Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Encellede RNA sekvensering av Fluorescently merket musen Neurons med manuell sortering og dobbel In Vitro transkripsjon absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq)

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/58690
Automatic Translation
1, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory

Summary

Denne protokollen beskriver manuell sortering fremgangsmåten for å isolere enkelt fluorescently merket neurons etterfulgt av i vitro transkripsjon-baserte mRNA forsterkning for høy-dybde encellede RNA sekvensering.

Abstract

Encellede RNA sekvensering (RNA-seq) er nå et vidt gjennomført verktøy for assaying genuttrykk. Kommersielt tilgjengelige encellede RNA-sekvensering plattformer behandle alle innsettingsceller ukritisk. Fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) brukes noen ganger oppstrøms isolere en spesielt merket befolkning av interesse. En begrensning av FACS er behovet for høyt antall innsettingsceller med betydelig merket fraksjoner, som er upraktisk for innsamling og profilering sjeldne eller tynt merket Nevron bestander fra musen hjernen. Her beskriver vi en metode for manuelt å samle spredte fluorescently merket enkelt neurons fra ferske dissosiert musen hjernevev. Denne prosessen tillater fanger single-merket neurons med høy renhetsgrad og påfølgende integrering med en i vitro transkripsjon-baserte forsterkning protokoll som bevarer endogene transkripsjon prosenter. Vi beskriver en dobbel lineær forsterkning metode som bruker unike molekyl identifikatorer (UMIs) til å generere individuelle mRNA teller. To runder av forsterkning gir en høy grad av genet per enkelt celle.

Introduction

Encellede RNA sekvensering (RNA-seq) har forvandlet transcriptomic studier. Mens store encellede RNAseq kan utføres ved hjelp av en rekke teknikker, som dråper1,2, microfluidics3, nanogrids4og microwells5, kan ikke de fleste metoder sortere definerte celletyper som uttrykker genetisk kodet fluorophores. For å isolere et merke celle befolkningen, brukes fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) ofte til å sortere merkede celler i én celle modus. Men FACS har noen begrensninger og krever nitid eksempel behandlingstrinnene. Først, et stort antall innsettingsceller er vanligvis nødvendig (ofte flere millioner celler per mL), med en betydelig andel (> 15-20%) som inneholder merket befolkningen. Andre kan cellen preparater kreve flere runder med tetthet gradert sentrifugering fremgangsmåte for å fjerne glial brøkdel, avfall og celle klumper som kan ellers tette munnstykket eller flow cellen. Tredje bruker FACS vanligvis flekker og destaining trinn for live/døde flekker (f.eks 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iodide (PI) og Cytotracker fargestoffer), som tar opp ekstra tid. Fjerde, som en tommelfingerregel for to farger sortering (som DAPI og grønn/rød fluorescerende protein (GFP/RFP)), vanligvis to eksempler og en kontroll er nødvendig, krever en umerket prøve behandles i tillegg til ønsket musen belastningen. Femte utføres filtrering ofte flere ganger før og under eksempel sortering for å proaktivt forhindre tette utvalg linjer i en FACS maskin. Sjette må tid være tildelt i vanligste FACS oppsett å initialisere og stabilisere væske strømmen og utføre slippverktøy kalibrering. Syvende, kontroll prøver vanligvis kjøres i rekkefølge før samlingen faktisk prøve å konfigurere kompensasjon matriser, doublet avvisning, gates, etc. brukere enten utføre trinn seks og sju selv forhånd eller krever det hjelp av en tekniker parallelt. Til slutt, innlegget-FACS, det er ofte skritt for å sikre at bare merket én celler, finnes i hver brønn; for eksempel ved å sjekke prøver i et høyt innhold screening oppsett som en rask plate imager.

Å omgå innstillinger og tilrettelegge en relativt rask, målrettet sekvensering av en liten populasjon av enkelt fluorescently merket neurons, beskriver vi en manuell sortering prosedyren etterfulgt av to runder med en svært følsom i vitro forsterkning protokollen, kalt dobbel in vitro transkripsjon med absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq). Den RNA forsterkning og cDNA bibliotek generasjonen er tilpasset fra Eberwine et al. 6 og Hashimshony et al. 7, med enkelte modifikasjoner for mus interneurons som har mindre mobilnettet volum; Videre har vi også funnet at det er like nyttige for eksitatoriske pyramidale nevroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer inkludert dyr fag er godkjent av IACUC på Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manuell sortering av Fluorescently merket musen Neurons

