Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Tumor Initiation and Maintenance Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 3Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

هذه المخطوطة وصف أسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) للتحقيق بسيطة وسريعة لدور متعددة الجينات المرشحة في سرطان الدم النقوي الحاد (AML) انتشار الخلايا في موازية. هذه التقنية قابلة للتطوير ويمكن تطبيقها في خطوط خلايا السرطان الأخرى كذلك.

Abstract

وقد استخدمت الدراسات اضطراب الجينات على نطاق واسع التحقيق في دور الجينات الفردية في أمراض مكافحة غسل الأموال. لتحقيق اضطراب الجينات كاملة، قد جعلت العديد من هذه الدراسات استخدام نماذج خروج المغلوب الجينات المعقدة. في حين تقدم هذه الدراسات مع خروج المغلوب الفئران نظاما للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري أنيقة واجتازت اختبار الزمن، طريقة سريعة وقابلة للتطوير لتقييم المرشح الجينات التي تلعب دوراً في انتشار خلية مكافحة غسل الأموال أو البقاء على قيد الحياة في نماذج مكافحة غسل الأموال سيساعد على التعجيل باستجواب موازية متعددة الجينات المرشحة. وعززت التقدم الذي أحرز مؤخرا في تكنولوجيا الجينوم تحرير كبير قدرتنا على أداء الاضطرابات الوراثية على نطاق لم يسبق له مثيل. واحد مثل هذا النظام لتحرير الجينوم هو الأسلوب كريسبر-Cas9-تعتمد التي يمكن استخدامها لإجراء تغييرات سريعة وفعالة في جينوم الخلية المستهدفة. بسهولة وقابلية لحذف الجينات كريسبر/Cas9-بوساطة يجعلها واحدة من التقنيات الأكثر جاذبية لاستجواب عدد كبير من الجينات في فحوصات المظهرية. هنا، فإننا نعرض مقايسة بسيطة باستخدام كريسبر/Cas9 بوساطة الجينات-تعطل جنبا إلى جنب مع المنافسة القائمة على التدفق الخلوي الفائق فحوصات للتحقيق في دور الجينات التي قد تلعب دوراً هاما في انتشار أو البقاء على قيد الحياة للإنسان و موريني خطوط خلية مكافحة غسل الأموال.

Introduction

وشهدت العقود القليلة الماضية جهود بحثية عديدة ركزت على تحديد مساهمة رئيسية المسارات الجزيئية في أمراض سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). تقليديا، تم أداء تعطيل الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال باستخدام الفئران خروج المغلوب الشرطي أو دبوس الشعر القصير الحمض النووي الريبي (شرنا). بينما الفئران خروج المغلوب توفر نظام متطور لمراقبة الزمانية للجينات-الحذف، توليد جينات الفئران خروج المغلوب ذات العمالة الكثيفة، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة. وعلاوة على ذلك، جين-الضربة القاضية باستخدام استراتيجيات جزئ ليست قابلة للتطوير بسهولة؛ هذه الاستراتيجيات لا تصلح أيضا لاستجواب جينات عدة بالتوازي. وبعد اكتشاف أساليب تدخل الجيش الملكي النيبالي إلى مرناس الذاتية تدق لأسفل باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA) أو شرنا، بدأت العديد من المجموعات باستخدام تقنيات الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في دور جينات محددة في مجال مكافحة غسل الأموال. منذ خلايا مكافحة غسل الأموال مورين والبشرية على السواء، يصعب ترانسفيكت باستخدام الأساليب التقليدية تعداء على أساس المادة الدهنية، معظم الدراسات شرنا العاملين لينتيفيرالي أو ترميز ريتروفيرالي لدراسة وظيفة الجينات في خلايا مكافحة غسل الأموال. الاكتشاف الأخير لتجمع يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) وثورة nucleases Cas المرتبطة بها (كريسبر-Cas9) استهداف الجين التكنولوجيات1،،من23. استخدام كريسبر-Cas9، جينات معينة أو مناطق الجينوم يمكن حذف، وتحرير أو الموسومة بكفاءة وسهولة. كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير الجينات يظهر الآن كأسلوب الاختيار للتحقيق في علاقات التركيب الوراثي للنمط الظاهري في أنواع الخلايا المختلفة بسبب البساطة والفعالية، وانطباق واسع النطاق لهذا الأسلوب. كما أصبحت أساليب كريسبر-Cas9-تعتمد الأسلوب المفضل في مكافحة غسل الأموال، ليس فقط لاستجواب الجينات الفردية، ولكن أيضا كوسيلة لاستهداف جينات متعددة في الشاشات الوراثية المنتشرة أو المجمعة بهدف التحقيق في جينات عدة بالتوازي إمكانات مكافحة غسل الأموال-تبعيات4،،من56.

في هذه المخطوطة، يصف لنا مقايسة نمو تنافسي بسيطة لقياس أثر اضطراب الجينات في نمو خلايا مكافحة غسل الأموال، استناداً إلى مستقر كريسبر-Cas9-بوساطة الجينات تحرير تليها الفائق التدفق الخلوي. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة، وقابلة للتطوير للتجارب الإنتاجية المتوسطة للتحقيق في دور الجينات عدة بالتوازي في خلايا مكافحة غسل الأموال.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية مكافحة غسل الأموال توليد خط الحيوانات المستنسخة مع التعبير عالية من Cas9 مستقر ونشط

