Summary
Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.
Abstract
Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) hebben bewezen een waardevol hulpmiddel om het bestuderen van de menselijke ontwikkeling en ziekte. Verdere bevordering van iPSCs als een regeneratieve therapeutische vereist een veilig, robuust, en raadzaam herprogrammering protocol. Hier presenteren we een klinisch relevante, stapsgewijze protocol voor de herprogrammering van de extreem hoog rendement van menselijke dermale fibroblasten in iPSCs met behulp van een niet-integratie aanpak. De kern van het protocol bestaat uit het uitdrukken van pluripotent factoren (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) gewijzigd van in vitro getranscribeerde messenger RNAs gesynthetiseerd met nucleotiden (gemodificeerde mRNAs). De herprogrammering gemodificeerde mRNAs zijn transfected in primaire fibroblasten elke 48 h samen met volwassen embryonale stamcel-specifieke microRNA-367/302 nabootsers voor twee weken. De resulterende iPSC kolonies kunnen dan worden geïsoleerd en direct uitgebreid in feeder-vrij voorwaarden. Het maximaliseren van efficiëntie en consistentie van onze herprogrammering protocol over fibroblast monsters, hebben we verschillende parameters, met inbegrip van de transfectie regime van RNA, geoptimaliseerd timing van transfections en kweekomstandigheden seeding dichtheden. Nog belangrijker is, onze methode genereert hoogwaardige iPSCs van meeste fibroblast bronnen, met inbegrip van moeilijk te herprogrammeren zieke, leeftijd en/of verouderend monsters.
Introduction
Herprogrammering van somatische cellen met geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vereist uitgebreide uitdrukking van een kernset van transcriptiefactoren die belangrijk zijn om pluripotent1,2. Bij de productie van iPSCs voor klinische toepassingen, is het essentieel dat de vogelgriepvirus invoercellen lasten tot een minimum tijdens de verwerking beperkt en de efficiëntie van iPSC generatie wordt onderhouden op een relatief hoog niveau in verschillende steekproeven van de patiënt. De meerderheid van de herprogrammering van de methoden, met inbegrip van de integratie-vrije protocollen, lijdt echter in zeer lage herprogrammering rendementen, welke limiet klinische nut van deze3 benaderingen. De lage herprogrammering efficiëntie kan ook bevorderen selectieve herprogrammering van de cellen dragen al aanwezige mutaties, vogelgriepvirus werkdruk in de resulterende iPSCs toeneemt. Daarnaast lijden alle DNA gebaseerde herprogrammering methoden, zoals lentivirus en episomal-gebaseerde benaderingen, aan de zorg van de veiligheid dat DNA willekeurig kan in het genoom integreren en maken kans op schadelijke dat mutagenese en ongewenste) potentieel oncogene) uitdrukking van pluripotent genen in downstream weefsel derivaten4.
Een veelbelovende aanpak vogelgriepvirus verlichten in de resulterende iPSCs te bereiken van efficiënte inductie van pluripotent in somatische cellen is het gebruik van synthetische afgetopte messenger RNAs gemodificeerde nucleobasen (gemodificeerde mRNAs) voor5te herprogrammeren. De efficiëntie van gemodificeerde mRNA gebaseerde herprogrammering benaderingen kan verder worden verbeterd door toevoeging van embryonale stamcellen (ESC)-specifieke microRNAs (miRNAs)-367/302s3, waarin is aangetoond dat lichaamscellen met herprogrammeren efficiënter6 ,7. Nochtans, zelfs met de toevoeging van miRNAs-367/302s, de gewijzigde mRNA gebaseerde herprogrammering aanpak vaak niet in slaagt tijdens toepassing naar vers geïsoleerde patiënten cellen3. Tot adres inconsistenties van deze gewijzigde mRNA gebaseerde benadering, hebben we onlangs gemeld een geoptimaliseerde, integratie-gratis strategie die induceert pluripotent in menselijke primaire fibroblasten met een hoog slagingspercentage en maakt gebruik van zowel gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering van de factoren en volwassen miRNA-367/302 bootst8. In onze methode bevat de herprogrammering gemodificeerde mRNA cocktail een aangepaste versie van OCT4 gefuseerd met de MyoD transactivation domein (genaamd M3O)9 en vijf andere herprogrammering factoren (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A en NANOG). Het combineren van de gemodificeerde mRNA codering de pluripotent factoren met de miRNA leek nabootsers te hebben een synergie-effect op de herprogrammering van de efficiëntie in dit protocol. Extra optimalisaties van het RNA transfectie regime, cel zaaien en kweken voorwaarden werden ook noodzakelijke herprogrammering efficiëntie van de aanpak van een ultra-hoge niveau8te verhogen.
In tegenstelling tot vele andere protocollen vereist onze herprogrammering benadering meestal slechts een paar duizend input fibroblasten. Daarnaast betrekken vele gemeenschappelijke niet-integratie van strategieën door middel van episomal plasmiden, Sendai virus of zelfreplicerende RNA uitgebreide passaging te verdunnen de herprogrammering vector in de gegenereerde iPSCs. Omgekeerd, gemodificeerde mRNA en volwassen miRNA nabootsers hebben een korte halfwaardetijd en worden snel geëlimineerd uit cellen. Samen genomen, is het bedrag van de cumulatieve cel cultuur tijd tussen het verzamelen van monsters van de patiënt en de generatie van bruikbare iPSCs minimaal in deze benadering, effectief beperken mutatie accumulatie in de resulterende iPSCs en verbetering van de kosteneffectiviteit.
Hier presenteren we het gedetailleerde stapsgewijze protocol om hoogrenderende herprogrammering van de volwassen menselijke fibroblasten in iPSCs met behulp van onze combinatorische gemodificeerde mRNA/miRNA gebaseerde aanpak8. Dit RNA gebaseerde herprogrammering protocol biedt een robuuste, eenvoudige en kosteneffectieve methode voor het genereren van integratie-vrije iPSCs voor onderzoek en potentieel klinische toepassingen. Het is bovendien van toepassing op de herprogrammering van allerlei fibroblast lijnen met inbegrip van moeilijk-aan-herprogrammeren, ziekte-geassocieerde, leeftijd en verouderend fibroblasten. Een schematische voorstelling van het protocol voor menselijke fibroblasten herprogrammering is afgebeeld in Figuur 1. Het protocol wordt een methode voor drie putten van menselijke volwassen primaire fibroblasten in een 6-well formaat bord te herprogrammeren specifiek beschreven. Twee putten levert meestal een voldoende aantal hoogwaardige iPSC kolonies. In veel gevallen slechts één goed is nodig, en de derde kan goed worden gebruikt voor analyse van efficiëntie te herprogrammeren. Indien nodig, kan het aantal putten worden opgeschaald.
Protocol
Werken onder omstandigheden RNase-vrij en gebruik van aseptische technieken indien mogelijk. Alle cel cultuur-gerelateerde bewerkingen uitvoeren in een biologische veiligheidskast met behulp van aseptische technieken. Volg institutionele bioveiligheid normen voor werk met menselijke cellen.
