Summary
כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.
Abstract
ג'ין ההפרעות מחקרים שימשו בהרחבה לחקור את התפקיד של גנים בודדים ב- AML פתוגנזה. להשגת שיבוש גנטי מלא, רבים ממחקרים אלה עשו שימוש מודלים נוקאאוט גנטי מורכב. בעוד מחקרים אלה עם עכברים knockout מציעים מערכת במבחן הזמן אלגנטית על חקירת יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ, שיטה מהיר ומדרגי להערכת מועמד גנים זה לשחק תפקיד התפשטות תאים AML או הישרדות AML דגמים יעזור לזרז חקירת גנים המועמד מרובים במקביל. ההתקדמות בטכנולוגיות לעריכת הגנום פופולארים באופן דרמטי את היכולת שלנו לבצע לפליטת גנטי בקנה מידה חסר תקדים. מערכת אחת כזאת של הגנום עריכה היא שיטת CRISPR-Cas9 מבוססי יכול לשמש כדי להפוך מהירה וכן שינויים בגנום תא היעד. נוחות ואת המדרגיות של מחיקה ג'ין CRISPR/Cas9-מתווכת ' עושה את זה אחת מהטכניקות האטרקטיבי ביותר עבור החקירה של מספר רב של גנים מבחני פנוטיפי. כאן, אנו מציגים וזמינותו פשוטה באמצעות גנים CRISPR/Cas9 מתווכת-בשילוב עם תפוקה גבוהה לזרום cytometry מבוססת על תחרות מבחני הפרעה לחקור את התפקיד של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב התפשטות או ההישרדות של האדם, שורות תאים מאתר של AML.
Introduction
העשורים האחרונים ראינו מאמצים מחקרים רבים התמקדו בזיהוי התרומה של מסלולים מולקולריים מפתח ב פתוגנזה לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). באופן מסורתי, ג'ין-הפרעה בתאי AML בוצעה באמצעות עכברים knockout מותנה או סיכת ראש-קצרים RNA (shRNA). בעוד עכברים knockout מציעים מערכת מתוחכמת לשליטה-עתיים של ג'ין-מחיקה, יצירת עכברים knockout ג'ין הוא מהגידולים, גוזלת זמן יקר. יתר על כן, ג'ין-הסתרה באמצעות אסטרטגיות רקומבינציה אינה להרחבה בקלות; אסטרטגיות אלו אינם מתאימים עצמם טוב לחקירה של מספר גנים במקביל. לאחר הגילוי של שיטות התערבות RNA mRNAs אנדוגני דפיקה למטה בעזרת RNA קטנים מפריעות (siRNA) או shRNA, החלו קבוצות רבות באמצעות טכניקות התערבות RNA לחקור את התפקיד של גנים ספציפיים ב- AML. מאז תאים AML מאתר והן אנושי שקשה לחסלם transfect בשיטות תקנים מסורתי המבוסס על שומנים בדם, לרוב מחקרים shRNA מועסקים lentivirally או מקודד retrovirally ללמוד פונקציה גנים בתאים AML. גילוי זה התבצעה מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR), nucleases Cas המשויך (CRISPR-Cas9) יש מהפכה פילוח ג'ין טכנולוגיות1,2,3. באמצעות CRISPR-Cas9, גנים ספציפיים או אזורים גנומית ניתן למחוק, לערוך או מתויגים עם יעילות וקלות. CRISPR Cas9-עריכת מבוססי-ג'ין עכשיו מתעוררים כמו שיטת הבחירה עבור חוקרים יחסי גנוטיפ-כדי-פנוטיפ סוגי תאים שונים עקב פשטות, יעילות, ישימות רחבה של טכניקה זו. שיטות המבוססות על CRISPR-Cas9 גם הופכים שיטת הבחירה ב- AML, לא רק עבור חוקרים גנים בודדים, אבל גם כמו דרך היעד גנים מרובים במסכים ערוכים או במאגר הגנטי שמטרתו חוקרים מספר גנים במקביל כפוטנציאל AML-תלות4,5,6.
כתב יד זה, אנו מתארים וזמינותו צמיחה תחרותי פשוטה למדידת ההשפעה של ג'ין-הפרעה על הגידול של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, בהתבסס על יציבה CRISPR Cas9-בתיווך גנים לעריכת ואחריו cytometry זרימה תפוקה גבוהה. שיטה זו היא פשוטה, יעילה, ניתן להרחבה עד בינוני-תפוקה ניסויים עבור חוקרים את התפקיד של מספר גנים במקביל בתאים AML.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור AML תא קו שיבוטים עם ביטוי גבוהה של Cas9 פעילה ויציבה
- הפקה של Cas9 lentivirus
- יום 0: צלחת 4 x 10 תאים6 293T ב- 10 מ"ל של DMEM עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-גלוטמין בצלחת תרביות רקמה 10 ס מ ב אבטחה ברמה 2 (BSL2) מוסמך הוד התרבות תאים. הכנס את המאכל חממה 37 ° C.
- יום 1: התאים מצופה 293T צריך להיות 70 – 80% confluent ביום 1. לבצע את תרביות תאים באמצעות פרוטוקול הבאים בשעות אחר הצהריים.
- חממו את בינוני תרביות תאים, תרבות המדיה ואת תרביות תאים ריאגנט לטמפרטורת החדר. להפשיר את כל פלסמידים הנדרשים עבור תרביות תאים.
- מיקס 9 µg של psPAX2, 0.9 µg של pMD2.G µg 9 של פלסמידים pLenti-Cas9 עם µL 500 של תרביות תאים במדיום שפופרת 5 מ.
- להוסיף 1.7 מ של תרביות תאים בינוני mL 14 סיבוב התחתית התחתונה. הוסף µL 57 של תרביות תאים ריאגנט ישירות לתוך המדיום תרביות תאים בצינור כדי להימנע מלגעת הקיר של הצינור.
- בעדינות להוסיף את המיקס כולו פלסמיד תרביות תאים ריאגנט פתרון ומערבבים על-ידי הקשה בעדינות את הצינורית על הצד. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. בינתיים, לשנות את המדיום מהצלחת 293T הזריעה.
- להוסיף את תערובת תרביות תאים dropwise לצלחת, רוק בעדינות את הצלחת הצידה לערבוב יעיל. מקם את הצלחת חממה 37 ° C.