  1. إنتاج لينتيفيروس Cas9
    1. اليوم 0: لوحة 4 × 106 293T الخلايا في 10 مل دميم مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين ولام الجلوتامين في طبق استنبات الأنسجة 10 سم في السلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) معتمد هود ثقافة الخلية. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية.
    2. يوم 1: ينبغي أن تكون الخلايا 293T مطلي روافد 70 – 80% في يوم 1. أداء تعداء استخدام بروتوكول التالية في فترة ما بعد الظهر.
    3. حرارة متوسطة تعداء ووسائط الثقافة وكاشف تعداء لدرجة حرارة الغرفة. ذوبان الجليد كل والبلازميدات المطلوبة تعداء.
    4. 9 ميكس ميكروغرام psPAX2، 0.9 ميكروغرام من pMD2.G و 9 ميكروغرام من البلازميدات بلينتي-Cas9 مع 500 ميليلتر من تعداء المتوسطة في أنبوب 5 مل.
    5. إضافة مل 1.7 من تعداء المتوسطة إلى مل 14 جولة الأنبوبة السفلي. إضافة 57 ميليلتر من تعداء الكاشف مباشرة في المتوسط تعداء في أنبوب لتجنب لمس جدار الأنبوبة.
    6. بلطف إضافة مزيج بلازميد كامل للحل كاشف تعداء وتخلط بلطف التنصت على الأنبوب على الجانب. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 – 30 دقيقة. وفي الوقت نفسه، تغير المتوسط من لوحة 293T المصنف.
    7. إضافة مزيج تعداء dropwise اللوحة والصخور بلطف لوحة جانبية لخلط تتسم بالكفاءة. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    8. يوم 2: نضح المادة طافية من لوحة تعداء بلطف أن الخلايا لا بالانزعاج أو فكها من اللوحة. تجاهل المادة طافية. إضافة 10 مل من 10% جديدة دميم المتوسطة بالانزلاق إلى أسفل بلطف من الجانبين من لوحة لتجنب إزاحة الخلايا.
    9. يوم 3: جمع الفيروس الذي يحتوي على المادة طافية من لوحة تعداء ببطء برسمه في محقن معقم 10 سم. بعد أن يتم جمع المادة طافية في المحاقن، إرفاق فلتر 0.45 ميكرومتر عقيمة للمحاقن وعقد بحقنه وتصفية عبر أنبوب مخروطي البوليبروبيلين العقيمة، طازجة 15 مل. بلطف يغرق المحاقن لتصفية الفيروس التي تحتوي على المادة طافية من خلال عامل التصفية 0.45 ميكرومتر في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل.
    10. تخزين متوسطة مكيفة الفيروسية في مختبرين من 2 مل في 2 مل كريوفيالس في-80 درجة مئوية.
  2. توصيل خطوط خلية مكافحة غسل الأموال
    1. اليوم-1: تمييع 1 ملغ/مل فيبرونيكتين البشري الماشوب يفتت الأسهم إلى 10 ميكروغرام/مل مع المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS). معطف زراعة الأنسجة تعامل 6 لوحة جيدا مع 2 مل من 10 ميكروغرام/مل فيبرونيكتين البشري الماشوب بلغة العامل الحل في غطاء ثقافة خلية BSL2 وافق. التفاف اللوحة في التفاف تتشبث لتجنب الخسارة في التبخر وتخزين في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    2. اليوم 0: ذوبان المادة طافية الفيروسية التي تحتوي على Cas9. نضح الحل بلغة فيبرونيكتين البشري الماشوب تماما من اللوحة مغلفة تماما قبل سبينفيكشن. إضافة 2 مل من الفيروسية متوسطة مكيفة مع Cas9 إلى اللوحة وأنها تدور في س 1,300 ز لمدة 90 دقيقة عند 35 درجة مئوية. وهذا يساعد على الجسيمات الفيروسية نعلق على سبينفيكتيد جيدا.
    3. وفي الوقت نفسه، عد الخلايا تكون ترانسدوسيد وتدور أسفل 2 × 106 خلايا في أنبوب مخروطي البوليبروبيلين 15 مل. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة.
    4. وبعد سبينفيكشن، إزالة جميع المادة طافية الفيروسية من سبينفيكتيد جيدا وتجاهل. يتم إرفاق جزيئات الفيروسات التراجعية من المادة طافية إلى الجزء السفلي من سبينفيكتيد جيدا. حسنا، هذا إضافة الخلايا6 2 x 10 حراكه في 2 مل متوسطة من الخطوة أعلاه.
    5. تدور اللوحة مرة أخرى في 1,300 س ز بإيجاز شديد (1-2 دقيقة) كافية للسماح للخلايا لتستقر في الجزء السفلي. ضع اللوحة العودة إلى الحاضنة وترك بين عشية وضحاها لتوصيل مع الجسيمات الفيروسية سبينفيكتيد المرفقة للبئر.
    6. يوم 1: اعتماداً على كثافة الخلية، إضافة أكثر المتوسطة للخلايا ترانسدوسيد لتجنب فرط.
    7. يوم 2: إضافة منذ بلازميد بلينتي-Cas9 علامة مقاومة بلاستيسيدين، بلاستيسيدين بجرعة 10 ميكروغرام/مل إلى ترانسدوسيد وأونترانسدوسيد (مراقبة) MOLM13 أو خلايا اللوكيميا الماوس MLL AF9 لاختيار Cas9 الإعراب عن الخلايا.