1. reagentia en apparatuur voor de bereiding van de initiatie herprogrammering
- Bereiden de bewerkt-mRNA cocktail coderen herprogrammering factoren.
- Volg de eerder gepubliceerde protocol10 te voeren in vitro transcriptie, aftopping, en procedures voor elke gewijzigde mRNA codering van individuele herprogrammering factor dephosphorylation. Na de definitieve zuivering, elueer de gemodificeerde mRNA met nuclease-gratis water, aanvulling van de gezuiverde gemodificeerde mRNA-oplossing met 1 U/µL RNase remmer kwantificeren van de gemodificeerde mRNAs met behulp van een spectrofotometer en opslaan bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden. Bereiden meerdere aliquots van elke gewijzigde mRNA tot een minimum beperken van het aantal cycli bevriezen-ontdooien.
Opmerking: Soortgelijke protocollen voor gemodificeerde mRNA productie geweest gemeld elders5,8,11. Sjablonen voor in vitro transcriptie kunnen worden gegenereerd door PCR versterking van overeenkomstige plasmide sjablonen gebruikend inleidingen die zijn vermeld in de Tabel van de materialen volgens de eerder gepubliceerde protocol10. Plasmide sjablonen voor elke herprogrammering factor (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) en mWasabi (control voor Transfectie) zijn verkrijgbaar bij Addgene, een non-profit plasmide repository. - Meng alle gewijzigde mRNAs bij een molaire verhouding van 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) en zijn inclusief 10% mWasabi bewerkt mRNA als een besturingselement voor de efficiëntie van de transfectie. Aanpassen van de concentratie van de volledige gemodificeerde mRNA herprogrammering mix om een eindconcentratie van 100 ng/µL door toevoeging van nuclease-gratis water aangevuld met 1 U/µL RNase-remmer. Bereiden van zeven 33 µL aliquots van de complete bewerkt mRNA cocktail. Opslaan van de gemengde herprogrammering aliquots bij-80 ° C.
Opmerking: voor elke transfectie, 1.000 ng van de gemodificeerde mRNA cocktail per putje wordt toegevoegd (dat wil zeggen, een totaal van 3.000 ng voor 3 putten). Elke 33 µL aliquoot formaat van transfect 3 putjes van de plaat van een 6-well formaat wordt aangepast en bevat 3 µL van overtollige volume ter verantwoording voor pipetting fouten. Voorbereiding van zeven 33 µL aliquots volstaat om te voltooien een volledige fibroblast herprogrammering van 3 putten in een 6-well formaat plaat.
- Volg de eerder gepubliceerde protocol10 te voeren in vitro transcriptie, aftopping, en procedures voor elke gewijzigde mRNA codering van individuele herprogrammering factor dephosphorylation. Na de definitieve zuivering, elueer de gemodificeerde mRNA met nuclease-gratis water, aanvulling van de gezuiverde gemodificeerde mRNA-oplossing met 1 U/µL RNase remmer kwantificeren van de gemodificeerde mRNAs met behulp van een spectrofotometer en opslaan bij-80 ° C voor maximaal 6 maanden. Bereiden meerdere aliquots van elke gewijzigde mRNA tot een minimum beperken van het aantal cycli bevriezen-ontdooien.
- De cocktail van miRNA nabootsers herprogrammering voor te bereiden.
- Los gelyofiliseerd miRNA nabootsers (Syn-heeft-miR-302a - 3p, Syn-heeft-miR-302b - 3p, Syn-heeft-miR - 302c - 3p, Syn-heeft-miR-302d-3 p, Syn-heeft-miR-367-3 p) tot een uiteindelijke concentratie van 5 pmol/µL (5 µM) in nuclease-gratis water aangevuld met 1 U/µL van RNase-remmer. Meerdere aliquots van elke miRNA mimic voor te bereiden en op te slaan bij-80 ° C voor lange termijn opslag.
- Meng alle miRNA nabootsers in een molaire 1:1:1:1:1 in verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 5 pmol/µL (5 µM). Bereiden van zeven 14 µL aliquots van de miRNA bootst mix. Opslaan van de gemengde aliquots bij-80 ° C.
Opmerking: Voor elke transfectie, 20 pmol van de miRNA nabootsers mix toegevoegd per putje (dat wil zeggen, een totaal van 60 pmol voor 3 putten). Elke 14 µL aliquoot formaat van transfect 3 putjes van de plaat van een 6-well formaat wordt aangepast en bevat 2 µL van overtollige volume ter verantwoording voor pipetting fouten. Voorbereiding van zeven 14 µL aliquots volstaat om te voltooien een volledige fibroblast herprogrammering van 3 putten in een 6-well formaat plaat.
- De buffer van de Transfectie te bereiden.
- Vooraf warm één flacon van 500 mL en een fles van 100 mL van verse verminderd-serum medium tot kamertemperatuur (RT) voor ongeveer 2 h. Gebruik geen een waterbad.
- Een pH-meter overbrengen in een kabinet bioveiligheid. Wassen van de meter glaselektrode met nuclease-gratis water. Kalibreren van de pH-meter volgens de vervaardiging's instructies. De elektrode opnieuw met nuclease-gratis water wassen.
- Breng beide flessen van verminderd-serum medium in de kast bioveiligheid. Gebruik de flacon 500 mL RT om te passen van de pH.
- Wordt de basis pH van het verlaagd-serum medium door het invoegen van de pH-meter glaselektrode in de buffer. Wachten tot 1 min. vóór het lezen van de pH op de meter.
- 3-4 mL van de 1 M NaOH aan 500 mL van verminderd-serum medium toevoegen, sluit de fles en meng goed. Wachten tot 5 min. voor het openen van de fles voor pH-meting. De pH-meter-elektrode in de buffer invoegen en wacht totdat de lezing op de pH-meter stabiliseert.
- Doorgaan met het toevoegen van kleine hoeveelheden van 1 M NaOH totdat de pH verlaagd-serum medium 8.15 – 8.17 tot. Kalibreren van de pH-meter meerdere keren tijdens het proces. Als op enig moment de pH hoger dan 8.18 wordt, verminderen door toevoeging van vers verminderd-serum medium uit de voorverwarmde 100 mL fles (stap 1.3.1).
Opmerking: De pH van de buffer verminderd-serum medium gebaseerde transfectie is van cruciaal belang. Herprogrammering zal lukken als de pH van de buffer van de transfectie ongeveer 8,2 ± 0,05 is, maar kan niet als de pH hoger dan 8,25 is. Daarom is het aangeraden om te stoppen met het toevoegen van NaOH zodra de pH van de buffer 8.15 – 8.17 bereikt. Dit zal ervoor zorgen dat de definitieve pH van de buffer van de transfectie ongeveer 8,2 – 8.22 na sterilisatie is. - Filter steriliseren de transfectie buffer met behulp van een 0,22 µm vacuüm filtratie-systeem. Aliquot de gesteriliseerde buffer in 5 of 15 mL tubes met minimale luchtruim.
- Winkel aliquots van de transfectie buffer voor maximaal 3 maanden bij 4 ° C. Wordt de pH van de aliquots periodiek. Gooi de aliquots indien de pH hoger dan 8,25 is. Beperken aliquoot zede voor 2 transfections pas sinds Gasbedwelming met behulp van de transfectie buffer atmosferische lucht de pH van de buffer verhoogt.