- יום 2: וארוקן את תגובת שיקוע מהצלחת תרביות תאים בעדינות כך התאים לא מופרע או רופף מהצלחת. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ של מדיום DMEM 10% טרי באמצעות החלקה למטה בעדינות מצד לצד של הצלחת להימנע הם מוציאים את התאים.
- יום 3: לאסוף את הוירוס המכילה תגובת שיקוע מהצלחת תרביות תאים לאט על-ידי ציור זה לתוך מזרק סטרילי 10 ס מ. לאחר תגובת שיקוע נאסף לתוך המזרק, לצרף המזרק מסנן מיקרומטר 0.45 סטרילי, החזק את המזרק ואת מסנן על צינור חרוטי פוליפרופילן טריים, סטרילי 15 מ"ל. מזנקת בעדינות את המזרק כדי לסנן את הווירוס המכיל תגובת שיקוע דרך המסנן מיקרומטר 0.45 לתוך הצינור חרוט פוליפרופילן 15 מ"ל.
- לאחסן המדיום הממוזגים ויראלית aliquots של 2 מ ל כל אחד ב- 2 mL cryovials ב-80 מעלות צלזיוס.
- התמרה חושית של שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה
- יום-1: למהול 1 מ"ג/מ"ל fibronectin האנושי רקומביננטי פרגמנט המניה µg/mL 10 עם סליין סטרילי באגירה פוספט (PBS). המעיל רקמות תרבות-שאינם מטופלים 6 טוב צלחת עם 2 מ"ל של הפתרון עובד 10 µg/mL פרגמנט fibronectin האנושי רקומביננטי בשכונה תרבות תא BSL2 אושרה. עוטף את הצלחת לעטוף תיאחז כדי למנוע אובדן על אידוי וחנות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- יום 0: להפשיר את תגובת שיקוע נגיפית המכילה Cas9. האחות הפתרון פרגמנט רקומביננטי fibronectin אנושי לחלוטין מן הלוח מצופה לפני spinfection. להוסיף 2 מ של נגיפי בינוני ממוזגים עם Cas9 לצלחת ולסובב את זה ב x 1300 גרם במשך 90 דקות ב- 35 מעלות צלזיוס. זה עוזר את חלקיקי נגיפי לצרף spinfected טוב.
- בינתיים, לספור את התאים כדי להיות transduced ו ספין למטה 2 x 10 תאים6 צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ"ל של מדיה תרבות טריים.
- לאחר spinfection, להסיר את תגובת שיקוע ויראלי spinfected טוב וזורקים. חלקיקי retroviral תגובת שיקוע מחוברים בתחתית spinfected טוב. זה להוסיף, התאים6 2 x 10 resuspended ב 2 מ של האמצעי השלבים שלעיל.
- לסובב את הצלחת שוב ב 1300 x g מאוד בקצרה (1-2 דקות) מספיק כדי לאפשר את התאים להתיישב בחלק התחתון. מקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה, להשאיר למשך הלילה עבור התמרה חושית עם חלקיקי נגיפי spinfected מחובר היטב.
- יום 1: בהתאם צפיפות התאים, יש להוסיף בינוני יותר לתאים transduced כדי למנוע גידול יתר.
- יום 2: מאז פלסמיד pLenti-Cas9 יש לסמן התנגדות Blasticidin, להוסיף Blasticidin במינון 10 מ ל/µg transduced, untransduced (בקרה) MOLM13 או תאים לוקמיה העכבר MLL-AF9 לבחירת Cas9 לבטא תאים.
הערה: Blasticidin מבחר של Cas9-transduced MOLM13 או MLL-AF9 בתאי הלוקמיה נחשב מלאה כאשר כל התאים בקרה untransduced חוסלו. עבור שורות תאים חוץ MOLM13 ו- MLL-AF9 לוקמיה, עקומת תגובת המינון חייב להתבצע לפני הניסוי הזה כך יכול להיות מועסק המינון האופטימלי. טיטור של תגובת שיקוע ויראלי יכול להתבצע גם במקרה של המחירים נמוכים-התמרה חושית.
- לשכפל את בחירת התאים מבטאים גבוהה-Cas9.
הערה: שמנו לב כי בעוד כמה שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה, לשכפול הבחירה ייתכן שלא יהיה צורך: עיקר האוכלוסייה Cas9-Blasticidin נבחר כבר יש יעילות גבוהה לעריכת הגנום. במקרה זה, ניתן לדלג על שלב 1.3 ולעבור שלב 1.4 כדי להעריך את הביטוי Cas9 בתאים AML בצובר Cas9-blasticidin על-ידי המערב סופג את זה זה עדיין יהיה חשוב להעריך את יעילות לעריכת ג'ין באותם תאים בצובר Cas9-AML (שלב 1.5) לפני שימשיך מבחני תחרות. אנחנו משערת כי הבחירה של שיבוטים גבוהה יחיד-Cas9 מפחית את ההשתנות לעריכת הגנום, אשר חשוב במיוחד בעת בדיקת מספר של מדריך יחיד שונה RNAs (sgRNAs).- מבצעים חד-תא בערך Cas9-Blasticidin נבחר תאים לוקמיה MOLM13 ו- MLL-AF9 מעתה בשם MOLM13-Cas9 ותאים MLL-AF9-Cas9, בהתאמה, שימוש של סדרן FACS הכלול ברדס BSL2 אושרה. ניתן לבצע מיון 5 – 10 עגול התחתון תרביות רקמה שטופלו לוחות טוב 96.
- פעם אחת MOLM13-Cas9, שיבוטים MLL-AF9-Cas9 נאספו ולהרחיב בנפרד בשם, 10 – 20 שיבוטים עם 10 µg/mL של Blasticidin תרבות בתקשורת כדי להבטיח שמירה על הביטוי Cas9.
- הביטוי לבדוק חלבון Cas9 יציב על-ידי immunoblotting.
- להפוך תמציות הגרעין של כל שיבוטים Blasticidin נבחר של לוקמיה MOLM13 ו- MLL-AF9 באמצעות ערכת חילוץ גרעיני לפי הפרוטוקול של היצרן. בדוק Cas9 ביטוי חלבון באמצעות אנטי-דגל M2 נוגדן מאז Cas9 בתוך פלסמיד pLenti-Cas9 קשורה epitope N-מסוף דגל.