      ملاحظة: ويعتبر التحديد بلاستيسيدين من خلايا سرطان الدم ترانسدوسيد Cas9 MOLM13 أو MLL AF9 كاملة عندما أزيلت كافة الخلايا الموجودة في عنصر التحكم أونترانسدوسيد. لخطوط الخلايا عدا سرطان الدم MOLM13 و MLL AF9، منحنى استجابة جرعة يجب أن يتم قبل هذه التجربة حيث أنه يمكن أن تستخدم جرعة مثلى. يمكن أيضا إجراء المعايرة من المادة طافية الفيروسية في حالة معدلات منخفضة-توصيل.
  3. استنساخ تحديد الخلايا وإذ تعرب عن Cas9 عالية.
    ملاحظة: لقد لاحظنا أن بعض خطوط خلية مكافحة غسل الأموال، قد لا يكون التحديد استنساخ اللازمة: معظم السكان Cas9-بلاستيسيدين مختارة مسبقاً قد عالية الكفاءة تحرير الجينوم. وفي هذه الحالة، من الممكن تخطي 1.3 الخطوة والانتقال إلى الخطوة 1.4 تقييم التعبير Cas9 في خلايا مكافحة غسل الأموال المجمعة Cas9-بلاستيسيدين بواسطة النشاف الغربية. سيكون هاما لتقييم كفاءة تحرير الجينات في تلك الخلايا المجمعة Cas9-مكافحة غسل الأموال (الخطوة 1.5) قبل الانتقال إلى فحوصات المنافسة. أننا نخلص أن يقلل اختيار استنساخ واحدة عالية-Cas9 تقلب تحرير الجينوم، وأهمية خاصة عند اختبار عدد من دليل واحد مختلفة الكشف (سجرناس).
    1. أداء خلية واحدة نوع من Cas9-بلاستيسيدين تحديد خلايا سرطان الدم MOLM13 و MLL AF9 من الآن فصاعدا تسمى MOLM13-Cas9 وخلايا MLL-AF9-Cas9، على التوالي، باستخدام أرز نظام مراقبة الأصول الميدانية الواردة في غطاء BSL2 وافق. يمكن إجراء الفرز في 5-10 جولة أسفل غير زراعة الأنسجة المعالجة 96 جيدا لوحات.
    2. مرة واحدة MOLM13-Cas9 واستنساخ MLL-AF9-Cas9 تم انتقاؤها واسمه على حدة، توسيع استنساخ 10 – 20 مع 10 ميكروغرام/مل من بلاستيسيدين في ثقافة وسائل الإعلام لضمان الحفاظ على التعبير Cas9.
  4. التعبير تحقق استقرارا Cas9 البروتين إيمونوبلوتينج.
    1. جعل النووية مقتطفات من جميع المستنسخين بلاستيسيدين مختارة من اللوكيميا MOLM13 و MLL AF9 باستخدام "مجموعة استخراج النووية" وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. تحقق من Cas9 البروتين التعبير استخدام المضادة العلم جسم M2 منذ Cas9 في بلازميد بلينتي-Cas9 مرتبط حانمه الطرفي ن علم.
    2. تحميل 50 ميكروغرام من البروتين الكلي من كل استخراج النووية على % 10 مكررا-تريس جل وتشغيل الهلام في 120 الخامس حتى يتم فصل النطاقات العليا كذلك.
    3. كتلة الغشاء مع الحل الحليب 5% في تبسة المخزن المؤقت لح 1.
    4. احتضان الغشاء مع تخفيف 1:1,000 من جسم M2 المضادة العلم بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. وفي اليوم التالي يغسل الغشاء مع المخزن المؤقت تبسة واحتضان مع برنامج الصحة الإنجابية جسم الماوس المضادة مترافق الثانوية في إضعاف 1:5,000 (تركيز النهائي 0.16 ميكروغرام/مل) في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    6. يغسل الغشاء جيدا مع تبسة ووضع وصمة عار استخدام الركيزة القامة.
    7. اختيار استنساخ 3-4 مع تعبير البروتين أعلى من Cas9 كما يراها النشاف الغربية لمزيد من التحليل الوظيفي (الشكل 1).
  5. ضمان ارتفاع النشاط Cas9 في استنساخ المحدد
    1. إعداد المادة طافية لينتيفيرال من متجه ترميز سجرنا مع سجرناس التي تستهدف الإنسان أو الماوس موضع الملاذ الأمن AAVS1 كما هو موضح في "الخطوة 1، 1".
    2. ترانسدوسي أعلى MOLM13 الإعراب عن Cas9 أو استنساخ اللوكيميا MLL AF9 مع مكافحة--AAVS1 سجرنا لينتيفيرال المادة طافية باستخدام الأسلوب سبينفيكشن الموصوفة أعلاه. حدد مع 2.5 ميكروغرام/مل بوروميسين لمدة 4 أيام.
    3. تنقية الحمض النووي من المستنسخين اللوكيميا MOLM13-Cas9 أو MLL-AF9-Cas9 بعد التحديد بوروميسين جنبا إلى جنب مع كل منهما البرية من نوع عناصر التحكم باستخدام أدوات استخراج "الحمض النووي" وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. استخدام 50 نانوغرام من الحمض النووي كقالب لأداء بكر مع AAVS1_test_primers استخدام 2 x ميكس الرئيسي بوليميراز Polymerase والبرنامج بكر المدرجة في الجدول 1.
    4. تشغيل المنتج بكر على 2% [اغروس] هلام وجل تنقية الفرقة 268 زوج قاعدي باستخدام مجموعة أدوات استخراج جل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. سانغر التسلسل الهلام تنقية المنتج PCR باستخدام الدليل التمهيدي AAVS1_target-frag_F.
    5. تقييم كفاءة التحرير بالمقارنة AAVS1 تحريرها وتسلسل wildtype استخدام الأدوات المستندة إلى ويب على الإنترنت (الشكل 2).