- De fibroblast uitbreiding medium (FEM) bereiden: minimale essentiële medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1 x 1 x glutamine supplement, 55 µM 2-mercaptoethanol, niet-essentiële aminozuren, 1 x pen/strep/fungizone. Winkel de FEM bij 4 ° C.
- Bereiden het herprogrammering medium: DMEM/F12 (geen HEPES) aangevuld met 20% knockout serum vervanging (KOSR), 0,5 x niet-essentiële aminozuren, 0.5 x glutamine supplement, 55 µM 2-mercaptoethanol, 50 µg Mo/mL ascorbinezuur, 1 x pen/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF , en 200 ng/mL B18R. Bereiden van het medium bij de aanvang van de herprogrammering zonder bFGF en B18R, en op te slaan bij 4 ° C. Gebruik het niet verder dan 1 maand na voorbereiding. BFGF en B18R onmiddellijk vóór elk gebruik toevoegen aan een aliquot deel formaat voor die dag gebruik.
- Bereiden van het medium plating door toevoeging van 5% warmte-geïnactiveerd (HI) FBS in het herprogrammering medium met 20% KOSR zonder bFGF en B18R uit stap 1.5. De middellange fresh voor te bereiden op de dag van het beoogde gebruik. Voeg bFGF en B18R onmiddellijk vóór gebruik op dag 0 te herprogrammeren.
- Kalibreer de weefselkweek incubators voordat de herprogrammering volgens de instructies van de fabrikant met behulp van een handheld digitale CO2 analyzer. Gebruik een laag-O2 incubator voor de herprogrammering stappen om succesvolle iPSC generatie.
2. het kweken van fibroblasten voor herprogrammering
- Fibroblasten voorafgaand aan de inleiding van herprogrammering (dag -2) voor te bereiden.
- Jas een nieuwe 10 cm weefselkweek plaat met 5 mL 0,1% gelatine. Tik of swirl van de plaat om ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak is bedekt. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C. Gecombineerd gelatine en voeg 10 mL van de FEM. Set opzij. Laat niet het gecoate oppervlak van de plaat te drogen alvorens toe te voegen FEM.
- Zorgvuldig gecombineerd het verbruikte medium van de fibroblasten. Spoel de cellen met 5 mL van de DPBS te verwijderen van de resterende serum. Voeg 3 mL trypsine-EDTA. Zachtjes rock de plaat om ervoor te zorgen volledige dekking over de gewenste cellen.
- Gecombineerd overtollige vocht, ~ 500 µL van trypsine verlaten. Doe niet teveel gecombineerd, aangezien dit kan drogen en doden van de fibroblasten. Incubeer de fibroblasten met trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
- Verwijderen de plaat uit de incubator en stevig maar voorzichtig Tik op de kant van de plaat te verjagen van de cellen. Controleer de cellen onder de Microscoop. Als de cellen vrijstaand en zwevende zijn, gaat u verder. Als de cellen nog steeds verbonden zijn, Incubeer gedurende een andere 3 minuten.
- Snel spoelen/verzamelen de vrijstaande cellen met behulp van 5 mL FEM te neutraliseren de trypsine-EDTA. Verplaats de fibroblast schorsing naar een conische tube van 15 mL. Controleer of de cellen goed gemengd.
- Meng voorzichtig de celsuspensie om te breken grote bosjes van cellen, dan rekenen ze op een hemocytometer. Overdracht 2.5 x 105 cellen in de gelatine beklede 10-cm schotel bereid in stap 2.1.1. Incubeer de cellen 's nachts in de 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde regelmatige weefselkweek incubator.
Opmerking: De celdichtheid is cruciaal voor het bereiken van hoogrenderende herprogrammering, want het is belangrijk dat de fibroblasten gezond en snel verdelen zijn. Plating 2.5 x 105 cellen levert een 40-60% confluentie 2 dagen later voor de meeste fibroblast monsters. Het bedrag aanpassen voor zieke of verouderend cellen te bereiken van de gewenste 40-60% confluentie 48 uur later. - Vervang het medium met 10 mL verse FEM de volgende dag (dag -1).
- Plaat van de fibroblasten om te starten (dag 0) te herprogrammeren.
- Controleer of de fibroblasten te herprogrammeren op 40-60% confluentie (Figuur 2, dag 0). Als de cellen over- of weinig heuvels zijn, passage van de fibroblasten, zoals beschreven in stap 2.1 en de dichtheid van de beplating dienovereenkomstig aan te passen. Cultuur voor nog eens 2 dagen.
- Breng 4 mL van DPBS in een conische tube van 15 mL. Voeg 100 µL van recombinante menselijke (rh) laminin-521. Pipetteer omhoog en omlaag om meng.
- Voeg 1 ml per putje van verdunde rhLaminin-521 in 3 putjes van de plaat van een 6-well. Incubeer de beklede plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Warm 6 mL FEM en 4 mL plating middellange tot 37 ° C. Een aanvulling op het medium van de beplating met bFGF om een eindconcentratie van 100 ng/mL en B18R om een eindconcentratie van 200 ng/mL.
- Zorgvuldig gecombineerd het verbruikte medium van fibroblasten (stap 2.2.1). Spoel de cellen met 5 mL van DPBS en voeg 3 mL trypsine-EDTA. Zachtjes rock de plaat ter dekking van de cellen met trypsine-EDTA.
- Overtollige vocht, verlaten ~ 500 µL van trypsine, zoals gedaan in stap 2.1.3 gecombineerd. Incubeer de fibroblasten met trypsine-EDTA gedurende 3 minuten bij 37 ° C. Verwijderen de plaat uit de incubator en stevig maar voorzichtig Tik op de kant van de plaat te verjagen van de cellen. Controleer de cellen onder de Microscoop. Als de cellen vrijstaand en zwevende zijn, gaat u verder. Als de cellen nog steeds verbonden zijn, Incubeer gedurende een andere 3 minuten.
- Spoel-/ verzamelen de vrijstaande cellen met behulp van 5 mL FEM te neutraliseren de trypsine-EDTA. Verplaats de fibroblast schorsing naar een conische tube van 15 mL. Controleer of de cellen goed gemengd zijn en ze op een hemocytometer rekenen. Pipetteer 12.000 cellen in 4 mL voorverwarmde plating voedingsbodem uit stap 2.2.4.
Opmerking: Niet centrifugeren van de cellen op elk gewenst moment. Het aantal vergulde cellen kan worden aangepast omhoog of omlaag als vereist voor langzaam of snel-groeiende lijnen, respectievelijk. - Verwijder de beklede plaat uit de incubator en verdunde rhLaminin-521 de gecoate putjes gecombineerd. Laat niet het oppervlak van de putten te drogen. Zachtjes resuspendeer de cellen in het medium van de beplating. Pipetteer 1 mL celsuspensie in elk gecoat goed (dat wil zeggen, 3.000 cellen per putje).