- לטעון µg 50 של חלבון הכולל של כל תמצית גרעיני על 10% Bis-טריס ג'ל ולהפעיל את הג'ל-120 V עד להקות העליון מופרדים היטב.
- לחסום את הקרום עם 5% פתרון חלב TBST מאגר מאובטח.
- דגירה הקרום עם 1:1,000 לדילול דגל נגד נוגדן M2-ריכוז הסופי של µg/mL 1-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- ביום למחרת, לשטוף את הקרום עם מאגר TBST, דגירה עם HRP מצומדת העכבר אנטי משני נוגדן-לדילול 1:5,000 (הריכוז הסופי של 0.16 µg/mL) בטמפרטורת החדר מאובטח.
- לשטוף את הקרום ביסודיות עם TBST ולפתח את האבן החשופה באמצעות ECL המצע.
- לבחור שיבוטים 3-4 עם הביטוי החלבון הגבוהה ביותר של Cas9 כפי שנראה סופג המערבי לצורך ניתוח פונקציונאלי נוסף (איור 1).
- הבטחת הפעילות Cas9 גבוהה שיבוטים שנבחרו
- להכין lentiviral תגובת שיקוע של וקטור קידוד sgRNA עם sgRNAs לעבר האדם או עכבר AAVS1 כספת-הארבור לוקוס כפי שמתואר על 1.1 שלב.
- מגלי העליון להביע Cas9 MOLM13 או לוקמיה MLL-AF9 שיבוטים עם אנטי-AAVS1 sgRNA lentiviral תגובת שיקוע בשיטת spinfection שתוארו לעיל. בחר עם 2.5 µg/mL Puromycin ארבעה ימים.
- לטהר את הדנ א של שיבוטים לוקמיה MOLM13-Cas9 או MLL-AF9-Cas9 לאחר הבחירה Puromycin יחד עם פקדים פראי-סוג המתאימים באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי לפי הוראות היצרן. שימוש 50 ng של DNA כתבנית כדי לבצע PCR עם AAVS1_test_primers באמצעות 2 x מיקס מאסטר של אנזימים, התוכנית PCR המפורטים בטבלה1.
- להפעיל את המוצר PCR על ג'ל agarose 2%, ג'ל-לטהר את הלהקה זוג בסיסים 268 באמצעות ערכת חילוץ ג'ל לפי הפרוטוקול של היצרן. סאנגר רצף הג'ל טהור PCR מוצר באמצעות פריימר של AAVS1_target-frag_F.
- להעריך יעילות העריכה על ידי השוואה של AAVS1 נערך רצפים wildtype באמצעות כלים מבוססי-אינטרנט מקוון (איור 2).
2. שיבוט, התמרה חושית של sgRNAs בתאים AML-Cas9
-
תפוקה בינונית שכפול של sgRNAs
- עיצוב sgRNAs 4-6 עבור הגן עניין באמצעות תוכנת עיצוב CRISPR מבוססי-אינטרנט. יש מספר CRISPR עיצוב כלים זמינים באינטרנט כגון http://crispr.mit.edu/ אשר ליצור רצפים sgRNA מבוסס על רצף ה-DNA קלט.
- מלא את המידע המתאים בשדות עם כוכביות. לחץ על הגנום היעד עבור עיצוב sgRNA. הדבק את רצף היעד בתיבה רצף ולחץ על לחצן שלח .
- לקראת שיבוט ב pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W sgRNA ביטוי פלסמיד, רצץ של נוקלאוטידים "CACC" חוש oligo, "AAAC" כדי oligo antisense המלווים הפוך לפני שמזמינים. סדר premixed חוש וחוש אנטי oligos בצלחת 96-ובכן מתויג Oligo-מיקס של חברת סינתזה oligonucleotide.
הערה: אנחנו עשינו שימוש pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W פלסמיד, שבו יש דרך האתר הגבלת BbsI sgRNA שיבוט. במקרה השני פלסמידים ביטוי sgRNA משמשים, המסוכך על המשמש את oligonucleotides sgRNA צריך להשתנות בהתאם. - לקחת U התחתון 96-ובכן לוח נפרד מתויג חישול צלחת. להפוך את תערובת הבסיס של 1 µL PNK T4, µL 1 של 10 x מאגר מצדו T4 DNA ו 6 µL של מים ליום חישול התגובה.
- הוסף 8 µL של המיקס מאסטר כל טוב של צלחת מחזק. להוסיף 1 µL של 100 מיקרומטר, הגיוני, antisense oligo (או 2 µL של מעורבות oligos הגיוני-אנטי-סנס) לתערובת בסיס. פיפטה 2 – 3 פעמים בעדינות לערבב היטב, לסובב את הצלחת בקצרה כדי לקבל את תערובות לתחתית של וולס.
- השתמש בתוכנית מחזק הבאים על מכונת ה-PCR: 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 2 דקות 30 s ב 95 ° C ואחריו קירור איטי עד 22 ° C בשיעור של 0.1 º C/s. לאחר חישול, לקחת צלחת 96-ובכן טרי מתויג OligoMix מדולל. . על הצלחת הזו, לדלל את oligos phosphorylated ואת annealed מן התגובה לעיל עם מים (1:200) באמצעות פיפטה רב-ערוצי.
- µG 5 תקציר של pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W וקטור עם 1.5 µL של אנזים הגבלה BbsI (10,000 יחידות/mL) באמצעות מאגר המתאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי linearize זה עבור מצדו מאוחר יותר.
- לקחת צלחת טוב טרי 96 מתויג מצדו צלחת ולהוסיף 20 ng של BbsI מתעכל pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W וקטור באר אחת לכל מצדו sgRNA הרצוי. להוסיף 2 µL של oligos phosphorylated, annealed מהצלחת OligoMix מדולל .
- מוסיפים 1 µL 10 x T4 ליגאז מאגר µL 1 של האנזים T4 DNA ליגאז. פיפטה עם פיפטה רב-ערוצי ובעדינות דגירה המיקס מצדו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
הערה: ניתן לאחסן מצדו mixes ב-20 ° C עבור השלב שינוי מאוחר יותר. - בינתיים, הפשרה 90 µL של כשיר מבחינה כימית e. coli תאים על הקרח 10 דקות לפני סוף השלב מצדו.
- באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להפוך aliquots 10 µL של התאים המוסמכת כל טוב של צלחת נפרדת טוב 96.
- להוסיף את התערובת מצדו מהשלב 2.1.8 תגובה על תוך טוב המכיל תאי המוסמכת, פיפטה מעלה מטה בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- פיפטה 5 µL של חיידקים-DNA לערבב ישירות מן התגובה לעיל לתוך 6. ובכן לוח המכיל LB-אגר עם 100 µg/mL אמפיצילין. חזור על כל התגובות טרנספורמציה.
- צלחת כל תגובה טרנספורמציה לתוך בנפרד שכותרתה טוב של צלחת 6-. טוב. מוסיפים כ 5-8 חרוזי זכוכית לכל טוב לנער את הצלחת כל 6-ובכן 8 – 10 פעמים בתנועה סיבובית.
- לבחור מושבות יחידה 1-2 מכל קידוח עם טיפ פיפטה µL 20 סטרילית, פסים זה מקום בזהירות עם תוויות ברורות על סטרילי 10 ס מצלחת פטרי עם אגר LB ו- 100 מ"ג/מ"ל אמפיצילין. אחרי שהתרוצץ המשקולת ליברות, פשוט להוציא את הטיפ משמש לשכפול ומבטא לתוך 3 מ ל LB-אמפיצילין המכיל במדיום mL 14 סיבוב התחתית התחתונה מסומן עם מספר שיבוט בקטריאלי המתאים.
- שלח את הצלחת חיידקי ישירות סנגר רצף עם פריימר לפנים יזם U6 אנושי.
- לאחר אישור רצף של sgRNAs משובטים, לטהר את הדנ א מהצינור 14 מ"ל המתאימים באמצעות ערכת הכנה מיני לפי הוראות היצרן.
- מודדים את ריכוז ואיכות כל המיני-preps עם ספקטרופוטומטרים. לנרמל בכל מיני להתכונן לכל ריכוז של 15 ng/µL ו פיפטה לתוך צלחת טוב 96 מתויג sgRNA צלחת שיבוטים.
הערה: הצלחת הזו יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C או להשתמש ישירות עבור הכנת וירוס.
- עיצוב sgRNAs 4-6 עבור הגן עניין באמצעות תוכנת עיצוב CRISPR מבוססי-אינטרנט. יש מספר CRISPR עיצוב כלים זמינים באינטרנט כגון http://crispr.mit.edu/ אשר ליצור רצפים sgRNA מבוסס על רצף ה-DNA קלט.
-
בייצור נגיפי של המבנים sgRNA התמרה חושית
- לייצור של חלקיקים lentiviral sgRNA בתבנית 96-ובכן, בצע "shRNA/sgRNA/ORF תפוקה גבוהה ייצור ויראלי (96 טוב)" פרוטוקול של פלטפורמת ההפרעות גנטיות (GPP אינטרנט בפורטל) במכון ברוד (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols).
- µL 200 של תגובת שיקוע ויראלי להעביר צינורות סטרילי ומקפיאים מיד ב-80 מעלות צלזיוס.
- יום-1: מעיל בתחתית שטוח רקמות ללא תרבות מטופלים 96 טוב צלחת עם 100 µL של קטע רקומביננטי fibronectin אנושי-ריכוז של µg/mL 10 בשכונה תרבות תא BSL2. לעטוף את הצלחת באמצעות גלישת תיאחז כדי למנוע אידוי אובדן ולהשאיר אותה על הספסל במשך הלילה.
- יום 0: להסיר את השבר רקומביננטי fibronectin אנושי מכל קידוח. להפשיר את תגובת שיקוע ויראלי של כל sgRNA בטמפרטורת החדר. להוסיף 50 µL של תגובת שיקוע ויראלי מהצינור כל אחד מצופה היטב של צלחת התמרה חושית. לסובב את הצלחת התמרה חושית ב x 1300 גרם במשך 90 דקות ב- 35 מעלות צלזיוס.
- לקראת סוף spinfection, נחשב MOLM13-Cas9 (שיבוט B3) תאים מן הבקבוק תרבות. השתמש 10,000 תאים לכל טוב בכרך µL 100. לספור את התאים על כל התמרה חושית הבארות, נפח מת התחשבות.
- לאחר spinfection 90 דקות, הסר את תגובת שיקוע כל הבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצי התרגלו 50 µL לאט בהטיית לצלחת. להוסיף כל טוב לאט מחליק במורד משפת 100 µL התרבות של התאים המשובטים B3 MOLM13-Cas9.
- לסובב את הצלחת ב x 1,300 g למשך 2 דקות ב- 35 ° C לתת את התאים להתפשר על גבי התחתון. להעביר את הצלחת החממה כיתה של תרביות רקמה 37 º C.
- יום 1: הוספת µL 100 של בינוני טריים כל טוב המכיל sgRNA transduced Cas9-MOLM13 או Cas9-MLL-AF9 לוקמיה תאים כך שאמצעי האחסון בינוני הסופי 200 µL.
3. תחרותי צמיחה Assay
- יום 3: 72 h (יום 3) לכתוב התמרה חושית, לבדוק את אחוז sgRNA המכיל תאים חיוביים BFP כל היטב על ידי cytometry זרימה (FACS). השתמש צבע הכדאיות תא כדי לסמן או לא לכלול תאים מתים מניתוח.
- המשך מחדש יופיצ שיעור של התאים לתוך בארות חדשות בינונית טרייה לאחר כל ניתוח FACS למנוע יתר במהלך וזמינותו.
-
חזור על הניתוח FACS כל 2-3 ימים כדי לבדוק את חלקם היחסי של BFP חיובי (BFP + ve) תאים בהשוואה BFP עמיתיהם (BFP-ve) שלילי (איור 3). לנתח את אחוז BFP תאים חיוביים עבור כל נקודת זמן (באמצעות FlowJo או תוכנה דומה של ניתוח FACS).
- גרור קבצים Fcs עבור כל דגימה תוכנה FlowJo. לחץ פעמיים על כל קובץ דוגמא אחת, מגרש אבן חשופה נקודה של פיזור קדמי (FSC) לעומת הצד פיזור (האס) עם FSC על ציר והאס על ציר Y. שער כל התאים.