2-الاستنساخ وتوصيل سجرناس في "خلايا" مكافحة غسل الأموال-Cas9

  1. الإنتاجية المتوسطة استنساخ سجرناس
    1. تصميم سجرناس 4 – 6 للجينات للاهتمام باستخدام برامج تصميم كريسبر المستندة إلى ويب. هناك عدد من أدوات التصميم كريسبر المتاحة على الإنترنت مثل http://crispr.mit.edu/وتوليد متواليات سجرنا استناداً إلى تسلسل الحمض النووي إدخال.
      1. تعبئة معلومات مناسبة في حقول مع علامات نجمية. انقر فوق على الجينوم المستهدفة لتصميم سجرنا. لصق تسلسل الهدف في مربع تسلسل وانقر على زر إرسال .
    2. للاستنساخ في (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 W سجرنا التعبير بلازميد، prepend النيوكليوتيدات "كاكك" إلى اليغو الشعور و "آآك" إلى اليغو العقاقير تستكمل عكس قبل أن يأمر. أوليجوس الإحساس والشعور بمناهضة النظام ممزوجة مسبقاً في صفيحة 96-جيدا المسمى اليغو-مزيج من شركة توليف اليغنوكليوتيد.
      ملاحظة: وقد أحرزنا استخدام (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 بلازميد ث، الذي لديه موقع تقييد بسي لاستنساخ سجرنا. في حالة استخدام أخرى والبلازميدات التعبير سجرنا، يتدلى المستخدمة النوكليوتيد سجرنا الحاجة إلى تغييرها تبعاً لذلك.
    3. أن لوحة 96-جيدا أسفل يو منفصلة تسمى لوحة الصلب. جعل مزيج رئيسي من 1 ميليلتر بنك T4، 1 ميليلتر من 10 × المخزن المؤقت لربط الحمض النووي T4 و 6 ميليلتر من الماء كل الصلب رد فعل.
    4. إضافة 8 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل من لوحة انلينغ جيدا. أضف 1 ميليلتر من كل 100 ميكرومتر، والشعور واليغو العقاقير (أو 2 ميليلتر من المختلطة الشعور-مكافحة--معنى أوليجوس) إلى مزيج الرئيسي. "الماصة؛" 2 – 3 مرات بلطف مزيج جيد، تدور لوحة بإيجاز للحصول على خلطات إلى الجزء السفلي من الآبار.
    5. استخدام برنامج انلينغ التالية على جهاز PCR: 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 2 دقيقة 30 ثانية عند 95 درجة مئوية متبوعاً بالتبريد البطيء إلى 22 درجة مئوية بمعدل 0.1 ° C/s. بعد الصلب، تأخذ لوحة 96-بئر جديدة المسمى أوليجوميكس المخفف. في هذه اللوحة، تخفف من أوليجوس فوسفوريلاتيد والملدنه من رد فعل أعلاه مع الماء (1: 200) استخدام ماصة متعددة القنوات.
    6. ملخص 5 ميكروغرام من pKLV2-U6gRNA5 (بسي)-PGKpuro2ABFP-ث مع ناقل ميليلتر 1.5 بسي إنزيم التقييد (10,000 وحدة/مل) استخدام مخزن مؤقت لمناسبة في 37 درجة مئوية ح 2 لينيريزي فإنه لربط في وقت لاحق.
    7. تأخذ طبق جيدا طازجة 96 المسمى ربط لوحة وإضافة 20 نانوغرام من بسي يهضم (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث متجهة إلى بئر واحدة لربط سجرنا المرجوة. يضاف إلى ذلك، 2 ميليلتر من أوليجوس فوسفوريلاتيد، الملدنة من لوحة أوليجوميكس المخفف .
    8. إضافة 1 ميليلتر من المخزن ليجاسى x T4 10 و 1 ميليلتر من الإنزيم ليجاسى الحمض النووي T4. بلطف "الماصة؛" مع ماصة متعددة القنوات واحتضان هذا المزيج ربط في درجة حرارة الغرفة ح 2.
      ملاحظة: ويمكن تخزين يمزج ربط في-20 درجة مئوية لخطوة التحول في وقت لاحق.
    9. وفي الوقت نفسه، الخلايا ميليلتر ذوبان 90 من كيميائيا المختصة كولاي على الجليد 10 دقيقة قبل نهاية الخطوة عملية ربط.
    10. استخدام ماصة متعددة القنوات، جعل 10 ميليلتر مختبرين للخلايا المختصة في كل من لوحة منفصلة 96 جيدا جيدا.
    11. إضافة ربط الخليط من الخطوة 2.1.8 إلى جيدا يتضمن الخلايا المختصة، ماصة صعودا وهبوطاً بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    12. ماصة 5 ميليلتر مزيج الحمض النووي البكتيريا مباشرة من رد فعل أعلاه إلى 6 أيضا لوحة تتضمن أجار رطل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. كرر لكل من ردود فعل التحول.
    13. لوحة كل رد فعل التحول إلى تلصق عليها بطاقات بشكل منفصل أيضا من لوحة 6-جيدا. إضافة حوالي 5 – 8 الزجاج الخرز إلى كل خير ويهز لوحة كاملة 6-جيدا 8 – 10 مرات في حركة دائرية.
    14. اختيار المستعمرات واحدة 1 – 2 من كل بئر مع تلميح ماصة معقمة 20 ميليلتر ومتتالية في بقعة توسم بعناية على معقم 10 سم طبق بيتري مع أجار رطل و 100 مغ/مل الأمبيسلّين. بعد streaking في لوحة رطل، ببساطة إخراج تلميح المستخدمة لاستنساخ streaking في 3 مل من رطل-الأمبيسلّين المتوسطة تحتوي على مل 14 جولة الأنبوبة أسفل علامة مع عدد استنساخ البكتيرية المقابلة.
    15. إرسال لوحة البكتيرية مباشرة سانغر التسلسل مع التمهيدي مروج U6 البشرية إلى الأمام.
    16. وبعد تأكيد تسلسل سجرناس المستنسخة، تنقية الحمض النووي من أنبوب 14 مل المقابلة باستخدام مجموعة أدوات الإعداد المصغر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    17. قياس تركيز ونوعية كل من ميني-محضرات مع جهاز المطياف الضوئي. تطبيع كل الإعدادية المصغر لتركيز 15 نانوغرام/ميليلتر وماصة في صفيحة جيدا 96 المسمى سجرنا "لوحة الحيوانات المستنسخة".
      ملاحظة: هذه اللوحة يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية أو تستخدم مباشرة في إعداد الفيروس.
  2. إنتاج الفيروسية سجرنا بنيات وتوصيل
    1. لإنتاج جزيئات سجرنا لينتيفيرال في شكل 96-جيدا، اتبع "شرنا/سجرنا/ORF إنتاجية عالية الإنتاج الفيروسية (96 جيدا)" بروتوكول من "منصة اضطراب الوراثية" (GPP web Portal) معهد واسع (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols).
    2. نقل 200 ميليلتر من المادة طافية الفيروسية لأنابيب معقمة وتجمد فورا في-80 درجة مئوية.
    3. اليوم-1: معطف لوحة مسطحة قاع الأنسجة عدم جيدا 96 ثقافة تعامل مع 100 ميليلتر فيبرونيكتين البشري الماشوب جزء بتركيز 10 ميكروغرام/مل في غطاء ثقافة خلية BSL2. التفاف لوحة استخدام التفاف تتشبث لتجنب فقدان التبخر وتركه على مقاعد البدلاء بين عشية وضحاها.
    4. اليوم 0: إزالة الجزء فيبرونيكتين البشري المؤتلف من كل بئر. ذوبان المادة طافية الفيروسية لكل سجرنا في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميليلتر من المادة طافية الفيروسية من كل أنبوبة لكل المغلفة جيدا من لوحة توصيل. تدور لوحة توصيل في س 1,300 ز لمدة 90 دقيقة عند 35 درجة مئوية.
    5. نهاية سبينفيكشن، عد الخلايا MOLM13-Cas9 (استنساخ B3) من قارورة الثقافة. استخدام خلايا 10,000 كل بئر في 100 ميليلتر الحجم. عد الخلايا لجميع الآبار توصيل، مراعاة حجم القتلى.
    6. وبعد سبينفيكشن 90 دقيقة، إزالة المادة طافية من جميع الآبار باستخدام ماصة الأقنية تعديلها إلى 50 ميليلتر ببطء عن إمالة اللوحة. إضافة 100 ميليلتر لثقافة MOLM13-Cas9 استنساخ B3 الخلايا لكل انزلاق جيدا ببطء إلى أسفل من الحافة.
    7. تدور اللوحة في 1,300 س ز 2 دقيقة على 35 درجة مئوية للسماح للخلايا تسوية إلى الأسفل. نقل اللوحة للحاضنة الصف زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية.
    8. يوم 1: إضافة 100 ميليلتر الطازجة المتوسطة وكل سجرنا أيضا تحتوي على ترانسدوسيد Cas9-MOLM13 أو خلايا اللوكيميا Cas9-MLL-AF9 أن متوسطة الحجم النهائي هو 200 ميليلتر.

