجمة باساجينج الأسلوب، كما هو الحال مع يدتا، Y-27632 ليس من الضروري للحفاظ على صلاحية اللجنة التوجيهية بعد تقسيم. وقد تخلصنا تماما الوسائط المكملة مع Y-27632 لجميع عزل اللجنة التوجيهية أو التوسع أو الثقافة الروتينية.
قيود البروتوكول:
وهو القيد واحد لوصف الجيش الملكي النيبالي النهج القائم في إعادة برمجة التكلفة الأولية والتعقيد المرتبطة بإعداد الكواشف إعادة برمجة. على الرغم من أن الإجراءات التحضيرية لتوليد مرناً الكواشف الروتينية كافة وقد سبق وصف (PCR، النسخ في المختبر ، العلاج الدناز، وضع سقف، ديفوسفوريليشن، وتنقية)، تراكمياً إنتاج الكواشف مرناً عملية طويلة نسبيا وغير تافهة. التحدي الرئيسية الأخرى لهذا البروتوكول هو الحاجة إلى ترانسفيكت كل 48 ساعة، زيادة كثافة العمالة من بروتوكول إعادة برمجة الخلايا. هذه الاعتبارات قد تكون باهظة إذا هي رغبت في إعادة برمجة فقط بضع عينات المرضى. ومع ذلك، إذا كان الاعتبار الأساسي هو الجيل من إيبسكس ذات الصلة سريرياً أو تحقيق كفاءة إعادة برمجة عالية جداً، وصف الجيش الملكي النيبالي النهج القائم في إعادة برمجة مثالي.
وباختصار، الموصوفة عالية الكفاءة على أساس الحمض النووي الريبي إعادة برمجة الأسلوب يتوقف على كفاءة تعداء الأمثل لنوع الخلية الجسمية إعادة برمجتها كما هو موضح في أعمالنا المنشور السابق8. البروتوكول تعداء الحمض النووي الريبي المعروضة في هذه الدراسة جداً ضبطها للخلايا الليفية الأولية البشرية لكن محتملة يمكن أن تكون مصممة لأنواع الخلايا الأخرى لتحسين كفاءة إعادة برمجة خلايا جسدية مختلفة.
Disclosures
أ وجيجابايت هي المخترعين المشاركين في طلب البراءة بعنوان "الأساليب والتراكيب لإعادة برمجة الخلايا"، رقم تطبيق المعاهدة PCT/US2016/063258.
Acknowledgments
ونحن ممتنون للدعم التمويلي من المعاهد الوطنية للصحة (T32AR007411-33) وفي جامعة كولورادو الجلد الأمراض الأساسية مركز أبحاث (P30AR057212). ونشكر أيضا "الشراكة البحثية انحلال البشرة الفقاعي" (EB)، EB مؤسسة البحوث الطبية، و "علاج EB الخيرية"، تندب انحلال البشرة الفقاعي البحوث رابطة (ديبرا) الدولية ومؤسسة الملك بودوان صندوق فلينديركيندجي، والبوابات حدود الصندوق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