- לחץ פעמיים על התאים מגודרת, מניחים אותם על הכתם הכדאיות (על ציר Y) לעומת FSC גובה (H) או אזור (א) נקודה חשופה. שער הכדאיות כתם שלילי תאים (חיים).
- לחץ פעמיים על תאים חיים מגודרת, להתוות BFP (לאורך ציר Y) לעומת FSC (א) על ציר X. שער BFP + ve תאים. חלות כל השערים הללו כל הדגימות על-ידי גרירת המדגם הנבחר כל דוגמאות תחת לשונית קבוצה .
- לחץ על שולחן עורך לעשות טבלת ניתוח של כל הדגימות. גרור ספירת BFP + ve דוגמא אחת בטבלה ולחץ על לחצן תצוגה ב- שולחן עורך כדי ליצור דוח אצווה של כל הדגימות עם שולחן מציג את אחוז תאים BFP + ve . שמור את הטבלה xls.
- לחשב את העלייה פרופורציונליים או ירידה % BFP תאים חיוביים בתוך האוכלוסייה תא חי לאורך זמן והשווה יחס זה ביחס של תאים חיוביים BFP sgRNAs שליטה (כגון לוציפראז, ביצים מקושקשות או GFP sgRNA).
- להתוות את היחס שבין BFP תאים חיוביים עבור sgRNAs שונות כולל את gene (s) של הריבית וכן פקדי משתמש יום 3 כקו הבסיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר שלנו, אנחנו קודם transduced את MOLM13 האנושית AML שורת התאים הנושאת רוברטסונית MLL-AF9 עם כייל גבוה וירוס קידוד פלסמיד lentiviral את Cas9-blasticidin. בידיים שלנו, בצובר ממוינת תאי MOLM13-Cas9 תציג את הביטוי Cas9 ברמה גבוהה על ידי סופג המערבי ואת גם לא לבצע היטב כאשר לבדיקה עבור ג'ין יעיל עריכה-באמצעות השיטה שתוארה לעיל7. לכן, התקדמנו כדי ליצור שיבוטים תא בודד ולבחור רק השיבוטים עם רמות גבוהות של Cas9 כפי שנראה המערבי סופג (איור 1). אסף 2 שיבוטים ברורים ואנו transduced אותם עם sgRNAs מיקוד אתר מיקומה כספת-הנמל AAVS1 כפי שתואר קודם7. באמצעות DNA גנומי מופק sgRNA שנבחר Puromycin MOLM13-Cas9-AAVS1 שיבוטים, ביצענו של PCR באמצעות תחל פורש את sgRNA AAVS1 לחתוך האתר ולאחר סנגר וסודרו 268 bp PCR מוצר ספציפי של מושבות המבודד 10 עבור כל המשובטים MOLM13. לאחר יישור עם הרצף הורים, מצאנו כי MOLM13-Cas9 שיבוט B3 ולשכפל MLL-AF9-Cas9 8 היה יעילות של 100% (נתונים לא מוצג). אז בחרנו שיבוטים אלה ספרים גבוהים בתיווך Cas9 לעריכת הגנום ליכולת שלנו מבחני תחרות sgRNA. בעוד מחקרים אלו נערכו, בכלים מבוססי-אינטרנט לבדיקה במהירות יעילות לעריכת הגנום של רצפי סנגר פותחו על ידי קבוצות שונות כגון הגאות8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) או קרח (https://ice.synthego.com/#/). כלים אלה להצליח מאוד קלה וחסכונית כדי להעריך את יעילות לעריכת הגנום ללא צורך לשכפל קטעים בודדים ולבצע רצף של שיבוטים מרובים. לכן, תאים בכמות גדולה לבטא Cas9 צריך להיבדק קודם על הגנום עריכת יעילות בשיטות אלה. במקרה היעילות לעריכת הגנום הוא גבוה, ואז שיבוט תא בודד אינה דרושה. גם במקרה זה שיבוט תא בודד יש צורך כפי שנראה במחקרים שלנו, הכלים להערכת אלה מבוסס-אינטרנט תדר mutational מציעים שיטה הרבה יותר מהר לבדיקת מספר שיבוטים במקביל.
עבור sgRNA שיבוט, עשינו שימוש sgRNA שיבוט פלסמיד pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, אשר בנמלים חלבון פלואורסצנטי כחול (BFP) עבור מעקב אחר תאים sgRNA transduced ומפיץ של מונחי-RNA פולימראז השלישי האנושי U6 שמניע את הביטוי של sgRNAs משובטים יחד עם לגרדום RNA (tracRNA) ' מעקב '. השתמשנו במערכת זו לשבט sgRNAs 2 מיקוד DOT1L, חלבון ידוע יש תפקיד חשוב בוויסות epigenetic של ביטוי גנים. DOT1L הוא methyltransferase היסטון זה הפקדות מונו, די, tri-מתילציה היעד גנים9,10. מחקרים הראו כי DOT1L ממלא תפקיד חשוב ב- AML מונע על ידי MLL-fusion oncogenes. לכן, נוקאאוט DOT1L באמצעות CRISPR-Cas9 צפוי להוביל לפגום באופן משמעותי את העכבר MLL-AF9 לוקמיה התפשטות תאים בקו13,12,11,מחקרים קודמים14. השתמשנו בשתי sgRNAs מיקוד לוקוס נמל מבטחים את AAVS1, אשר אינטרון של הגן PPP1R12C. sgRNAs לייצר שינויים גנומית באתר זה אינן עשויות להיות השפעות על היכולת המקדימות של שורות תאים MLL-לוקמיה. כפקד חיובית, שיבטנו sgRNAs מיקוד גנים הקשורים שכפול RPA3 את הדנ א. RPA3 הוא גן פאן-חיוני כי הוכח להיות חשוב עבור ההתפשטות של מספר AML תא קווים4,15,16 . לכן, anti-RPA3 sgRNAs להציג אפקטים אנטי-proliferative חזקה בתאים AML, משמשים בדרך כלל כפקד חיובי. לאחר התמרה חושית עם פלסמידים sgRNA אנטי-AAVS1 ו- anti-RPA3, מדדנו חלקם היחסי של BFP + ve sgRNA transduced תאים לעומת עמיתיהם BFP-ve כל 2-3 ימים בתרבות (איור 3). עם פרוטוקול המתואר לעיל, הביא התמרה חושית של תאים MOLM13 או AML MLL-AF9 60 – 70% יעילות התמרה חושית עם ההכנות שלנו ויראלי, עוזב את התאים 30-40% הנותרים untransduced או BFP-ve היטב בכל. דבר זה מאפשר המחקר של התפשטות היחסי של הגנום לערוך תאים עם פראי-סוג תאים של אותה טוב. פרופורציונאלית לעליה או ירידה באחוז התאים sgRNA transduced שימשה אמצעי כדי לשקף את השפעת sgRNA תפקודית המתווך מחיקה גנים בתאים MOLM13-Cas9. אם הגן שלך עניין חשוב מהירה של התאים AML מבחן, ואז בתיווך sgRNA שיבוש של הגן הזה יוביל הצטמצמות היחסי BFP לבטא sgRNA + ve תאים לעומת התאים BFP-ve במהלך וזמינותו, בעוד sgRNAs מיקוד לוציפראז, GFP או שאינם חיוניים גנים ישמרו על BFP + ve /-ve יחס לאורך זמן.