3-تنافسية النمو بالانزيم

  1. يوم 3:72 ح (اليوم 3) وظيفة توصيل، والتحقق من النسبة المئوية سجرنا التي تحتوي على خلايا حزب الحرية الإيجابية في كل بئر بالتدفق الخلوي (نظام مراقبة الأصول الميدانية). استخدام صبغة بقاء خلية للاحتفال واستبعاد الخلايا الميتة من التحليل.
  2. مواصلة إعادة طلاء نسبة من الخلايا في آبار جديدة مع متوسطة جديدة بعد كل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتجنب فرط أثناء الفحص.
  3. كرر كل 2 – 3 أيام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للتحقق من نسبة الخلايا إيجابية (حزب الحرية + ve) حزب الحرية بالمقارنة مع حزب الحرية السلبية (حزب الحرية-ve) النظراء (الشكل 3). تحليل النسبة المئوية لخلايا حزب الحرية الإيجابية لكل نقطة الوقت (باستخدام فلوجو أو برامج مماثلة في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية).
    1. اسحب الملفات Fcs لكل عينة للبرمجيات فلووجو. انقر نقراً مزدوجاً فوق أي ملف عينة واحدة والمؤامرة دوت وصمة عار للأمام مبعثر (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مع منتدى التعاون الأمني في X المحور، والتعاون بين بلدان الجنوب على المحور ص. بوابة كافة الخلايا.
    2. انقر نقراً مزدوجاً فوق الخلايا مسور وارسم لهم على استمرارية وصمة عار (على المحور ص) مقابل منتدى التعاون الأمني الطول (H) أو منطقة (A) دوت وصمة عار. بوابة صلاحية وصمة سلبية الخلايا (لايف).
    3. انقر نقراً مزدوجاً فوق الخلايا الحية مسور ومؤامرة حزب الحرية (على المحور ص) مقابل "منتدى التعاون الأمني" (أ) على محور س. بوابة حزب الحرية + ve الخلايا. تنطبق جميع هذه البوابات لجميع العينات بواسطة سحب العينة المختارة جميع العينات تحت علامة التبويب مجموعة .
    4. انقر فوق محرر الجدول جعل جدول بتحليل جميع العينات. سحب حزب الحرية + ve العد من عينة واحدة للجدول، وانقر فوق الزر عرض في محرر الجدول لإنشاء تقرير دفعة لجميع العينات مع جدول عرض النسبة المئوية لخلايا حزب الحرية + ve . حفظ الجدول كما xls.
  4. حساب الزيادة النسبية أو نقصان في حزب الحرية % الخلايا إيجابية داخل السكان خلية حية على مر الزمن ومقارنة هذه النسبة بنسبة لخلايا حزب الحرية الإيجابية في سجرناس عنصر تحكم (مثل لوسيفراس، سارعت أو سجرنا التجارة والنقل).
  5. ارسم نسبة خلايا حزب الحرية الإيجابية سجرناس مختلفة بما في ذلك gene(s) للفائدة، فضلا عن عناصر التحكم باستخدام يوم 3 كخط الأساس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وفي دراستنا، نحن أولاً ترانسدوسيد MOLM13 البشرية AML الخلية السطر الذي يحمل إزفاء MLL AF9 مع الفيروس عالية-عيار ترميز بلازميد لينتيفيرال Cas9-بلاستيسيدين. في أيدينا، جل المفرز MOLM13-Cas9 الخلايا لم يتم عرض التعبير Cas9 مستوى عال من النشاف الغربية وأيضا لم يكن أداؤها جيدا عند جزيئي للجينات كفاءة التحرير-استخدام الأسلوب الموصوفة سابقا7. ولذلك، شرعنا في إنشاء استنساخ خلية واحدة فقط وحدد فقط استنساخ مع مستويات عالية من Cas9 كما يراها الغربية النشاف (الشكل 1). نحن التقطت 2 استنساخ متميزة وترانسدوسيد لهم مع سجرناس استهدف موقعا في موضع الملاذ الأمن AAVS1 ك سابقة وصف7. باستخدام الحمض النووي المستخرج من سجرنا مختارة بوروميسين MOLM13-Cas9-AAVS1 الحيوانات المستنسخة، أجرينا PCR استخدام كبسولة تفجير تمتد سجرنا AAVS1 قطع الموقع وسانغر التسلسل 268 bp PCR منتج معين من 10 مستعمرات منعزلة لكل استنساخ MOLM13. بعد المحاذاة مع تسلسل الأبوية، وجدنا أنه استنساخ MOLM13-Cas9 B3 واستنساخ MLL-AF9-Cas9 8 كفاءة 100% (البيانات لا تظهر). ثم اخترنا هذه الحيوانات المستنسخة عرض وساطة Cas9 التحرير الجينوم قدرة عالية لفحوصات المنافسة سجرنا لدينا. وبينما كانت تجري هذه الدراسات، وضعت الأدوات المستندة إلى ويب لاختبار سرعة كفاءة تحرير الجينوم من تسلسل سانجر مجموعات مختلفة مثل المد والجزر8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) أو الجليد (https://ice.synthego.com/#/). هذه الأدوات تجعل من السهل للغاية وفعالة من حيث التكلفة لتقييم كفاءة تحرير الجينوم دون الحاجة إلى استنساخ الأجزاء الفردية وإجراء تسلسل لاستنساخ متعددة. ولذلك، ينبغي أولاً اختبار الخلايا الأكبر إذ تعرب عن Cas9 للجينوم تحرير كفاءة استخدام هذه الأساليب. في حالة تحرير الجينوم كفاءة عالية، ثم استنساخ خلية واحدة غير مطلوبة. أيضا، في حالة أن الاستنساخ خلية مفردة المسبق كما رأينا في دراساتنا، توفر هذه الأدوات المستندة إلى ويب حيث تردد تقدير طريقة أسرع بكثير لاختبار استنساخ عدة بالتوازي.

لاستنساخ سجرنا، قدمنا استخدام سجرنا استنساخ بلازميد (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث، الذي يأوي بروتين فلوري أزرق (حزب الحرية) لتعقب الخلايا سجرنا ترانسدوسيد ويحركها "الثالث بوليميريز الحمض النووي الريبي" بشرية U6 مروج الذي يدفع بالتعبير عن سجرناس المستنسخة جنبا إلى جنب مع سقالة الراسم الحمض النووي الريبي (تراكرنا). استخدمنا هذا النظام لاستنساخ سجرناس 2 استهداف DOT1L، بروتين يعرف بأن تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير الجيني جينية. DOT1L هو methyltransferase هيستون تودع مونو، دي وثلاثي-مثلايشن في الهدف الجينات9،10. وقد أظهرت الدراسات أن DOT1L دوراً هاما في مكافحة غسل الأموال التي تدفعها المسرطنة MLL-الانصهار. ولذلك يتوقع خروج المغلوب DOT1L باستخدام Cas9 كريسبر يؤدي إلى يضعف إلى حد كبير الماوس MLL AF9 انتشار الخلايا اللوكيميا تماشيا مع الدراسات السابقة11،12،،من1314. كنا سجرناس هما استهداف موضع هاربر للأمان AAVS1، وفي إنترون الجينات PPP1R12C. سجرناس المنتجة للتعديلات الجينية في هذا الموقع لا يحتمل أن يكون لها أي آثار على القدرة التكاثري لخطوط خلايا سرطان الدم MLL. كعنصر إيجابي، نحن المستنسخة سجرناس استهداف الجين المرتبط بتكرار الحمض النووي RPA3. RPA3 هو جين عموم الضرورية التي أظهرت مهمة لانتشار عدة مكافحة غسل الأموال خلية خطوط4،،من1516 . ولمكافحة RPA3 سجرناس عرض آثار مكافحة التكاثري قوية في خلايا مكافحة غسل الأموال وتستخدم عادة كعنصر إيجابي. بعد توصيل مع البلازميدات سجرنا AAVS1 المضادة ومكافحة RPA3، قمنا بقياس نسبة النسبي لحزب الحرية + ve سجرنا ترانسدوسيد الخلايا بالمقارنة مع نظرائهم في حزب الحرية-ve كل 2 – 3 أيام في الثقافة (الشكل 3). مع البروتوكول، المذكورة أعلاه، أدت توصيل الخلايا MOLM13 أو MLL AF9 مكافحة غسل الأموال في كفاءة توصيل 60-70% مع استعداداتنا الفيروسية، ترك الخلايا 30-40% المتبقية أونترانسدوسيد أو ve حزب الحرية في كل بئر. وهذا يسمح لدراسة الانتشار النسبي للجينوم تحرير الخلايا مع الخلايا البرية من نوع في نفس جيدا. يتناسب مع الزيادة أو النقصان بالنسبة المئوية للخلايا سجرنا ترانسدوسيد استخدمت كتدبير لتعكس أثر سجرنا الوظيفية بوساطة الحذف الجينات في الخلايا MOLM13-Cas9. إذا كان الجين الخاص بك لمصلحة هاما لانتشار الخلايا اختبار مكافحة غسل الأموال، ثم تعطل سجرنا بوساطة هذا الجين سيؤدي إلى تناقص نسبي للإعراب عن سجرنا حزب الحرية + ve الخلايا بالمقارنة مع خلايا حزب الحرية-ve أثناء الفحص، بينما سجرناس استهداف لوسيفراس، بروتينات فلورية خضراء أو الجينات غير ضرورية سوف يحتفظ حزب الحرية + ve نسبة ve مع مرور الوقت.