- Plaats de vergulde cellen in een tri-gas weefselkweek incubator met O2 ingesteld op 5% (laag-O2). Zodra de plaat wordt neergezet, voorzichtig maar grondig dispergeren cellen door afwisselend een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Herhaal de bewegingen 2 meer tijden. Incubeer de cellen 's nachts. Wervelen niet de plaat te mengen.
- Pipetteer 4 mL herprogrammering middellange tot een conische tube van 15 mL en breng dit in de lage-O2 incubator met een losgedraaide GLB equilibreer 's nachts. Voeg geen bFGF en B18R tot de volgende dag.
3. Inleiding van herprogrammering (dag 1)
Opmerking: Zodra de herprogrammering wordt geïnitieerd, dagelijks onderhoud is vereist voor ongeveer 1 maand. Zorg ervoor dat plan dienovereenkomstig. Alle latere cel incubations moeten worden uitgevoerd onder lage-O2 voorwaarden in de 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 bevochtigde tri-gas weefselkweek incubator.
- Vervang het plating medium ten minste 1 h vóór transfectie.
- Verwijder het equilibrated herprogrammering medium uit de lage-O2 incubator. BFGF toevoegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL en B18R om een eindconcentratie van 200 ng/mL. Meng goed.
- Doorgaan met 1 tegelijk goed, gebruik een pipet 1 mL aan het gebruikte medium verwijderen en te vervangen door 1 mL van herprogrammering medium aangevuld met bFGF en B18R. Herhaal dit voor elk putje. Gebruik geen vacuüm aspiratie, die overdreven droogt de cellen veroorzaakt stress en herprogrammering efficiëntie vermindert. Verplaats de plaat met cellen terug in de lage-O2 incubator.
- Transfect van fibroblasten met 5 µL van RNAiMax transfectiereagens per 1 µg gemodificeerde mRNA en 1 µL van het transfectiereagens per 6 pmol van miRNA bootst per transfectie.
Opmerking: Optimale resultaten worden verkregen wanneer transfections gaan voor 16-20 h. De transfectiereagens is verdunde 10 x; de 100 ng/µL gemodificeerde mRNA cocktail is verdund 5 x; en de 5 pmol/µL miRNA nabootsers mix is verdund 8.33 x met de transfectie buffer vóór kleurverandering. Zie tabel 1 voor een overzicht van de transfectie setup.- Terwijl de voorbereiding van de transfectie mixen, minimaliseren potentiële Gasbedwelming met behulp van reagentia RNase door standaard laboratoriumpraktijken te volgen.
- Equilibreer een aliquoot gedeelte van de transfectie buffer (stap 1.3) voor ongeveer 1 h op RT. Gebruik geen een waterbad 37 ° C of incubator de transfectie buffer opwarmen.
- Verwijder een enkele hoeveelheid gemodificeerde mRNAs (33 µL) en miRNA bootst (14 µL) van-80 ° C en warm ze aan RT voor ongeveer 3-5 min, totdat het ontdooid. Niet ontdooien de aliquots bij 37 ° C. Draai ze naar beneden kort in een microfuge.
- Warm de transfectiereagens aan RT voor ongeveer 3-5 min. Gebruik geen een waterbad 37 ° C of incubator. Omkeren van de gesloten buis 2 tot 3 keer te mengen van het reagens. Draai het naar beneden kort in een microfuge.
- Pipetteer 279 µL van de RT transfectie buffer in een microcentrifuge RNase-gratis buis. Voeg 31 µL van het transfectiereagens tot een eindvolume van 310 µL. Meng grondig door pipetteren. Doen niet vortex. Incubeer de buis op RT voor 1 min.
Opmerking: Dit volume van de verdunde transfectiereagens volstaat tot complexe gemodificeerde mRNA zowel de miRNA bootst aliquots uit stap 3.2.3. - 132 µL van de buffer van de transfectie RT aan het afgepipetteerde deel. 33 µL van gemodificeerde mRNA toevoegen. Voorzichtig te mengen Pipetteer: eindvolume is 165 µL.
- 102,6 µL van de buffer van de transfectie RT aan het monster 14 µL van miRNA nabootsers toevoegen. Voorzichtig te mengen Pipetteer: eindvolume is 116.6 µL.
- Voeg 165 µL van de verdunde transfectiereagens uit stap 3.2.5 tot de verdunde mRNA van stap 3.2.6 gewijzigd. Pipetteer te mengen: eindvolume is 330 µL.
- 116.6 µL van de verdunde transfectiereagens uit stap 3.2.5 toevoegen aan de verdunde miRNA nabootsers mix uit stap 3.2.7. Meng goed (eindvolume is 233.2 µL). Incubeer gedurende 15 minuten op RT dat de buffer van de Transfectie aan complex met de gewijzigde mRNAs en miRNA nabootst.
- Verwijder de plaat met cellen uit de lage-O2 incubator. Voeg 100 µL (1 µg) van de complexvorm bewerkt mRNA transfectie mix aan elk putje, ontkleuring in de put. Het verspreiden van de complexen van de transfectie door voorzichtig maar grondig het schudden van de plaat met een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Wervelen niet de plaat te mengen.
- Voeg 66,7 µL (20 pmol) van de complexvorm miRNA nabootsers transfectie mix aan elk putje, ontkleuring in de put. Dispergeren complexen van de transfectie door voorzichtig maar grondig het schudden van de plaat met een omhoog/omlaag en links/rechts beweging. Wervelen niet de plaat te mengen.
- Plaats de transfected cellen in de incubator tri-gas met O2 ingesteld op 5% (laag-O2). Zodra de plaat wordt neergezet, verspreiden de transfectie complexen opnieuw door voorzichtig maar grondig het schudden van de plaat met een omhoog/omlaag en links/rechts beweging.
- Pipetteer 4 mL medium in een conische tube van 15 mL te herprogrammeren en plaats deze in de laag-O2 incubator met losgedraaide GLB equilibreer 's nachts. Voeg geen bFGF en B18R tot de volgende dag.
| Buis 1 - RNAiMax-verdunning (1ste mix) | ||
| Reagens | Concentratie | Volume |
| Buffer van de Transfectie | 279 ΜL | |
| RNAiMax (2e toevoegen) | 10 x | 31 ΜL |
| Totaal: 310 µL | ||
| (Incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur) | ||
| Buis 2 - gemodificeerde mRNA mix (2e mix) | ||
| Reagens | Concentratie | Volume |
| gemodificeerde mRNA mix | 100 ng/µL (5 x) | 33 ΜL |
| Buffer van de Transfectie | 132 ΜL | |
| Totaal: 165 µL | ||
| (het toevoegen van gelijk volume verdunde RNAiMax van buis-1) | ||
| Buis 3 - miRNA nabootsers mix (3e mix) | ||
| Reagens | Concentratie | Volume |
| miRNA bootst mix | 5 pmol/µL (8.33 x) | 14 ΜL |
| Buffer van de Transfectie | 102,6 ΜL | |
| Totaal: 116.6 µL | ||
| (het toevoegen van gelijk volume verdunde RNAiMax van buis-1) | ||
Tabel 1: Voorbereiding voor Transfectie mix.
