Summary
이 프로토콜 수동을 정렬 mRNA 증폭 높은 깊이 단일 셀 RNA 시퀀싱 전사 기반 생체 외에서 다음 단일 붙일 레이블된 신경 세포를 분리 하는 절차에 설명 합니다.
Abstract
단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 지금 유전자 발현 시 금 한 널리 구현 된 도구 이다. 상업적으로 사용 가능한 단일 셀 RNA 시퀀싱 플랫폼 무차별 모든 입력된 셀 처리합니다. 때때로, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 관심의 구체적으로 레이블이 지정 된 인구를 분리 하 상류 사용 됩니다. FACS의 한계는 수집 하 고 쥐의 뇌에서 드문 또는 띄엄띄엄 레이블이 신경 인구를 프로 파일링에 대 한 실용적인 크게 레이블이 분수 입력된 셀의 높은 숫자에 대 한 필요는. 여기, 우리는 수동으로 수집 스파스 붙일 갓에서 단일 뉴런을 표시 해리 마우스 뇌 조직에 대 한 메서드를 설명 합니다. 이 프로세스는 높은 순도와 생체 외에서 전사 기반 증폭 프로토콜 생 성적 비율을 유지 하는 후속 통합 단일 레이블 뉴런을 캡처에 대 한 수 있습니다. 개별 mRNA 카운트를 생성 하기 위해 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하는 이중 선형 증폭 방법을 설명 합니다. 증폭 결과 단일 셀 당 유전자 검출의 높은 학위에서의 2 라운드.
Introduction
단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) transcriptomic 연구 변신 했다. 대규모 단일 셀 RNAseq 다양 한 방울1,2, 마이크로3, nanogrids4, microwells5와 같은 기술 사용 하 여 수행할 수 있지만 대부분 메서드 정의 된 셀을 정렬할 수 없습니다. 그 유전자 인코딩된 fluorophores를 표현 한다. 선택 세포 인구를 격리 하려면 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀 모드에서 레이블이 지정 된 셀을 정렬 하려면 종종 사용 됩니다. 그러나, FACS 몇 가지 제한 사항이 있으며 세심 한 샘플 처리 단계가 필요 합니다. 첫째, 입력된 셀의 많은 수는 일반적으로 상당한 분수 (종종 몇 백만 셀 mL 당), 필요 (> 15-20%) 레이블이 지정 된 인구를 포함 하. 둘째, 셀 준비 조밀도 기온 변화도 원심 분리 단계 폐해 분수, 파편, 및 그렇지 않으면 노즐 또는 흐름 셀을 방해할 수 있습니다 세포 덩어리를 제거 하의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다. 셋째, FACS 일반적으로 얼룩이 지 고 라이브/죽은 (예를 들어, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium 요오드 화물 (PI), 및 Cytotracker 염료) 얼룩, 추가 시간을 소요 하기 위한 단계를 destaining을 사용 합니다. 넷째, 엄지손가락의 규칙 2-색상 정렬 (예: DAPI 및 그린/레드 형광 단백질 (GFP/RFP)), 일반적으로 두 개의 예제 및 컨트롤은 필요에 따라 원하는 마우스 긴장 뿐만 아니라 처리 됩니다 레이블된 샘플을 요구. 다섯째, 필터링은 종종 수행 하기 전에 여러 번 샘플 FACS 기계에 막힌된 샘플 라인을 사전 방지 하기 위해 정렬 하는 동안. 여섯째, 가장 일반적으로 사용 되 FACS 설정을 초기화 하 고 유체 흐름을 안정화 고 방울 캘리브레이션을 수행에 시간을 할당 해야 합니다. 예제는 일반적으로 보상 행렬, 더블 릿 거부 설정, 중 문, 등 사용자 설정 단계 6과 7 스스로 미리 또는 필요에 대 한 실제 샘플 컬렉션 이전 순서 대로 실행 하는 7, 제어는 동시에 기술자의 지원입니다. 마지막으로, 포스트-FACS, 종종 하나의 분류에 셀에 각 잘; 있는지 확인 하는 단계는 예를 들어 빠른 판 영상 등이 콘텐츠 심사 설치에 샘플 검사 여.
위에서 설명한 단계를 우회 하 여 붙일 레이블이 단일 뉴런의 작은 인구의 시퀀싱을 대상으로 비교적 빠른 촉진 수동 절차 뒤에 매우 민감한 체 외 의 2 라운드 정렬 설명 증폭 프로토콜, 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 두 번 시험관 전사 라는. RNA 증폭 및 cDNA 라이브러리 생성은 Eberwine 그 외 여러분 에서 적응 6 와 Hashimshony 외. 7, 작은 세포 볼륨; 있는 마우스 수에 맞게 특정 수정 또한, 우리는 또한 흥분 성의 피라미드 뉴런에 대 한 동등 하 게 유용 하다 발견.
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Protocol
동물 주제를 포함 하 여 모든 절차는 찬 봄 항구 실험실, 뉴욕 (IACUC #16-13-09-8)에 IACUC에 의해 승인 되었습니다.
1. 수동 정렬 붙일 레이블이 마우스 뉴런의
- 10-15 µ m 출구 직경 모 세관 끌어당기는 사람을 사용 하 여 다음 설정을 가진 유리 microcapillaries ( 재료의 표참조)를 당겨: 열: 508, 풀: 비어 벨: 빈, 시간: 빈.
- 120-150 cm 유연한 실리콘 튜브 (~0.8 m m 내경) 0.2 µ m polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 주사기 필터와 적당 한 튜브 커넥터를 사용 하 여 양방향 튜브 밸브에 연결 합니다.
- 냉장된 (4 ° C) 인공 뇌 척추 액체 (실제, 표 1)의 500 mL를 준비 하 고 15 분 동안 또는 솔루션 될 때까지 완전히 한 airstone 통해 버블링 균형 5% 이산화탄소 산소에 의해 산화.
- 150 mL 비 커 (표 1)에 활동 차단제의 칵테일 실제의 100ml 준비 합니다.
- 1 mg/mL 150 mL 비 커 (표 1)에 구 분수 IV 효소와 실제의 100ml 준비 합니다.
- 150 mL 비 커에 1% 소 태아 혈 청 (FBS) 솔루션으로 실제의 100 mL를 준비 하 고는 airstone 통해 균형 5% 이산화탄소 산소와 산소.
- 작은 위 가진는 두개골을 열고 신선한 두뇌 피 질 손상 없이 정밀한 집게를 사용 하 여 추출 하 여 안락사 마우스에서 뇌를 해 부.
참고: 어떤 긴장, 나이 및 성별의 마우스를 사용할 수 있습니다으로 원하는. 뇌 동결 또는 바이러스 또는 다른 유해/전염 성 요원을 주입 하는 쥐에 수동 정렬 수행 하지. - 냉장 및 산소는 airstone는 단면 전체 기간 동안 5% 이산화탄소 균형 산소에 연결 된 떠나 실제 뇌를 유지.
- Vibratome 척에 두뇌 놓고 300 µ m 두께에 코로나 또는 화살 섹션을 잘라. ~ 10-50의 최소 얻기 위해 필요에 따라 많은 섹션을 수집 몇 백 셀 까지의 셀을 표시. 코 튼 메쉬 슬라이스 홀더, 그래서 그들은 산소 실제 목욕 비 커 안에 배치에 슬라이스를 넣어.
- 실제 활동 차단제와 실 온에서 15-20 분에 대 한 블록 포함 된 비 커에 신선한 분할 영역을 이동 합니다. 버블링 산소 airstone를 사용 하 여 유지.
- 실내 온도에 약한 소화를 수행 하기 위해 효소 솔루션 실제를 포함 하는 비 커에 슬라이스를 이동: P4 14 동물에 대 한 20-30 분 또는 45-60 분 P28-56 동물에 대 한 최대. 버블링 산소를 유지.
- 실 온에서 5-10 분에 대 한 활동 차단 솔루션으로 실제를 포함 하는 비이 커에 다시 분할 영역을 이동 하 여 효소와 실제 충분히 세척 한다. 버블링 산소를 유지.
- 실제 1% 포함 된 100 mm 페 트리 접시에 개별 섹션을 이동 상 온에서 FBS. 형광 절 개 범위, microdissect 지역 및 관심의 레이어 (몇 백)까지 10-50 셀의 최소 데. 고급 포 셉 또는 22-28 G 주입 바늘 나무 홀더 (꼬치)에 연결 하 여 한 켤레와 서를 수행 합니다.
- 1%의 ~0.8 mL를 포함 하는 2 mL microfuge 관 microdissected 조각 이동 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 실제 솔루션에서 FBS.
- 실 온에서 microfuge 관에서 해 부 조직 triturate 3 긴 줄기 파스퇴르 펫 열린 불꽃 이상 그들을 압 연 하 여 출구 직경을 감소와 함께 확인 합니다. 각 피 펫와 ~ 10 선을 수행 큰 및 작은와 끝 시작.
- 산소 실제 포함 된 100 mm 페 트리 접시에 해리 셀을 분배 (페 트리 접시 1 %agar 또는 투명 실리콘 1시 10분에서 화합물의 5 m m 얇게 코팅 될 수 비율, 필요한 경우). 실내 온도에서 보관.
- 점차적으로 정착, 다음 해 부 현미경 GFP/RFP 신호를 관찰 하는 셀에 대 한 대기 ~ 5-7 분.
참고: 단일 셀, 파편, 및 작은 덩어리 밝은 (BF) 필드에 표시 됩니다. - 유연한 실리콘 튜브에 부착 된 (단계 1.1)에서 모 세관 피 펫을 사용 하 여 한 번에 10-15 GFP/RFP 셀 선택 (0.4-0.8 m m 내경) 신선한 산소 실제 포함 된 100 mm 페 트리 접시에 셀을 분배 하 고.
- 혀로 튜브 밸브의 끝을 차단 하 여 관심의 셀 가깝게 모 세관을 두십시오. 셀 블록을 덜어 시 모 세관 동작을 사용 하 여 캡처하고 피펫으로 입력에서 과잉 액체를 방지 하기 위해 신속 하 게 다시 차단 합니다. 부드럽게 불어, 해 부 현미경의 형광 광학에서 모 세관 끝을 관찰 하는 동안 100 mm 페 트리 접시 신선한 산소 실제에 셀을 분배. ~ 100-150를 수집 하는 목적은 세포 총.
- 반복 단계 1.19 번 더 (파편)에 따라 고 전송 ~ 50-75의 총 세포 새로운 100 mm 페 트리 접시, 파편 등 오염 물질은 밝은 필드 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 광학에서 최소한의 확인.
- 마지막으로, 0.5 µ L 볼륨 보다 더에 단일 셀을 선택할 때마다 신선한 microcapillary 피 펫을 사용 하 여, 고 추방 단일 0.2 mL microfuge 관으로 (또는 8 0.2 mL microfuge 관의 한 스트립) 뇌관으로 샘플 컬렉션 버퍼의 1 µ L을 포함 하 N10B1-N10B96 (표 2). 셀 컬렉션 버퍼에 유지 하기 위해 microfuge 관에서 피 펫 팁을 휴식. 펫을 삭제 합니다.
- 고정 셀 튜브 드라이 아이스에 넣어 하 고 그들을 저장 하 여 장기-80 ° C 냉동 실에 그들은 RNA 증폭 처리할 준비가 될 때까지.
2. 첫 라운드 RNA 증폭
참고: 다음 절차 8 0.2 mL microfuge 관의 단일 스트립입니다. 필요에 따라 반응 비율.
- 합성 된 cDNA의 첫 번째 가닥 (1 회전).
- 5 분 뒤에 5 분; 4 ˚C 70 ˚C에서 1.22 단계에서 열 제거 두 번 반복 합니다.
- 얼음 역전사 (RT) 마스터 믹스/먼저 물가 종합 마스터 믹스 다음과 같은 성분 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 조립: 첫 번째 가닥 버퍼 (2 µ L), dNTP 믹스 (4 µ L), RNase 억제제 (1 µ L), 그리고 효소 (1 µ L) x 10.
- 짧게 원심 하단에 모든 것을 수집 하는 탁상 원심 분리기에 스트립. 얼음에 계속.
- 위의 튜브에 RT 마스터 믹스/먼저 물가 종합 마스터 믹스의 1 µ L를 추가 (전체 셀 컬렉션에서 샘플 버퍼의 1 µ L + RT의 1 µ L의 용량 = 2 µ L/튜브). Pipetting으로 잘 섞는다. 짧게 하단에 전체 콘텐츠를 수집 하 여 얼음에 계속 회전 합니다.
- 위의 튜브/s 공기 오븐에서 2 h 42 ° C에서 품 어. 즉시 반응을 종료 하 고 두 번째 가닥 합성 단계를 진행 하는 얼음에 튜브를 넣어.
- 두 번째 가닥은 cDNA의 합성 (1 회전).
- 1.5 mL 튜브에 다음 순서로 얼음에 두 번째 가닥 마스터 믹스 (80 µ L) 확인: nuclease 무료 물 (63 µ L), 두 번째 가닥 버퍼 (10 µ L), dNTP 믹스 (4 µ L), DNA 중 합 효소 (2 µ L), 그리고 RNaseH x 10 (1 µ L). Vortexing, 다음 하단에 수집 하 여 얼음에 계속 회전 하 여 잘 재료를 혼합.
- 사전 냉각 장치, 단계 2.2.3 시작할 준비가 다음 프로그램을 실행 시작 열 cycler (뚜껑 열 = 해제; 2 h, 4 ° C 보류에 대 한 16 ° C), 그리고 16 ° c.에 일시 중지
- 80 µ L/스트립 (또는 10 µ L/튜브) 지구 그리고 계속의 각 튜브를 두 번째 가닥 마스터 믹스의 얼음에 추가 합니다. 열 cycler 스트립 전송 및 위에 시작 하는 16 ° C 단계를 다시 시작. 2 h 16 ° c.에 대 한 스트립을 품 어
- 두 번째 가닥 합성 단계 후 다음 cDNA 정화 단계를 진행 하는 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 두 배 좌초 된 cDNA를 정화 (1 회전).
참고: 모든 centrifugations는 실 온에서 ~ 8000 x g에서 수행 됩니다. 16000 x g 필터 카트리지 손상을 방지를 초과할 수 없습니다.- 건조가 열 블록에 나중에 사용에 대 한 50-55 ° C에 nuclease 무료 물 100 µ L를가 열 시작 합니다. CDNA의 부분적인 변성을 방지 하기 위해 58 ° C 초과할 수 없습니다.
- 1.5 mL 튜브에 cDNA 바인딩 버퍼의 250 µ L를 추가 합니다. 버퍼, 침전 물에 대 한 확인 후 다시 침전을 해산 하기 위해 10 분 동안 37 ° C에 버퍼 솔루션 따뜻한.
- 하나의 8 튜브 스트립의 cDNAs cDNA 바인딩 버퍼에 전송. 추가 다운스트림 프로세스 1 관 (8 셀)이이 단계에서 셀을 결합 한다. 철저 하 게 2-3 번 pipetting 여 터치 믹스 3-4 회. 하단 콘텐츠를 수집 하는 스핀.
- 단단히 (는 생체 외에서 전송 (IVT) kit)에서 세척 튜브에 cDNA 필터 카트리지를 넣어. 필터의 중앙에 위의 믹스를 추가 합니다. ~ 1 분 또는 때까지 필터를 통해 8000 x g에서 원심. 흐름을 통해 삭제 하 고 세척 관을 대체 합니다.
- 열에 IVT 키트에서 500 µ L의 워시 버퍼를 추가 합니다.
참고: 이전 그 에탄올 세척 버퍼에 추가 되어 있는지 확인 합니다. - ~ 1 분 또는 때까지 필터를 통해 8000 x g에서 원심. 흐름을 통해 그리고 다시 카트리지를 ~ 1 분 8000 x g에서 원심 분리기를 삭제 합니다.
- CDNA 차입 튜브 (1.5 mL nuclease 무료 튜브)에 cDNA 필터를 전송 합니다. 필터의 중앙에 미리 따뜻하게 nuclease 무료 물 8.5 µ L를 적용 됩니다. 2 분 동안 기다려와 ~1.5 분 8000 x g에서 원심.
- 미리 따뜻하게 nuclease 무료 물 8.5 µ L로 다시 elute 고 즉시 첫 번째 라운드 IVT 계속 합니다.
참고: 더블-좌초 된 cDNA 복구 볼륨 ~ 16 µ L를 있을 것입니다.
- CDNA에서 증폭 된 RNA (aRNA) 생산을 위한 생체 외에서 전송 (IVT) 반응 수행 (1 회전).
- 37 ° c.에 교 잡 공기 오븐을 설정
- 다음 순서로 얼음 IVT 마스터 믹스 준비: 단계 2.3.8에서에서 eluted 더블-좌초 된 cDNA의 16 µ L, 추가 4 µ L의 T7 ATP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 CTP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 GTP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 UTP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 10 x 반응 버퍼; 그리고 4 µ L T7 효소 혼합의. 잘 혼합, 회전, 및 얼음 만요.
- CDNA의 16 µ L을 포함 하는 각 관에 IVT 마스터 믹스의 24 µ L를 추가 합니다. 철저 하 게 하 고 부드럽게 pipetting으로 내용을 혼합. 14 h 37 ° C에서 튜브를 품 어.
참고: 보육에 대 한 < 12 h 수율에 심각 하 게 영향을 미칩니다. - 비 diethyl pyrocarbonate (비 DEPC)의 60 µ L 처리 RNase 무료 물 100 µ L 볼륨을 증가 IVT 반응을 중지를 추가 합니다.
- 정화는 aRNA.
참고: 모든 centrifugations는 실 온에서 ~ 8000 x g에서 수행 됩니다. 16000 x g 필터 카트리지 손상을 방지를 초과할 수 없습니다.- ~ 200 µ L nuclease 무료 50-55 ° C를 위한 물의 건조 난방 블록 또는 PCR 기계에 나중에 사용할 난방을 시작 합니다. ARNA의 부분적인 변성을 방지 하기 위해 58 ° C 초과할 수 없습니다.
- 1.5 mL nuclease 무료 튜브 aRNA 전송. 각 aRNA 샘플 aRNA 바인딩 버퍼의 350 µ L를 추가 합니다. 100% 에탄올 각 튜브와 혼합 하 여 3 번 pipetting (혼합 하 고 회전 소용돌이 하지 마)의 250 µ L를 추가 합니다.
- 전송 믹스 즉시 RNA 정화 열 부드럽게 필터 카트리지의 센터에 추가 하 여. 원심에서 8000 x g ~ 1 분 또는 때까지 혼합 필터 완전히 통과 했다. 폐기물 수집 튜브를 재사용 하 고 흐름을 통해 삭제
참고: RNA 에탄올의 추가 따라 계기 시작 됩니다. - 각 필터 카트리지를 워시 버퍼의 650 µ L를 추가 합니다. G x 또는 전체 버퍼를 지날 때까지 8000 ~ 1 분에 대 한 원심 분리기. 통해 흐름 무시 하 고 워시 버퍼의 흔적을 제거 하는 추가 ~ 1 분에 대 한 필터를 회전.
- 신선한 aRNA 컬렉션 튜브를 필터를 전송 합니다. 필터의 중앙에 미리가 열 (50-55 ° C) nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 동안 기다립니다 다음 8000 g x 또는 컬렉션 튜브에 지날 때까지에 ~1.5 분 원심.
3. 두 번째 라운드 증폭
- 첫번째 물가 cDNA를 합성 (2 차).
- 전송 aRNA 단계 2.5.5 200 µ L microfuge 관 고 진공 집중 100 µ L 10 µ L. 감소 볼륨 추정 200 µ L 튜브에 물 10 µ L와 65 분 비교에 대 한 집중 하는 진공 장치를 실행, 열을 사용 하 여 elutant.
- 42 ° c 교 잡 공기 오븐 예 열
- ARNA, 짧게, 소용돌이를 IVT 키트에서 임의의 hexamer 뇌관의 2 µ L을 추가 하 고 내용을 수집 하 스핀.
- 열 cycler에 10 분 동안 70 ° C에서 microfuge 관 품 어 다음 얼음에 그것을 배치.
- 다음 실시간 마스터 믹스 준비: 첫 번째 가닥 합성 버퍼, dNTP 혼합의 4 µ L, 1 µ L의 RNase 억제제, 및 ArrayScript 효소의 1 µ L 10의 2 µ L. 부드럽게 vortexing에 의해 200 µ L microfuge 관에서 잘 믹스는 다음 내용을 수집 하 여 얼음에 회전.
- 8 추가 RT 마스터의 µ L 각 microfuge 관 (첫 번째 가닥) 혼합. 2 h 42 ° C 공기 인큐베이터에 튜브를 놓습니다.
- 위의 반응에 RNaseH의 1 µ L를 추가 합니다. Pipetting 2-3 시간 하 고 터치 하 여 잘 혼합 3-4 회, 그리고 내용을 수집 하는 스핀. PCR 기계에 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 부 화, 후 즉시 두 번째 가닥 합성 단계를 진행 합니다.
- 두 번째 가닥 cDNA의 합성 (2 차).
- T7 RA5 뇌관 (25 ng / µ L 작업 희석, 표 2)에서 3 µ L을 추가 하 고 각 cDNA 샘플 RNase 무료 물 2 µ L. 믹스 잘, 그리고 스핀 내용을 수집 합니다.
- 열 cycler에서 10 분 동안 70 ° C에서 품 어. 얼음에 반응을 놓습니다.
- RT 마스터 준비 얼음 (2 가닥)을 혼합: nuclease 무료 물 58 µ L, 두 번째 가닥 버퍼 x 10의 10 µ L, dNTP 혼합의 4 µ L 및 DNA 중 합 효소의 2 µ L. Vortexing와 스핀 내용을 수집 하 여 잘 혼합. 얼음에 계속.
- 3.2.2 단계에서 각 관에 위의 믹스의 74 µ L를 추가 합니다. 2-3 번 pipetting으로 잘 혼합 3-4 회, 다음 내용을 수집 하 회전 터치. 얼음에 유지 하 고 개최.
- 미리 뚜껑 열을 해제 16 ° C에 열 cycler 멋진. 2 h 16 ° c.에 대 한 열 cycler에 튜브를 배치
- 두 번째 가닥 합성 단계 후 cDNA 정화 단계를 진행 하거나-20 ° c.에 고정 하려면 얼음에 튜브를 놓습니다
참고: cDNA 정화 동결 하기 전에 좋습니다.
- CDNA 정화를 수행 (2 차).
참고: 모든 centrifugations는 실 온에서 ~ 8000 x g에서 수행 됩니다. 16000 x g 필터 카트리지 손상을 방지를 초과할 수 없습니다.- 건조가 열 블록에 나중에 사용에 대 한 50-55 ° C에 nuclease 무료 물을 열을 시작 합니다. CDNA의 부분적인 변성을 방지 하기 위해 58 ° C 초과할 수 없습니다.
- 1.5 mL nuclease 무료 튜브에는 cDNA를 전송 합니다. 각 튜브를 cDNA 바인딩 버퍼의 250 µ L를 추가 합니다. 버퍼에 있는 침전 물에 대 한 확인 하 고 다시 해산 10 분 동안 37 ° C에 버퍼 솔루션 따뜻한. 철저 하 게 2-3 번 pipetting 여 터치 믹스 3-4 회. 내용을 수집 하는 스핀.
- 단단히 워시 튜브에 cDNA 필터 카트리지를 넣어. 필터의 중앙에 위의 믹스를 추가 합니다. ~ 1 분 또는 때까지 필터를 통해 8000 x g에서 원심. 흐름을 통해 삭제 하 고 세척 관을 대체 합니다.
- 워시 버퍼의 500 µ L를 추가 합니다. 이전 에탄올 세척 버퍼에 추가 되어 있는지 확인 합니다. ~ 1 분 또는 때까지 필터를 통해 8000 x g에서 원심.
- 흐름을 통해 삭제 하 고 다시 카트리지를 ~ 1 분 8000 x g에서 원심. CDNA 차입 튜브를 cDNA 필터를 전송 합니다.
- 필터의 중앙에 미리 따뜻하게 nuclease 무료 물 8.5 µ L를 적용 됩니다. 2 분 동안 기다려와 ~1.5 분 Elute 추가 8.5 µ L로 미리 데워 nuclease 무료 물에 대 한 8000 x g에서 원심.
참고: 더블-좌초 된 cDNA 복구 볼륨 ~ 16 µ L를 있을 것입니다. - 두 번째 라운드 IVT 또는-20 ° C에서 cDNA를 하룻밤 동결 즉시 진행 합니다.
- IVT aRNA 생산의 두 번째 라운드를 수행 합니다.
- 37 ° C (36 ° C 기준)를 교 잡 공기 오븐을 설정 합니다.
- 다음 순서로 얼음 IVT 마스터 믹스 준비: 단계의 3.3.7 eluted 더블-좌초 된 cDNA의 16 µ L, 추가 4 µ L의 T7 ATP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 CTP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 GTP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 UTP 솔루션 (75 밀리미터); 4 µ L의 T7 10 x 반응 버퍼; 그리고 4 µ L T7 효소 혼합의. 잘, 간단히 내용을 수집 스핀 누르고 얼음에 있습니다.
- CDNA의 16 µ L을 포함 하는 각 관에 IVT 마스터 믹스의 24 µ L를 추가 합니다. 철저 하 게 하 고 부드럽게 pipetting으로 내용을 혼합. 14 h 37 ° C에서 튜브를 품 어.
참고: < 12 h에 대 한 보육 심각 하 게 수익률을 적용 됩니다. - 비 DEPC의 60 µ L 처리 RNase 무료 물 100 µ L 볼륨을 증가 IVT 반응을 중지를 추가 합니다.
- ARNA 정화를 수행 (2 차).
참고: 모든 centrifugations는 실 온에서 ~ 8000 x g에서 수행 됩니다. 16000 x g 필터 카트리지 손상을 방지를 초과할 수 없습니다.- ~ 200 µ L nuclease 무료 50-55 ° C를 위한 물의 건조 난방 블록 또는 PCR 기계에 나중에 사용할 난방을 시작 합니다. aRNA의 부분적인 변성을 방지 하기 위해 58 ° C 초과할 수 없습니다.
- 1.5 mL nuclease 무료 튜브는 aRNA 전송. 각 aRNA 샘플 aRNA 바인딩 버퍼의 350 µ L를 추가 합니다. 각 튜브 하 pipetting (혼합 하 고 회전 소용돌이 하지 마십시오)에 의해 3 번을 혼합 ACS 학년 100% 에탄올의 250 µ L를 추가 합니다.
참고: RNA 에탄올의 추가 따라 계기 시작 됩니다. - 전송 믹스 즉시 RNA 정화 열 부드럽게 필터 카트리지의 센터에 추가 하 여. 원심에서 8000 x g ~ 1 분 또는 때까지 혼합 필터 완전히 통과 했다. 통해 흐름 무시 하 고 폐기물 수집 튜브를 다시 사용.
- 각 필터 카트리지를 워시 버퍼의 650 µ L를 추가 합니다. G x 또는 전체 버퍼를 지날 때까지 8000 ~ 1 분에 대 한 원심 분리기. 통해 흐름 무시 하 고 워시 버퍼의 흔적을 제거 하는 추가 ~ 1 분에 대 한 필터를 회전.
- 신선한 aRNA 컬렉션 튜브를 필터를 전송 합니다. 필터의 중앙에 미리가 열 nuclease 무료 물 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 동안 기다립니다 다음 8000 g x 또는 그것은 일이 지날 때까지에 ~1.5 분 원심.
- 분 광 광도 계 (260 nm 파장)에 및 bioanalyzer에 대 한 튜브에 aliquot 2 µ L aRNA 수율 및 품질 확인 분석을 확산.
참고: 농도 이상 5 ng / µ L; 여야 합니다. 그렇지 않으면 샘플을 거부 합니다. ~ 1 년-80 ° c.에 대 한 샘플을 저장할 수 있습니다. 샘플을 동결 해빙 하지 마십시오. - ARNA 제품 제조업체의 프로토콜 (그림 2) 다음의 적절 한 확산을 시각화 하는 bioanalyzer를 사용 하 여 샘플을 확인 하십시오.
4. 증폭 RNA 조각화 및 정리
- 얼음 (총 볼륨 40 µ L, aRNA 겹치지 샘플 바 코드의 결합 2 관)에서 다음과 같은 혼합: aRNA (200 ng 총)와 RNA 조각화 버퍼의 4 µ L의 36 µ L. 94 ° C 90에서 혼합물을 품 어 s.
- 혼합물이 얼음 RNA 조각화 중지 버퍼의 4 µ L을 추가 하는 즉시 이동 합니다. Nuclease 무료 물 56 µ L을 추가 하 여 100 µ L 볼륨을 조정 합니다.
- 추가 350 µ L에서 RNA 정화 실내 버퍼의 ( 재료의 표참조) 키트와 pipetting으로 잘 혼합. EtOH의 250 µ L을 추가 하 고 pipetting, 잘 혼합 한 RNA 정화 스핀 열 샘플을 전송. 15 회전 8000 x g에서 s.
- 새로운 컬렉션 튜브에 열을 전송 하 고 RPE 버퍼의 500 µ L를 추가 합니다. 15에 대 한 스핀 흐름 통해 s 8000 x g.에서 삭제. 8000 x g에 80 %EtOH 스핀 2 분의 500 µ L를 추가 합니다.
- 새로운 컬렉션 튜브, 열, 및 최고 속도로 5 분에 대 한 스핀의 오픈 뚜껑에 열을 전송.
- 새로운 컬렉션 튜브에 열을 전송 하 고 nuclease 무료 물, 1 분에 대 한 최고 속도로 회전의 16 µ L을 elute.
5. 라이브러리 준비
참고: IVTs 수 수 풀링된이 시점에서, 사용 하는 바코드에 중첩 부분이 없을 경우. 인산 가수분해 효소 치료 시간은 40 분 폴 리 뉴클레오티드 니 치료 시간은 1 시간입니다.
- 0.7 mL PCR 튜브에 조각난된 aRNA의 16 µ L, 추가 다음 혼합의 4 µ L: 2 µ L 인산 가수분해 효소 버퍼, 남극 인산 가수분해 효소의 1 µ L 및 재조합 ribonuclease 억제제 (예, RNaseOUT)의 1 µ L x 10의. 다음 프로토콜 열 cycler에서 품 어: 30 분, 5 분 및 4 ° c.에 보류에 대 한 65 ° C에 대 한 37 ° C
- 5.1 단계에서 0.7 mL PCR 튜브에 추가 다음 믹스의 30 µ L: nuclease 무료 물 17 µ L, 인산 가수분해 효소 버퍼, ATP (10 mM)의 5 µ L, 1 µ L 재조합 ribonuclease 억제제의 x 10의 5 µ L 및 PNK의 2 µ L. 60 분 동안 37 ° C에서 열 cycler에서 incubate 다음 4 ° c.에서 개최
- 인산 가수분해 효소와 PNK 취급 aRNA 열 정리를 수행 합니다.
- Nuclease 무료 물 50 µ L을 추가 하 여 100 µ L 볼륨을 조정 합니다. 실내 버퍼의 350 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. EtOH의 250 µ L을 추가 하 고 pipetting, 잘 혼합 한 RNA 정화 스핀 열 샘플을 전송.
- 15 회전 s 8000 x g.에 새로운 컬렉션 튜브는 열 전송 및 RPE 버퍼의 500 µ L을 추가.
- 15 회전 s 8000 x g.에 흐름을 통해 삭제 하 고 80%의 500 µ L을 추가 EtOH.
- 8000 x g. 전송 열 새로운 컬렉션 튜브에 2 분 동안 회전 열을 최고 속도로 5 분에 대 한 스핀의 뚜껑을 엽니다.
- 새로운 컬렉션 튜브에 열을 전송 하 고 14 µ L nuclease 무료 물, 소재의 ~ 10 µ L 볼륨을 복구 하는 1 분에 대 한 최고 속도로 회전을 elute. 열을 삭제 합니다. ~ 10 분 동안 진공 집중 장치를 사용 하 여 5 µ L을 볼륨을 줄입니다.
- 선 3' 상업을 사용 하 여 어댑터 키트 ( 재료의 표참조).
- 3' 어댑터 (RA3) TrueSeq 키트 3 겹 nuclease 무료 물에서 약화 시키고-20 ° c.에 aliquots 저장
- 인산 가수분해 효소와 PNK 취급 RNA의 5 µ L, 1 µ L 희석 3' 어댑터의 추가. 2 분 동안 70 ° C에서 품 어 그리고 즉시에 이차 구조 형성을 방지 하기 위해 얼음에 튜브를 장소.
- 다음 혼합의 4 µ L를 추가: 흠 결 찰 버퍼 (HML), 1 µ L의 RNase 억제제, 그리고 T4 RNA 리가 2 (잘린)의 1 µ L x 5의 2 µ L. 불기 (뚜껑 열고) 1 시간에 28 ° C에서 미리가 열된 열 cycler에 튜브를 품 어.
- 열 cycler에 남아 있는 반응 튜브와 함께 정지 솔루션 (STP)의 1 µ L을 추가 하 고 부드럽게 플라스틱 전체 볼륨 아래로 6-8 시간을 철저 하 게 혼합. 얼음에 15 분 동안 28 ° C에서 열 cycler에 반응 관을 품 어 다음 튜브를 계속 합니다.
- 3 µ L 12 µ L. 사용 6 µ L의 총 볼륨-80 ° c.에 나머지 6 µ L 저장 하 nuclease 무료 물 추가
- 반전 녹음 방송 반응을 수행 합니다.
- PCR 튜브에 다음 결합: 어댑터 출혈 RNA와 RNA RT 뇌관 (RTP)의 1 µ L의 6 µ L. 2 분 동안 70 ° C에서 튜브를 품 어 다음 즉시 얼음에 튜브를 배치 합니다.
- 다음 혼합의 5.5 µ L를 추가: 첫 번째 가닥 버퍼, 12.5 m m dNTP 믹스의 0.5 µ L, 100 mM DTT, RNase 억제제의 1 µ L 및 역전사의 1 µ L의 1 µ L x 5의 2 µ L. 1 시간에 50 ° C에서 미리가 열된 열 cycler에 튜브를 품 어 다음 얼음 (샘플-20 ° C에서 보관 하실 수 있습니다)에 튜브를 장소.
- 5', 3'-뇌관 합자 제품 풍부 하 11-15 사이클 PCR 증폭을 수행 합니다.
- 각 반전 녹음 방송 반응 추가 다음 믹스의 35.5 µ L: 울트라 순수 물 8.5 µ L, PCR 믹스 (PML), 25 µ L 및 RNA PCR 뇌관 (RP1)의 2 µ L. 각 반응에는 고유 하 게 인덱싱된 RNA PCR 뇌관의 2 µ L를 추가 (RPIX, X = 1 ~ 24).
- 다음 PCR 순환 상태를 사용 하 여 열 cycler에 튜브를 증폭: 98 ° C 30에 대 한 s; 10의 98 ° C 12-15 사이클 s; 30에서 60 ° C s; 72 ° C 30에 대 한 s; 72 ° C 10 분; 다음 4 ° c.에서 개최
6. PCR 제품 정리 및 크기 선택
- 실 온에서 prewarm AmpureXP 자석 구슬 와 동 구슬 잘 분산 될 때까지 다음 50 µ L PCR 반응 (1:1 PCR 제품: 구슬)를 50 µ L를 추가. 혼합 내용을 최대 10 번을 철저 하 게 혼합 합니다.
- 액체는 분명 나타날 때까지 적어도 5 분, 마그네틱 스탠드에 15 분 장소에 대 한 실 온에서 품 어. 제거 하 고 삭제는 상쾌한의 95 µ L.
- 추가 200 µ L의 갓된 80 %EtOH. 적어도 30 s, 다음 제거 및 삭제는 상쾌한 구슬 방해 하지 않고 품 어. 이것을 한 번 더 반복 합니다.
- 구슬 또는 15 분 동안 완전히 건조 될 때까지 건조 물의 resuspension 버퍼의 32.5 µ L로 resuspend. 철저 하 게 혼합 10 번 위아래로 전체 볼륨 플라스틱
- 액체는 분명 나타날 때까지 5 분, 마그네틱 스탠드에 2 분 장소에 대 한 실 온에서 품 어. 새로운 튜브에는 상쾌한의 30 µ L를 전송. 50 µ L 총 볼륨을 얻으려면 nuclease 무료 물 20 µ L를 추가 합니다.
- 단단한 단계의 가역 immobilization (SPRI) 자석 구슬 가진 PCR 제품의 크기 선택을 수행 합니다.
- SPRI 구슬의 준비 단계 6.5 및 혼합 철저 하 게 pipetting 튜브 0.7 x 볼륨 (35 µ L)를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 5 분 또는 별도 구슬 때까지 대기 합니다. 비즈를 방해 하지 않고는 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다.
- 추가 200 µ L의 갓된 85 %EtOH. 30 s, 다음 제거는 EtOH 기다립니다. 10 분 동안 구슬 건조
- Nuclease 무료 물 20 µ L를 추가 합니다. 튜브는 자석에 다시 5 분 동안 대기 장소와 방해 또는 구슬 감동 없이 액체 부분에서 플라스틱. -20 ° c.에 DNA를 저장
7입니다. 도서관 금액 및 품질의 결정
- 260 nm 파장에서 분 광 광도 계와 DNA의 농도 확인 (예상 농도 적어도 5 ~-10 ng / µ L).
- 1 µ L 각 샘플의 크기 분포를 조사 하는 고감도 DNA 칩을 사용 하 여 bioanalyzer에 실행 (300-400 bp에 피크 예상 ( 그림 3참조)).
8. 샘플 제출
- 겹치지 않는 시퀀싱 PCR 바코드 (1:1 비율)를 결합 한다. 예를 들어 함께 동등한 나노 그램 양의 각 샘플의 PCR 제품 RPI-1 및 RPI-2, RPI-3와 RPI-4 결합, RNA에 따라 시퀀싱 코어의 총 입력된 샘플 크기 요구 사항 권장 사항.
- 결합, 후 5 ng / µ L을 적어도 10 µ L 볼륨 또는 시퀀싱 시설 코어에 의해 권장 총 농도 조정 합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, GABAergic 신경 했다 수동으로 정렬 (그림 1) 고 RNA는 증폭, cDNA 라이브러리 (그림 2)로 그리고 높은 깊이8시퀀스. 증폭된 RNA (aRNA) 제품 500 위에 약간 피크 분포와 크기에서 200-4000 bp 사이 원거리 bp (그림 3A). 비드 정화 cDNA 라이브러리 추가 구슬 200 보다 작은 파편 제거를 사용 하 여 정화의 두 번째 라운드에 의해 크기 제한 했다 bp (그림 3B 와 3c)와 ~ 350에서 피크와 혈압. 데 짧은 조각 이어질 것입니다 빈 읽기 (아니 mRNA 삽입, 유일한 어댑터 및 뇌관 시퀀스), 반면 긴 조각 총 출력을 읽기 감소 흐름 세포에 더 많은 공간을 차지할 것입니다. 시퀀싱 시 우리는 정기적으로 105 중간, 또는 6.9 x 105 평균 매핑된 읽기 셀 (그림 4A) 당 x 4.8를 얻은. Umi를 사용 하 여 중복 RNA 제거 후 각 단일 셀 셀 (그림 4B) 당 105 중간, 또는 1.4 x 105 평균 독특한 읽기 x 1.0을 했다. 각 단일 셀 외부 RNA 컨트롤 컨소시엄 (ERCC), 스파이크에 RNA 샘플에 추가 된 분자의 절대 수를 계산할 수 있는 내부 통제로 사용 되었다. 입력의 선형 관계를 있었다 관찰된 조사, 0.92와 조정 된 R2 의 경사와 = 0.94 (그림 4C). 우리 평균 (~ 7500에서 12000 유전자/세포에 배열 되는) 하나의 신경 당 ~ 10000 유전자 발견, > 95 %는 단일의 감지 > 6000 유전자 세포 (그림 4D-4 층). 이 번호 비교 비슷한 마우스 두뇌 파생 된 단일 뉴런에서 (예를 들어, 1,865-4,760 유전자 Zeisel 외 에 게시 된 데이터에 대 한 호의 9, Tasic 그 외 여러분 7,250 유전자 10및 Okaty 외 에 8000 유전자 11). 독자의 Poulin 외 에 이동 상세한 비교를 위해 12 .
그림 1 : 디바-이 다음 뉴런의 수동 정렬의 워크플로 신선한 마우스 두뇌 수집 했다 슬라이스, 그리고 관심 영역 이었다 microdissected. 형광 단백질을 표현 하는 단일 뉴런 수동으로 수집 된 고 선형 증폭의 2 라운드를 사용 하 여 체 외에 전사에 의해 증폭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 독특한 분자 식별자 (Umi) 또는 varietal 태그를 통합 하면서 증폭의 2 라운드와 디바-Seq의 도식 워크플로. 샘플 바코드 (SBC) 9-뉴클레오티드 코드 (청록)에 의해 식별 각 단일 셀 수 있습니다. 우미 각 뇌관을 사용에 대 한 다른 길이에서 임의의 뉴클레오티드 10 bp의 스트레칭입니다. 단계에서 생물 정보학, 데 같은 우미 시퀀스 두 개의 매핑된 성적 집계 됩니다만 한 번 따라서 증폭 중복을 제거 하 고 절대 성적 계산에 대 한 허용. RA5와 RA3는 시퀀싱 뇌관, 있으며 T7 RA5 뇌관 T7 RNA 중 합 효소는 다시 하 고 선형 증폭의 두 번째 라운드를 수행할 수 있도록 라운드 aRNA 제품에 다시 T7 시퀀스를 추가할 수 체 외에 전사에 의해 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 예 bioanalyzer 플롯. 약 500에서 피크와 200-4000 bp 사이 여야 합니다 (A) aRNA 크기 분포는 임의의 형광 장치 [푸]를 bp. x 축. (B) 구슬 정리 후 cDNA 라이브러리 제품의 배포 크기. (C) 약 350 피크 0.7 x SPRI 크기 선택 (단계 6.6) 후 배포 크기 혈압.
그림 4 : 시퀀스 예 배포판 및 유전자 검출 수동으로 정렬 뉴런에서 후 읽기 디바-Seq8 . (A) 총 매핑된 읽기 배포. (B) 총 독특한 분포를 읽습니다. (C) ERCC 읽기 이상의 4 배나 선형 관계를 표시합니다. (D) 유전자 검색 대 읽을 수 보여줍니다 > 95% 단일 셀 > 6000 유전자/세포. (E) 유전자 6 사이 감지 interneuron 유형은 비교. (F) 셀, 지리적 취득 #GSE92522 당 검출 하는 유전자의 분포. 이 그림에서 폴 외 적응 되었습니다. 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 버퍼 | 항목 | 농도 | 금액 (µ L) |
| 샘플 컬렉션 버퍼 | 재조합 ribonuclease 억제제 | 55 | |
| ERCC | 1:50K 희석 | 110 | |
| Nuclease 무료 물 | 605 | ||
| Aliquot 43.75 µ L의 위 16 튜브 (8; 200 µ L PCR 튜브의 2 스트립); 추가 튜브 당 다음 | |||
| T7-우미-뇌관 (예: N10B1-N10B16) | 1 ng / µ l | 6.25 µ L/튜브 | |
| 각 튜브 50 µ L (각 튜브 25 µ L aliquots에 분할 고 수-80 ° C에서 냉동)에 최종 볼륨 | |||
| 솔루션: | 항목 | 농도 | 금액 |
| L 5을 실제: 분해 | NaCl | 126 mM | 36.8 g |
| KCl | 3 m m | 1.15 g | |
| NaH2포4 | 1.25 m m | 0.75 g | |
| NaHCO3 | 20 mM | 8.4 g | |
| 실제의 500 mL, 10-15 분 동안 산소 거품 다음 신선한 때마다 다음 추가: | |||
| D-포도 당 | 20 mM | 1.8 g | |
| MgSO4 | 2 mM | 4 M 재고에서 0.5 mL | |
| CaCl2 | 2 mM | 4 M 재고에서 0.5 mL | |
| 실제 산소를 계속 밖으로 | |||
| 솔루션: | 항목 | 농도 | |
| 활동 차단 칵테일: 100 x 재고 확인 | |||
| 100 mL에 실제 추가 | |||
| APV | 0.05 m m | ||
| CNQX | 0.02 m m | ||
| TTX | 0.0001 m m (0.1 µ M) | ||
| 솔루션: | 항목 | 금액 | |
| 프로 테아 제 soltion (100 mL) | Streptomyces griseus에서 효소 | 100 mg | |
| 소 태아 혈 청: 상용 소스, 각 사용에 대 한 500 µ L에서 aliquot. | |||
표 1: 목록 솔루션 및 버퍼입니다.
표 2: 프라이 머와 시퀀스 목록. N10B1-N10B96 첫 번째 가닥 뇌관 T7 RA5 이며 두 번째 라운드 뇌관. 이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
프로토콜을 정렬 매뉴얼은 인구 밀도 쥐 두뇌에서 표시 또는 현재 높은 처리량 셀을 사용 하 여 공부 가능 하지 않은 희소 한 세포 인구를 대표 하는 신경의 감독된 RNA 시퀀싱에 적합 정렬 및 증폭 방법입니다. FACS를 보통 복종 셀 노즐 크기에 따라 ~ 9-14 psi의 범위에서 칼 집 및 샘플 라인 압력을 받 다 고 원하는 이벤트 요금. 또한, 노즐에서 배출 되 고, 시 셀 수 토지 하드 컬렉션 튜브 또는 우물 영향 스트레스를 일으키는 샘플 버퍼 코팅의 표면에. 수동 정렬 하는 동안 같은 높은 압력 적 적용 됩니다, 셀 모 세관 작용에 의해 피펫으로 빨려 고 부드럽게 밖으로 그들을 부과 단순히 유리 펫의 팁에 의해 퇴 학. 디바-Seq 프로토콜은 작은 세포 볼륨 세포에서 RNA 증폭에 유용 (< 8 µ L) 시작 물자 및 일관 되 게 수익률 많은 감지 유전자 (8-10 K)의 낮은, 깊은 시퀀싱과 결합 하면 세부에 대 한 세포질 기능 기본 셀 정체성8,,1314의 일관 된 분자 그림의 복원. 셀 컬렉션 단계, 유전자 검출, 높은 감도 및 절대 분자 계산을 수행 하는 능력의 순도, 때문에이 메서드는 세포 상태 및 높은 깊이 정밀도와 질병 이상 공부 하는 데 유용.
증폭된 RNA 및 유전자 검출도의 수익률이이 프로토콜에서 상대적으로 높은 반면, 특정 절차 조치 일관성을 유지 도움이. 두 번째 가닥 합성 하는 동안 어셈블리 얼음에서 수행 되어야 합니다, 열 cycler 단위에 전송 하기 전에 미리 냉각 하며 반응 이루어져야 합니다 16 ° C에 엄격 하 게 (또는 약간 아래) aRNA 생산량을 줄일 수 있는 헤어핀의 형성을 피하기 위해. 그것은 또한 두 번째 가닥 합성, 동안 16 ° C에서 2 시간을 초과할 수 없습니다 권고 하 고 가능 한 한 빨리 cDNA 정화 단계를 이동 하는 것이 중요 하다. IVT 단계 12 h에 대 한 보육 일부 aRNA 저하 될 수 있습니다 IVT 시간의 14 h를 초과 하는 반면 aRNA 수율을 줄어들 수 있습니다.
우리가 쓰레기 동료 FACS 고 디바-Seq;를 사용 하 여 수동 정렬에서 동일한 입력 샘플 비교 연구를 수행 하지 못했습니다. 따라서, 우리가 어떤 특정 유전자 카테고리 FACS에 수동 정렬에 misregulated는 주장 하지 않습니다. FACS 및 수동 정렬 가능성이 어느 정도의 유전자 식 유물을 소개 합니다. 차동 진 식 상황에 대 한 같은 효과 이론에서 취소 해야한다 서로, 밖으로 제어 및 샘플 그룹에서 보여진 것 처럼. 최근에, 전사 저 해제의 칵테일 즉시 이른 유전자 발현의 활성화를 방지 하기 위해 사용 되었습니다 그리고 그런 단계도이 프로토콜15에 포함 될 수 있습니다.
정렬 과정 매뉴얼은 부드럽고 빠르게 (일반적으로 90-160 분) FACS (샘플 준비 시간 제외) 조밀도 기온 변화도 원심 분리, 필요한 생존, cytotracker 염료로 얼룩이 지 고 후 시각화 정렬에 비해. 수동 정렬 우물에 정렬 시 높은 칼 집 압력 및 충격 스트레스를 셀 적용 되지 않습니다. 그것은 또한 상수 근처 액세스 산소 실제 하 고 전반적인 환경을 제공 합니다 상 냥 하 고 보다 적게 스트레스가 많은 정렬, 빠른 스파이크 셀 높은 신진 대사 요구 등 스트레스에 민감한 세포에 대 한 중요 한 될 수 있습니다. 디바-Seq에 현재, 96 셀까지 수 수 다중화 시 약 비용을 절약 하 고 절대 mRNA 계산 셀 당 높은 유전자 수 제공.
그러나,이 방법; 단점이 있다 예를 들어 신뢰할 수 있는 요구를 붙일 정렬 매뉴얼 시작 인구로 서 셀 표시. 그것은 본질적으로 낮은 처리량 프로세스, FACS에 보다 상당히 낮은 최대, 32-64 셀 저조한 각 정렬 세션. 수동 정렬는 또한 좋은 모터 기술과 유리 펫 해 부 현미경을 조작 하 여 microcapillary 펫에 단일 셀을 캡처 연습을 요구 한다. 디바-Seq 증폭은 3'-편견; 따라서, 그것은 전체 transcriptome 증폭에 사용할 수 없습니다 하 고 스플라이스 isoform 검출에 적합 하지 않습니다 또한.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사 다는 것을 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH (5R01MH094705-04와 Z.J.H.에 R01MH109665-01)에서 교부 금에 의해, CSHL 로버트 슨 신경 과학 기금 (Z.J.H.)에 의해 고 NARSAD 장래가 화목 (되)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ERCC RNA Spike-In Control Mixes | Thermo Fisher | Cat# 4456740 | |
| SuperScript III | Thermo Fisher | Cat# 18080093 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | Cat# 10777019 | |
| RNA fragmentation buffer | New England Biolabs | Cat# E6105S | |
| RNA MinElute kit | Qiagen | Cat# 74204 | |
| Antarctic phosphatase | New England Biolabs | Cat# M0289 | |
| Poly nucleotide kinase | New England Biolabs | Cat# M0201 | |
| T4 RNA ligase2, truncated | New England Biolabs | Cat# M0242 | |
| Ampure Xp magnetic beads | Beckman Coulter | Cat# A63880 | |
| SPRIselect size selection magnetic beads | Thermo Fisher | Cat# B23317 | |
| DL-AP5 | Tocris | Cat# 0105 | |
| CNQX | Tocris | Cat# 1045 | |
| TTX | Tocris | Cat# 1078 | |
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | Cat# P5147 | |
| Message Amp II kit | Thermo Fisher | Cat# AM1751 | |
| Carbogen | Airgas | Cat# UN3156 | |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | Cat# 761036 | |
| Illumina TrueSeq smallRNA kit | Illumina | Cat# RS-200-0012 | |
| Bioanalyzer RNA Pico chip | Agilent | Cat# 5067-1513 | |
| Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip | Agilent | Cat# 5067-4626 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | ||
| Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics. (Leica model MZ-16F). | Leica | Model MZ-16F | |
| Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm. | Warner instruments | Model GC100-15, Order# 30-0017 | |
| Capillary pipette puller | Sutter Instruments Co | P-97 | |
| Vibratome | Thermo Microm | HM 650V | |
| Vibratome tissue cooling unit | Thermo Microm | CU 65 |
References
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