באמצעות 2 נגד נפרד-RPA3 sgRNAs, ראינו ירידה הדרגתית ומשמעותית באחוזים של BFP + ve תאים בהשוואה BFP-ve untransduced מקבילים. לעומת זאת, אחוז sgRNA אנטי-AAVS1 לבטא BFP תאים נשארו קבועים יחסית לאורך זמן, הוכחת כי המיקוד AAVS1 יש השפעה על ההתפשטות של תאים MOLM13 (איור 4a). באופן דומה, בתאים MLL-AF9-Cas9 העכבר, בדקנו את ההשפעות של sgRNAs מיקוד אופסין # רודופסין (Rho1), הגן פיגמנטציה עין בקרה שלילית, Dot1l, הרגולטור epigenetic ידוע הדרושות ההתפשטות של תאים לוקמיה MLL-AF9 לאורך זמן . המחקר הזה, BFP + ve העכבר MLL-AF9-Cas9 תאים transduced עם sgRNAs נגד נפרד-DOT1L 2 הראו הפסד דרמטי ומתקדמת לאורך זמן בהשוואה לתאים BFP-ve sgRNA transduced (איור 4b). לעומת זאת, היחס של אנטי-Rho1 sgRNA נותר כמעט ללא שינוי לאורך זמן. תוצאות אלה מדגימים את הפגיעות של MLL-AF9 לבטא תאים לוקמיה העכבר דלדול Dot1l, המאשר את התוצאות שפורסמו בעבר.
איור 1: נציג המערבי חשופה התוצאות מראה רמות שונות Cas9. תא בודד שיבוטים של הקו הסלולרי MOLM13 AML transduced עם CAS9 היו ובחן עבור הדגל-Cas9 רמות הביטוי באמצעות נוגדנים אנטי-דגל. שיבוטים מציג הביטוי הגבוהה ביותר של Cas9 נבחרו ללימודי. HEK293-T תאים transfected עם Cas9 הביטוי פלסמיד שימשו פקד חיובי ותאים Cas9 ללא transduced MOLM13 כפקדי שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח נציג של הגנום העריכה לוקוס Dot1l מוערך על ידי ניתוח קרח. אמפליקון PCR סביב אתר היעד של sgRNA Dot1l היה סנגר וסודרו נותחה באמצעות ניתוח קרח. השוואה של הרצף sgDot1l (קו כתום) שאינן ממוקדות רצף ה-DNA (הקו הירוק) מדגים את הרמה הגבוהה של עריכת יעילות בתאים sgDot1l ממוקד סביב אתר המטרה sgRNA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זרימת סכמטי של השיטות המוצע. sgRNAs משוכפלות ב sgRNA ביטוי וקטור משותפת להביע החלבון הניאון כגון BFP. התאים היעד transduced במחירים התמרה חושית 30 – 60%, ואחריה cytometry זרימה כל 2-3 ימים. sgRNAs מיקוד גנים הדרושים עבור התפשטות תאים AML יראה דלדול יחסית לאורך זמן כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג נובעת תחרות מבחני-אנוש ותאים AML העכבר. () התוצאות מציגות מתקדמים משמעותית ביותר מבחינה סטטיסטית לירידה RPA3 transduced MOLM13-Cas9 התאים המשובטים B3. לעומת זאת, sgRNAs מיקוד האתר AAVS1 השפעה. sgRNAs (b) מיקוד Dot1l מראים ירידה מדהימה ומתקדמת התפשטות תחרותי, בניגוד sgRNAs מיקוד אופסין # רודופסין (Rho). p > 0.05. p < 0.05. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן של ממוצע (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: חלוקה כללית של הפרוטוקול. () זמן עבור כל שלב בייצור של וירוס Cas9 ולא sgRNA לשכפול המתוארות. עיצוב, שכפול של sgRNAs יכול להתבצע תוך יצירת שיבוט יחיד של AML שורות תאים עם ביטוי Cas9 יציב. (b) פרוטוקול כללי התמרה חושית של AML שורות תאים עם sgRNAs ואת וזמינותו צמיחה תחרותי באמצעות FACS מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מחזורים | משך מחזור | טמפרטורה |
| 1 | 2 דקות | 95 ºC |
| 35 | 30 s | 95 ºC |
| 30 s | 55 ºC | |
| 30 s | 72 ºC | |
| 1 | 5 דקות | 72 ºC |
| . תחזיק | אינסוף | 4 ºC |
טבלה 1: תוכנית ה-PCR AAVS1 הגברה לוקוס מ- DNA גנומי. תוכנית ה-PCR המשמש עבור ההגברה של לוקוס AAVS1 מ- DNA גנומי ליעילות הבדיקה חיתוך של Cas9 ב Cas9 לבטא שיבוטים.
הקבצים המשלימים: רצפים oligo sgRNA. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לביצוע של צמיחה תחרותי המבוססות על CRISPR-Cas9 assay לחקור את התפקיד של המועמד גנים ב- AML שורות תאים באמצעות cytometry זרימה ב- AML האדם/מאתר תאים (איור 5). מטרת וזמינותו היא לזהות את ההשפעה של ג'ין מחיקה על תחזוקה של התפשטות תאים AML מעל שבועיים עד שלושה שבועות בקנה-מידה בינוני-תפוקה. כמה צעדים קריטיים שצריך להיות אחריו בקפידה כדי להקל על שינוי קנה מידה הפרוטוקול המתואר. בייצור של Cas9 lentivirus, זה הכרחי לסנן את המדיום וירוס ממוזגים דרך מסנן מיקרומטר 0.45 כדי למנוע את דחויים של תאים 293T לוירוס המכיל תגובת שיקוע. במהלך spinfection, גלישת לצלחת spinfection עם גלישת נדבקים או מצלמות-מיקרוסקופים מסייעת למנוע אפשרות זיהום במהלך צנטריפוגה. עם זאת, הגלישה להסירה לפני הצבת את הצלחת spinfected חזרה ב חממה תרביות רקמה. . זה מאוד חשוב להעריך ביטוי Cas9 שיבוטים עבור יעילות העריכה. שיבוטים עם יעילות העריכה נמוך-הגנום משקפים פעילות Cas9 לקויה, עלול להשפיע על שיעור ההצלחה של הניסוי. בניסויים שלנו, אנו קודם transduced שיבוטים אנושיים AML Cas9 עם sgRNAs מיקוד של לוקוס AAVS1, וסודרו שלהם DNAs גנומית לעריכה יעילות. השוואה של AAVS1 נערך ורצפים wildtype יכול להיות מוערך באמצעות כלים מבוססי-אינטרנט מקוון כגון הגאות8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) או קרח (https://ice.synthego.com/#/). תוכניות אלה השוואת סאנגר רצף עקבות של PCR פוטנציאל הערוך קטע רצף ערוכות wildtype או הפניה ולהעריך את התדירות של שינויים. זוהי דרך מהירה של הערכת שינויים mutational שהביא sgRNA הבדיקה, אשר הוא מדד פעילות Cas9 תאית. לחלופין, שיבוט של ה-PCR המוצר לתוך פלסמיד כשכפול PCR כגון סיירי בוטה שיבוט וקטור יכול להתבצע, ואחריו סנגר רצף של מושבות בודדות כדי להעריך את יעילות לעריכת הגנום על ידי עימוד רצפים של כל לכפיל פראי-סוג. אנו מעדיפים את שיטת לשעבר, בהתחשב שלה נוחות וחסכון לעומת שיטת השיבוט. בדרך כלל, הגילוי של זוג בסיסים משתנה כגון נקודה, indels, וכו '., על או סביב האתר חיתוך sgRNA, הרוב המכריע של שיבוטים ברצף את נוכחותם של Cas9 פעיל ביותר. לכן, בחרנו לוקמיה MOLM13 או MLL-AF9 שיבוטים B3 ו- 8, בהתאמה, עם יעילות העריכה הגבוהה לניסויים נוספים.
תיכננו sgRNAs מיקוד גנים שונים מצויה בפרוטוקול באמצעות http://crispr.mit.edu/, תוכנה מבוססת אינטרנט זה נותן רשימה של sgRNAs. מומלץ לבחור בעל ניקוד העליון sgRNAs מתוך הרשימה כדי לחסל את אלה עם אפקטים את המטרה החזוי. SgRNAs מעוצב יכול להיות משובטת שימוש בכל הפרוטוקולים שפורסמו כמו האחד באתר (http://www.addgene.org/67974/). Oligos הישר ואת antisense קודם phosphorylated, annealed לפי השלב 2.1.5. הצעד הראשון ב 37 ° C חשוב עבור phosphorylating את oligos עם קינאז T4, מחזורי PCR הבאים חשובים עבור חישול של תחושה, תחושה אנטי oligonucleotides לתוך dsDNA. חשוב כי החלבון הניאון הווקטור שיבוט sgRNA אשר הוא קריטי עבור מעקב אחר תאים sgRNA transduced בהמשך מבחני תחרות. sgRNA שיבוט תוגדל עם השימוש של 96 הצלחת היטב כל השלבים כולל חישול מצדו. מצדו, הנקיים microtube PCR רצועות יכול לשמש גם מכיוון שהן תואמות פיפטות רב-ערוצי. במקרה כי השינוי של קבוצה גדולה יותר של שיבוטים sgRNA יש צורך, צלחת 96-ובכן באיזה μL 10 של התאים המוסמכים הם טרום-aliquoted היטב כל וקפואים ב-80 מעלות צלזיוס יכול לשמש כדי לזרז את התהליך כולו. המטרה של ציפוי תגובות מצדו הוא לאסוף מושבות בודדות, אשר קשה לבצע בתבנית 96-ובכן. לפיכך, לטרנספורמציה חיידקית, יש פגיעה קלה מדרגיות. ובכל זאת, אפילו עבור ציפוי של טרנספורמציה מתגובות צלחת שלמה של 96-ובכן, זה רק דורש סכום כולל של 16 לוחות 6-טוב עבור הפרוייקט כולו. יש להיזהר בשלב הבא של איסוף מושבות של הלוחות טרנספורמציה. בזמן ומבטא מושבה על מקום עם תוויות ברורות, ודא במקום מבודד בבירור מן המקומות האחרים. סימון מרובע ברשת לקרקעית הפטרי עם סמן קבוע כהה מסייע במניעת זיהום צולב של שיבוטים חיידקי.
לאחר minipreps של המבנים sgRNA מוכן, הנגיף יכול להתבצע בתבנית 96-ובכן. ברמה זו של תפוקה, זה לא מעשי לסינון µL 200 של וירוס המכיל תגובת שיקוע. לפיכך, תגובת שיקוע ויראלי אמורים לקפוא לפחות לילה כדי למנוע זיהום לחצות כל התאים 293T כמשימות לתוך תגובת שיקוע. זה יכול גם להיות מאוחסנים ב- 50 aliquots µL בצינור PCR עקר רצועות כדי להימנע להקפיא הפשרתו של תגובת שיקוע. עוד יותר, supernatants וירוס ממוזגים אלה משמשים transducing תאים AML. במקרה זה נמוכה titers של התמרה חושית ויראלי שנצפו, כפי לאומדן בתדר נמוך BFP + ve תאים, ואז זה עשוי להיות חשוב לקבוע את נגיפי כייל נוגדנים ואת הבדיקה transductions-ריבוי שונים של זיהומים (MOI) כדי להבטיח 40-60 אחוז התמרה חושית המחירים. כייל ויראלי ונחישות MOI החישוב מתואר ב פירוט כאן17. תחרות וזמינותו, כפי שמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול, חשוב מאוד לא לכלול תאים כלכלית כדי למנוע כדין חפצים אוטומטי-זריחה במהלך ניתוח של BFP ליחס הלא-BFP. בזמנו של FACS, לפני ניתוח הבדיקה דוגמאות, השימוש BFP שלילי ופקדים חיובי BFP מומלץ מאוד להגדיר במדויק את המתחים. בכל נקודה בזמן מחדש משוריין, תלוי נפח התאים להיות מצופה מחדש הריכוז של תאים בנקודת-הזמן נתון. אנחנו בדרך כלל מחדש מצופה μL 20 מתוך סכום כולל של 200 μL בכל זמן-נקודה לבאר טריים μL 180 בינוני טריים. מומלץ מאוד ערבוב יסודי של התאים על-ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה לפני ציפוי מחדש. בדרך כלל, הבחנו כי וזמינותו צריך להתבצע במשך 15-20 ימים כדי הודעה חזקה לשינויים BFP + ve /-ve יחסי, למרות מגבלה זו משתנה ג'ין ג'ין.
הגדרת הניסוי הזה מתאים מאוד בדיקות מספר גנים במקביל מספר שורות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה כדי לזהות במהירות את התפקיד של המועמד גנים ההישרדות או התפשטות של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה. קודם של התפשטות תחרותי וזמינותו המתוארים כאן היא כי זה אינו לוקח בחשבון פוטנציאל התא-החיצוניים גורמים כגון paracrine איתות האירועים מתאי גן במיקוד שעשוי להשפיע על האוכלוסייה שאינן ממוקדות תא בתוך אותו היטב. למרות שזה נדיר, גורם זה צריך לזכור כאשר עורכים זה וזמינותו. למרות השתמשנו AML כדוגמה עבור מבחני תחרות CRISPR-Cas9 מבוססי תיאר כתב יד זה, שיטה זו יכול לשמש עבור כל שורות תאים סרטן כדי לזהות את התפקיד של גנים מרובים במקביל. יש יתרונות שונים של ג'ין-מחיקה באמצעות CRISPR-Cas9 מעל הגן-נוקאאוט באמצעות התערבות ב RNA. ראשית, בניגוד shRNAs, אשר בדרך כלל להציג מגוון רחב של עיכוב mRNA היעד, sgRNAs בשילוב עם נוקלאז Cas9 אבצע הסתרה מלאה של היעד גנים. זה עלול לגרום פנוטיפים דרמטי ועקבית יותר עם שיטות המבוססות על CRISPR-Cas9, אף-על-פי זה חייב להיות הזהיר כי יעילות מיקוד sgRNAs בודדים, כמו גם shRNAs עשויה להשתנות באופן ניכר.
וזמינותו לזרום cytometry מבוססת על התחרות מציע מספר יתרונות על מבחני התפשטות המסורתית שבה מספר קבוע של תאים הם מצופה כדי למדוד את הפעילות proliferative היחסי של תאים מוטרד-ג'ין. אחד היתרונות הוא כי הפעילות proliferative היחסי של תאים בקלות, במהירות נמדד על ידי cytometry זרימה במשך מספר ימים, תוך עקיפת הצורך תא לספור בכל שלב ציפוי. פעולה זו שימושית כאשר בדיקות מספר גדול של המועמד sgRNAs מיקוד מספר גנים, כמו ספירת כל הבארות היא מסורבלת, עלול להוביל אי דיוקים. בניגוד, מבחני מדידה מבוסס-ATP עבור צמיחת תאים, דנ ניתן לבצע דגימה של תאים חיים, מה שהופך את שיטה זו מועילה לצורך ניתוח לטווח ארוך. זה מועיל במיוחד במחקר של גורמים כגון מאפננים epigenetic, אשר עשויה להציג מאוחר אקטינג השפעות על התפשטות של תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה עשויה לדרוש מבחני לטווח ארוך. שנית, הנוכחות של תאים שאינם transduced בתוך אותו טוב מאפשר עבור אוכלוסיה תא ומבוקרות היטב יכול לשמש כדי להגדיר את התוכנית הבסיסית עבור וזמינותו. שלישית, כאשר הגדרת בתבנית 96-ובכן, וזמינותו כמעט לחלוטין מתבצעים באמצעות פיפטות רב ערוצית, באופן משמעותי זירוז התהליך כולו של שכפול של sgRNAs על הכנת וירוס ובסופו של דבר הערכת זרימת-cytometric קרינה פלואורסצנטית.
השיטה המתוארת כאן ניתן ביעילות טיפס למעלה בשביל החקירה של עד 96 sgRNAs במקביל ומציג מסך ערוכים. בהנחה sgRNAs 4-6 לכל גן, שיטה זו ולכן ניתן לחקירה מהירה לפחות 16-24 גנים במקביל. במקרה של מספר גדול של גנים, כגון מסלול המולקולרי כולו צריך להיחקר בתאים AML, מסכי CRISPR-Cas9 מבוססי במאגר יהיה יותר שימושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.J.D הוא יועץ A2A תרופות (ניו ג'רזי), ותרופות Salgomed (קרית אתא). מחברים אחרים יש אין התנגשויות להכריז.
Acknowledgments
פלסמיד pCW-Cas9 הייתה מתנת אריק לנדר & דוד סבאטיני (Addgene פלסמיד # 50661), pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W פלסמיד מהמעבדה יוסה (Addgene פלסמיד #67974. ברצוננו להודות הליבה Cytometry זרימה במכון דיסקברי רפואי SBP לעזרה בזמן עם ניתוח תזרים ומיון. נשמח להכיר את התמיכה של הקרן לזכר טטה הגברת כדי לספירה נשמח להכיר גם את התמיכה של מקורות המימון הבאים: NIH/NCI P30 CA030199 סרטן מרכז בחסות גרנט, V-הקרן ומרכזים את סן דייגו NCI סרטן (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).