4. ter vervanging van herprogrammering Medium tussen Transfections (dagen 2, 4, 6, 8, 10 en 12)
- Vervang de middellange 16-20 h na transfectie zoals beschreven in 3.1.1–3.1.2. BFGF toevoegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL en B18R om een eindconcentratie van 200 ng/mL in herprogrammering middellange aliquots.
- Monitor mWasabi expressie dagelijks te bevestigen van transfectie kwaliteit met behulp van een microscoop die is geconfigureerd voor het visualiseren van EGFP.
Opmerking: mWasabi expressie moet minimaal blijken op dag 2 en toename van helderheid met elke extra transfectie.
5. elk-ander-dag Transfections (dagen 3, 5, 7, 9, 11 en 13)
- Voert de transfectie zoals beschreven in stap 3.2. Wijzig het medium niet op dagen van transfectie.
- Bereiden van een hoeveelheid van 4 mL medium te herprogrammeren en plaats deze in de laag-O2 incubator aan equilibreer gedurende de middellange verandering op de volgende dag. Voeg geen bFGF en B18R tot de volgende dag.
6. de procedures moeten worden uitgevoerd na definitieve transfectie
- Dagelijkse middellange wijzigingen uitvoeren vanaf dag 14 door ongeveer dag 17. Warm 7 mL herprogrammering middellange tot 37 ° C. BFGF toevoegen aan een eindconcentratie van 100 ng/mL.
Opmerking: B18R is niet langer nodig na de definitieve transfectie. Buiten dag 14 is het niet langer nodig om het medium's nachts in de laag-O2 incubator equilibreer. - Verwijder het medium van alle putjes met behulp van een precisiepipet serologische. Vermijd het gebruik van ambitie blijven. Voeg toe 2 mL medium aangevuld met bFGF per putje te herprogrammeren.
- Op dag 17 en 18, analyseren de geherprogrammeerde putten onder een Microscoop omgekeerde of ontleden. Als kolonies worden gevormd in de nabijheid van elkaar dankzij hoog rendement te herprogrammeren en niet kunnen handmatig geïsoleerd worden, scheidt u de kolonies door het uitvoeren van een optionele passaging van geherprogrammeerde putten die zijn beschreven in stap 7 hieronder. Als kolonies schaars en goed gescheiden zijn, handmatig kiezen de klonen rechtstreeks vanuit de geherprogrammeerde goed zoals beschreven in stap 8 en subcultuur iPSCs volgens standaard protocollen.
7. facultatieve Procedure: Passaging cellen geherprogrammeerd putjes met behulp van EDTA
- 0,5 mM EDTA in DPBS (EDTA) bereid door verdunning van de stockoplossing van de EDTA 0.5 M. Filter steriliseren EDTA met behulp van een 0,22 µm vacuüm filtratie-systeem.
- Feeder-vrije pluripotente stamcel (PSC) medium (bijvoorbeeld mTeSR1) volgens instructies van de fabrikant voor te bereiden. Vooraf warm 32 milliliters PSC middellange tot 37 ° C.
- Jas alle putjes van twee 6-well formaat platen met hESC-gekwalificeerde extracellulaire matrix (ECM) volgens de instructies van de fabrikant. Zegel platen met parafin film en hen Incubeer gedurende 1 h op RT.
- De ECM-oplossing aan de voorverwarmde platen gecombineerd en 2 mL van PSC medium per putje te vervangen. Laat niet het oppervlak van de putten te drogen. Ze gereserveerd.
- Het herprogrammering medium uit 2 geherprogrammeerde putten gecombineerd op een dag wanneer de koloniën groot en duidelijk gevormde zijn (meestal dag 18). Spoel één keer met 1 mL EDTA en aspirate.
- Voeg 1 mL EDTA per putje. Incubeer gedurende 4 minuten bij 37 ° C.
- Zachtjes verwijderen de plaat uit de incubator en plaats deze in de bioveiligheid kabinet.
Opmerking: op dit punt, cellen mogelijk zeer losjes zelfklevend en gemakkelijk verdreven. - Zorgvuldig gecombineerd EDTA uit beide putten. Voeg 3 mL van voorverwarmde PSC medium aan elk goed behandeld met EDTA. Gebruik een cel-schraper te voorzichtig maar grondig verjagen cellen uit beide putten.
- Gebruik een serologische pipet zachtjes de celsuspensie Pipetteer en breken grote bosjes. Niet Pipetteer totdat alle de cel klontjes verdwenen zijn. Behoud van iPSC clusters.
Opmerking: Grote bosjes Plating zal geen invloed op iPSC kolonie uitgroei. Als er buitensporig grote cel klontjes, gewoon vermijden hen overbrengen naar de volgende schotel. - Met behulp van een serologische precisiepipet, verdeel cellen uit elk putje EDTA-behandeld door pipetting 0,5 mL in elk putje van de 6-well ECM beklede plaat.
Opmerking: Cellen uit de geherprogrammeerde putten niet combineren (dat wil zeggen, goed geherprogrammeerd 1 dient gelijkmatig te worden verdeeld in de eerste 6-well-plaat en geherprogrammeerde goed 2 gelijkmatig verdeeld moeten worden in de tweede 6-well-plaat). - Verplaats de vergulde cellen terug in de lage-O2 incubator. Schud om gelijkmatig verdelen cellen, elke plaat heen-en-weer en links-naar-rechts. Niet wervelen. Vervang dagelijks het PSC-medium.
8. picking iPSC kolonies
- Vooraf warm 15 mL PSC middellange tot 37 ° C. Jas alle putjes van een enkele 6-well plaat met hESC-gekwalificeerde ECM na instructies van de fabrikant. Zegel van de platen met paraffine film en hen Incubeer gedurende 1 h op RT.
- Gecombineerd het kweekmedium uit putten wordt gebruikt voor het verzamelen van iPSCs. Spoel één keer met 1 mL EDTA en aspirate. Voeg 1 mL EDTA per putje. Incubeer gedurende 4 minuten bij 37° C. Terwijl de cellen worden aan het broeden, gecombineerd de ECM-oplossing uit de voorverwarmde borden en vervangen van 2 mL van PSC medium per putje. De platen worden gereserveerd.
- Verwijder voorzichtig de plaat met iPSCs moeten worden gepickt uit de incubator en plaatst u deze in het biosafety kabinet.
Opmerking: op dit punt, cellen mogelijk zeer losjes zelfklevend en gemakkelijk verdreven. - Zorgvuldig gecombineerd EDTA. Heel zachtjes Voeg 3 mL van voorverwarmde PSC medium, verzorgen niet te verjagen iPSC kolonies.
- Verplaats de plaat naar een bereik van het inverted of ontleden beter visualiseren kolonies. Een pipet 1 mL met een steriele tip voor te bereiden. Druk de plunjer volledig en gebruik vervolgens het uiteinde van de pipet zachtjes schrapen een kolonie terwijl u de vloeistof langzaam in de tip om het verzamelen van de kolonie. Tekenen als kleine medium mogelijk terwijl het oppakken van de iPSC-kolonie.
- Als u wilt overbrengen van de kolonie, Pipetteer omhoog en omlaag 3-4 keer in een enkel putje van de ECM beklede plaat uit stap 8.2. Herhaal totdat 6 kolonies zijn geplukt en overgedragen naar afzonderlijke wells. Kies niet meer dan 2 kolonies uit een enkele bron als een optionele passaging beschreven in stap 7 is verricht.
- Gebruik een standaard menselijke stamcellen protocol te bevriezen van alle resterende putjes. Ontdooien, en bevroren voorraden opnieuw plaat als meer koloniën later moeten worden gepickt.
9. karakterisatie van iPSCs
- TRA-1-60 kleuring voor analyse van herprogrammering van efficiëntie (dag 18) uitvoeren
Opmerking: 2 van de 3 geherprogrammeerd putten zijn gepasseerd voor toekomstige kolonie picken. De resterende goed kan worden gebruikt voor de kleuring van de TRA-1-60. Deze procedure kan worden uitgevoerd op de top van de Bank laboratorium.- Was de geherprogrammeerde goed met 1 mL PBS. Het herstellen van cellen met ijskoude methanol bij-20 ° C gedurende 5 minuten.
- Gecombineerd methanol. Droog de put voor ongeveer 2 min. Wees voorzichtig niet te veel te droog. De cellen hebben gedroogd genoeg wanneer ze een doorschijnend/matte kleur.
- Was het nou 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden. Tijdens de wast, bereiden 3 mL 3% waterstofperoxide in PBS.
- De PBS gecombineerd. Voeg toe 2 mL verdunde peroxide oplossing. Incubeer gedurende 15 min op RT met zacht schudden. Bereiden van 4 mL van de blokkerende oplossing: 10% runderen-serum albumine (BSA) in PBS.
- De peroxide oplossing gecombineerd. Het goed 2 keer met 1 mL PBS gedurende 5 minuten wassen.
- PBS gecombineerd en voeg 2 mL van het blokkeren van de oplossing in de put. Incubeer gedurende 1 h op RT.
- Was het nou 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden.
- Verdun primair anti-TRA-1-60 antilichaam op 1:100 in de blokkerende oplossing aangevuld met 0,05% natriumazide. Bereiden 1 mL verdunning van het antilichaam voor 1 goed van een 6-well formaat schotel. De antilichaam-verdunning toevoegen naar de waterput en wikkel de plaat met parafilm om verdamping. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met zacht schudden.
Opmerking: Indien nodig, de incubatie met het primaire antilichaam kan gebeuren voor 1 h bij RT met zacht schudden. De verdunning van het primaire antilichaam kan opnieuw gebruikt worden tot 5 keer. - Na incubatie met het primaire antilichaam, wassen het goed 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden.
- Verdun het secundaire anti-muis HRP-geconjugeerde antilichaam op 1:200 in de blokkerende oplossing. Incubeer de put met de verdunning van het secundair antilichaam voor 2 h op RT met zacht schudden.
- De verdunning secundair antilichaam gecombineerd en wassen van de goed 3 keer met 1 mL PBS voor 5 min met zacht schudden.
- Tijdens de derde wash, bereiden de substraat oplossing volgens de instructies van de fabrikant. Na de definitieve wash, gecombineerd PBS. Voeg 1 mL van de oplossing van het substraat en incubeer tot gewenste kleur ontwikkelt (ongeveer 10 min).
- Het substraat oplossing gecombineerd. Spoel de put met water gedurende 5 minuten terwijl het zachtjes te schudden.
- Tellen de koloniën, indien gewenst. Herprogrammering efficiëntie = (aantal kolonies) / (aantal vergulde fibroblasten) x 100%.
- Voor langdurige opslag, water uit de gekleurde plaat gecombineerd en 's nachts drogen op RT. Seal de gedroogde plaat met parafilm bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 jaar herprogrammering om efficiëntie te beoordelen later.
Representative Results
Het duurt meestal ongeveer 5-6 weken na de opening van de fibroblast herprogrammering tot bevriezing van de eerste flesjes van iPSCs (Figuur 1). Het herprogrammering protocol kan over het algemeen worden onderverdeeld in twee fasen. Fase 1 bevat de fibroblast cultuur en zeven transfections, met de herprogrammering RNA cocktail uitgevoerd elke 48 h. fase 2 isolatie, uitbreiding en karakterisering van de iPSC-kolonies.
Voordat het protocol, er moet voor worden gezorgd dat de fibroblasten te herprogrammeren van goede kwaliteit zijn. Gezonde fibroblasten hoort spindel-vormig, bipolaire, en refractile met een verdubbeling tijd van ongeveer 24 uur. Per dag 0, moeten 250.000 cellen verguld in een 10 cm schotel op dag -2 groeien tot 40 – 60% confluentie (Figuur 1, dag 0) en opbrengst van ongeveer 6 tot 10 x 105 cellen. Cellen in een trager tempo prolifererende kunnen worden gecompenseerd door de beplating op een hogere dichtheid op dag -2 en op dag 0 voor herprogrammering.
Fibroblasten moeten zeer schaars volgende beplating in een putje van een 6-well formaat schotel voor herprogrammering weergegeven (Figuur 2, dag 1). Vierentwintig uur na de eerste transfectie, zal fibroblasten verliezen hun vorm spindel en aannemen van een meer afgeronde morfologie (Figuur 2, dag 2), die wordt onderhouden door de rest van de herprogrammering. Groene fluorescentie van mWasabi mRNA moet minimaal waarneembare op dag 2 en gestaag toenemen in helderheid als duidelijk zichtbaar door dag 4. De mogelijkheid om te detecteren mWasabi fluorescentie kan afhankelijk van toepassingsgebied gevoeligheid en setup. Celdichtheid zal geleidelijk en consequent gedurende de eerste drie transfections (dagen 1-6), met een schijnbare uitbarsting in verspreiding tussen 7 en 8 dagen. De cellen moeten grotendeels confluente verschijnen per dag 10 (Figuur 2, dag 10). De eerste kolonies van de iPSC kunnen verschijnen zo spoedig dag 11 (Figuur 2, dag 11); koloniën mogelijk echter niet waarneembaar tot zo laat dag 18. In het algemeen door dagen 15 – 18: er zullen grote en duidelijke iPSC kolonies die duidelijk zijn te onderscheiden van de omringende, onvolledig geherprogrammeerde fibroblasten (dag 15,Figuur 2en Figuur 3, dag 17). Immunokleuring voor de pluripotent marker TRA-1-60 kan worden uitgevoerd om te beoordelen herprogrammering efficiëntie (Figuur 3, dag 17, TRA-1-60). In onze ervaring, de meeste lijnen van de fibroblast opbrengst honderden kolonies per geherprogrammeerd goed (Figuur 3, inset B).
Suboptimaal plating dichtheid is de meest voorkomende reden voor het lagere rendement van herprogrammering in ons protocol en wordt vaak geassocieerd met fibroblasten die zieke, verouderend, en/of high-passage. Als plating dichtheid te laag is, zal er grote Acellulair onvruchtbaar patches aan het einde van de herprogrammering (figuur 4C), en iPSC kolonies kunnen niet uitmaken (Figuur 4 d). Geherprogrammeerde cellen moet zeer confluente door dag 14 (Vergelijk figuur 4A en 4B van Figuur 2, dag 14). Op dezelfde manier als cellen ook dichtbevolkte zijn verguld of zich kunnen te snel vermenigvuldigen, is herprogrammering van efficiëntie drastisch verminderd.
Als u wilt behouden homogeniteit van patiënt afkomstige iPSCs, is het belangrijk om uit te breiden cellijnen uit een één kolonie. Aangezien herprogrammering van efficiëntie zeer hoog in ons protocol is, kan naburige iPSC kolonies vormen in de nabijheid van en uitgroeien tot elk een ander (Figuur 3, dagen 15 – 17). Dit maakt het soms moeilijk om een één kolonie voor klonen uitbreiding mechanisch te scheiden. We hebben gemerkt dat het nuttig zijn om de eerste passage een geherprogrammeerde goed en Verdun het over een groter gebied van de cultuur. Een goede doorgang verhouding bestaat uit gelijkmatig splitsen een geherprogrammeerde 6-goed-formaat plaat goed over een hele 6-well-plate.
Na de passage van de verdunning, iPSCs groeien als kolonies en zijn gemakkelijk te onderscheiden van fibroblasten (Figuur 5, dag 18). Aanvankelijk, iPSC kolonies losjes mogen worden verpakt, en afzonderlijke cellen hebben een relatief grote cytoplasmatische gebied. In de loop van de 4-7 dagen, de iPSCs vermenigvuldigen en vormen een karakteristiek strak boordevol kolonie met gedefinieerde randen. Individuele cellen binnen de kolonie hebben een grote nucleaire breuk met prominente nucleoli (Figuur 5, dag 22). Er moet veel koloniën die in elk putje vormen, en alleen degenen met klassieke iPSC morfologie moeten worden gepickt voor expansie.
Figuur 1 : Herprogrammering van menselijke fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Een schematisch protocol voor de herprogrammering van de menselijke fibroblasten wordt gepresenteerd. Fibroblasten zijn eerste gepasseerd bij een lage dichtheid in een putje van een 6-well formaat schotel, gevolgd door zeven transfections uitgevoerd met tussenpozen van 48 uur. Na elke transfectie is medium vervangen 16-20 h. Geherprogrammeerde iPSCs zijn eerste gepasseerd op ongeveer dag 18 en klonen kolonies worden geplukt door dag 26. Meestal kunnen fibroblast afkomstige iPSC lijnen worden ingevroren voor langetermijnopslag overdag 38. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief dagelijks beelden tijdens elke dag van de herprogrammering. Fibroblasten moet ongeveer 40 – 60% heuvels op het moment van overgang naar initiëren herprogrammering (dag 0, cellen zijn verguld in een 10 cm schotel). De eerste transfectie (T1) vindt plaats op dag 1, en de cellen moeten op dit punt zeer schaars verschijnen. De volgende dag (dag 2), moet een meer afgeronde morfologie blijken. Cellen zal blijven toenemen in dichtheid in het gehele protocol met iPSC clusters beginnen te verschijnen zo spoedig dag 11 (omcirkeld in het rood). Door dag 15 zullen de iPSC koloniën grote met discrete grenzen. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kolonie vorming na transfections met herprogrammering gemodificeerde mRNAs en miRNA nabootst. Low-vergroting beelden werden genomen van een vertegenwoordiger herprogrammering op 15-17 dagen. Na de definitieve transfectie, zullen geherprogrammeerde iPSCs duidelijk kolonies met grenzen die zijn gedefinieerd die uitvouwen in grootte en condenseren om te worden duidelijk onderscheiden van onvolledig geherprogrammeerde omliggende fibroblasten vormen. Immunokleuring voor de pluripotent marker TRA-1-60 duidt op de aanwezigheid van iPSCs (inzet A) en kan worden gebruikt voor de berekening van de herprogrammering van de efficiëntie door het tellen van alle kolonies binnen een enkele goed (inzet B, voorbeelden van aftelbare kolonies omcirkeld in het groen). Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Representatief beelden van suboptimale plating dichtheid voor herprogrammering. (A, B) Voorbeelden van fibroblasten, die ook schaars op dag 14 van herprogrammering zijn (te vergelijken met Figuur 2, dag 14). (C) lage vergroting afbeelding op dag 17 met een groot, onvruchtbaar patch te herprogrammeren omcirkeld in het rood. (D) de zelfde put was vastgesteld en gekleurd voor TRA-1-60 te bevestigen algemene armen herprogrammering efficiëntie als gevolg van lage celdichtheid. Schaal bars = 200 µm (A, B), en 1 mm (C, D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Representatief beelden van iPSCs na de eerste passage. Na het voltooien van transfections met gemodificeerde mRNAs en miRNA nabootsers, geherprogrammeerde cellen te herprogrammeren zijn gepasseerd door 17 – 20 dagen. iPSCs hebben een voordeel groei in PVC medium en snel inhalen fibroblasten die onvolledig waren geherprogrammeerd. In eerste instantie zal iPSCs kolonies die kunnen worden weergegeven met slecht gedefinieerde randen losse vormen. Binnen enkele dagen, de cellen snel vermenigvuldigen en neem op de kenmerkende morfologie van opeengepakte cellen met een hoge verhouding van kern naar cytoplasma, strak clustering in kolonies met duidelijke grenzen. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol beschrijft een klinisch relevante, niet-integratie, RNA gebaseerde methode waarmee de herprogrammering van de normale en ziekte-geassocieerde menselijke fibroblast lijnen in iPSCs op een ultra-hoge efficiëntie. Tot op heden, heeft elke regel van de menselijke fibroblast die hebben wij geprobeerd te herprogrammeren met het beschreven protocol een bevredigend aantal kwalitatief hoogwaardige iPSCs voor downstream toepassingen opgeleverd. Resulterende iPSCs kunnen onmiddellijk worden overgedragen en uitgebreid in feeder-vrije cultuuromstandigheden.
Kwaliteit van fibroblasten voor herprogrammering:
Herprogrammering van succes is sterk afhankelijk van de kwaliteit van het starten van de fibroblasten. In het ideale geval moet herprogrammering worden begonnen met de laagste passage fibroblasten beschikbaar om de hoogste efficiëntie te bereiken. Herprogrammering van efficiëntie is het beste met fibroblasten van passage 2-4. Herprogrammering nog werken met hoge-passage (passage 5 – 8), zelfs verouderend fibroblasten, zij het met een lagere efficiëntie. Soms lage-passage fibroblasten zijn niet beschikbaar of patiënt monsters hebben een genetische mutatie die voorkomt gezonde groei dat. In dit geval, kan optimalisatie van eerste plating dichtheid worden verlangd. De herprogrammering van gecompromitteerde fibroblast lijnen wordt meestal geassocieerd met toegenomen celdood tijdens RNA transfections. Dientengevolge, zal de cellen in de herprogrammering goed lijken te zijn schaars door 10-14 dagen te herprogrammeren. Grote Acellulair gebieden zal ook zichtbaar zijn in de put. Als dit het geval is, zal het herprogrammering protocol moeten worden opnieuw gestart met een hogere eerste beginnummer van fibroblasten. Plating 3.000 invoercellen per putje van een 6-well formaat schotel werkt consequent voor de meeste volwassen fibroblast lijnen. Echter kan verhogen de beplating aantal tot 5.000-10.000 (50.000 voor verouderend lijnen) helpen om herprogrammering van ziekte-geassocieerde monsters, zoals werd gemeld in onze vorige publicatie8. Omgekeerd, cellen te vroeg confluentie bereiken kunnen ook tegen herprogrammering. Als cellen ondergaan transfections met herprogrammering RNAs te snel vermenigvuldigen (zoals soms het geval met primaire neonatale fibroblasten), starten met 500 fibroblasten per putje van een 6-well formaat schotel8te herprogrammeren.
Behandeling van de transfectie buffer:
De pH van de buffer van de transfectie (verminderd-serum medium aangepast aan de pH van 8,2) is essentieel aan de verwezenlijking van de efficiëntie van de optimale transfectie vereist voor dit protocol te herprogrammeren. Om deze reden, worden verschillende voorzorgsmaatregelen met betrekking tot de behandeling van de transfectie buffer aanbevolen. We hebben vastgesteld dat zelfs korte blootstelling van de buffer van de Transfectie aan atmosferische lucht is van invloed op de pH van de buffer. Daarom moet de transfectie buffer aliquoted schroefdop verpakkingsgasssen met minimale luchtruim (wij gebruiken hetzij 5 of 15 mL schroefdop conische buizen). Om verdere blootstelling van de lucht, elke transfectie buffer aliquoot voor een maximum van twee transfections te gebruiken. Tot slot, sinds temperatuur effecten pH is het essentieel dat de buffer van de Transfectie aan RT is geëquilibreerd voor montage van de transfectie complexen. Het is aangeraden om niet warm de transfectie buffer tot 37 ° C.
Passaging van iPSCs:
Terwijl veel eerder gepubliceerd protocollen aanbevelen individuele iPSC koloniën aan het einde van de herprogrammering plukken, dit is wellicht moeilijk te bereiken als de efficiëntie van herprogrammering zeer hoog is of als de kolonies cluster samen, zoals vaak het geval in onze Protocol. Als iPSC kolonies dicht bij elkaar zijn, is het daarom raadzaam te passaging eerst de cellen te spreiden geherprogrammeerde iPSCs voordat het handmatig plukken kolonies. Er zijn verschillende voordelen aan het uitvoeren van deze vroege passage stap. De kolonies uitspreiden geeft hen meer ruimte om te groeien, opbrengst veel grotere kolonies voor picken dan anders in de oorspronkelijke bron zou kunnen worden bereikt. Dit verbetert sterk het slagingspercentage bij het vaststellen van een iPSC lijn van een geplukt kloon. Wij vinden ook dat de extra cultuur keer met fibroblasten, zij het op een verdunde ratio weergegeven de gemiddelde kwaliteit van geplukt iPSC kolonies te verbeteren. De onvolledig geherprogrammeerde fibroblasten voorschrijven ondersteunende paracrine factoren, die blijven helpen vaststellen van de iPSCs en de directe overgang in feeder-vrije cel cultuuromstandigheden. Fibroblasten hebben toevalligerwijs een nadeel van de selectieve groei in vergelijking met iPSCs wanneer in mTeSR1 gekweekt. Daarom is de besmettende fibroblast-celpopulatie snel verdund tot te verwaarlozen hoeveelheden binnen 3-4 gangen.
ROCK-remmers zoals Y-27632 worden vaak gebruikt voor routinematige cultuur van menselijke iPSCs. We hebben gevonden dat frequente en/of uitgebreide cultuur van sommige iPSC lijnen met Y-27632 schadelijke gevolgen voor algehele kwaliteit hebben kan. Wanneer u een klomp passaging methode, is zoals met EDTA, Y-27632 niet nodig om de levensvatbaarheid van de iPSC na de splitsing. Wij hebben volledig geëlimineerd aanvulling media met Y-27632 voor alle iPSC isolatie, uitbreiding of routine cultuur.
Protocol beperkingen:
Een beperking aan de beschreven RNA gebaseerde herprogrammering benadering is de initiële kosten en complexiteit die is gekoppeld aan de voorbereiding van de herprogrammering reagentia. Hoewel voorbereidende procedures voor het genereren van mRNA reagentia zijn alle routine en zijn eerder beschreven (PCR, in vitro transcriptie DNase behandeling, aftopping, defosforylerings, zuivering), cumulatief is de productie van mRNA reagentia is een relatief lange en niet-triviale proces. De andere grote uitdaging bij dit protocol is de noodzaak om transfect cellen elke 48 h, verhogen van de intensiteit van de arbeid van de herprogrammering protocol. Deze overwegingen kunnen worden onbetaalbaar desgewenst herprogrammering van slechts een paar voorbeelden van de patiënt is. Echter, als de primaire overweging het genereren van klinisch relevante iPSCs of zeer hoge herprogrammering efficiëntie is, de beschreven RNA gebaseerde herprogrammering benadering is ideaal.
Kortom, de beschreven hoogrenderende RNA gebaseerde herprogrammering methode staat of valt met geoptimaliseerde transfectie efficiëntie van de somatische celtype zoals beschreven in onze eerdere publicatie8worden geherprogrammeerd. Het RNA transfectie protocol gepresenteerd in deze studie is sterk afgestemd voor menselijke primaire fibroblasten, maar mogelijk kan worden afgestemd op andere celtypes herprogrammering efficiëntie van verschillende somatische cellen te verbeteren.
Disclosures
I. k. en G.B. zijn mede-uitvinders op een octrooiaanvraag getiteld "Methoden en composities voor herprogrammering cellen", PCT Application No. PCT/US2016/063258.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de financiering van de steun van de National Institutes of Health (T32AR007411-33) en de Universiteit van Colorado huid ziekten Core onderzoekscentrum (P30AR057212). Wij danken ook de Epidermolysis Bullosa (EB) onderzoekspartnerschap, EB Medical Research Foundation, Cure EB liefdadigheid, Dystrofe Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) International, Koning Boudewijnstichting Vlinderkindje Fonds en poorten Grenzen Fonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid templates for PCR | |||
| pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
| pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
| pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
| pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
| pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
| pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
| pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
| Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
| Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
| (ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
| Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
| 5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| DNase I | NEB | M0303S | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
| Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
| Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
| RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
| Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
| Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
| Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
| Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
| Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
| Fibroblast culture and reprogramming | |||
| 0.1% Gelatin in H2O | StemCell technologies | #07903 | |
| Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
| 6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
| FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
| GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
| Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
| MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
| Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
| Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
| Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
| iPSC culture | |||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
| EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
| Antibodies and Detection | |||
| Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
| Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
| Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
| Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
| VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Special Equipment | |||
| Description | Notes | ||
| Biological safety cabinet | |||
| Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37 °C. | ||
| Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37 °C. Use for the reprogramming procedure. | ||
| pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
| Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science. 302 (5644), 415-419 (2003).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency. Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).
- Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).
- Kogut, I., et al. High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Hirai, H., et al. Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD. Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Avci-Adali, M., et al. In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells. Journal of Visualized Experiments. , e51943 (2014).