باستخدام 2 مكافحة منفصلة--RPA3 سجرناس، لاحظنا انخفاضا تدريجيا وكبير في النسبة المئوية لحزب الحرية + ve الخلايا بالمقارنة مع حزب الحرية-ve أونترانسدوسيد النظراء. وفي المقابل، النسبة المئوية لمكافحة AAVS1 سجرنا معربا عن خلايا حزب الحرية ثابتاً نسبيا مع مرور الوقت، مما يدل على أن استهداف AAVS1 ليس له تأثير على انتشار الخلايا MOLM13 (الشكل 4 أ). وبالمثل، في الماوس الخلايا MLL-AF9-Cas9، ونحن اختبار آثار استهداف الجين تصبغ العين كالمراقبة السلبية و Dot1l، منظم جينية معروفة لتكون مطلوبة من أجل انتشار خلايا سرطان الدم MLL AF9 على مر الزمن من رهودوبسن (Rho1)، سجرناس . في هذه الدراسة، وحزب الحرية + ve أظهرت الماوس الخلايا MLL-AF9-Cas9 ترانسدوسيد مع سجرناس DOT1L مكافحة منفصلة 2 خسارة درامية وتدريجيا على مر الزمن مقارنة مع حزب الحرية-ve سجرنا غير ترانسدوسيد الخلايا (الشكل 4 باء). وفي المقابل، ظلت نسبة سجرنا مكافحة--Rho1 دون تغيير نسبيا مع مرور الزمن. تبين هذه النتائج ضعف MLL AF9 معربا عن خلايا اللوكيميا الماوس إلى نضوب Dot1l، تؤكد النتائج المنشورة سابقا.

Figure 1
رقم 1: وصمة عار الغربية الممثل النتائج تبين مختلف المستويات Cas9. تم سبر استنساخ خلية واحدة من خط خلية مكافحة غسل الأموال MOLM13 ترانسدوسيد مع CAS9 للعلم-Cas9 مستويات التعبير باستخدام الأجسام المضادة العلم. واختيرت استنساخ عرض اسمي تعبير عن Cas9 لإجراء المزيد من الدراسات. Transfected الخلايا HEK293 T مع Cas9 التعبير بلازميد استخدمت كعنصر إيجابي والخلايا MOLM13 غير ترانسدوسيد Cas9 كعناصر سلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل الممثل للجينوم التحرير في Dot1l موضع تقييم من قبل تحليل الجليد. وكان أمبليكون بكر تتمحور حول موقع الهدف سجرنا Dot1l سانغر التسلسل وتحليلها باستخدام تحليل الجليد. مقارنة بين التسلسل sgDot1l (خط برتقالي) إلى تسلسل الحمض النووي غير المستهدفة (الخط الأخضر) يوضح المستوى المرتفع لتحرير الكفاءة في الخلايا sgDot1l المستهدفة حول الموقع المستهدف سجرنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: سير العمل التخطيطي من الأساليب المقترحة. يتم استنساخ سجرناس في ناقلات التعبير سجرنا المشترك معربا عن بروتين فلورسنت مثل حزب الحرية. الخلايا الهدف ترانسدوسيد في معدلات توصيل 30 – 60 في المائة وتليها التدفق الخلوي كل 2 – 3 أيام. سوف تظهر سجرناس استهداف الجينات المطلوبة لمكافحة غسل الأموال انتشار الخلايا نضوب نسبي مع مرور الوقت كما هو موضح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: يؤدي الممثل من فحوصات المنافسة في الإنسان وخلايا مكافحة غسل الأموال الفأرة. () نتائج إظهار تقدمية هامة إحصائيا جداً انخفاض في RPA3 ترانسدوسيد MOLM13-Cas9 استنساخ B3 الخلايا. وفي المقابل، سجرناس استهداف الموقع AAVS1 ليس لها أي أثر. سجرناس (ب) استهداف Dot1l تظهر انخفاضا ملحوظا وتدريجيا في الانتشار التنافسية، على النقيض من سجرناس استهداف رودوبسين (Rho). p > 0.05. ف < 0.05. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD) ويعني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: المخطط العام للبروتوكول. () الوقت لكل خطوة في إنتاج فيروس Cas9 والاستنساخ سجرنا الموصوفة. يمكن تنفيذ التصميم واستنساخ سجرناس أثناء إنشاء استنساخ واحد من خطوط خلية مكافحة غسل الأموال مع التعبير Cas9 مستقرة. ويرد (ب) بروتوكول عام لتوصيل خطوط خلية مكافحة غسل الأموال مع سجرناس والمقايسة النمو التنافسي باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

دورات مدة الدورة درجة الحرارة
1 2 دقيقة 95 درجة مئوية
35 30 s 95 درجة مئوية
30 s 55 درجة مئوية
30 s 72 درجة مئوية
1 5 دقيقة 72 درجة مئوية
عقد بلا حدود 4 درجة مئوية

الجدول 1: برنامج PCR لتضخيم موضع AAVS1 من "الحمض النووي"- برنامج PCR يستخدم لتضخيم موضع AAVS1 من الحمض النووي لاختبار كفاءة قطع من Cas9 في Cas9 التعبير عن استنساخ.

"الملف التكميلي": تسلسل اليغو سجرنا- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المخطوطة، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة للقيام فحص كريسبر-Cas9-تعتمد نمو تنافسي التحقيق في دور الجينات المرشحة في خطوط خلية مكافحة غسل الأموال باستخدام التدفق الخلوي في الخلايا البشرية/الفاري مكافحة غسل الأموال (الشكل 5). الهدف المتمثل التحليل تحديد تأثير حذف الجينات في الصيانة من انتشار خلية مكافحة غسل الأموال أكثر من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع على نطاق متوسط الإنتاجية. تحتاج بعض الخطوات الحاسمة التي يتعين اتباعها بعناية لتسهيل توسيع نطاق البروتوكول وصف. في إنتاج Cas9 lentivirus، من الضروري تصفية المتوسطة الفيروس مكيفة من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر لتجنب ترحيل الخلايا 293T للفيروس التي تحتوي على المادة طافية. أثناء سبينفيكتيون، التفاف لوحة سبينفيكتيون مع التفاف تتشبث أو بارافيلم يساعد على تجنب التلوث المحتملة أثناء الطرد المركزي. ومع ذلك، يجب إزالة الالتفاف قبل أن يضع لوحة سبينفيكتيد مرة أخرى في حاضنة استنبات الأنسجة. من المهم جداً تقييم استنساخ معربا عن Cas9 للتحرير من الكفاءة. الحيوانات المستنسخة بكفاءة منخفضة-الجينوم التحرير يعكس عدم كفاية Cas9 النشاط وقد تؤثر على معدل النجاح التجربة. في تجاربنا، نحن أولاً ترانسدوسيد استنساخ الإنسان مكافحة غسل الأموال Cas9 مع سجرناس استهداف موضع AAVS1 ومتسلسلة السلطات الوطنية المعينة الجينوم لتحرير الكفاءة. مقارنة بين AAVS1 تحريرها وتسلسلات wildtype يمكن تقييم استخدام أدوات الإنترنت المستندة إلى ويب مثل المد والجزر8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) أو الجليد (https://ice.synthego.com/#/). قارن هذه البرامج سانغر التسلسل آثار يحتمل أن المحرر بكر تجزئتها إلى تسلسل wildtype أو مرجع غير المحررة وتقدير تواتر التغييرات. هذه طريقة سريعة لتقييم حيث التغييرات الناجمة عن سجرنا الاختبار، وهو مقياس للنشاط Cas9 الخلوية. بدلاً من ذلك، استنساخ بكر المنتج إلى بلازميد [بكر] استنساخ مثل يمكن أن يؤديها توبو كليلة استنساخ متجهة، تليها سانغر التسلسل من مستعمرات فردية لتقييم كفاءة تحرير الجينوم بمحاذاة التسلسل لكل استنساخ البرية من نوع. ونحن نفضل الأسلوب السابق، نظراً للسهولة والفعالية من حيث التكلفة مقارنة بالأسلوب الاستنساخ. عادة ما يغير اكتشاف زوج قاعدي مثل الطفرات، إينديلس، إلخ.، في أو حول الموقع قطع سجرنا في غالبية العظمى من استنساخ المتتابعة تشير إلى وجود Cas9 نشطة للغاية. وهكذا، اخترنا اللوكيميا MOLM13 أو MLL AF9 استنساخ B3 و 8، على التوالي، مع كفاءة التحرير أعلى لإجراء مزيد من التجارب.

لقد قمنا بتصميم سجرناس استهداف جينات مختلفة المذكورة في البروتوكول باستخدام http://crispr.mit.edu/، برامج المستندة إلى ويب التي تعطي قائمة سجرناس. من المستحسن لتحديد سجل أعلى سجرناس من القائمة من أجل القضاء على تلك مع توقع الآثار خارج الهدف. يمكن استنساخ سجرناس مصممة باستخدام أي بروتوكول من البروتوكولات المنشورة مثل واحد على موقع على شبكة الإنترنت (http://www.addgene.org/67974/). أولاً فوسفوريلاتيد أوليجوس الشعور وأنتيسينسي وتعتيق حسب الخطوة 2.1.5. المهم أن الخطوة الأولى في 37 درجة مئوية فوسفوريلاتينج أوليجوس مع كيناز T4 واللاحقة PCR دورات هامة للصلب الإحساس والنوكليوتيد معنى المضادة إلى دسدنا. من المهم أن يكون بروتين فلوري في ناقلات سجرنا الاستنساخ هو أمر حاسم لتتبع الخلايا سجرنا ترانسدوسيد في وقت لاحق في فحوصات المنافسة. سجرنا الاستنساخ هو الارتقاء باستخدام لوحة 96 جيدا في جميع الخطوات بما في ذلك الصلب وربط. لربط, يمكن أيضا استخدام شرائط microtube بكر نظيفة نظراً لأنها متوافقة مع الممصات متعددة القنوات. في حالة أن هناك حاجة إلى التحول من مجموعة أكبر من الحيوانات المستنسخة سجرنا، لوحة 96-جيدا في أي 10 ميكروليتر من الخلايا المختصة قبل اليكووتيد في كل بئر والمجمدة في-80 درجة مئوية يمكن استخدامها للإسراع بالعملية برمتها. الغرض من تصفيح ردود فعل عملية ربط لاختيار المستعمرات الفردية، التي من الصعب القيام بتنسيق 96-جيدا. ومن ثم، للتحول البكتيري، هناك خسارة طفيفة في قابلية التوسع. لا تزال، حتى بالنسبة للطلاء من ردود فعل التحول من صفيحة 96-جيدا كامل، سوف يتطلب فقط ما مجموعة ستة عشر لوحات 6-جيدا للمشروع بأكمله. يتعين على المرء أن يكون حذراً في الخطوة التالية من الانتقاء المستعمرات من لوحات التحويل. بينما streaking مستعمرة على بقعة توسم، ضمان أن الموقع وضوح المعزولة من المواقع الأخرى. وسم شبكة مربعة في الجزء السفلي من صحن بيتري مع علامة الظلام دائم يساعد على منع التلوث عبر استنساخ البكتيرية.

مرة مينيبريبس من بنيات سجرنا على استعداد، يمكن جعل الفيروس في شكل 96-جيدا. في هذا المستوى من الإنتاجية، من غير العملي لتصفية 200 ميليلتر من الفيروسات التي تحتوي على المادة طافية. ومن ثم، ينبغي تجميد المادة طافية الفيروسية بين عشية وضحاها على الأقل لتجنب التلوث المنتقل من أية خلايا 293T إلى المادة طافية. فإنه يمكن أيضا تخزينها في 50 ميليلتر مختبرين في أنبوب PCR العقيمة تجميد شرائط لتجنب ذوبان الجليد من المادة طافية. علاوة على ذلك، تستخدم هذه الفيروسات مكيفة سوبيرناتانتس ترانسدوسينج خلايا مكافحة غسل الأموال. في حالة أن انخفاض التتر من مراعاة توصيل الفيروسية، حسب تقييم التردد المنخفض من حزب الحرية + ve الخلايا، ثم قد يكون من المهم لتحديد عيار الفيروسية واختبار ترانسدوكشنز في تعدد مختلف الإصابات (وزارة الداخلية) لضمان 40-60 في المائة معدلات توصيل. تحديد عيار الفيروسية ووزارة الداخلية هو وصف الحساب بالتفصيل هنا17. في تحليل المنافسة، كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول، ومن المهم جداً استبعاد الخلايا غير قابل للحياة لمنع القطع زائفة من السيارات-الأسفار أثناء تحليل في حزب الحرية إلى نسبة غير حزب الحرية. نظام مراقبة الأصول الميدانية، في الوقت قبل تحليل عينات الاختبار، ينصح بشدة استخدام حزب الحرية السلبية والإيجابية عناصر حزب الحرية بدقة لتحديد الفولتية. عند كل نقطة وقت إعادة الطلاء، حجم الخلايا لتكون إعادة مطلي يعتمد على تركيز الخلايا عند نقطة الوقت معين. نحن عادة إعادة مطلي 20 ميكروليتر من إجمالي 200 ميكروليتر في كل وقت نقطة في بئر جديدة مع ميكروليتر 180 متوسطة جديدة. خلط دقيق للخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً قبل إعادة طلاء ينصح بشدة. بشكل عام، وقد لاحظنا أن الإنزيم يحتاج إلى تنفذ أكثر من 15 – 20 يوما لإشعار قوية التغييرات في حزب الحرية + ve النسب هاء، وعلى الرغم من أن هذا يختلف من الجينات بالجينات.

هذا التشكيل التجريبية مناسبة تماما لاختبار الجينات عديدة في نفس الوقت في عدة أسطر خلية مكافحة غسل الأموال على وجه السرعة تحديد دور الجينات المرشحة في بقاء أو انتشار خلايا مكافحة غسل الأموال. أحد المحاذير للمقايسة انتشار التنافسية الموصوفة هنا هو أنها لا تعتبر عوامل الخلية الخارجية المحتملة مثل paracrine مما يشير إلى الأحداث من الخلايا المستهدفة للجينات التي قد تؤثر على السكان غير المستهدفة خلية داخل نفس جيدا. على الرغم من أن هذا قد يكون نادر حدوث، هذا العامل ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند إجراء هذا الفحص. على الرغم من أننا استخدمنا مكافحة غسل الأموال كمثال لفحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة الموصوفة في هذه المخطوطة، يمكن استخدام هذا الأسلوب لأي خط خلية سرطان لتحديد دور الجينات متعددة في نفس الوقت. وهناك مزايا مختلفة من الجينات-حذف استخدام كريسبر-Cas9 عبر الجينات-ضربة قاضية استخدام تدخل الجيش الملكي النيبالي. أولاً، خلافا شرناس، التي عادة ما تظهر مجموعة واسعة نطاق من تثبيط الهدف مرناً، تفعيل سجرناس إلى جانب نوكلاس Cas9 كاملة بالضربة القاضية للجينات المستهدفة. قد ينتج تعمل درامية وأكثر اتساقا مع أساليب كريسبر-Cas9-تعتمد، على الرغم من أنه يجب التحذير أن كفاءة الاستهداف سجرناس الفردية، فضلا عن شرناس قد تختلف على نطاق واسع.

تحليل المنافسة القائمة على التدفق الخلوي يوفر العديد من المزايا عبر فحوصات الانتشار التقليدية التي يتم مطلي بعدد محدد من الخلايا لقياس النشاط التكاثري النسبي للخلايا الجينات قلق. ميزة واحدة أن النشاط التكاثري النسبي من الخلايا يمكن بسهولة وسرعة يقاس بالتدفق الخلوي لعدة أيام، تجاوز الحاجة لخلية العد في كل خطوة والطلاء. وهذا مفيد عند اختبار عدد كبير من سجرناس مرشح استهداف جينات عدة، كعد جميع الآبار مرهقة ويمكن أن يؤدي إلى أخطاء. خلافا، فحوصات القياس القائم على ATP لنمو الخلايا، يمكن إجراء قياس التدفق على عينة خلايا الحية، مما يجعل هذا الأسلوب مفيداً لتحليل على المدى الطويل. وهذا مفيد بوجه خاص في دراسة العوامل مثل المغيرون جينية، التي قد تظهر الآثار المتأخرة بالنيابة عن انتشار خلايا مكافحة غسل الأموال، وقد تتطلب فحوصات طويلة الأجل. ثانيا، وجود خلايا غير ترانسدوسيد داخل نفس جيد يسمح لسكان خلية جيدا الخاضعة لمراقبة التي يمكن استخدامها لتعيين خط الأساس بالنسبة المقايسة. ثالثا، عندما يمكن تماما تقريبا إجراء الإعداد في شكل 96، حسنا، التحليل باستخدام الممصات متعددة القنوات، إلى حد كبير تسريع العملية برمتها من استنساخ سجرناس لإعداد الفيروس، وفي نهاية المطاف تقييم تدفق--سيتوميتريك الأسفار.

يمكن أن يكون الأسلوب الموصوفة هنا كفاءة رفع مستوى لتحقيق سجرناس تصل إلى 96 بالتوازي في على شاشة أراييد. افتراض سجرناس 4 – 6 كل الجينات، يمكن لذلك استخدام هذا الأسلوب للاستجواب السريع للجينات على الأقل 16 – 24 بالتوازي. في حالة عدد أكبر من الجينات، مثل طريقا جزيئية كامل يحتاج لاستجوابهم في خلايا مكافحة غسل الأموال، شاشات كريسبر-Cas9-تعتمد المجمعة سوف يكون أكثر فائدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

A.J.D خبير استشاري للمستحضرات الصيدلانية A2A (نيو جيرسي) والمداواة سالجوميد (سان دييغو). مؤلفين آخرين قد أية تعارضات تعلن.

Acknowledgments

بلازميد pCW-Cas9 وكان هدية من إريك لاندر & ديفيد ساباتيني (بلازميد أدجيني # 50661) و (بسي)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 ث بلازميد من مختبر يوسا (بلازميد أدجيني #67974. نود أن أشكر الأساسية "التدفق الخلوي" في معهد الاستراتيجية والخطة الاستشرافية الاكتشاف الطبي للمساعدة في الوقت المناسب مع تحليل تدفق والفرز. ونود أن نعترف بالدعم من "مؤسسة النصب التذكاري تاتا سيدة" إلى ميلادي ونود أن نعترف أيضا بدعم مصادر التمويل التالية: المعاهد الوطنية للصحة/NCI P30 CA030199 السرطان مركز رعاية منحة، والخامس-المؤسسة ومراكز السرطان NCI سان دييغو (C3) #PTC2017to A.J.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FLAG-M2 Antibody sigma-aldrich F3165, lot # SLBS3530V
Anti-mouse Antibody Invitrogen 31446, lot # TA2514341
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Fisher 34095
ChemiDoc Imaging System BIO RAD 17001401
Sorvall Legend RT centrifuge Thermo Scientific
Blasticidin Thermo Fisher R21001
SYTOX Red Thermo Fisher S34859
Opti-MEM Thermo Fisher 31985062
DMEM Thermo Fisher 11965-092
RPMI Thermo Fisher 11875-093
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030081
Fetal Bovine Serum (FBS) SAFC 12303C
single gRNA vector Addgene #67974 pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W
CelLytic Nuclear extraction kit sigma-alorich NXTRACT
XtremeGENE 9 sigma-alorich 6365787001
Retronectin Takara T100B
Flow cytometer BD Biosciences
T4 PNK NEBioLabs M0201S
T4 DNA ligation buffer NEBioLabs B0202S
T4 DNA Ligase enzyme NEBioLabs M0202S
Ampicillin Fisher scientific BP1760-25
LB agar Fisher scientific BP9724-500
LB Broth Fisher scientific BP9731-500
Qiagen mini-prep kit Qiagen 27104
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher NanoDrop One
Recombinant Murine IL-3 Peprotech 213-13
Recombinant Murine IL-6 Peprotech 216-16
Recombinant Murine M-CSF Peprotech 315-02
Stable competent cells NEBiolabs C3040I
10 cm Tissue Culture dishes Fisher Scientific 353003
Cell lysis solution Qiagen 158906
Protein precipitation solution Qiagen 158910
DNA hydration solution Qiagen 158914
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
BbSI New England BioLabs R0539S
APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit Genessee Scientific 42-138
Puromycin Fisher scientific BP2956100
50 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495949A
15 mL polypropylene conical tubes Fisher scientific 1495970C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  3. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  4. Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
  5. Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
  6. Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
  7. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  8. Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
  9. Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
  10. Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
  11. Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
  12. Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
  13. Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
  14. Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
  15. Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
  16. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  17. Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, pdb prot4755 (2007).

Tags

أبحاث السرطان، 143 قضية، مكافحة غسل الأموال، كريسبر-Cas9، والمقايسة الفائق، والنمو التنافسي المقايسة، DOT1L، سرطان الدم، وسرطان
تحقيق تبعيات الجينية باستخدام فحوصات كريسبر-Cas9-تعتمد المنافسة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao,… More

Deshpande, A., Chen, B. R., Zhao, L., Saddoris, K., Kerr, M., Zhu, N., Mali, P., Deshpande, A. J. Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays. J. Vis. Exp. (143), e58710, doi:10.3791/58710 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter