Undersøgelse af genetiske afhængigheder ved hjælp af CRISPR-Cas9-baserede konkurrence Assays
Summary
Dette manuskript beskriver en grupperet regelmæssigt Interspaced korte palindromiske gentager (CRISPR) CRISPR-Cas9-baseret metode for enkel og hurtig undersøgelse af flere kandidat gener i akut Myeloid leukæmi (AML) celledelingen i rolle parallel. Denne teknik er skalerbar og kan anvendes i andre kræft cellelinjer så godt.
Abstract
Gen undertrykkelse af netbårne undersøgelser har været flittigt brugt til at undersøge rollen af enkelte gener i AML patogenese. For at opnå komplet gen forstyrrelser, mange af disse studier har gjort brug af komplekse gen knockout modeller. Mens disse undersøgelser med knockout mus tilbyder en elegant og tid-testet systemet for at undersøge genotype-fænotype relationer, en hurtig og skalerbar metode til vurdering af kandidat gener, spille en rolle i AML celledelingen eller overlevelse i AML modeller vil medvirke til at fremskynde den parallelle forhør af flere kandidat gener. De seneste fremskridt i genom-redigering teknologier har dramatisk forbedret vores evne til at udføre genetiske forstyrrelser på et hidtil uset omfang. Et sådant system af genom-redigering er den CRISPR-Cas9-baseret metode, der kan bruges til at foretage hurtige og effektive ændringer i target cell genom. Den lethed og skalerbarhed af CRISPR/Cas9-medieret gen-sletning gør det en af de mest attraktive teknikker for afhøring af et stort antal gener i fænotypiske assays. Her præsenterer vi en simpel analyse ved hjælp af CRISPR/Cas9 medieret gen-forstyrrelser kombineret med høj overførselshastighed flow-flowcytometri-baserede konkurrence assays til at undersøge rollen af gener, der kan spille en vigtig rolle i udbredelsen eller overlevelsen af menneskelige og murine AML cellelinjer.
Introduction
De sidste par årtier har set talrige forskningsindsats fokuseret på at identificere centrale molekylære veje i akut myeloid leukæmi (AML) patogenese bidrag. Gen-forstyrrelser i AML celler har traditionelt udført ved hjælp af betingede knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Mens knockout mus tilbyder et sofistikeret system for spatio-temporale kontrol af gen-sletning, er generere gen knockout mus arbejdskrævende, tidskrævende og dyrt. Desuden gen-udskæringer ved hjælp af rekombination strategier er ikke let skalerbare; disse strategier egner ikke sig godt til afhøring af flere gener i parallel. Efter opdagelsen af RNA interferens metoder til knock-down endogene mRNAs ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA) eller shRNA, begyndte mange grupper ved hjælp af RNA interferens teknikker til at undersøge rollen af specifikke gener i AML. Da både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskeligt at transfect ved hjælp af traditionelle lipid-baserede Transfektion metoder, de fleste undersøgelser ansat lentivirally eller Retroviralt kodet shRNA for at studere genfunktion i AML celler. Den nylige opdagelse af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) og de tilknyttede Cas nukleaser (CRISPR-Cas9) har revolutioneret gen-targeting teknologier1,2,3. Ved hjælp af CRISPR-Cas9, kan specifikke gener eller genomisk regioner slettes, redigeres eller markeret med effektivitet og lethed. CRISPR-Cas9-baseret gen-redigering er nu fremstår som den foretrukne metode til undersøgelse af genotype-fænotype relationer i forskellige celletyper på grund af enkelhed, effektivitet og bred anvendelighed af denne teknik. CRISPR-Cas9-baserede metoder bliver også metoden til valg i AML, ikke kun for spørgekriterierne enkelte gener, men også som en måde til at målrette flere gener i klædt eller poolede genetiske skærme med henblik på at undersøge flere gener parallelt som potentielle AML-afhængigheder4,5,6.
I dette manuskript beskriver vi en simpel konkurrencedygtig vækst assay for måling af virkningen af gen-forstyrrelser på væksten af AML celler, baseret på stabile CRISPR-Cas9-medieret gen-redigering efterfulgt af høj overførselshastighed flowcytometri. Denne metode er enkel, effektiv og skalerbar til medium-overførselshastighed eksperimenter for at undersøge rollen af flere gener parallelt i AML celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en detaljeret protokol til at foretage en CRISPR-Cas9-baserede konkurrencedygtig vækst analyse for at undersøge rollen af kandidat gener i AML cellelinjer hjælp flowcytometri fra human/murine AML celler (figur 5). Målet med analysen er at identificere effekten af gen sletning på vedligeholdelse af AML celleproliferation over to til tre uger på en medium-overførselshastighed skala. Nogle kritiske trin skal følges nøje for at lette optrapning af den bes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCW-Cas9 plasmid var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmid # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W plasmid fra Yusa lab (Addgene plasmid #67974. Vi vil gerne takke flowcytometri core på SBP medicinske opdagelse Institute for rettidig hjælp med flow analyse og sortering. Vi vil gerne anerkende støtten af Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi vil gerne også anerkender støtten fra de følgende finansieringskilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponsoreret Grant, V-Foundation og San Diego NCI Cancer Centre (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