  1. Trekke glass microcapillaries (se Tabell of Materials) til 10-15 µm Avslutt diameter med en kapillær avtrekker med følgende innstillinger: varme: 508, trekk: Tom, vel: Tom, tid: Tom.
  2. Fest 120-150 cm fleksibel silikon rør (~0.8 mm i diameter) til et 0,2 µm polyvinylidene difluoride (PVDF) membran sprøyte filter og en toveis rør ventil ved hjelp av egnet rør kontakter.
  3. Forberede 500 mL kjølt (4 ° C) kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, tabell 1), og oxygenate av boblende 5% karbondioksid balansert oksygen gjennom en airstone i 15 minutter eller til løsningen fjernes helt.
  4. Forberede 100 mL ACSF med en cocktail av aktivitet blokkere i et 150 mL beaker (tabell 1).
  5. Forberede 100 mL ACSF med 1 mg/mL Streptococcus brøkdel IV protease i et 150 mL beaker (tabell 1).
  6. Forberede 100 mL ACSF med 1% fosterets bovin serum (FBS) løsning i et 150 mL beaker og oxygenate med 5% karbondioksid balansert oksygen gjennom en airstone.
  7. Dissekere hjernen fra euthanized musen ved å åpne kraniet med en liten saks og utdrager frisk hjernen med fine tang uten å skade cortex.
    Merk: Mus noen belastning, alder og kjønn kan brukes som ønsket. Ikke fryse hjernen eller utføre manuelle sortering på mus injisert med virus eller andre farlige/smittestoffer.
  8. Vær hjernen kjølt og oksygenrikt ACSF, forlater en airstone knyttet til 5% karbondioksid balanse oksygen under hele varigheten av inndelingen.
  9. Plasser hjernen på vibratome chuck og kutte koronale eller sagittal seksjoner 300 µm tykkelse. Samle så mange inndelinger måtte få minimum ~ 10-50 merket cellene til flere hundre celler. Sett skiver på en bomull meshed skive, plassert inne i et beaker slik de er badet i oksygenrikt ACSF.
  10. Flytte ferske skiver til et beger med ACSF aktivitet blokkere og blokk for 15-20 min ved romtemperatur. Holde boblende oksygen ved hjelp av airstone.
  11. Flytte sektorene til et beger med ACSF protease løsningen å utføre mild fordøyelsen ved romtemperatur: 20-30 minutter for P4-14 dyr eller opptil 45-60 minutter for P28-56 dyr. Holde boblende oksygen.
  12. Bleke ACSF med protease ved å flytte skiver tilbake til begeret med ACSF aktivitet blokkere løsning for 5-10 minutter ved romtemperatur. Holde boblende oksygen.
  13. Flytte enkelte deler til en 100 mm Petriskål inneholder ACSF med 1% FBS ved romtemperatur. Under et fluorescerende disseksjon omfang, microdissect områder og lag rundt har minst 10-50 celler (opptil et par hundre). Utføre microdissection med et par fine tang eller ved 22 – 28 G injeksjon nåler på tre innehavere (spyd).
  14. Bruke en Pasteur pipette, flytte microdissected brikkene slik 2 mL microfuge som inneholder ~0.8 mL 1% FBS i ACSF løsning.
  15. Triturate dissekert vevet i microfuge røret ved romtemperatur. Gjøre tre langstilkede Pasteur Pipetter med minkende Avslutt diameter ved å rulle dem over åpen flamme. Utføre ~ 10 slag med hver pipette, starter med den største og slutter med den minste.
  16. Dispensere dissosiert cellene i en 100 mm Petriskål inneholder oksygenrikt ACSF (Petriskål kan være tynt belagt med 5 mm 1% agar eller klart silikon ved 1:10 forhold, hvis ønskelig). Holde ved romtemperatur.
  17. Vent ~ 5-7 min for cellene å gradvis bosette, og observere GFP/RFP signalet under disseksjon mikroskop.
    Merk: Enkeltceller, avfall og små klumper vises i lyse-feltet (BF).
  18. Velg 10-15 GFP/RFP cellene samtidig med en kapillær pipette (fra trinn 1.1) knyttet til fleksibel silikon rør (0,4-0,8 mm indre diameter) og cellene i en 100 mm Petriskål inneholder ferske oksygenrikt ACSF.
  19. Ved å blokkere slutten av slangen ventilen med tungen, plassere av kapillær nær cellen rundt. Fange celler ved hjelp av kapillær handling på lindre blokken, og raskt blokkere igjen for å forhindre overflødig væske inn i pipette. Dispensere cellene på en 100 mm bensin fat med fersk oksygenrikt ACSF ved å forsiktig blåse, mens observere kapillær spissen under fluorescens optikk disseksjon mikroskopet. Mål å samle ~ 100-150 celler samlet.
  20. Gjenta trinn 1,19 én eller to ganger mer (avhengig av rusk) og overføre totalt ~ 50-75 cellene til en ny 100 mm Petriskål, sørge for at forurensninger som rusk er minimal i lyse-feltet differensial forstyrrelser kontrast (DIC) optikk.
  21. Til slutt bruker en frisk microcapillary pipette hver gang, Velg en enkelt celle i ikke mer enn 0,5 µL volum og utvise den inn i et enkelt 0,2 mL microfuge rør (eller en stripe av åtte 0,2 mL microfuge rør) som inneholder 1 µL eksempel samling bufferen med primer N10B1-N10B96 (tabell 2). Bryte pipette spissen i microfuge røret å sikre at cellen forblir i samlingen bufferen. Kast pipetter.
  22. Fryse cellene ved å sette rør på tørris og lagre dem langsiktig i-80 ° C fryser før de er klare til å bli behandlet for RNA forsterkning.

2. første runde RNA forsterkning

Merk: Følgende er for enkelt stripen av åtte 0,2 mL microfuge rør. Skalere reaksjonene etter behov.

  1. Syntetisere den første stranden av cDNA (første runde).
    1. Varme strimler fra trinn 1,22 på 70 grader i 5 min etterfulgt av 4 grader i 5 min; Gjenta to ganger.
    2. Montere på isen revers transkriptase (RT) master mix/første-strand syntese master mix bruker følgende ingredienser (se Tabell for materiale): 10 x første-strand buffer (2 µL), dNTP mix (4 µL), RNase hemmer (1 µL) og enzym (1 µL).
    3. Kort sentrifuge stripen på en tabletop sentrifuge å samle alt på bunnen. Hold på is.
    4. Legge til 1 µL RT master mix/første-strand syntese master Mix ovenfor rør (totalt volum 1 µL eksempel bufferen fra cellen samling + 1 µL RT = 2 µL/rør). Bland godt av pipettering. Kort spin å samle hele innholdet på bunnen og oppbevare den på is.
    5. Ruge over rør/s ved 42 ° C i 2t i luften ovn. Satte rørene på is umiddelbart å avslutte reaksjonen og videre til andre-strand syntese trinn.
  2. Syntetisere den andre stranden av cDNA (første runde).
    1. Gjør andre strand master mix (80 µL) på isen i rekkefølgen nedenfor i en 1,5 mL tube: nuclease-fritt vann (63 µL), 10 x andre strand buffer (10 µL), dNTP mix (4 µL), DNA utvalg (2 µL) og RNaseH (1 µL). Bland ingrediensene godt av vortexing og spin å samle på bunnen og holde på isen.
    2. Starte den termiske cycler, kjøre følgende program avkjøles før enheten, starte trinn 2.2.3 (lokk varme = off; 16 ° C 2 h, 4 ° C hold), og pause på 16 ° C.
    3. Legge til en 80 µL/strip (eller 10 µL/tube) andre strand master Mix til hver tube stripe og holde på is. Overføre stripen til den termiske cycler og gjenoppta 16 ° C trinnet startet ovenfor. Inkuber stripen for 2t på 16 ° C.
    4. Etter det andre-strand syntese trinnet, plassere rør på is å gå videre til neste cDNA rensing trinn.
  3. Rense dobbel strandet cDNA (første runde).
    Merk: Alle centrifugations utføres ~ 8000 x g ved romtemperatur. Aldri overskride 16.000 x g for å unngå skade filterelementet.
    1. Starte oppvarming 100 µL nuclease-gratis vann til 50-55 ° C for senere bruk i en tørr oppvarming blokk. Aldri overskride 58 ° C for å hindre delvis denaturering av cDNA.
    2. Legge til 250 µL cDNA binding bufferen en 1,5 mL tube. Se etter precipitates i bufferen, og varme buffer løsning på 37 ° C i 10 min å oppløse re precipitates.
    3. Overføre cDNAs fra en enkelt 8-tube stripe til den cDNA innbinding bufferen. Kombinere cellene i dette trinnet for ytterligere nedstrøms prosesser (8 celler i 1 rør). Mix grundig av pipettering 2 - 3 ganger og flicking 3 - 4 ganger. Spin å samle innholdet nederst.
    4. Sett filterelementet cDNA i vask rør (fra en i vitro transkripsjon (PES) kit) fast. Legge til ovennevnte blandingen til midten av filteret. Sentrifuge 8000 x g ~ 1 min eller til det er gjennom filteret. Forkaste gjennomflytsenhet og erstatte vask røret.
    5. Legge til 500 µL av vaskebuffer fra IVT kit i kolonnen.
      Merk: Kontroller at etanol er lagt til av vaskebuffer tidligere.
    6. Sentrifuge 8000 x g ~ 1 min eller til det er gjennom filteret. Kast gjennomflytsenhet og sentrifuger igjen på 8000 x g i ~ 1 min tømme kassetten.
    7. Overføre cDNA filteret til en cDNA elueringsrør (1,5 mL nuclease gratis rør). Bruke 8,5 µL av forvarmes nuclease-fritt vann til midten av filteret. Vent i 2 minutter og sentrifuge 8000 x g i ~1.5 min.
    8. Elute igjen med 8,5 µL forvarmes nuclease uten vann og Fortsett umiddelbart til den første runde IVT.
      Merk: Double-strandet cDNA gjenopprettingsvolumet blir ~ 16 µL.
  4. Utføre en i vitro transkripsjon (PES) reaksjon for forsterket RNA (aRNA) produksjonen fra cDNA (første runde).
    1. Angi hybridisering luft ovnen til 37 ° C.
    2. Forberede master mix IVT på isen i følgende rekkefølge: 16 µL av eluted double-strandet cDNA fra trinn 2.3.8, legge til 4 µL av T7 ATP løsning (75 mM); 4 µL T7 CTP løsning (75 mM); 4 µL T7 GTP løsning (75 mM); 4 µL T7 UTP løsning (75 mM); 4 µL T7 10 x reaksjon bufferen; og 4 µL av T7 enzym. Bland godt, spinn, og holde på is.
    3. Legge til 24 µL av IVT master mix hver rør som inneholder 16 µL av cDNA. Bland innholdet av pipettering forsiktig og grundig. Inkuber røret ved 37 ° C i 14 h.
      Merk: Inkubasjonstiden for < 12t alvorlig påvirker avkastningen.
    4. Legg 60 µL av ikke-diethyl pyrocarbonate (ikke-DEPC) behandlet RNase-fritt vann for å øke volumet til 100 µL og stoppe IVT reaksjonen.
  5. Rense aRNA.
    Merk: Alle centrifugations utføres ~ 8000 x g ved romtemperatur. Aldri overskride 16.000 x g for å unngå skade filterelementet.
    1. Starte oppvarming ~ 200 µL av nuclease-fritt vann til 50-55 ° C for senere bruk i en tørr oppvarming blokk eller PCR maskin. Aldri overskride 58 ° C for å hindre delvis denaturering av aRNA.
    2. Overføre aRNA til en 1,5 mL nuclease gratis rør. Legge til 350 µL aRNA bindende bufferen hver aRNA prøve. Legge til 250 µL av 100% etanol hver rør og bland ved 3 ganger av pipettering (gjør ikke vortex å blande og spinn).
    3. Overføre mix umiddelbart til kolonnen RNA rensing ved å legge den forsiktig til midten av filterelementet. Sentrifuge 8000 x g i ~ 1 min eller til blandingen har gått helt gjennom filteret. Forkaste gjennomflytsenhet og gjenbruke innsamling røret
      Merk: RNA starter fremskynde ved tillegg av etanol.
    4. Legge til 650 µL av vaskebuffer hver filterelementet. Sentrifuger i ~ 1 min på 8000 x g eller til hele bufferen har passert. Forkaste gjennomflytsenhet og spinne filtrene for en ekstra ~ 1 min å fjerne spor av vaskebuffer.
    5. Overføre filteret til en frisk aRNA samling rør. Legg 100 µL av forvarmet (50-55 ° C) nuclease-fritt vann til midten av filteret. Vent i 2 minutter, deretter virvel i ~1.5 min på 8000 x g eller før det har gått inn i samling røret.

3. andre runde forsterkning

  1. Syntetisere den første strand cDNA (andre runde).
    1. Overføre aRNA fra trinn 2.5.5 slik 200 µL microfuge og vakuum konsentrere 100 µL elutant 10 µL. bruker ingen varme, kjøre den vakuum munnstykke for 65 min. sammenligne med 10 µL av vann i en 200 µL tube å anslå redusert volumet.
    2. Forvarm ovnen hybridisering luft til 42 ° C.
    3. Legge til 2 µL av tilfeldige praktiske primere fra IVT kit aRNA, vortex kort, og spinne for å samle innholdet.
    4. Inkuber microfuge røret ved 70 ° C i 10 minutter i en termisk cycler, og plasser det på is.
    5. Klargjør følgende RT master blandingen: 2 µL av 10 x første strand syntese buffer, 4 µL dNTP mix, 1 µL av RNase hemmer og 1 µL av ArrayScript enzym. Bland godt i en 200 µL microfuge tube av forsiktig vortexing, store å samle innholdet og plassere på is.
    6. Legge 8 µL RT Master mix (første strand) til hver microfuge tube. Plass rør i en 42 ° C luft inkubator for 2T.
    7. Legge til 1 µL av RNaseH over reaksjonen. Bland godt av pipettering 2 - 3 ganger og flicking 3 - 4 ganger, og spinn samle innholdet. Ruge på 37 ° C i 30 min på en PCR-maskin. Etter inkubasjon videre til andre-strand syntese trinn umiddelbart.
  2. Syntetisere den andre stranden av cDNA (andre runde).
    1. Legge 3 µL av T7-RA5 primer (på 25 ng/µL arbeider fortynning, tabell 2) og 2 µL RNase-gratis vann til hver cDNA prøve. Bland godt og spin for å samle innholdet.
    2. Inkuber ved 70 ° C i 10 minutter i en termisk cycler. Plass reaksjonen på isen.
    3. Forberede RT master mix (andre strand) på is: 58 µL nuclease uten vann, 10 µL av 10 x andre strand buffer, 4 µL dNTP mix og 2 µL av DNA polymerase. Bland godt vortexing og spinn samle innholdet. Hold på is.
    4. Legge til 74 µL av ovennevnte miksen hver rør fra trinn 3.2.2. Bland godt av pipettering 2-3 ganger og flicking 3 - 4 ganger, deretter spinne for å samle innholdet. Holde på is og hold.
    5. Pre-avkjøle den termiske cycler 16 ° c deaktiverer lokket varmen. Plassere rør i den termiske cycler 2 h på 16 ° C.
    6. Etter det andre-strand syntese trinnet, plassere rør på is til videre til cDNA rensing trinn, eller fryse på 20 ° C.
      Merk: cDNA rensing anbefales før frysing.
  3. Utføre cDNA rensing (andre runde).
    Merk: Alle centrifugations utføres ~ 8000 x g ved romtemperatur. Aldri overskride 16.000 x g for å unngå skade filterelementet.
    1. Starte oppvarming nuclease-fritt vann til 50-55 ° C for senere bruk i en tørr oppvarming blokk. Aldri overskride 58 ° C for å hindre delvis denaturering av cDNA.
    2. Overføring av cDNA til en 1,5 mL nuclease gratis rør. Legge til 250 µL cDNA binding bufferen hver rør. Se etter precipitates i bufferen og varme buffer løsning på 37 ° C i 10 min til å oppløse. Mix grundig av pipettering 2-3 ganger og flicking 3 - 4 ganger. Spin å samle innholdet.
    3. Godt sett filterelementet cDNA i vask rørene. Legge til ovennevnte blandingen til midten av filteret. Sentrifuge 8000 x g ~ 1 min eller til det er gjennom filteret. Forkaste gjennomflytsenhet og erstatte vask røret.
    4. Legg til 500 µL av vaskebuffer. Kontroller at etanol er lagt til av vaskebuffer tidligere. Sentrifuge 8000 x g ~ 1 min eller til det er gjennom filteret.
    5. Forkaste gjennomflytsenhet og sentrifuge igjen 8000 x g i ~ 1 min tømme kassetten. Overføre cDNA filteret til en cDNA elueringsrør.
    6. Bruke 8,5 µL av forvarmes nuclease-fritt vann til midten av filteret. Vent i 2 minutter og sentrifuge 8000 x g i ~1.5 min. Elute igjen med ekstra 8,5 µL forvarmes nuclease uten vann.
      Merk: Double-strandet cDNA gjenopprettingsvolumet blir ~ 16 µL.
    7. Umiddelbart videre til andre runde IVT eller fryse cDNA på 20 ° C over natten.
  4. Utføre en ny runde av aRNA produksjonen av IVT.
    1. Angi hybridisering luft ovnen 37 ° C (36 ° C setpoint).
    2. Forberede master mix IVT på isen i følgende rekkefølge: 16 µL av eluted double-strandet cDNA fra trinn 3.3.7, legge til 4 µL av T7 ATP løsning (75 mM); 4 µL T7 CTP løsning (75 mM); 4 µL T7 GTP løsning (75 mM); 4 µL T7 UTP løsning (75 mM); 4 µL T7 10 x reaksjon bufferen; og 4 µL av T7 enzym. Bland godt, spin kort for å samle innholdet og holde på is.
    3. Legge til 24 µL av IVT master mix hver rør som inneholder 16 µL av cDNA. Bland innholdet av pipettering forsiktig og grundig. Inkuber rør ved 37 ° C i 14 h.
      Merk: Inkubasjonstiden for < 12t alvorlig påvirker avkastningen.
    4. Legg 60 µL av ikke-DEPC behandlet RNase-fritt vann for å øke volumet til 100 µL og stoppe IVT reaksjonen.
  5. Utføre aRNA rensing (andre runde).
    Merk: Alle centrifugations utføres ~ 8000 x g ved romtemperatur. Aldri overskride 16.000 x g for å unngå skade filterelementet.
    1. Starte oppvarming ~ 200 µL av nuclease-fritt vann til 50-55 ° C for senere bruk i en tørr oppvarming blokk eller PCR maskin. Aldri overskride 58 ° C for å hindre delvis denaturering av aRNA.
    2. Overføre aRNA til en 1,5 mL nuclease gratis rør. Legge til 350 µL aRNA bindende bufferen hver aRNA prøve. Legge til 250 µL av ACS klasse 100% etanol hver rør og bland 3 ganger av pipettering (gjør ikke vortex å blande og spinn).
      Merk: RNA starter fremskynde ved tillegg av etanol.
    3. Overføre mix umiddelbart til kolonnen RNA rensing ved å legge den forsiktig til midten av filterelementet. Sentrifuge 8000 x g i ~ 1 min eller til blandingen har gått helt gjennom filteret. Forkaste gjennomflytsenhet og gjenbruke innsamling røret.
    4. Legge til 650 µL av vaskebuffer hver filterelementet. Sentrifuger i ~ 1 min på 8000 x g eller til hele bufferen har passert. Forkaste gjennomflytsenhet og spinne filtrene for en ekstra ~ 1 min å fjerne spor av vaskebuffer.
    5. Overføre filtrene til en frisk aRNA samling rør. Legg 100 µL av forvarmet nuclease-fritt vann til midten av filteret. Vent i 2 minutter, deretter virvel i ~1.5 min på 8000 x g eller før det har gått.
    6. Aliquot 2 µL i et rør for spektrofotometer (på 260 nm wavelength) og bioanalyzer spre analyser etter aRNA avkastning og kvalitet.
      Merk: Konsentrasjon må være minst 5 ng/µL; ellers avvise prøven. Prøven kan lagres for ~ 1 år-80 ° C. Unngå fryse-tining prøvene.
    7. Se eksemplene bruker en bioanalyzer for å visualisere riktig spre aRNA produkter etter produsentens protokoll (figur 2).

4. forsterket RNA fragmentering og rengjøring

  1. Bland følgende på isen (totalt volum 40 µL, kombinere 2 rør av eksempel strekkoder for aRNA ikke-overlappende): 36 µL aRNA (200 ng totalt) og 4 µL av RNA fragmentering buffer. Inkuber blandingen ved 94 ° C i 90 s.
  2. Umiddelbart flytte blandingen is og legge 4 µL av RNA fragmentering stopp buffer. Juster volumet til 100 µL ved å legge til 56 µL nuclease uten vann.
  3. Legge til 350 µL av RLT buffer av RNA rensing kit (se Tabell for materiale) og bland godt pipettering. Legge til 250 µL av EtOH, bland godt pipettering og overføre prøven til kolonnen RNA rensing spinn. Spinn for 15 s 8000 x g.
  4. Overføre kolonnen til ny samling rør og legge 500 µL RPE bufferen. Spinn for 15 s på 8000 x g. forkaste gjennomflytsenhet. Legg til 500 µL av 80% EtOH og spinn for 2 min 8000 x g.
  5. Overføre kolonnen til en ny samling rør, åpne lokket på kolonne- og spinn for 5 min i full fart.
  6. Overføre kolonnen til en ny samling rør, og elute med 16 µL nuclease uten vann, spinning på full fart for 1 min.

5. biblioteket forberedelse

Merk: IVTs kan samordnes på dette punktet, hvis det finnes ingen overlapping i strekkoder brukes. Fosfatase behandling tid er 40 min. Poly-nukleotid kinase behandling tid 1t.

  1. 16 µL av fragmentert aRNA i et 0,7 mL PCR rør, legge til 4 µL av følgende mix: 2 µL av 10 x fosfatase buffer, 1 µL av Antarktis fosfatase og 1 µL av rekombinant ribonuclease hemmer (f.eksRNaseOUT). Inkuber i en termisk cycler med følgende protokollen: 37 ° C i 30 min, 65 ° C i 5 minutter, og hold på 4 ° C.
  2. 0,7 mL PCR røret fra trinn 5.1, legge til 30 µL av følgende mix: 17 µL nuclease uten vann, 5 µL av 10 x fosfatase buffer, 5 µL ATP (10 mM), 1 µL av rekombinant ribonuclease hemmer og 2 µL av PNK. Inkuber i den termiske cycler på 37 ° C for 60 min, så hold på 4 ° C.
  3. Utføre en kolonne opprydding fosfatase og PNK-behandlet aRNA.
    1. Juster volumet til 100 µL ved å legge til 50 µL nuclease uten vann. Legge til 350 µL RLT bufferen og bland godt. Legge til 250 µL av EtOH, bland godt pipettering og overføre prøven til kolonnen RNA rensing spinn.
    2. Spinn for 15 s på 8000 x g. overføre kolonnen til en ny samling rør og legge 500 µL RPE bufferen.
    3. Spinn for 15 s på 8000 x g. forkaste gjennomflytsenhet og legge til 500 µL av 80% EtOH.
    4. Spinn i 2 minutter på 8000 x g. overføring kolonnen slik ny samling åpner lokket på kolonne- og spinn for 5 min i full fart.
    5. Overføre kolonnen til en ny samling rør og elute med 14 µL nuclease uten vann, spinning på full fart for 1 min gjenopprette en ~ 10 µL volumet av materiale. Kast kolonnen. Reduser volumet til 5 µL bruker en vakuum konsentrator for ~ 10 min.
  4. Ligate 3' kortet bruker en kommersiell kit (se Tabell for materiale).
    1. Fortynne 3 kortet (RA3) fra TrueSeq utstyr 3 folder med nuclease-fritt vann og lagre dele på 20 ° C.
    2. 5 µL fosfatase og PNK-behandlet RNA, legge 1 µL av utvannet 3' adapter. Ruge på 70 ° C i 2 minutter, og deretter umiddelbart sett røret på is å hindre sekundær formasjon.
    3. Legge til 4 µL av følgende mix: 2 µL av 5 x HM ligation buffer (HML), 1 µL av RNase hemmer og 1 µL av T4 RNA ligase 2 (avkortet). Inkuber røret på forvarmet termisk cycler på 28 ° C i 1 time (Uoppvarmet eller med lokk åpent).
    4. Med reaksjon røret på termisk cycler, legge 1 µL av stopp løsning (STP) og forsiktig Pipetter hele volumet opp og ned 6-8 ganger til bland godt. Fortsette å ruge reaksjon røret på den termiske cycler på 28 ° C i 15 min, og sett røret på is.
    5. Legge 3 µL nuclease-gratis vann for å få et totalt volum på 12 µL. Bruk 6 µL og oppbevare det resterende 6 µL på-80 ° C.
  5. Utføre en omvendt transkripsjon reaksjon.
    1. Kombinere følgende i et PCR-rør: 6 µL av kort-samskrevet RNA og 1 µL av RNA RT primer (RTP). Inkuber røret på 70 ° C i 2 minutter, deretter umiddelbart sett røret på is.
    2. Legge til 5,5 µL av følgende mix: 2 µL av 5 x første strand buffer, 0,5 µL 12.5 mM dNTP mix, 1 µL av 100 mM DTT, 1 µL av RNase hemmer og 1 µL av revers transkriptase. Inkuber røret i forvarmet termisk cycler ved 50 ° C i 1 time og sett røret på is (prøver kan holdes på 20 ° C).
  6. Utføre PCR forsterkning med 11-15 sykluser å berike 5', 3-primer samskrevet produktet.
    1. Hver omvendt transkripsjon reaksjon, legge til 35,5 µL av følgende mix: 8,5 µL svært rent vann, 25 µL PCR mix (PML) og 2 µL av RNA PCR primer (RP1). Hver reaksjon, legge 2 µL av en entydig indeksert RNA PCR primer (RPIX, X = 1 til 24).
    2. Forsterke røret i termisk cycler bruker PCR sykling følgende: 98 ° C for 30 s; 12-15 sykluser av 98 ° C for 10 s; 60 ° C på 30 s; 72 ° C for 30 s; 72 ° C i 10 min; hold på 4 ° C.

6. PCR produktet opprydding og størrelse

  1. Prewarm AmpureXP magnetiske perler ved romtemperatur. Vortex perler før de er godt spredt, deretter legge 50 µL til 50 µL PCR reaksjonen (1:1 PCR produkt: perler). Bland innholdet til ti ganger bland godt.
  2. Inkuber ved romtemperatur i 15 min. sted på en magnetisk stand for minst 5 min, til væsken vises klart. Fjerne og slette 95 µL nedbryting av.
  3. Legge til 200 µL av nylagde 80% EtOH. Inkuber for minst 30 s, deretter fjerne og Forkast nedbryting uten å forstyrre perler. Gjenta dette igjen.
  4. Air-Dry perler i 15 minutter eller til helt tørt. Resuspend med 32,5 µL rørets bufferen. Pipetter hele volumet opp og ned ti ganger bland godt.
  5. Inkuber ved romtemperatur for 2 min. sted på en magnetisk stå i 5 minutter, til væsken vises klart. Overføring 30 µL nedbryting av til en ny tube. Legge til 20 µL nuclease-gratis vann for å få en 50 µL totalt volum.
  6. Utfør størrelse utvalg av PCR-produkter med solid fase reversibel immobilisering (SPRI) magnetiske perler.
    1. Legge til 0,7 x volum (35 µL) av SPRI perler til røret utarbeidet i trinn 6.5 og bland godt av pipettering. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Sett røret på en magnetisk stå og vente i 5 minutter eller til perlene separat. Fjerne nedbryting forsiktig uten å forstyrre perler.
    3. Legge til 200 µL av nylagde 85% EtOH. Vent 30 s og fjern EtOH. Air-Dry perler i 10 min.
  7. Legge til 20 µL nuclease uten vann. Sett røret på magnet, vent 5 min og Pipetter av likvide delen uten forstyrrende eller berøre perler. Lagre DNA på 20 ° C.

7. fastsettelse av biblioteket mengden og kvaliteten

  1. Sjekk konsentrasjonen av DNA med et spektrofotometer på 260 nm bølgelengde (forventet konsentrasjon er minst ~ 5-10 ng/µL).
  2. Kjøre 1 µL av hvert utvalg på en bioanalyzer med en høy følsomhet DNA chip for å undersøke størrelsesDistribusjon (forventet peak er på 300-400 bp (se fig. 3)).

8. eksempel innlevering

  1. Kombinere ikke-overlappende sekvensering PCR strekkoder (1:1 ratio). For eksempel kombinere PCR produkter av prøver med RPI-1 og RPI-2, RPI-3 og RPI-4 sammen i samme nanogram beløp hver, ifølge RNA sekvensering core's totale input eksempel beløpet kravet anbefalinger.
  2. Etter kombinere, justere den totale konsentrasjonen 5 ng/µL og minst 10 µL volum eller anbefalt av sekvensering anlegget kjernen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, GABAergic neurons var manuelt sortert (figur 1) og RNA ble forsterket, deretter laget i et cDNA bibliotek (figur 2) og sekvensert høy dybde8. Forsterket RNA (aRNA) produktene varierte mellom 200-4000 bp i størrelse, med en topp distribusjon over 500 bp (figur 3A). Perle-renset cDNA biblioteket var størrelse-begrenset av en ny runde med rensing bruker perler som eliminert mindre fragmenter mindre enn 200 bp (figur 3B og 3 C) og med en topp på ~ 350 bp. Har kortere fragmenter vil føre til tom leser (ingen mRNA setter inn, bare kortet og primer sekvenser), mens lengre fragmenter vil oppta mer plass på flyt cellene, redusere totale lese utgang. På sekvensering oppnådd vi rutinemessig en 4.8 x 105 median eller 6,9 x 105 gjennomsnittlig tilordnet leser per celle (figur 4A). Etter dupliserte RNA fjerning ved hjelp av UMIs, hadde hver eneste celle en 1,0 x 105 median eller 1.4 x 105 gjennomsnittlig unike leser per celle (figur 4B). I hver enkelt celle eksterne RNA kontroller consortium (ERCC), ble spiker i RNA brukt som en intern kontroll som absolutte antallet molekyler som er lagt til utvalget kan beregnes. Det var en lineær sammenheng inngang til observert teller, med en skråning på 0,92 og justert R2 = 0,94 (figur 4C). Vi oppdaget gjennomsnittlig ~ 10 000 gener per enkelt Nevron (alt fra ~ 7500 til 12 000 gener/mobiltelefon), med > 95% av single celler oppdage > 6000 gener (Figur 4 d-4F). Sammenligner dette tallet gunstig mot publiserte data fra lignende musen hjerne-avledet enkelt neurons (f.eks 1,865-4,760 gener i Zeisel et al. 9, 7,250 gener i Tasic et al. 10og 8000 gener i Okaty et al. 11). leserne kommer til Poulin et al. 12 for en detaljert sammenligning.

Figure 1
Figur 1 : Arbeidsflyten for manuell sortering av neurons etterfulgt av DIVA-Seq. Frisk musen hjernen var samlet og skiver, og området rundt var microdissected. Enkelt neurons uttrykke fluorescerende proteiner ble samlet manuelt og forsterket med to runder av lineær forsterkning ved i vitro transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Skjematisk arbeidsflyten DIVA-Seq med to runder av forsterkning mens omfatter unike molekylær identifikatorer (UMIs) eller varietal-tags. Eksempel strekkode (SBC) tillater hver eneste celle identifiseres ved sin 9-nukleotid kode (Blågrønn). UMI er en strekning av tilfeldige nukleotider 10 bp i lengde som er forskjellig for hver primer brukes. I bioinformatikk-trinn telles to tilordnede transkripsjoner har samme UMI sekvens bare én gang, dermed eliminere forsterkning duplikater og tillate absolutt transkripsjon teller. RA5 og RA3 er sekvensering primere, og T7-RA5 primer er nødvendig legge T7 sekvenser første runde aRNA produktene slik at T7 RNA polymerase kan binde og utføre en ny runde med lineær forsterkning av i vitro transkripsjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Eksempel bioanalyzer tomter. (A) aRNA størrelse distribusjoner, bør ha mellom 200 og 4000 bp med en topp på rundt 500 bp. x-aksen har vilkårlig fluorescens enhet [FU]. (B) størrelse distribusjon av cDNA biblioteket produkter etter perle opprydding. (C) størrelse fordeling etter 0,7 x SPRI størrelse utvalg (trinn 6.6) med en topp rundt 350 bp.

Figure 4
Figur 4 : Eksempel sekvens lese distribusjoner og gene oppdagelsen fra manuelt-sortert neurons etter DIVA-Seq8 . (A) totalt tilordnet lese distribusjon. (B) totalt unike leser distribusjon. (C) ERCC leser viser lineær sammenheng 4 størrelsesordener. (D) gener oppdaget vs lese teller viser at > 95% enkeltceller har > 6000 gener/mobiltelefon. (E) gener oppdaget blant 6 interneuron er sammenlignbare. (F) distribusjon av gener oppdaget per celle, GEO tiltredelse #GSE92522. Dette tallet er tilpasset fra Paul et al. 8. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Buffer Element Konsentrasjon Beløp (µL)
Eksempel samling buffer Rekombinant ribonuclease hemmer 55
ERCC 1:50K fortynnet 110
Nuclease gratis vann 605
Aliquot 43.75 µL av over i 16 rør (2 strimler av 8; 200 µL PCR rør); Legg til følgende per rør
T7-UMI-primere (f.eks N10B1-N10B16) 1 ng/µL 6,25 µL/rør
Siste bindet i hver rør 50 µL (hver rør kan deles i 25 µL dele og frosset ved-80 ° C)
Løsninger: Element Konsentrasjon Beløp
ACSF: for å gjøre 5 L oppløse NaCl 126 mM 36,8 g
KCl 3 mM 1,15 g
NaH2PO4 1,25 mM 0,75 g
NaHCO3 20 mM 8.4 g
Til 500 mL ACSF, boble oksygen i 10-15 min deretter legge til følgende frisk hver gang:
D-glukose 20 mM 1,8 g
MgSO4 2 mM 0,5 mL fra 4 M lager
CaCl2 2 mM 0,5 mL fra 4 M lager
Holde ACSF oksygenert gjennom ut
Løsninger: Element Konsentrasjon
Aktivitet blokkering cocktail: lage en 100 x lager
ACSF legge til 100 mL
APV 0.05 mM
CNQX 0.02 mM
TTX 0.0001 mM (0,1 µM)
Løsninger: Element Beløp
Protease soltion (100 mL) Protease fra Streptomyces griseus 100 mg
Fosterets bovin serum: kommersielle kilden, aliquot i 500 µL for hvert bruk.

Tabell 1: Liste over løsninger og buffere.

Tabell 2: liste over primere og sekvenser. N10B1-N10B96 er første strand primere og T7-RA5 er den andre-runde primeren. Klikk her for å laste ned denne tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Manuell sortering protokollen er egnet for en veiledet RNA sekvensering av Nevron populasjoner som enten tynt merket i mus hjernen eller representerer en sjelden celle populasjon som ellers ikke er mulig å studere med gjeldende høy gjennomstrømming cellen sortering og forsterkning metoder. Celler underlegges FACS vanligvis gjennomgå skjede og prøve linje press i størrelsesorden ~ 9-14 psi, avhengig av størrelsen på munnstykket og ønsket hendelse priser. Dessuten, ved å være kastet ut av munnstykket, kan cellene lande hardt på overflaten av samling rør eller brønner belagt med eksempel buffer forårsaker innvirkning stress. Under manuell sortering, er slike høyt trykk aldri brukt, som cellene er sugd inn i pipette kapillær handling og utvist av forsiktig blåse dem og bare bryte tips av glass pipetter. DIVA-Seq protokollen er nyttig for RNA forsterkning fra celler med små mobilnettet volumer (< 8 µL) og lav materiale og konsekvent gir stort antall synlig gener (8-10 K), som, når kombinert med dyp sekvensering, gir detaljert rekonstruksjoner av et sammenhengende molekylær bilde av cellulære funksjoner underliggende celle identitet8,13,14. På grunn av renhet celle samling trinn, høy følsomhet genet gjenkjenning og utøve absolutt molekyl teller, er denne metoden nyttig for studerer mobilnettet stater og sykdom patofysiologi med høy dybde og presisjon.

Avkastningen av forsterket RNA og graden av genet er relativt høy i denne protokollen, å visse fremgangsmåter for tiltak opprettholde konsistens. Under andre-strand syntese, montering må gjøres på is, termisk cycler må være pre-avkjølt før de overføres til enheten og reaksjonen må gjøres strengt på 16 ° C (eller litt nedenfor) for å unngå hårnåler som kan redusere aRNA avkastning. Det er også anbefales ikke å overskride 2 h på 16 ° C i løpet av andre-strand syntese, og det er viktig å flytte til cDNA rensing trinn så snart som mulig. Under IVT trinnene, kan inkubasjonstiden for mindre enn 12 h redusere aRNA avkastning, mens overstiger 14 h IVT tid kan resultere i dårligere aRNA.

Vi utførte ikke en komparativ studie med samme inn prøven fra kull-kameratene underlegges FACS og manuell sortering bruker DIVA-Seq; Derfor påstå vi ikke at noen bestemt gen kategori er misregulated FACS og ikke i manuell sortering. Både FACS og manuell sortering vil trolig presentere noen grad av gene expression gjenstander. For differensial gene expression situasjoner, skulle slik effekt i teorien avlyse ut, som det vil være manifestert i både kontroll og eksempelsider grupper. Nylig en cocktail av transkripsjon hemmere har blitt brukt til å forhindre aktiveringen av umiddelbar tidlig genekspresjon, og slike tiltak også kan innlemmet til denne protokollen15.

Manuell sortering prosessen er mild og raskere (vanligvis 90-160 min) sammenliknet med FACS (unntatt Klargjøringstiden eksempel) som krever tetthet gradert sentrifugering, farging med livskraft, cytotracker fargestoffer, og etter sortering visualisering. Manuell sortering ikke underlagt cellene til høy skjede press og innvirkning stress på sortering på brønner. Det kan også nesten konstant tilgang til oksygenrikt ACSF og samlet gir et gjestfritt og mindre stressende sortering miljø, som kan være avgjørende for celler som er følsom for stress som rask skyter celler med høyt metabolsk krav. I DIVA-Seq Foreløpig kan opptil 96 celler være multiplekset for å lagre reagens kostnader og gi absolutt mRNA teller med høy genet teller per celle.

Det finnes imidlertid ulemper til denne metoden. for eksempel manuell sortering behov pålitelig fluorescently merket cellene som starter innbyggere. Det er iboende en lav gjennomstrømming prosess, med hvert sortering økt gir 32 – 64 celler til et maksimalt, som er betydelig lavere enn i FACS. Manuell sortering også krever fine motorikken og litt øvelse å manipulere glass Pipetter under disseksjon mikroskop og fange enkeltceller i microcapillary pipetter. DIVA-Seq forsterkning er 3-partisk; derfor det kan ikke brukes for hele transcriptome forsterkning og er heller ikke egnet for skjøte isoformen gjenkjenning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH (5R01MH094705-04 og R01MH109665-01 til Z.J.H.) av CSHL Robertson nevrovitenskap Fund (til Z.J.H.) og av et NARSAD Post-Doctoral fellesskap (til A.P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes Thermo Fisher Cat# 4456740
SuperScript III Thermo Fisher Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer New England Biolabs Cat# E6105S
RNA MinElute kit Qiagen Cat# 74204
Antarctic phosphatase New England Biolabs Cat# M0289
Poly nucleotide kinase New England Biolabs Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated New England Biolabs Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads Beckman Coulter Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads Thermo Fisher Cat# B23317
DL-AP5 Tocris Cat# 0105
CNQX Tocris Cat# 1045
TTX Tocris Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich Cat# P5147
Message Amp II kit Thermo Fisher Cat# AM1751
Carbogen Airgas Cat# UN3156
Sylgard 184 Sigma-Aldrich Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip Agilent Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip Agilent Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100 Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F). Leica Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. Warner instruments Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller Sutter Instruments Co P-97
Vibratome Thermo Microm HM 650V
Vibratome tissue cooling unit Thermo Microm CU 65

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
  6. Eberwine, J., et al. Analysis of gene expression in single live neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).
  7. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  8. Paul, A., et al. Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity. Cell. 171 (3), 522-539 (2017).
  9. Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 1934, (2015).
  10. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).
  11. Okaty, B. W., et al. Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System. Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).
  12. Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).
  13. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability. Genome Biology. 17, 101 (2016).
  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  15. Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).

Tags

Nevrovitenskap problemet 140 manuell sortering Nevron encellede RNA sekvensering DIVA-Seq i vitro transkripsjon lineær forsterkning unik molekylær identifikator (UMI)
Encellede RNA sekvensering av Fluorescently merket musen Neurons med manuell sortering og dobbel <em>In Vitro</em> transkripsjon absolutte teller sekvensering (DIVA-Seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell… More

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (140), e58690, doi:10.3791/58690 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter