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Neuroscience

एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के साथ फ्लोरोसेंट लेबल माउस ंयूरॉंस मैनुअल छंटाई और डबल इन विट्रो प्रतिलेखन के साथ निरपेक्ष गणना अनुक्रमण (DIVA-Seq)

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/58690
Automatic Translation
1, 1
1Cold Spring Harbor Laboratory

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन मैनुअल छंटाई प्रक्रिया को अलग करने के लिए एकल फ्लोरोसेंट लेबल इन विट्रो प्रतिलेखन के बाद ंयूरॉंस उच्च गहराई एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के लिए आधारित mRNA प्रवर्धन ।

Abstract

एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) अब जीन अभिव्यक्ति परख के लिए एक व्यापक रूप से कार्यान्वित उपकरण है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकल-कक्ष आरएनए-अनुक्रमण प्लेटफ़ॉर्म सभी इनपुट कक्षों की अंधाधुंध प्रक्रिया करते हैं. कई बार, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) का उपयोग ऊपर की रुचि के विशेष लेबल वाली जनसंख्या को अलग करने के लिए किया जाता है । FACS की एक सीमा काफी लेबल भागों, जो इकट्ठा करने और दुर्लभ या विरल माउस मस्तिष्क से ंयूरॉन आबादी लेबल की रूपरेखा के लिए अव्यावहारिक है के साथ इनपुट कोशिकाओं की उच्च संख्या के लिए की जरूरत है । यहां, हम स्वयं का संग्रह के लिए एक विधि का वर्णन विरल फ्लोरोसेंट एक हौसले से असंबद्ध माउस मस्तिष्क ऊतक से ंयूरॉंस लेबल । यह प्रक्रिया एकल पर कब्जा करने के लिए अनुमति देता है, उच्च शुद्धता और बाद में एक साथ एकीकरण के साथ न्यूरॉन्स लेबल के साथ एक में इन विट्रो परिवर्धन प्रोटोकॉल है कि अंतर्जात प्रतिलिपि अनुपात को बरकरार रखता है. हम एक दोहरे रेखीय प्रवर्धन पद्धति का वर्णन करते है जो व्यक्तिगत mRNA गणना उत्पंन करने के लिए अनंय अणु पहचानकर्ता (UMIs) का उपयोग करती है । एक कोशिका प्रति जीन का पता लगाने के एक उच्च डिग्री में प्रवर्धन परिणामों के दो दौर ।

Introduction

एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-seq) ने transcriptomic अध्ययन बदल दिया है । बड़े पैमाने पर एकल-कक्ष RNAseq, जैसे बूंदों1,2, microfluidics3, nanogrids4, और microwells5के रूप में तकनीकों की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, अधिकांश विधियाँ निर्धारित कक्ष प्रकार सॉर्ट नहीं कर सकता कि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग fluorophores एक्सप्रेस । किसी कक्ष का चयन करें जनसंख्या को अलग करने के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) अक्सर लेबल किए गए कक्षों को एकल-कक्ष मोड में सॉर्ट करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, FACS कुछ प्रतिबंध है और सावधानीपूर्वक नमूना संसाधन चरणों की आवश्यकता है । सबसे पहले, इनपुट कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या आम तौर पर (अक्सर कई लाख कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर) की जरूरत है, एक महत्वपूर्ण अंश के साथ (> 15 – 20%) लेबल जनसंख्या युक्त । दूसरा, सेल की तैयारी घनत्व ढाल केंद्रापसारक कदम के कई दौर glial अंश, मलबे को दूर करने की आवश्यकता हो सकती है, और सेल के झुरमुट कि अंयथा नोजल या प्रवाह सेल रोकना हो सकता है । तीसरा, FACS आम तौर पर दाग और जीवित/मृत धुंधला (जैसे, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium आयोडाइड (PI), और Cytotracker रंजक) है, जो अतिरिक्त समय लेने के लिए कदम दाग को रोजगार । चौथा, दो के लिए अंगूठे का एक नियम के रूप में रंग छँटाई (जैसे DAPI और हरे/लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP/आरएफपी)), आमतौर पर दो नमूने और एक नियंत्रण की जरूरत है, एक unlabeled नमूना वांछित माउस तनाव के अलावा संसाधित किया जा करने की आवश्यकता है । पांचवां, फ़िल्टरिंग अक्सर कई बार किया जाता है पहले और नमूना छंटाई के दौरान लगातार एक FACS मशीन में भरा नमूना लाइनों को रोकने के लिए । छठा, समय सबसे अधिक इस्तेमाल किया FACS setups में शुरू करने और द्रव धारा स्थिर और छोटी बूंद अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए आवंटित किया जाना चाहिए । सातवें, नियंत्रण के नमूने आमतौर पर अनुक्रम में वास्तविक नमूना संग्रह करने से पहले चलाने के लिए क्षतिपूर्ति मैट्रिक्स सेट कर रहे हैं, नक़ल अस्वीकृति, गेट्स की स्थापना, आदि उपयोगकर्ताओं को या तो कदम छह और सात खुद को समय से आगे प्रदर्शन या आवश्यकता समानांतर में एक तकनीशियन की सहायता । अंत में, पोस्ट-FACS, वहां अक्सर यह सुनिश्चित करने के लिए कदम है कि केवल लेबल एकल कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से मौजूद हैं; उदाहरण के लिए, एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सेटअप जैसे एक तेज प्लेट imager में नमूनों की जाँच करके ।

ऊपर उल्लिखित चरणों को दरकिनार और एकल फ्लोरोसेंट लेबल ंयूरॉंस की एक छोटी सी आबादी के एक अपेक्षाकृत त्वरित, लक्षित अनुक्रमण को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम एक मैनुअल छंटाई प्रक्रिया का वर्णन एक अति संवेदनशील के दो दौर के बाद इन विट्रो में प्रवर्धन प्रोटोकॉल, बुलाया डबल में-इन विट्रो प्रतिलेखन निरपेक्ष गिनती अनुक्रमण (दिवा-Seq) के साथ । आरएनए प्रवर्धन और सीडीएनए पुस्तकालय पीढ़ी Eberwine एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं । 6 और Hashimshony एट अल. 7, कुछ संशोधनों के साथ माउस ंयूरॉंस कि छोटे सेलुलर संस्करणों के अनुरूप है; इसके अलावा, हम यह भी पाया है कि यह उत्तेजक पिरामिड ंयूरॉंस के लिए समान रूप से उपयोगी है ।

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Protocol

शीत वसंत हार्बर लेबोरेटरी, NY (IACUC #16-13-09-8) में IACUC द्वारा पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं को अनुमोदित किया गया है ।

1. फ्लोरोसेंट लेबल माउस ंयूरॉंस की मैनुअल छंटाई

  1. खींचो ग्लास microcapillaries ( सामग्री की तालिकादेखें) करने के लिए 10 – 15 µm निकास व्यास निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक केशिका खींचने का उपयोग: हीट: ५०८, खींचो: रिक्त, vel: रिक्त, समय: रिक्त.
  2. संलग्न 120-150 सेमी लचीला सिलिकॉन टयूबिंग (~ ०.८ मिमी व्यास के अंदर) एक ०.२ µm polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली सिरिंज फिल्टर और उपयुक्त टयूबिंग connectors का उपयोग कर एक दो तरह टयूबिंग वाल्व ।
  3. ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF, तालिका 1), और आक्सीजन द्वारा bubbling 5% कार्बन डाइऑक्साइड एक airstone के माध्यम से 15 मिनट के लिए या समाधान पूरी तरह से साफ करता है जब तक ऑक्सीजन की ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
  4. एक १५० मिलीलीटर चोंच (तालिका 1) में गतिविधि ब्लॉकर्स की एक कॉकटेल के साथ ACSF के १०० मिलीलीटर तैयार करें ।
  5. एक १५० मिलीलीटर चोंच (तालिका 1) में 1 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोकोकस अंश IV को छेड़ने के साथ ACSF के १०० मिलीलीटर तैयार करें ।
  6. एक १५० मिलीलीटर यूरिन में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) समाधान के साथ ACSF के १०० मिलीलीटर तैयार करें और एक airstone के माध्यम से 5% कार्बन डाइऑक्साइड संतुलित ऑक्सीजन के साथ आक्सीजन ।
  7. एक छोटे से कैंची के साथ cranium खोलने के द्वारा एक euthanized माउस से मस्तिष्क काटना और प्रांतस्था को नुकसान पहुँचाए बिना ठीक संदंश का उपयोग कर ताजा मस्तिष्क निकालने.
    नोट: किसी भी तनाव, उंर के चूहों, और लिंग वांछित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । मस्तिष्क फ्रीज या वायरस या अन्य खतरनाक/संक्रामक एजेंटों के साथ इंजेक्शन चूहों पर मैन्युअल छंटाई प्रदर्शन न करें ।
  8. दिमाग को ठंडा और oxygenated ACSF में रखें, सेक्शनिंग की पूरी अवधि के दौरान 5% कार्बन डाइऑक्साइड बैलेंस ऑक्सीजन से जुड़ी एक airstone को छोड़ दें ।
  9. vibratome चक पर मस्तिष्क की स्थिति और ३०० µm मोटाई में राज्याभिषेक या sagittal वर्गों में कटौती । के रूप में कई वर्गों के रूप में इकट्ठा करने की जरूरत है ~ 10-50 लेबल कोशिकाओं को कई सौ कोशिकाओं तक की एक ंयूनतम प्राप्त करने के लिए । एक कपास पर स्लाइसें रखो, स्लाइस धारक एक चोंच के अंदर रखा तो वे oxygenated ACSF में नहाया रहे हैं ।
  10. कमरे के तापमान पर 15 – 20 मिनट के लिए गतिविधि अवरोधकों और ब्लॉक के साथ ACSF युक्त एक चोंच में ताजा स्लाइस ले जाएं । bubbling ऑक्सीजन airstone का उपयोग कर रखो ।
  11. कमरे के तापमान पर हल्के पाचन करने के लिए छेड़ने वाले समाधान के साथ ACSF युक्त चोंच में स्लाइस ले जाएं: 20-पी-14 पशुओं के लिए 30 मिनट या 45-P28-56 पशुओं के लिए 60 मिनट । bubbling ऑक्सीजन रखो ।
  12. कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए गतिविधि ब्लॉकर्स समाधान के साथ ACSF युक्त चोंच को वापस स्लाइस चलती द्वारा ACSF बाहर धोने । bubbling ऑक्सीजन रखो ।
  13. कमरे के तापमान पर 1% FBS के साथ ACSF युक्त एक १०० mm पेट्री डिश के लिए व्यक्तिगत वर्गों ले जाएं । एक फ्लोरोसेंट विच्छेदन गुंजाइश के तहत, microdissect क्षेत्रों और ब्याज की परतों 10 की एक ंयूनतम होने-50 कोशिकाओं (कुछ सौ तक) । ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ microdissection प्रदर्शन या लकड़ी धारकों (कटार) पर 22-28 जी इंजेक्शन सुई संलग्न द्वारा ।
  14. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, एक 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूब FBS समाधान में 1% ACSF के ~ ०.८ मिलीलीटर युक्त के लिए microdissected टुकड़े ले जाएं ।
  15. कमरे के तापमान पर microfuge ट्यूब में विच्छेदित ऊतक Triturate । तीन लंबे समय से बाहर निकलें व्यास उंहें एक खुली लौ पर रोलिंग द्वारा कम के साथ पाश्चर पिपेट उपजी बनाओ । प्रदर्शन ~ प्रत्येक पिपेट के साथ 10 स्ट्रोक, सबसे बड़ा और सबसे छोटी के साथ समाप्त होने के साथ शुरू ।
  16. एक १०० मिमी पेट्री oxygenated ACSF युक्त पकवान में असंबद्ध कोशिकाओं को बांटना (पेट्री डिश बारीकी से 1% के 5 मिमी के साथ लेपित किया जा सकता है या स्पष्ट सिलिकॉन यौगिक 1:10 अनुपात में, यदि वांछित) । कमरे के तापमान पर रखें ।
  17. कोशिकाओं को धीरे से व्यवस्थित करने के लिए ~ 5-7 मिनट रुको, तो एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत GFP/आरएफपी संकेत का निरीक्षण ।
    नोट: एकल कोशिकाओं, मलबे, और छोटे झुरमुट उज्ज्वल क्षेत्र (BF) में दिखाई जाएगी ।
  18. एक समय में एक केशिका पिपेट (१.१ कदम से) लचीला सिलिकॉन टयूबिंग (0.4-0.8 मिमी भीतरी व्यास) के लिए संलग्न का उपयोग कर एक बार में 10-15 GFP/आरएफपी कोशिकाओं और कोशिकाओं को एक १०० मिमी पेट्री ताजा oxygenated ACSF युक्त पकवान में बांटना ।
  19. जीभ के साथ टयूबिंग वाल्व के अंत अवरुद्ध करके, स्थिति केशिका ब्याज की सेल के करीब । ब्लॉक से राहत पर केशिका कार्रवाई का उपयोग कर कोशिकाओं पर कब्जा है, और जल्दी से पिपेट में प्रवेश करने से अतिरिक्त तरल पदार्थ को रोकने के लिए फिर से ब्लॉक । धीरे से उड़ाने के द्वारा ताजा oxygenated ACSF के साथ एक १०० mm पेट्री डिश पर कोशिकाओं को बांटना, जबकि विच्छेदन माइक्रोस्कोप के प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी के तहत केशिका टिप देख । लक्ष्य ~ 100-150 कोशिकाओं कुल इकट्ठा करने के लिए ।
  20. दोहराएँ चरण १.१९ एक या दो बार और अधिक (मलबे पर निर्भर करता है) और एक कुल हस्तांतरण ~ 50-75 कोशिकाओं को एक नया १०० mm पेट्री डिश, बनाने यकीन है कि इस तरह के मलबे के रूप में संदूषणों उज्ज्वल में कम कर रहे हैं-क्षेत्र विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) प्रकाशिकी ।
  21. अंत में, एक ताजा microcapillary पिपेट हर बार का उपयोग कर, कोई ०.५ से अधिक µ एल मात्रा में एक एकल सेल का चयन और यह एक एकल ०.२ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में निष्कासित (या आठ ०.२ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के एक पट्टी) 1 µ एल युक्त नमूना संग्रह बफर के प्राइमरों के साथ N10B1-N10B96 (तालिका 2) । यह सुनिश्चित करने के लिए कि कक्ष संग्रह बफ़र में रहता है microfuge ट्यूब में पिपेट टिप भंग करें । पिपेट को त्यागें ।
  22. सूखी बर्फ पर ट्यूब डाल और उन्हें एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में लंबे समय तक भंडारण के द्वारा कोशिकाओं को फ्रीज जब तक वे आरएनए प्रवर्धन के लिए संसाधित किया जा करने के लिए तैयार हैं.

2. प्रथम गोल आरएनए प्रवर्धन

नोट: निंनलिखित प्रक्रिया आठ ०.२ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों के एकल पट्टी के लिए है । आवश्यकतानुसार प्रतिक्रियाओं को स्केल करे ।

  1. सीडीएनए (पहले दौर) के पहले किनारा को संश्लेषित करना.
    1. हीट स्ट्रिप्स से चरण १.२२ पर ७० ˚ c 5 मिनट के लिए 4 ˚ c के द्वारा पीछा किया; दोहराएं दो बार ।
    2. बर्फ पर इकट्ठे रिवर्स transcriptase (आरटी) मास्टर मिश्रण/प्रथम किनारा संश्लेषण मास्टर मिश्रण निम्न सामग्री का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें): 10x पहले किनारा बफर (2 µ एल), dNTP मिश्रण (4 µ एल), RNase अवरोध करनेवाला (1 µ एल), और एंजाइम (1 µ एल).
    3. संक्षेप में एक तालिका के ऊपर के तल पर सब कुछ इकट्ठा करने के लिए पट्टी केंद्रापसारक । बर्फ पर रखो ।
    4. 1 µ l जोड़ें के आरटी मास्टर मिक्स/प्रथम-किनारा संश्लेषण मास्टर मिश्रण के ऊपर ट्यूबों के लिए (1 µ l का नमूना बफ़र से कक्ष संग्रह + 1 µ l की कुल मात्रा RT = 2 µ l/ pipetting द्वारा अच्छी तरह मिलाएं । संक्षेप में तल पर पूरी सामग्री इकट्ठा करने और बर्फ पर रखने के लिए स्पिन ।
    5. एक हवा ओवन में 2 घंटे के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर ऊपर ट्यूब/ बर्फ पर ट्यूबों रखो तुरंत प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए और दूसरा-किनारा संश्लेषण कदम करने के लिए आगे बढ़ना ।
  2. सीडीएनए (पहले दौर) के दूसरे किनारा को संश्लेषित करना.
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में निम्नलिखित क्रम में बर्फ पर दूसरा कतरा मास्टर मिक्स (८० µ l) बनाओ: nuclease-मुफ्त पानी (६३ µ एल), 10x दूसरा किनारा बफर (10 µ एल), dNTP मिश्रण (4 µ एल), डीएनए पोलीमरेज़ (2 µ एल), और RNaseH (1 µ एल) । सामग्री को अच्छी तरह से भंवर से मिलाएं, फिर तल पर इकट्ठा और बर्फ पर रखने के लिए स्पिन ।
    2. थर्मल साइकिल चालक शुरू, पहले इकाई शांत करने के लिए निंनलिखित कार्यक्रम चलाने के लिए, कदम 2.2.3 शुरू करने के लिए तैयार हो (ढक्कन गर्मी = बंद; 2 घंटे के लिए 16 ° c, 4 ° c पकड़), और 16 डिग्री सेल्सियस पर ठहराव ।
    3. पट्टी के प्रत्येक ट्यूब के लिए दूसरा किनारा मास्टर मिश्रण के एक ८० µ l/पट्टी (या 10 µ एल/ट्यूब) जोड़ें और बर्फ पर रखो । थर्मल साइकिल चालक के लिए पट्टी स्थानांतरण और 16 ° c ऊपर शुरू कदम फिर से शुरू । 16 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए पट्टी की मशीन ।
    4. दूसरा किनारा संश्लेषण कदम के बाद, अगले सीडीएनए शुद्धि चरण के लिए आगे बढ़ने के लिए बर्फ पर ट्यूबों जगह है ।
  3. शुद्धि डबल असहाय सीडीएनए (पहले दौर) ।
    नोट: सभी केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर ~ ८,००० x g पर प्रदर्शन कर रहे हैं । कभी नहीं से अधिक १६,००० एक्स जी फिल्टर कारतूस को नुकसान से बचने के लिए ।
    1. हीटिंग शुरू १०० µ एल के nuclease-मुक्त पानी के लिए 50-55 ° c एक सूखी हीटिंग ब्लॉक में बाद में उपयोग के लिए । सीडीएनए के आंशिक विकार को रोकने के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस से अधिक कभी नहीं ।
    2. जोड़ें २५० µ एल सीडीएनए बाइंडिंग बफ़र के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब । बफ़र में हाला के लिए जांच करें, और फिर से भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए ३७ ° c के लिए बफ़र समाधान गर्म है ।
    3. सीडीएनए बाइंडिंग बफ़र के लिए एक एकल 8-ट्यूब पट्टी से cDNAs स्थानांतरण । आगे बहाव प्रक्रियाओं के लिए इस चरण में कोशिकाओं का मिश्रण (8 कोशिकाओं में 1 ट्यूब). pipetting 2-3 बार और फ़्लिक 3-4 बार द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । तल पर सामग्री इकट्ठा करने के लिए स्पिन ।
    4. धोने ट्यूबों में सीडीएनए फ़िल्टर कारतूस रखो (एक से इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT) किट) दृढ़ता से । फिल्टर के केंद्र के लिए ऊपर मिश्रण जोड़ें । के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ 1 मिनट या जब तक यह फिल्टर के माध्यम से है । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और धो ट्यूब बदलें ।
    5. IVT किट से वाश बफ़र के स्तंभ के लिए ५०० µ l जोड़ें ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इथेनॉल पहले धोने बफ़र के लिए जोड़ा गया है ।
    6. के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ 1 मिनट या जब तक यह फिल्टर के माध्यम से है । त्यागें प्रवाह के माध्यम से और ८,००० एक्स जी में फिर से केंद्रापसारक के लिए ~ 1 कारतूस खाली करने के लिए मिनट ।
    7. सीडीएनए फ़िल्टर को एक सीडीएनए रेफरेंस ट्यूब (१.५ एमएल nuclease-फ्री ट्यूब) पर ट्रांसफर करें । पूर्व गर्म nuclease के फिल्टर के केंद्र के लिए मुफ्त पानी की ८.५ µ एल लागू करें । 2 मिनट के लिए रुको और ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ १.५ मिनट के लिए ।
    8. Elute फिर से ८.५ µ एल के साथ पूर्व गर्म nuclease-मुक्त पानी और पहले दौर IVT के लिए तुरंत आगे बढ़ना ।
      नोट: डबल-कतरा सीडीएनए रिकवरी वॉल्यूम होगा ~ 16 µ l.
  4. सीडीएनए (पहले दौर) से प्रवर्धित आरएनए (अरना) उत्पादन के लिए एक इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT) प्रतिक्रिया निष्पादित करें ।
    1. ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए संकरण एयर ओवन सेट करें ।
    2. निंनलिखित क्रम में बर्फ पर IVT के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें: 16 µ l के लिए eluted डबल-कतरा सीडीएनए से कदम 2.3.8, जोड़ें 4 µ एल के T7 एटीपी समाधान (७५ मिमी); T7 CTP समाधान के 4 µ l (७५ mM); 4 µ l के T7 GTP हल (७५ mM); 4 µ l के T7 UTP हल (७५ mM); T7 10x प्रतिक्रिया बफर के 4 µ एल; और T7 एंजाइम मिश्रण के 4 µ l. मिश्रण अच्छी तरह से, स्पिन, और बर्फ पर पकड़ ।
    3. IVT मास्टर मिश्रण के 24 µ एल जोड़ें सीडीएनए के 16 µ एल युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए । धीरे और अच्छी तरह से pipetting द्वारा सामग्री मिश्रण । 14 एच के लिए ३७ ° c पर ट्यूब मशीन ।
      नोट: < 12 h के लिए मशीन गंभीर रूप से उपज को प्रभावित करती है ।
    4. ६० µ l को नॉन-diethyl pyrocarbonate (non-DEPC) का इलाज RNase-नि: शुल्क पानी की मात्रा को बढाने के लिए १०० µ l और IVT प्रतिक्रिया को रोक दीजिये.
  5. अरना को शुद्ध करे ।
    नोट: सभी केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर ~ ८,००० x g पर प्रदर्शन कर रहे हैं । कभी नहीं से अधिक १६,००० एक्स जी फिल्टर कारतूस को नुकसान से बचने के लिए ।
    1. हीटिंग शुरू ~ २०० µ एल के nuclease-मुक्त पानी के लिए 50-55 ° c एक सूखी हीटिंग ब्लॉक या पीसीआर मशीन में बाद में उपयोग के लिए । अरना के आंशिक विकार को रोकने के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस से अधिक कभी नहीं ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर nuclease-मुक्त ट्यूब को अरना स्थानांतरण । प्रत्येक अरना नमूना के लिए अरना बाइंडिंग बफ़र के ३५० µ l जोड़ें । प्रत्येक ट्यूब और मिश्रण करने के लिए १००% इथेनॉल के २५० µ एल जोड़ें pipetting द्वारा 3 बार (मिश्रण और स्पिन करने के लिए भंवर नहीं है) ।
    3. यह फिल्टर कारतूस के केंद्र के लिए धीरे से जोड़ने के द्वारा आरएनए शुद्धि कॉलम को तुरंत मिश्रण स्थानांतरण । के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ 1 मिनट या जब तक मिश्रण पूरी तरह से फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया है । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और अपशिष्ट संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग
      नोट: आरएनए इथेनॉल के अलावा पर तेज़ी शुरू कर देंगे ।
    4. प्रत्येक फिल्टर कारतूस को धोने बफर के ६५० µ एल जोड़ें । ८,००० x g पर ~ 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक या जब तक पूरे बफर पारित कर दिया है । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और वॉश बफ़र के अंश को निकालने के लिए एक अतिरिक्त ~ 1 मिनट के लिए फ़िल्टर स्पिन ।
    5. फ़िल्टर को एक ताज़ा अरना संग्रह ट्यूब पर स्थानांतरित करें । जोड़ें १०० µ एल के पूर्व गरम (50-55 डिग्री सेल्सियस) nuclease-मुक्त पानी फिल्टर के केंद्र के लिए । 2 मिनट के लिए रुको, तो ८,००० x जी में ~ १.५ मिनट के लिए केंद्रापसारक या जब तक यह संग्रह ट्यूब में पारित कर दिया है ।

3. द्वितीय दौर प्रवर्धन

  1. पहला कतरा सीडीएनए (दूसरे दौर) को संश्लेषित करना.
    1. स्थानांतरण अरना से चरण 2.5.5 को एक २०० µ l microfuge ट्यूब और वैक्यूम ध्यान लगाओ १०० µ l elutant को 10 µ l. कोई गर्मी का उपयोग, ६५ मिनट के लिए निर्वात संकेंद्रक चलाने के लिए । एक २०० µ एल ट्यूब में पानी की 10 µ एल के साथ तुलना कम मात्रा का अनुमान लगाने के लिए ।
    2. ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए संकरण एयर ओवन कचौरी ।
    3. IVT किट से यादृच्छिक hexamer प्राइमरों के 2 µ एल जोड़ें अरना, भंवर संक्षेप में, और स्पिन सामग्री इकट्ठा करने के लिए ।
    4. एक थर्मल साइकिल चालक में 10 मिनट के लिए ७० ° c पर microfuge ट्यूब मशीन, तो यह बर्फ पर जगह है ।
    5. निम्न RT मास्टर मिश्रण तैयार करें: 2 µ एल के 10x पहला किनारा संश्लेषण बफर, 4 µ l के dNTP मिश्रण, 1 µ l के RNase अवरोधक, और µ एंजाइम के 1 ArrayScript l. धीरे भंवर से एक २०० µ एल microfuge ट्यूब में अच्छी तरह से मिश्रण है, तो स्पिन सामग्री और बर्फ पर जगह इकट्ठा करने के लिए ।
    6. प्रत्येक microfuge ट्यूब को आरटी मास्टर मिक्स (पहला किनारा) के 8 µ एल जोड़ें । एक ४२ ° c एयर मशीन में ट्यूबों के लिए 2 एच प्लेस ।
    7. उपरोक्त प्रतिक्रिया के लिए RNaseH के 1 µ l को जोड़ें । pipetting 2-3 बार और फ़्लिक 3-4 बार, और स्पिन सामग्री इकट्ठा करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण । एक पीसीआर मशीन पर 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । मशीन के बाद, तुरंत दूसरा किनारा संश्लेषण कदम करने के लिए आगे बढ़ें ।
  2. सीडीएनए (दूसरे दौर) के दूसरे किनारा को संश्लेषित करना.
    1. T7-RA5 प्राइमर के 3 µ एल जोड़ें (पर 25 एनजी/µ एल काम कमजोर पड़ने, टेबल 2) और µ के 2 RNase एल, प्रत्येक सीडीएनए नमूना के लिए मुफ्त पानी । मिश्रण अच्छी तरह से, और स्पिन सामग्री इकट्ठा करने के लिए ।
    2. एक थर्मल साइकिल चालक में 10 मिनट के लिए ७० ° c पर मशीन । बर्फ पर प्रतिक्रिया प्लेस ।
    3. आर टी मास्टर मिक्स (दूसरा किनारा) बर्फ पर तैयार: ५८ µ एल के nuclease-मुफ्त पानी, 10 µ एल के 10x दूसरा किनारा बफर, 4 µ एल के dNTP मिश्रण, और डीएनए µ के 2 पोलीमरेज़ एल. भंवर और स्पिन सामग्री इकट्ठा करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण । बर्फ पर रखो ।
    4. कदम 3.2.2 से प्रत्येक ट्यूब के लिए ऊपर मिश्रण के ७४ µ एल जोड़ें । pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण 2-3 बार और 3-4 बार फ़्लिक, तो सामग्री इकट्ठा करने के लिए स्पिन । बर्फ पर रखो और पकड़ो ।
    5. पूर्व ठंडा करने के लिए थर्मल साइकिल चालक 16 ° c बंद ढक्कन गर्मी मोड़ द्वारा । 16 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए थर्मल साइकिल चालक में ट्यूबों प्लेस ।
    6. दूसरा-किनारा संश्लेषण कदम के बाद, सीडीएनए शुद्धि चरण के लिए आगे बढ़ना, या-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करने के लिए बर्फ पर ट्यूबों जगह है ।
      नोट: सीडीएनए शुद्धि ठंड से पहले की सिफारिश की है ।
  3. प्रदर्शन सीडीएनए शुद्धि (दूसरे दौर) ।
    नोट: सभी केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर ~ ८,००० x g पर प्रदर्शन कर रहे हैं । कभी नहीं से अधिक १६,००० एक्स जी फिल्टर कारतूस को नुकसान से बचने के लिए ।
    1. एक सूखी हीटिंग ब्लॉक में बाद में उपयोग के लिए 50-55 डिग्री सेल्सियस के लिए nuclease-मुक्त पानी हीटिंग शुरू करो । सीडीएनए के आंशिक विकार को रोकने के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस से अधिक कभी नहीं ।
    2. सीडीएनए को १.५ एमएल nuclease-फ्री ट्यूब पर ट्रांसफर करें । प्रत्येक ट्यूब के लिए सीडीएनए बाइंडिंग बफर के २५० µ एल जोड़ें । बफ़र में हाला के लिए जाँच करें और पुन: भंग करने के लिए 10 मिनट के लिए ३७ ° c करने के लिए बफ़र समाधान गर्म है । pipetting 2 – 3 बार और 3-4 बार फ़्लिक करके अच्छी तरह से मिलाएं । स्पिन सामग्री इकट्ठा करने के लिए ।
    3. मजबूती से धो ट्यूबों में सीडीएनए फिल्टर कारतूस डाल दिया । फिल्टर के केंद्र के लिए ऊपर मिश्रण जोड़ें । के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ 1 मिनट या जब तक यह फिल्टर के माध्यम से है । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और धो ट्यूब बदलें ।
    4. जोड़ें ५०० µ धोने बफर के एल । सुनिश्चित करें कि इथेनॉल पहले धोने बफर करने के लिए जोड़ा गया है । के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ 1 मिनट या जब तक यह फिल्टर के माध्यम से है ।
    5. त्याग के माध्यम से प्रवाह-के माध्यम से, और ८,००० एक्स जी में फिर से केंद्रापसारक के लिए ~ 1 कारतूस खाली करने के लिए मिनट । सीडीएनए फ़िल्टर को एक सीडीएनए रेफरेंस ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
    6. पूर्व गर्म nuclease के फिल्टर के केंद्र के लिए मुफ्त पानी की ८.५ µ एल लागू करें । 2 मिनट के लिए रुको और ८,००० एक्स जी पर केंद्रापसारक के लिए ~ १.५ min. Elute फिर से अतिरिक्त ८.५ µ एल के साथ पूर्व के गर्म nuclease मुक्त पानी ।
      नोट: डबल-कतरा सीडीएनए रिकवरी वॉल्यूम होगा ~ 16 µ l.
    7. दूसरे दौर IVT के लिए तुरंत आगे बढ़ें या-20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए रात भर फ्रीज ।
  4. IVT द्वारा अरना उत्पादन के एक दूसरे दौर प्रदर्शन करते हैं ।
    1. ३७ ° c (३६ ° c setpoint) के लिए संकरण एयर ओवन सेट करें ।
    2. निंनलिखित क्रम में बर्फ पर IVT के लिए मास्टर मिक्स तैयार करें: 16 µ l के लिए eluted डबल-कतरा सीडीएनए से कदम 3.3.7, जोड़ें 4 µ एल के T7 एटीपी समाधान (७५ मिमी); T7 CTP समाधान के 4 µ l (७५ mM); 4 µ l के T7 GTP हल (७५ mM); 4 µ l के T7 UTP हल (७५ mM); T7 10x प्रतिक्रिया बफर के 4 µ एल; और T7 एंजाइम मिश्रण के 4 µ l. अच्छी तरह से मिश्रण, सामग्री इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में स्पिन, और बर्फ पर पकड़.
    3. IVT मास्टर मिश्रण के 24 µ एल जोड़ें सीडीएनए के 16 µ एल युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए । धीरे और अच्छी तरह से pipetting द्वारा सामग्री मिश्रण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब की मशीन 14 एच के लिए ।
      नोट: < 12 h के लिए मशीन गंभीर रूप से उपज को प्रभावित करती है ।
    4. गैर-DEPC RNase के ६० µ l को जोड़ें-मुफ्त पानी की मात्रा को बढ़ाने के लिए १०० µ l और IVT प्रतिक्रिया को रोकने के लिए.
  5. प्रदर्शन अरना शुद्धि (दूसरे दौर) ।
    नोट: सभी केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर ~ ८,००० x g पर प्रदर्शन कर रहे हैं । कभी नहीं से अधिक १६,००० एक्स जी फिल्टर कारतूस को नुकसान से बचने के लिए ।
    1. हीटिंग शुरू ~ २०० µ एल के nuclease-मुक्त पानी के लिए 50-55 ° c एक सूखी हीटिंग ब्लॉक या पीसीआर मशीन में बाद में उपयोग के लिए । अरना के आंशिक विकार को रोकने के लिए ५८ डिग्री सेल्सियस से अधिक कभी नहीं ।
    2. अरना को १.५ एमएल nuclease-फ्री ट्यूब पर ट्रांसफर करें । प्रत्येक अरना नमूना के लिए अरना बाइंडिंग बफ़र के ३५० µ l जोड़ें । प्रत्येक ट्यूब के लिए ACS ग्रेड १००% इथेनॉल के २५० µ एल जोड़ें और pipetting द्वारा 3 बार मिश्रण (भंवर मिश्रण करने के लिए नहीं है और स्पिन) ।
      नोट: आरएनए इथेनॉल के अलावा पर तेज़ी शुरू कर देंगे ।
    3. यह फिल्टर कारतूस के केंद्र के लिए धीरे से जोड़ने के द्वारा आरएनए शुद्धि कॉलम को तुरंत मिश्रण स्थानांतरण । के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ~ 1 मिनट या जब तक मिश्रण पूरी तरह से फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया है । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और अपशिष्ट संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग ।
    4. प्रत्येक फिल्टर कारतूस को धोने बफर के ६५० µ एल जोड़ें । ८,००० x g पर ~ 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक या जब तक पूरे बफर पारित कर दिया है । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और वॉश बफ़र के अंश को निकालने के लिए एक अतिरिक्त ~ 1 मिनट के लिए फ़िल्टर स्पिन ।
    5. एक ताजा अरना संग्रह ट्यूब करने के लिए फिल्टर स्थानांतरण । फिल्टर के केंद्र के लिए पूर्व गर्म nuclease-मुफ्त पानी की १०० µ एल जोड़ें । 2 मिनट के लिए रुको, तो ८,००० x जी में ~ १.५ मिनट के लिए केंद्रापसारक या जब तक यह पारित कर दिया है ।
    6. Aliquot 2 µ एल spectrophotometer के लिए एक ट्यूब में (२६० एनएम तरंग दैर्ध्य पर) और विश्लेषक प्रसार विश्लेषण अरना उपज और गुणवत्ता के लिए जांच करने के लिए ।
      ध्यान दें: एकाग्रता कम से कम 5 एनजी/µ एल होना चाहिए; अंयथा, नमूने को अस्वीकार करें । नमूना ~ 1 वर्ष के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । नमूनों को फ्रीज-गल जाने से बचें ।
    7. निर्माता के प्रोटोकॉल (चित्रा 2) निंनलिखित अरना उत्पादों के समुचित प्रसार कल्पना करने के लिए एक विश्लेषक का उपयोग नमूनों की जांच करें ।

4. प्रवर्धित आरएनए विखंडन और सफाई

  1. मिश्रण बर्फ पर निंनलिखित (कुल मात्रा ४० µ एल, गठबंधन के 2 ट्यूबों अरना गैर अतिव्यापी नमूना बार कोड): ३६ µ l अरना (२०० एनजी कुल) और 4 µ एल आरएनए विखंडन बफर के । ९० एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण की मशीन ।
  2. तुरंत बर्फ के मिश्रण चाल और आरएनए विखंडन रोक बफर के 4 µ एल जोड़ें । nuclease-फ्री वॉटर के ५६ µ l को जोड़कर वॉल्यूम को १०० µ l पर एडजस्ट करें ।
  3. आरएनए शुद्धि किट से RLT बफर के ३५० µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं । ेतोः के २५० µ एल जोड़ें, pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, और आरएनए शुद्धि स्पिन कॉलम के लिए नमूना हस्तांतरण. 15 के लिए स्पिन ८,००० x g पर एस
  4. नए संग्रह ट्यूब करने के लिए स्तंभ स्थानांतरित करें और जोड़ें ५०० µ l RPE बफ़र । ८,००० x जी पर 15 एस के लिए स्पिन प्रवाह के माध्यम से त्यागें । ८,००० x g में 2 मिनट के लिए ८०% ेतोः और स्पिन के ५०० µ एल जोड़ें
  5. एक नया संग्रह ट्यूब, कॉलम के खुले ढक्कन, और पूर्ण गति से 5 मिनट के लिए स्पिन करने के लिए कॉलम स्थानांतरण ।
  6. एक नया संग्रह ट्यूब के लिए कॉलम स्थानांतरण, और nuclease के 16 µ एल के साथ elute-मुक्त पानी, 1 मिनट के लिए पूरी गति से कताई ।

5. पुस्तकालय की तैयारी

नोट: IVTs का इस्तेमाल किया बारकोड में ओवरलैप नहीं है, तो इस बिंदु पर परित किया जा सकता है । फॉस्फेट उपचार समय ४० मिनट है । पाली-न्यूक्लियोटाइड कळेनासे उपचार का समय 1 ज है ।

  1. एक ०.७ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में खंडित अरना के 16 µ एल, निंनलिखित मिश्रण के 4 µ एल जोड़ें: 10x फॉस्फेट बफर के 2 µ एल, अंटार्कटिक µ के 1 फॉस्फेट एल, और µ रिकॉमबिनेंट अवरोध करनेवाला (जैसे, ribonuclease) के 1 RNaseOUT एल । निंनलिखित प्रोटोकॉल के साथ एक थर्मल साइकिल चालक में मशीन: 30 मिनट के लिए ३७ ° c, 5 मिनट के लिए ६५ ° c, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
  2. ०.७ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब से कदम ५.१, निम्न मिश्रण में से 30 µ l जोड़ें: 17 µ l के nuclease-नि: शुल्क जल, 5 µ l की 10x फॉस्फेट बफर, 5 µ l के एटीपी (10 एमएम), 1 µ l की रिकॉमबिनेंट ribonuclease अवरोध करनेवाला, और 2 µ l के PNK. ६० मिनट के लिए ३७ ° c पर थर्मल साइकिल चालक में मशीन, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
  3. फॉस्फेट और PNK-स्वास्थ्यकर्मी अरना की एक स्तंभ क्लीनअप निष्पादित करें ।
    1. nuclease-मुक्त पानी के ५० µ l को जोड़कर १०० µ l को वॉल्यूम समायोजित करें । RLT बफर के ३५० µ एल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण । ेतोः के २५० µ एल जोड़ें, pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, और आरएनए शुद्धि स्पिन कॉलम के लिए नमूना हस्तांतरण.
    2. ८,००० x जी पर 15 एस के लिए स्पिन कॉलम एक नया संग्रह ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और RPE बफर के ५०० µ एल जोड़ें ।
    3. ८,००० x जी पर 15 एस के लिए स्पिन प्रवाह के माध्यम से त्यागें और ८०% ेतोः के ५०० µ एल जोड़ें ।
    4. स्पिन 2 मिनट के लिए ८,००० पर एक्स जी एक नया संग्रह ट्यूब करने के लिए कॉलम हस्तांतरण, कॉलम के ढक्कन खोलें, और 5 मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन ।
    5. एक नया संग्रह ट्यूब और nuclease के 14 µ एल के साथ elute-नि: शुल्क पानी, 1 मिनट के लिए पूरी गति से कताई के लिए कॉलम स्थानांतरण सामग्री की ~ 10 µ एल मात्रा ठीक । स्तंभ को छोड़ें । 5 µ के लिए मात्रा को कम ~ 10 मिनट के लिए एक वैक्यूम संकेंद्रण का उपयोग कर l ।
  4. Ligate एक 3 ' अनुकूलक एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. TrueSeq किट 3 परतों से nuclease-मुक्त पानी के साथ 3 ' अनुकूलक (RA3) पतला और aliquots-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. फॉस्फेट और PNK-इलाज आरएनए के 5 µ l करने के लिए, पतला 3 ' अनुकूलक के 1 µ l जोड़ें । 2 मिनट के लिए ७० ° c पर मशीन, और फिर तुरंत बर्फ पर ट्यूब माध्यमिक संरचना गठन को रोकने के लिए जगह है ।
    3. निंनलिखित मिश्रण के 4 µ एल जोड़ें: 5x एचएम के 2 µ एल बंधाव बफर (HML), µ अवरोध करनेवाला के 1 RNase एल, और टी-2 आरएनए µ के 1 ligase एल (छोटा) । 1 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म थर्मल साइकिल चालक पर ट्यूब गर्मी (या खुला ढक्कन के साथ) ।
    4. रिएक्शन थर्मल साइकिल चालक पर शेष ट्यूब के साथ, रोकने के समाधान (एसटीपी) के 1 µ एल जोड़ने और धीरे पूरी मात्रा पिपेट ऊपर और नीचे 6-8 बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । 15 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल साइकिल चालक पर प्रतिक्रिया ट्यूब की मशीन जारी रखें, तो बर्फ पर ट्यूब जगह है ।
    5. 12 µ l का कुल आयतन प्राप्त करने के लिए nuclease-मुक्त जल के 3 µ l का प्रयोग 6 µ l का उपयोग करें और शेष 6 µ l को-८० ° c पर संग्रहित कर लें ।
  5. एक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करते हैं ।
    1. एक पीसीआर ट्यूब में निंनलिखित गठबंधन: अनुकूलक के 6 µ एल-ligated आरएनए और आरएनए आरटी प्राइमर (RTP) के 1 µ एल । 2 मिनट के लिए ७० ° c पर ट्यूब मशीन, तो तुरंत बर्फ पर ट्यूब जगह है ।
    2. निंनलिखित मिश्रण के ५.५ µ एल जोड़ें: 5x के 2 µ एल पहला कतरा बफर, ०.५ µ एल के १२.५ मिमी dNTP मिश्रण, 1 µ एल के १०० मिमी डीटीटी, 1 µ एल के RNase अवरोध करनेवाला, और रिवर्स µ के 1 transcriptase l. 1 घंटे के लिए ५० ° c पर पूर्व गरम थर्मल साइकिल चालक में ट्यूब की मशीन, तो बर्फ पर ट्यूब जगह (नमूनों पर रखा जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस) ।
  6. 11-15 चक्र के साथ पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन 5 ', 3 '-प्राइमरी ligated उत्पाद को समृद्ध करने के लिए ।
    1. प्रत्येक रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करने के लिए, निम्न मिश्रण में से ३५.५ µ l जोड़ें: ८.५ अल्ट्रा शुद्ध पानी की µ एल, पीसीआर मिक्स (पीएमएल) के 25 µ एल, और आरएनए पीसीआर प्राइमर (µ) के 2 RP1 एल । प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक विशिष्ट अनुक्रमित आरएनए पीसीआर प्राइमर के 2 µ एल जोड़ें (RPIX, एक्स = 1 से 24) ।
    2. थर्मल साइकिल चालक में ट्यूब बढ़ाना निम्नलिखित पीसीआर सायक्लिंग शर्तों का उपयोग: ९८ ° c 30 s के लिए; 10 एस के लिए ९८ ° c के 12-15 चक्र; ६० ° c at 30 s; ७२ ° c 30 s के लिए; 10 मिनट के लिए ७२ ° c; फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।

6. पीसीआर उत्पाद क्लीनअप और आकार चयन

  1. गर्म AmpureXP चुंबकीय मोती कमरे के तापमान पर । भंवर मोती जब तक वे अच्छी तरह से फैला रहे हैं, तो जोड़ें ५० µ एल करने के लिए ५० µ l पीसीआर प्रतिक्रिया (1:1 पीसीआर उत्पाद: मोती) । सामग्री मिश्रण करने के लिए दस बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
  2. 15 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर जगह के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी कम से 5 मिनट के लिए, जब तक तरल स्पष्ट दिखाई देता है । निकालें और supernatant के ९५ µ l को छोड़ें ।
  3. नए सिरे से तैयार की २०० µ l को जोड़ें ८०% ेतोः । कम से 30 एस के लिए गर्मी, तो निकालें और मोतियों को परेशान किए बिना supernatant त्यागें । यह एक बार फिर दोहराएं ।
  4. हवा-15 मिनट के लिए या पूरी तरह से शुष्क जब तक मोतियों की सूखी । पुनर्निलंबित ३२.५ µ l resuspend बफ़र के साथ । पिपेट पूरी मात्रा को ऊपर और नीचे दस बार अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ।
  5. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर जगह है, जब तक तरल स्पष्ट दिखाई देता है । एक नई ट्यूब के लिए supernatant के 30 µ एल हस्तांतरण । एक ५० µ एल कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए nuclease मुक्त पानी की 20 µ एल जोड़ें ।
  6. ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) चुंबकीय मोतियों के साथ पीसीआर उत्पादों के आकार का चयन करते हैं ।
    1. ६.५ कदम में तैयार ट्यूब के लिए SPRI मोतियों की 0.7 एक्स मात्रा (३५ µ एल) जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    2. एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और 5 मिनट के लिए या मोती अलग तक प्रतीक्षा करें । मोतियों को परेशान किए बिना सावधानी से supernatant निकालें ।
    3. नए सिरे से तैयार की २०० µ l को जोड़ें ८५% ेतोः । 30 एस के लिए रुको, तो ेतोः निकालें । हवा-10 मिनट के लिए मोती सूखी ।
  7. nuclease-नि: शुल्क पानी के 20 µ एल जोड़ें । चुंबक पर ट्यूब वापस प्लेस, 5 मिनट के लिए रुको, और बंद तरल भाग पिपेट परेशान या मोतियों को छूने के बिना । -20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की दुकान ।

7. पुस्तकालय राशि एवं गुणवत्ता का निर्धारण

  1. २६० एनएम तरंग दैर्ध्य पर एक spectrophotometer के साथ डीएनए की एकाग्रता की जांच करें (अपेक्षित एकाग्रता कम से कम ~ 5-10 एनजी/µ एल) ।
  2. भागो 1 एक उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप का उपयोग करने के लिए आकार वितरण की जांच विश्लेषक पर प्रत्येक नमूने के µ l (उंमीद चोटी 300 में है-400 बीपी ( चित्रा 3देखें)) ।

8. नमूना प्रस्तुत

  1. गैर अतिव्यापी अनुक्रमण पीसीआर बारकोड (1:1 अनुपात) का मिश्रण । उदाहरण के लिए, आरएनए अनुक्रमण कोर के कुल इनपुट नमूना राशि के अनुसार, आरपीआई-1 और आरपीआई-2, आरपीआई-3 और आरपीआई-4 एक साथ बराबर नैनोग्राम मात्रा में नमूनों की पीसीआर उत्पादों का मिश्रण है ।
  2. संयोजन के बाद, कुल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 5 एनजी/µ l और कम से कम एक 10 µ l मात्रा या के रूप में sequencing सुविधा कोर द्वारा अनुशंसित.

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Representative Results

प्रोटोकॉल का उपयोग ऊपर वर्णित है, GABAergic न्यूरॉन्स मैन्युअल रूप से क्रमबद्ध थे (1 चित्रा) और आरएनए परिलक्षित किया गया था, तो एक सीडीएनए पुस्तकालय में बनाया (चित्रा 2) और उच्च गहराई पर अनुक्रम8. प्रवर्धित आरएनए (अरना) उत्पादों का आकार 200 – 4000 bp के बीच होता है, एक पीक वितरण के साथ थोड़ा ऊपर ५०० bp (चित्र 3ए) । मनका-शुद्ध सीडीएनए पुस्तकालय और आकार-शुद्धि के एक दूसरे दौर के द्वारा प्रतिबंधित मोतियों का उपयोग कर रहा है कि छोटे टुकड़े से कम २०० बीपी ( 3बी और सी सी) और एक चोटी के साथ ~ ३५० बीपी समाप्त । छोटे टुकड़े होने के लिए खाली पुस्तकें ले जाएगा (कोई mRNA आवेषण, केवल अनुकूलक और प्राइमर अनुक्रम), जबकि अब टुकड़े प्रवाह कोशिकाओं पर अधिक स्थान पर कब्जा होगा, कुल पढ़ने के उत्पादन को कम करने । sequencing पर, हम नियमित रूप से प्राप्त एक ४.८ x 105 माध्य, या ६.९ x 105 प्रति मैप किया गया औसत कक्ष (चित्र 4a) के अनुसार पढ़ता है । डुप्लिकेट आरएनए हटाने के बाद UMIs का उपयोग करते हुए, प्रत्येक एकल कोशिका एक १.० x 105 माध्य, या १.४ x 105 औसत अद्वितीय पढ़ता प्रति कक्ष (चित्रा 4B) था । प्रत्येक एकल कोशिका में बाहरी आरएनए नियंत्रण कंसोर्टियम (ERCC), कील-आरएनए में एक आंतरिक नियंत्रण है जिसके लिए नमूने में जोड़े गए अणुओं की निरपेक्ष संख्या गणना की जा सकती के रूप में इस्तेमाल किया गया था । देखा गिनती के लिए इनपुट के एक रैखिक संबंध था, ०.९२ की एक ढलान और समायोजित आर2 = ०.९४ (चित्र 4c) के साथ । हम एक ंयूरॉन प्रति औसत ~ १०,००० जीन का पता लगाया (~ ७,५०० से १२,००० जीन को लेकर/), के साथ > एक का पता लगाने कोशिकाओं का ९५% के साथ > ६,००० जीन (चित्रा 4d-4F) । यह संख्या समान माउस मस्तिष्क से प्रकाशित डेटा के खिलाफ पक्ष की तुलना करता है-व्युत्पंन एकल ंयूरॉंस (जैसे, 1865-Zeisel एट अल में 4760 जीन । 9, ७,२५० जीन Tasic एट अल में । 10, और Okaty एट अल में ८,००० जीन । 11). पाठकों Poulin एट अल करने के लिए निर्देशित कर रहे हैं । एक विस्तृत तुलना के लिए 12 ।

Figure 1
चित्रा 1 : दिवा-Seq के बाद न्यूरॉन्स के मैनुअल छंटाई के कार्यप्रवाह. ताजा माउस दिमाग एकत्र और कटा हुआ था, और ब्याज के क्षेत्र microdissected था । एकल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ंयूरॉंस मैंयुअल रूप से एकत्र किए गए और रैखिक प्रवर्धन के दो दौर के प्रयोग से प्रवर्धित इन विट्रो प्रतिलेखन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 2
चित्रा 2 : दिवा के योजनाबद्ध कार्यप्रवाह-प्रवर्धन के दो दौर के साथ Seq जबकि अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMIs) या उगाते-टैग को शामिल । नमूना बार कोड (SBC) प्रत्येक एकल कक्ष इसके 9-न्यूक्लियोटाइड कोड (चैती) द्वारा पहचाना जा करने के लिए अनुमति देता है । UMI यादृच्छिक न्यूक्लियोटाइड 10 बीपी की लंबाई में एक खिंचाव है कि प्रत्येक प्राइमर इस्तेमाल के लिए अलग है । bioinformatics कदम के दौरान, दो मैप्ड एक ही UMI अनुक्रम होने टेप केवल एक बार गिना जाएगा, इस प्रकार प्रवर्धन डुप्लिकेट को नष्ट करने और निरपेक्ष प्रतिलिपि गिनती के लिए अनुमति देता है । RA5 और RA3 sequencing प्राइमरों हैं, और T7-RA5 प्राइमर पहले दौर T7 उत्पादों के लिए अरना दृश्यों को जोड़ने के लिए इतना है कि T7 आरएनए पोलीमरेज़ कर सकते हैं और रैखिक प्रवर्धन के एक दूसरे दौर प्रदर्शन द्वारा इन विट्रो प्रतिलेखन की जरूरत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : उदाहरण के विश्लेषक भूखंड । (क) अरना आकार वितरण लगभग ५०० bp. X-अक्ष पर एक चोटी के साथ 200-4000 bp के बीच होना चाहिए मनमाने ढंग से प्रतिदीप्ति इकाई [फू] है । (ख) मनका सफाई के बाद सीडीएनए पुस्तकालय उत्पादों का आकार वितरण । (C) आकार वितरण के बाद 0.7 x SPRI आकार चयन (चरण ६.६) के आसपास एक चोटी के साथ ३५० bp.

Figure 4
चित्र 4 : उदाहरण अनुक्रम पढ़ें वितरण और दिवा-Seq8 के बाद मैन्युअल रूप से क्रमबद्ध न्यूरॉन्स से जीन का पता लगाने . (A) कुल मैप किए गए पठन बंटन । (ख) कुल अद्वितीय पुस्तकें वितरण । (ग) ERCC पढ़ता परिमाण के 4 आदेश पर रैखिक रिश्ता दिखाओ । (घ) जीन का पता चला बनाम पढ़ें गिना जाता है कि > 95% एकल सेल है > 6000 जीन/ (ङ) जीन का पता लगाया के बीच 6 न्यूरॉन प्रकार तुलना कर रहे हैं. (च) प्रति कोशिका पाई गई जीन का वितरण, भू प्रवेश #GSE92522. यह आंकड़ा पॉल एट अल से अनुकूलित किया गया है । 8. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

बफ़र आइटम एकाग्रता राशि (µ l)
नमूना संग्रह बफ़र रिकॉमबिनेंट ribonuclease अवरोधक ५५
ERCC 1:50K पतला ११०
Nuclease नि: शुल्क पाणी ६०५
Aliquot ४३.७५ µ एल ऊपर की 16 ट्यूबों में (2 स्ट्रिप्स के 8; २०० µ l पीसीआर ट्यूबों); प्रति ट्यूब निंनलिखित जोड़ें
T7-UMI-प्राइमर्स (उदा. N10B1-N10B16) 1 एनजी/µ एल ६.२५ µ एल ट्यूब/
प्रत्येक ट्यूब ५० µ एल में अंतिम मात्रा (प्रत्येक ट्यूब 25 µ एल aliquots में विभाजित किया जा सकता है और पर जमे हुए-८० डिग्री सेल्सियस)
समाधान: आइटम एकाग्रता राशि
ACSF: 5 L को भंग करना Nacl १२६ एमएम ३६.८ छ
KCl 3 मिमी १.१५ छ
णः2पो4 १.२५ एमएम ०.७५ छ
NaHCO३ 20 एमएम ८.४ छ
ACSF के ५०० मिलीलीटर, 10-15 मिनट के लिए बुलबुला ऑक्सीजन तो हर बार ताजा निंनलिखित जोड़ने के लिए:
D-ग्लूकोज 20 एमएम १.८ छ
MgSO4 2 मिमी ०.५ एमएल से 4 मीटर स्टॉक
CaCl२ 2 मिमी ०.५ एमएल से 4 मीटर स्टॉक
बाहर के माध्यम से ACSF oxygenated रखें
समाधान: आइटम एकाग्रता
गतिविधि अवरोधक कॉकटेल: एक 100x शेयर बनाओ
ते १०० मिलि ACSF जोड
APV ०.०५ एमएम
CNQX ०.०२ एमएम
TTX ०.०००१ मिमी (०.१ µ मीटर)
समाधान: आइटम राशि
चिढ़ाना soltion (१०० मिलि) Streptomyces griseus से छेड़-छाड़ १०० मिलीग्राम
भ्रूण गोजातीय सीरम: वाणिज्यिक स्रोत, प्रत्येक उपयोग के लिए ५०० µ l में aliquot.

तालिका 1: समाधानों और बफ़र्स की सूची ।

तालिका 2: प्राइमरों और दृश्यों की सूची । N10B1-N10B96 पहले कतरास प्राइमरी हैं और T7-RA5 दूसरे दौर की प्राइमरी है. कृपया यहां क्लिक करें इस तालिका डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

मैनुअल छँटाई प्रोटोकॉल है कि या तो कम चूहों मस्तिष्क में लेबल कर रहे हैं या एक दुर्लभ कोशिका जनसंख्या है कि अन्यथा वर्तमान उच्च प्रवाह सेल का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ंयूरॉन आबादी के एक निगरानी आरएनए अनुक्रमण के लिए उपयुक्त है छंटाई और प्रवर्धन तरीकों । FACS के अधीन कोशिकाओं को आमतौर पर ~ 9 – 14 साई की सीमा में म्यान और नमूना लाइन के दबाव से गुजरना, नोजल आकार और वांछित घटना दरों पर निर्भर करता है । इसके अलावा, पर नोक से बाहर किया जा रहा है, कोशिकाओं संग्रह ट्यूब या कुओं के साथ लेपित नमूना प्रभाव तनाव पैदा कर बफर के साथ सतह पर कड़ी मेहनत कर सकते हैं । मैनुअल छंटाई के दौरान, इस तरह के उच्च दबाव कभी लागू नहीं कर रहे हैं, के रूप में कोशिकाओं केशिका कार्रवाई से पिपेट में चूसा और धीरे से उंहें बाहर उड़ाने और बस कांच पिपेट के सुझावों को तोड़ने से निष्कासित कर रहे हैं । दिवा-Seq प्रोटोकॉल छोटे सेलुलर संस्करणों (< 8 µ l) और कम प्रारंभिक सामग्री के साथ कोशिकाओं से आरएनए प्रवर्धन के लिए उपयोगी है और लगातार (8-10 K), जो, जब गहरी अनुक्रमण के साथ युग्मित, विस्तृत के लिए अनुमति देता है जो detectable जीन की बड़ी संख्या की पैदावार सेलुलर कार्यों की एक सुसंगत आणविक तस्वीर के पुनर्निर्माण सेल पहचान8,13,14अंतर्निहित । कोशिका संग्रह कदम की शुद्धता के कारण, जीन का पता लगाने की उच्च संवेदनशीलता, और निरपेक्ष अणु गिनती प्रदर्शन करने की क्षमता, इस विधि उच्च गहराई और परिशुद्धता के साथ सेलुलर राज्यों और रोग pathophysiology का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है.

जबकि प्रवर्धित आरएनए की उपज और जीन का पता लगाने की डिग्री इस प्रोटोकॉल में अपेक्षाकृत अधिक है, कुछ प्रक्रियात्मक उपायों में निरंतरता बनाए रखने में मदद करते हैं । दूसरी किनारा संश्लेषण के दौरान, विधानसभा बर्फ पर किया जाना चाहिए, थर्मल साइकिल चालक इकाई को हस्तांतरण से पहले पूर्व ठंडा होना चाहिए, और प्रतिक्रिया सख्ती से 16 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए (या थोड़ा नीचे) अरना उपज को कम कर सकते हैं कि hairpins के गठन से बचने के लिए. यह भी दूसरे-किनारा संश्लेषण के दौरान 16 डिग्री सेल्सियस से अधिक 2 ज से अधिक नहीं की सलाह दी है, और यह सीडीएनए शुद्धिकरण कदम के रूप में जितनी जल्दी हो सके कदम करने के लिए महत्वपूर्ण है । IVT कदम के दौरान, कम से 12 घंटे के लिए मशीन अरना उपज कम हो सकता है, जबकि IVT समय के 14 ज से अधिक कुछ अरना क्षरण में परिणाम हो सकता है ।

हम कूड़े से एक ही इनपुट नमूना के साथ एक तुलनात्मक अध्ययन प्रदर्शन नहीं किया FACS और मैनुअल छंटाई के अधीन साथियों-Seq का उपयोग कर; इसलिए, हम दावा नहीं करते कि किसी विशेष जीन श्रेणी FACS में और मैनुअल छंटाई में नहीं अनियमित है । दोनों FACS और मैनुअल छंटाई की संभावना जीन अभिव्यक्ति कलाकृतियों के कुछ डिग्री परिचय होगा । अंतर जीन अभिव्यक्ति स्थितियों के लिए, किसी भी ऐसे प्रभाव सिद्धांत में होना चाहिए बाहर एक दूसरे को रद्द, के रूप में यह दोनों नियंत्रण और नमूना समूहों में प्रकट हो जाएगा । हाल ही में, प्रतिलेखन अवरोधकों का एक कॉकटेल तत्काल जल्दी जीन अभिव्यक्ति के सक्रियकरण को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और इस तरह के कदम भी इस प्रोटोकॉल15को शामिल किया जा सकता है ।

मैनुअल छंटाई प्रक्रिया कोमल और जल्दी है (आमतौर पर 90-160 मिनट) FACS की तुलना में (नमूना तैयारी के समय को छोड़कर) है कि घनत्व ढाल केंद्रापसारक, व्यवहार्यता, cytotracker रंगों के साथ धुंधला, और बाद छंटाई दृश्य की आवश्यकता है । मैनुअल छँटाई कुओं पर छंटाई पर उच्च म्यान दबाव और प्रभाव तनाव के लिए कोशिकाओं विषय नहीं है । यह भी oxygenated ACSF के पास लगातार उपयोग की अनुमति देता है और समग्र एक मेहमाननवाज और कम तनावपूर्ण छंटाई वातावरण प्रदान करता है, जो कोशिकाओं है कि उच्च चयापचय की मांग के साथ तेजी से spiking कोशिकाओं के रूप में तनाव के प्रति संवेदनशील है के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है । दिवा-Seq में वर्तमान में, अप करने के लिए ९६ कोशिकाओं को रिएजेंट लागत को बचाने और सेल प्रति उच्च जीन गिनती के साथ पूर्ण mRNA गिनती प्रदान करने के लिए मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है ।

हालांकि, इस विधि के लिए कमियां हैं; उदाहरण के लिए, मैनुअल छंटाई एक प्रारंभिक आबादी के रूप में विश्वसनीय फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं की जरूरत है । यह स्वाभाविक रूप से एक कम प्रवाह प्रक्रिया है, प्रत्येक छंटाई सत्र के साथ अपनी अधिकतम, जो काफी कम है पर FACS 32-64 कोशिकाओं उपज । मैनुअल छंटाई भी ठीक मोटर कौशल और कुछ अभ्यास के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत ग्लास पिपेट में हेरफेर और microcapillary पिपेट में एकल कोशिकाओं पर कब्जा करने की आवश्यकता है । दिवा-Seq प्रवर्धन ३ '-पक्षपाती; इसलिए, यह पूरे transcriptome प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है और यह भी ब्याह isoform पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों रहे हैं ।

Acknowledgments

यह काम NIH (5R01MH094705-04 और R01MH109665-01 से Z.J.H.), CSHL Robertson तंत्रिका विज्ञान कोष (Z.J.H.) द्वारा, और एक NARSAD पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप (एपी करने के लिए) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes Thermo Fisher Cat# 4456740
SuperScript III Thermo Fisher Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer New England Biolabs Cat# E6105S
RNA MinElute kit Qiagen Cat# 74204
Antarctic phosphatase New England Biolabs Cat# M0289
Poly nucleotide kinase New England Biolabs Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated New England Biolabs Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads Beckman Coulter Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads Thermo Fisher Cat# B23317
DL-AP5 Tocris Cat# 0105
CNQX Tocris Cat# 1045
TTX Tocris Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich Cat# P5147
Message Amp II kit Thermo Fisher Cat# AM1751
Carbogen Airgas Cat# UN3156
Sylgard 184 Sigma-Aldrich Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit Illumina Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip Agilent Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip Agilent Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100 Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F). Leica Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. Warner instruments Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller Sutter Instruments Co P-97
Vibratome Thermo Microm HM 650V
Vibratome tissue cooling unit Thermo Microm CU 65

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References

  1. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
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  3. Xin, Y., et al. Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).
  4. Gao, R., et al. Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer. Nature Communications. 8 (1), 228 (2017).
  5. Yuan, J., Sims, P. A. An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq. Scientific Reports. 6, 33883 (2016).
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  14. Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor. Nature Communications. 9 (1), (2018).
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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १४० मैनुअल छंटाई ंयूरॉन एकल सेल आरएनए अनुक्रमण दिवा-Seq इन विट्रो प्रतिलेखन रैखिक प्रवर्धन अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (UMI)
एकल सेल आरएनए अनुक्रमण के साथ फ्लोरोसेंट लेबल माउस ंयूरॉंस मैनुअल छंटाई और डबल इन <em>विट्रो</em> प्रतिलेखन के साथ निरपेक्ष गणना अनुक्रमण (DIVA-Seq)
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Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell… More

Paul, A., Huang, Z. J. Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq). J. Vis. Exp. (140), e58690, doi:10.3791/58690 (2018).

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