Summary
Ce manuscrit décrit une méthode de base CRISPR-Cas9 de groupés régulièrement entrecoupées court palindromique répète (CRISPR) pour une enquête rapide et simple du rôle de plusieurs gènes candidats à la prolifération des cellules de la leucémie myéloïde aiguë (AML) Parallèlement. Cette technique est évolutive et peut être appliquée dans les autres lignées cellulaires cancéreuses ainsi.
Abstract
Études de perturbation de gènes ont été utilisés intensivement pour enquêter sur le rôle des gènes individuels dans la pathogenèse de l’AML. Pour la réalisation complète du gène perturbation, beaucoup de ces études ont fait l’utilisation de modèles knock-out gène complexe. Bien que ces études sur des souris knockout offrent un système élégant et ayant fait leurs preuves pour enquêter sur les relations génotype-phénotype à, une méthode rapide et évolutive pour l’évaluation des gènes candidats qui jouent un rôle dans la prolifération cellulaire AML ou la survie dans les modèles AML aidera à accélérer l’interrogatoire parallèle de plusieurs gènes candidats. Les progrès récents dans les technologies de modification du génome ont amélioré considérablement notre capacité à effectuer des perturbations génétiques à une échelle sans précédent. Un tel système de modification du génome est la méthode CRISPR dotés de Cas9 qui permet d’effectuer des modifications rapides et efficaces dans le génome de cellules cibles. La simplicité et l’évolutivité des CRISPR/Cas9-mediated gene-suppression rend une des techniques plus attrayants pour l’interrogatoire d’un grand nombre de gènes dans des tests phénotypiques. Nous présentons ici un essai simple avec CRISPR/Cas9 médiée par gène-perturbation combinée à haut-débit débit-cytometry-concurrence fondée sur les dosages d’enquêter sur le rôle des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans la prolifération ou la survie de l’homme et lignées de cellules murines AML.
Introduction
Les dernières décennies ont vu les nombreux efforts de recherche axés sur l’identification de la contribution des principales voies moléculaires dans la pathogenèse de la leucémie myéloïde aiguë (AML). Traditionnellement, disruption de génique dans les cellules de Lam a été réalisée à l’aide de la souris knock-out conditionnel ou court-hairpin RNA (Sharn). Tandis que chez des souris knockout offrent un système sophistiqué de contrôle spatio-temporelle de la délétion de gène, générant des souris knockout gène est fastidieux, long et coûteux. En outre, gène-coups de grâce à l’aide de stratégies de recombinaison n’est pas facilement évolutive ; ces stratégies ne se prêtent pas bien à l’interrogatoire de plusieurs gènes en parallèle. Après la découverte de méthodes d’interférence ARN à l’ARNm endogène de précipitation à l’aide de petits ARN interférents (siARN) ou Sharn, nombreux groupes a commencé à utiliser des techniques de RNA interference pour enquêter sur le rôle des gènes spécifiques dans AML. Puisque les cellules AML murins et humains sont notoirement difficiles à transfecter à l’aide de méthodes de transfection de lipides à base traditionnelle, la plupart des études Sharn lentivirally salarié ou codé en retrovirally pour étudier la fonction des gènes dans les cellules de l’AML. La découverte récente de cluster régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR) et les nucléases de Cas connexes (CRISPR-Cas9) a révolutionné les technologies de ciblage de gène1,2,3. En utilisant CRISPR-Cas9, certains gènes ou régions génomiques peuvent être supprimées, sous la direction ou le tag avec efficacité et facilité. CRISPR Cas9-gène-modification basée est en train d’émerger comme la méthode de choix pour l’étude des relations génotype-phénotype à dans les types de cellules différentes en raison de la simplicité, l’efficacité et large applicabilité de cette technique. Méthodes CRISPR dotés de Cas9 deviennent aussi la méthode de choix des AML, non seulement pour interroger des gènes individuels, mais aussi comme une façon de cibler des gènes multiples dans les écrans génétiques rangés ou centralisées visant à enquêter sur plusieurs gènes en parallèle comme potentiel AML-dépendances4,5,6.
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un dosage simple croissance compétitive pour mesurer l’impact de la gène-perturbation sur la croissance des cellules de l’AML, selon stable CRISPR-Cas9-mediated gene édition suivie par cytométrie en flux haut débit. Cette méthode est simple, efficace et évolutive à débit moyen des expériences pour étudier le rôle de plusieurs gènes en parallèle dans les cellules de l’AML.
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Protocol
1. générer AML Cell Line Clones avec forte Expression de Cas9 Stable et Active
- Production de Cas9 lentivirus
- Jour 0 : Plaque 4 x 106 293 t cells dans 10 mL de DMEM avec 10 % sérum fœtal (SVF) et de la pénicilline et de L-glutamine dans un plat de culture de tissu de 10 cm dans un niveau 2 de biosafety (BSL2) certifié hotte de culture cellulaire. Placer le plat dans un incubateur à 37 ° C.
- Jour 1 : Les cellules 293 t plaqué devraient être 70 – 80 % anastomosé au jour 1. Effectuer la transfection utilisant le protocole suivant dans l’après-midi.
- Réchauffer le moyen de transfection, de milieux de culture et de réactif de transfection à température ambiante. Fondre tous les plasmides requis pour la transfection.
- Mix 9 mg de psPAX2, 0,9 µg de pMD2.G et 9 µg de plasmides pLenti-Cas9 avec 500 µL de milieu de transfection dans un tube de 5 mL.
- Ajouter 1,7 mL de milieu de transfection dans un 14 mL tube fond rond. Ajouter 57 µL de réactif de transfection directement dans le milieu de transfection dans le tube pour éviter de toucher les parois du tube.
- Doucement, ajouter le mélange de plasmide entier à la solution de réactif de transfection et mélanger en tapotant doucement le tube sur le côté. Incuber le mélange à température ambiante pendant 20 à 30 min. Dans le même temps, changer le milieu de la plaque de semis 293 t.
- Ajouter le mélange de transfection goutte à la plaque et en faisant doucement tourner la plaque sur le côté pour un mixage efficace. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C.
- Jour 2 : Aspirer le surnageant de la plaque de transfection doucement, telles que les cellules ne sont pas perturbés ou délogés de la plaque. Jeter le surnageant. Ajouter 10 mL de milieu DMEM de frais 10 % en glissant doucement sur les côtés de la plaque pour éviter les délogeant les cellules.
- Jour 3 : Récupérer le virus contenant surnageant de la plaque de transfection lentement en dessinant une seringue stérile de 10 cm. Après que le surnageant est recueilli dans la seringue, fixer un filtre de 0,45 : stérile à la seringue et tenez la seringue et le filtre dans un tube conique polypropylène fraîche et stérile de 15 mL. Doucement, plonger la seringue pour filtrer le virus contenant le liquide surnageant à travers le filtre de 0,45 µM dans le tube conique polypropylène 15 mL.
- Magasin du milieu conditionné viral en aliquotes de 2 mL chacun dans 2 mL cryovials à-80 ° C.
- Transduction de lignées cellulaires AML
- J -1 : Diluer 1 mg/mL bouillon de fragment de fibronectine humaine recombinante à 10 µg/mL avec stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Manteau une culture de tissu-non traités 6 plaque bien avec 2 mL de la solution de travail de fragment de fibronectine humaine recombinante 10 µg/mL dans une hotte de culture cellulaire BSL2 approuvé. Enrouler la plaque dans le film alimentaire pour éviter la perte sur l’évaporation et conserver à température ambiante pendant la nuit.
- Jour 0 : Décongeler le surnageant viral contenant Cas9. Aspirer la solution de fragment de fibronectine humaine recombinante complètement à partir de la plaque enduite juste avant spinfection. Ajouter 2 mL de milieu conditionné viral avec Cas9 à la plaque et faire tourner à 1 300 x g pendant 90 min à 35 ° C. Cela aide les particules virales attacher à la spinfected bien.
- Pendant ce temps, compter les cellules d’être transduites et spin down 2 x 106 cellules dans un tube conique polypropylène 15 mL. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de milieux de culture fraîche.
- Après spinfection, retirer tous le surnageant viral de la spinfected bien et jeter. Des particules rétrovirales du surnageant sont attachés à la partie inférieure de le spinfected bien. Eh bien, ajouter à cela les 2 x 106 cellules resuspendues dans 2 mL de milieu à partir de l’étape précédente.
- Faites tourner la plaque à nouveau à 1 300 x g très brièvement (1 à 2 min) suffisant pour que les cellules se sédentariser en bas. Replacez la plaque dans l’incubateur et laisser une nuit pour la transduction avec les particules virales spinfected attachés au puits.
- Jour 1 : Selon la densité des cellules, ajouter plus de moyen aux cellules transduits pour éviter la prolifération.
- Jour 2 : Puisque le plasmide pLenti-Cas9 dispose d’un marqueur de résistance Blasticidine, ajoutez Blasticidine à une dose de 10 µg/mL à transduite et untransduced (contrôle) MOLM13 ou cellules de leucémie de souris MLL-AF9 pour la sélection de Cas9 exprimant des cellules.
Remarque : Blasticidine sélection des Cas9-transduites MOLM13 ou MLL-AF9 cellules leucémiques est considérée complète lorsque toutes les cellules de contrôle untransduced ont été éliminés. Pour les lignées de cellules autres que la leucémie MOLM13 et MLL-AF9, une courbe dose-réponse doit être effectuée avant cette expérience afin qu’une dose optimale peut être employée. Titrage du surnageant viral peut également être effectuée en cas de taux faible-transduction.
- Dupliquer la sélection des cellules exprimant haut-Cas9.
Remarque : Nous avons remarqué que dans certaines lignées cellulaires AML, sélection du clone sera ne peut-être pas nécessaire : le gros Cas9-Blasticidine sélectionné population déjà a le rendement élevé de modification du génome. Dans ce cas, il est possible de sauter l’étape 1.3 et de passer à l’étape 1.4 afin d’évaluer l’expression de Cas9 dans les cellules AML en vrac Cas9-blasticidine western Blot. Encore, il serait important d’évaluer l’efficacité d’édition de gène dans les cellules en vrac Cas9-AML (1.5 étape) avant de procéder à des analyses de compétition. On présume que la sélection de clones de haut-Cas9 unique réduit la variabilité du génome-édition, qui est particulièrement importante lorsque vous testez un certain nombre de différent guide unique RNAs (sgRNAs).- Effectuer une cellule unique sorte de la Cas9-Blasticidine sélectionné MOLM13 et MLL-AF9 cellules leucémiques dorénavant appelés MOLM13-Cas9 et cellules de MLL-AF9-Cas9, respectivement, à l’aide d’un trieur de FACS contenu dans une hotte BSL2 approuvé. Tri peut être effectué en 5 à 10 fond rond sans culture tissulaire traitée 96 puits plaques.
- Autrefois simple MOLM13-Cas9 et clones de MLL-AF9-Cas9 ont été choisies et nommé individuellement, développez des clones de 10 – 20 10 µg/ml de Blasticidine dans les milieux de culture pour assurer le maintien de l’expression de Cas9.
- Expression contrôle de protéine de Cas9 stable par immunoblotting.
- Faire des extraits nucléaires de tous les clones de Blasticidine choisi de MOLM13 et MLL-AF9 leucémie en utilisant le Kit d’Extraction nucléaire conformément au protocole du fabricant. Vérifiez Cas9 expression de la protéine à l’aide d’Anti-Flag M2 anticorps depuis le Cas9 dans le plasmide pLenti-Cas9 est lié à un épitope pavillon N-terminale.
- Charge 50 µg de protéines totales de chaque extrait nucléaire sur 10 % Bis-Tris gel et exécutez le gel à 120 V jusqu'à ce que les bandes supérieures sont bien séparées.
- Bloquer la membrane avec une solution de lait 5 % dans un tampon TBST pendant 1 h.
- Incuber la membrane avec une dilution de 1 : 1 000 d’anticorps M2 Anti-Flag à une concentration finale de 1 µg/mL à 4 ° C durant la nuit.
- Le lendemain, lavez la membrane avec un tampon TBST et incuber avec HRP anti-souris secondaires anticorps conjugué à une dilution de 1:5,000 (concentration finale de 0,16 µg/mL) à la température ambiante pendant 1 h.
- Lavez la membrane soigneusement avec un mélange TBST et développer la tache en utilisant des substrats ECL.
- Sélectionner les 3 – 4 clones avec la plus haute expression de la protéine de Cas9 vu par Western Blot pour plus loin l’analyse fonctionnelle (Figure 1).
- Assurer une activité élevée de Cas9 dans clones sélectionnés
- Préparer le surnageant des gènes d’un vecteur d’encodage sgRNA avec sgRNAs ciblant l’humain ou souris AAVS1 locus de safe harbor, tel que décrit à l’étape 1.1.
- Transduce haut Cas9 exprimant MOLM13 ou leucémie de MLL-AF9 clones avec l’anti-AAVS1 sgRNA des gènes surnageant à l’aide de la méthode spinfection décrite ci-dessus. Sélectionnez avec 2,5 µg/mL Puromycine pendant 4 jours.
- Purifier l’ADN génomique de ces clones de leucémie MOLM13-Cas9 ou MLL-AF9-Cas9 après sélection de la Puromycine ainsi que de leurs témoins respectifs sauvage en utilisant le kit d’extraction d’ADN génomique selon les instructions du fabricant. Utilisation 50 ng d’ADN en tant que modèle pour effectuer un ACP avec le AAVS1_test_primers à l’aide de 2 x master mix de la Taq polymérase et le programme PCR énumérés au tableau 1.
- Exécuter le produit PCR sur un gel d’agarose à 2 % et gel-purifier la bande 268 paires de bases en utilisant un gel extraction kit conformément au protocole du fabricant. Séquence de Sanger le gel purifié produit de PCR à l’aide de l’apprêt AAVS1_target-frag_F.
- Évaluer l’efficacité édition par la comparaison de la AAVS1 sous la direction et les séquences de type sauvage à l’aide d’outils en ligne sur le web (Figure 2).
2. le clonage et la Transduction des sgRNAs dans les cellules de l’AML-Cas9
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Débit moyen de clonage de sgRNAs
- Conception sgRNAs de 4 à 6 pour le gène d’intérêt en utilisant un logiciel de conception CRISPR basée sur le web. Il existe un certain nombre d’outils de conception CRISPR disponible en ligne tels que http://crispr.mit.edu/ qui génèrent des séquences sgRNA basée sur une séquence d’ADN d’entrée.
- Remplir une information appropriée dans les champs avec des astérisques. Cliquez sur le génome de la cible pour la conception de sgRNA. Coller la séquence cible dans la boîte de la séquence et cliquez sur le bouton " soumettre ".
- Pour le clonage dans la pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - le plasmide W sgRNA expression, faire précéder les nucléotides « CACC » le sens oligo et « AAAC « à l’inverse oligo antisens complétée avant de commander. Oligos de sens et anti-sens ordre prémélangée dans une plaque à 96 puits étiquetés Oligo-Mix auprès d’une compagnie de synthèse d’oligonucléotide.
Remarque : Nous avons fait usage de la pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide W, qui possède le site de restriction BbsI pour le clonage de sgRNA. Dans le cas où autres plasmides d’expression sgRNA sont utilisés, les surplombs utilisés pour les oligonucléotides sgRNA doivent être modifiées en conséquence. - Prendre une plaque à 96 puits bas U distincte étiquetée Plaque de recuit. Faire un mélange maître de 1 µL T4 PNK, 1 µL d’ADN T4 ligature mémoire tampon 10 x et 6 µL d’eau par la réaction de recuit.
- Ajouter 8 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque de recuit. Ajouter 1 µL de 100 µM de chacun, sens et antisens oligo (ou 2 µL de mixte anti-sens-sens oligos) au master mix. Pipette de 2 – 3 fois doucement pour bien mélanger, tourner la plaque brièvement pour obtenir le mélange au fond du puits.
- Utilisez le programme de recuit suivant sur une machine PCR : 30 min à 37 ° C, 2 min 30 s à 95 ° C suivie d’un refroidissement lent à 22 ° C à raison de 0,1 ° C/s. Après le recuit, prendre une plaque à 96 puits frais étiquetée OligoMix dilué. Dans cette assiette, diluer les oligos phosphorylée et recuits de la réaction ci-dessus avec de l’eau (1 : 200) à l’aide d’une pipette multicanaux.
- Digest 5 µg de pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - vecteur W avec 1,5 µL d’enzyme de restriction BbsI (10 000 unités/mL) en utilisant un tampon approprié à 37 ° C pendant 2 h à linéariser il pour la ligature plus tard.
- Prenez une plaque bien frais 96 étiquetés Ligature plaque et ajouter 20 ng de la BbsI digérés (BbsI) - PGKpuro2ABFP - pKLV2-U6gRNA5 vecteur W d’un puits par la ligature sgRNA désirée. Pour cela, ajouter 2 µL d’oligos phosphorylée, recuit de la plaque OligoMix dilué .
- Ajouter 1 µL de tampon de ligase 10 x T4 et 1 µL de l’enzyme T4 DNA Ligase. Doucement, déposer avec une pipette multicanaux et incuber le mélange de ligature à température ambiante pendant 2 h.
Remarque : Ligature des mélanges peuvent être stockés à-20 ° C pendant l’étape de transformation plus tard. - Pendant ce temps, les cellules de dégel 90 µL d' chimiquement compétent e. coli sur glace 10 min avant la fin de l’étape de la ligature.
- À l’aide d’une pipette multicanaux, faire 10 µL d’extraits des cellules compétentes dans chaque puits d’une plaque bien 96 séparée.
- Ajouter le mélange de la ligature de l’étape 2.1.8 dans la cupule contenant les cellules compétentes, pipette de haut en bas doucement et incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Pipette 5 µL du mélange bactéries-ADN directement par la réaction ci-dessus dans un 6 bien sur plaque contenant LB-agar avec 100 µg/mL d’ampicilline. Répétez pour chaque les réactions de transformation.
- Plaque de chaque réaction de transformation dans une étiquette séparément bien d’une plaque de 6 puits. Ajouter environ 5 à 8 de perles de verre à chaque bien et secouer la plaque entière 6 puits de 8 à 10 fois dans un mouvement circulaire.
- Prélever des colonies unique 1 – 2 de chaque puits avec une pointe de pipette stérile 20 µL et il faire des rayures dans un spot soigneusement étiqueté sur une stérile de 10 cm boîte de pétri avec LB agar et 100 mg/mL ampicilline. Après étalement dans la plaque de la LB, simplement éjecter l’embout utilisé pour clone stries dans 3 mL de LB-ampicilline milieu contenant dans un 14 mL tube fond rond portant le numéro de clone bactérien correspondante.
- Envoyer la plaque bactérienne directement pour Sanger sequencing avec l’amorce vers l’avant du promoteur U6 humain.
- Après confirmation de la séquence de sgRNAs clonés, purifier l’ADN de tube de 14 mL correspondant à l’aide d’un kit de mini-préparent selon les instructions du fabricant.
- Mesurer la concentration et la qualité de chacun des mini-preps avec un spectrophotomètre. Normaliser chaque mini-préparent à une concentration de 15 ng/µL et pipette dans une assiette bien 96 étiquetés sgRNA plaque de Clones.
Remarque : Cette plaque peut être conservée à-20 ° C ou utilisée directement pour la préparation de virus.
- Conception sgRNAs de 4 à 6 pour le gène d’intérêt en utilisant un logiciel de conception CRISPR basée sur le web. Il existe un certain nombre d’outils de conception CRISPR disponible en ligne tels que http://crispr.mit.edu/ qui génèrent des séquences sgRNA basée sur une séquence d’ADN d’entrée.
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Production virale des constructions sgRNA et transduction
- Pour la production de particules lentivirales sgRNA au format 96 puits, suivez le « Sharn/sgRNA/ORF haut débit Production virale (96 puits) « protocole de la plate-forme de Perturbation génétique (portail web GPP) de l’Institut Broad (URL : https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/public/Resources/Protocols).
- Transférer 200 µL de liquide surnageant viral dans des tubes stériles et congeler à-80 ° C immédiatement.
- J -1 : Recouvrir une plaque bien 96 de culture traitée fond plat Non-tissu avec 100 µL de fragment de fibronectine humaine recombinante à une concentration de 10 µg/mL dans une hotte de culture cellulaire BSL2. Enrouler la plaque à l’aide de film alimentaire pour éviter les pertes par évaporation et laisser la nuit au banc.
- Jour 0 : Retirer le fragment de fibronectine humaine recombinante de chaque puits. Décongeler le surnageant viral de chaque sgRNA à température ambiante. Ajouter 50 µL de liquide surnageant viral dans chaque tube à chaque enduit puits de la plaque de transduction. Faites tourner la plaque de transduction à 1 300 x g pendant 90 min à 35 ° C.
- Vers la fin de spinfection, comte MOLM13-Cas9 (clone B3) cellules du flacon de culture. Utiliser 10 000 cellules par puits dans 100 volumes µL. Compter les cellules pour tous les puits de transduction, compte tenu de volume mort.
- Après la spinfection de 90 min, retirez le surnageant de tous les puits à l’aide d’une pipette multicanaux ajustée à 50 µL lentement par l’inclinaison de la plaque. Ajouter 100 µL de la culture de cellules de clone B3 MOLM13-Cas9 pour chaque bien lentement glisser vers le bas de la jante.
- Faites tourner la plaque à 1 300 x g pendant 2 min à 35 ° C et laisser les cellules déposent sur le fond. Placer la plaque dans l’étuve de grade de vitroplants de 37 ° C.
- Jour 1 : Ajouter 100 µL de milieu frais à chaque sgRNA bien contenant transduites Cas9-MOLM13 ou Cas9-MLL-AF9 leucémie des cellules telles que le dernier volume moyen est de 200 µL.
3. test de croissance compétitive
- Jour 3 : 72 h (jour 3) post transduction, vérifiez le pourcentage de sgRNA contenant les cellules positives BFP dans chaque puits par cytométrie en flux (FACS). Utilisez une teinture de viabilité cellulaire pour marquer et exclure les cellules mortes de l’analyse.
- Continuer la modification des plaques une proportion des cellules dans les nouveaux puits avec un milieu frais après chaque analyse de FACS pour éviter la prolifération pendant le test.
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Répéter l’analyse de FACS tous les 2 – 3 jours pour vérifier la proportion relative de BFP positif (BFP + ve) cellules par rapport aux contreparties BFP (BFP-ve) négatifs (Figure 3). Analyser le pourcentage de cellules positives BFP pour chaque point de temps (en utilisant le FlowJo ou le logiciel d’analyse similaire FACS).
- Faire glisser les fichiers Fcs pour chaque échantillon au logiciel FlowJo. Double-cliquez sur n’importe quel fichier d’un échantillon et tracer une tache point de dispersion vers l’avant (FSC) vs le diffusion latérale (SSC) avec FSC sur X axe et SSC sur l’axe Y. Porte de toutes les cellules.
- Cliquez deux fois sur les cellules fermées et tracer sur la tache de la viabilité (sur l’axe des Y) par rapport à la hauteur (H) de FSC ou zone (A) dot blot. Porte la viabilité tacher des cellules (vivantes) négatifs.
- Cliquez deux fois sur des cellules vivantes fermées et terrain BFP (sur l’axe des Y) vs FSC (A) sur axe des X. Barrière BFP + ve cellules. Appliquer toutes ces portes à tous les échantillons en faisant glisser l’échantillon sélectionné pour Tous les échantillons sous l’onglet groupe .
- Cliquez sur Éditeur de Table pour faire un tableau d’analyse de tous les échantillons. Faites glisser le comte BFP + ve dans un échantillon à la table et cliquez sur le bouton d’affichage dans l' Éditeur de Table pour créer un rapport de traitement par lots de tous les échantillons avec un tableau affichant le pourcentage de cellules BFP + ve . Enregistrez la table sous un xls.
- Calculer l’augmentation proportionnelle ou diminution % BFP positive de cellules au sein de la population de cellules vivantes au fil du temps et comparer ce ratio au ratio de cellules positives BFP dans le sgRNAs de contrôle (par exemple la luciférase, brouillés ou GFP sgRNA).
- Tracer le rapport de BFP cellules positives pour la sgRNAs différentes, y compris l’ou les gènes d’intérêt ainsi que les contrôles à l’aide de jour 3 sous la ligne de base.
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Representative Results
Dans notre étude, nous avons tout d’abord transduites la MOLM13 humaine AML lignée qui porte la translocation de MLL-AF9 avec haut-titre virus codant le plasmide lentiviraux Cas9-blasticidine. Dans nos mains, en vrac non triées de cellules MOLM13-Cas9 ne manifestaient pas de haut niveau d’expression Cas9 Western Blot et n’a pas exécuté aussi bien quand le dosage efficace gène édition-à l’aide de la méthode décrite précédemment7. Par conséquent, nous avons procédé à créer des clones de cellules du même et de ne sélectionner que les clones avec des niveaux élevés de Cas9 vu par Western Blot (Figure 1). Nous avons choisi 2 clones distincts et eux transduites avec sgRNAs ciblant un site dans le locus de refuge AAVS1 comme décrit plus tôt7. À l’aide de l’ADN génomique extrait la Puromycine sélectionnés Cas9-MOLM13-AAVS1 sgRNA clones, nous avons effectué un PCR avec des amorces couvrant la sgRNA de AAVS1 site de couper et sanger séquencé un produit spécifique du PCR bp 268 de 10 colonies isolées pour chaque clone de MOLM13. Après mise en conformité avec la séquence parentale, nous avons constaté que le clone MOLM13-Cas9 B3 et clone de MLL-AF9-Cas9 8 avaient un rendement de 100 % (données non présentées). Ensuite, nous avons sélectionné ces clones affichage haute capacité édition de génome induite par le Cas9 pour nos analyses de compétition sgRNA. Alors que ces études étaient en cours, outils web pour tester rapidement efficacité édition de génome de séquences de Sanger ont été développés par différents groupes tels que la marée8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) ou de la glace (https://ice.synthego.com/#/). Ces outils rendent extrêmement facile et rentable d’évaluer l’efficacité du génome-montage sans avoir à cloner des fragments individuels et de réaliser le séquençage de clones multiples. Donc, en vrac exprimant Cas9 piles doivent tout d’abord être éprouvées pour génome édition d’efficacité à l’aide de ces méthodes. Dans le cas où l’efficacité de la modification du génome est haut, puis le clonage de cellules individuelles n’est pas nécessaire. En outre, en cas que le clonage cellule unique est nécessaire comme on le voit dans nos études, ces outils d’estimation de fréquence de mutation sur le web offrent une méthode beaucoup plus rapide pour tester plusieurs clones en parallèle.
Pour le clonage de sgRNA, nous avons fait usage de la sgRNA clonage plasmide pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W, qui recèle une protéine fluorescente bleue (BFP) pour le suivi des cellules transduite de sgRNA et un promoteur U6 humain pilotée par l’ARN polymérase III qui anime l’expression de le clone sgRNAs ainsi que l’échafaudage de RNA (tracRNA) traceur. Nous avons utilisé ce système pour cloner 2 sgRNAs DOT1L, une protéine connue pour jouer un rôle important dans la régulation épigénétique de l’expression génique de ciblage. DOT1L est une histone-méthyltransférase dépose mono, di et tri-méthylation à cible gènes9,10. Des études ont montré que DOT1L joue un rôle important dans l’AML conduit par oncogènes de MLL-fusion. Par conséquent, DOT1L knockout utilisant CRISPR-Cas9 devrait conduire à altérer significativement la prolifération cellulaire MLL-AF9 leucémie de souris conformément à précédentes études11,12,13,14. Nous avons utilisé deux sgRNAs ciblant le locus AAVS1 safe harbor, qui est dans l’intron du gène PPP1R12C. sgRNAs produisant des altérations génomiques dans ce site ne sont pas susceptibles d’avoir des effets sur la capacité de prolifération des lignées cellulaires de MLL-leucémie. Comme témoin positif, nous avons cloné sgRNAs ciblant le gène associées à la réplication de l’ADN RPA3. RPA3 est un gène pan essentiel qui s’est avéré être important pour la prolifération de plusieurs AML cell lines4,15,16 . Anti-RPA3 sgRNAs donc afficher des effets anti-proliférante dans les cellules de Lam et sont généralement utilisées comme témoin positif. Après la transduction avec des plasmides sgRNA anti-AAVS1 et anti-RPA3, nous avons mesuré la proportion relative du BFP + ve sgRNA transduites cellules comparativement à leurs homologues de BFP-ve tous les 2 – 3 jours en culture (Figure 3). Avec le protocole décrit ci-dessus, la transduction des cellules MOLM13 ou MLL-AF9 AML entraîné une efficacité de transduction de 60 à 70 % avec nos préparations virales, laissant le reste 30 à 40 % des cellules untransduced ou BFP-ve dans chaque cupule. Ceci permet l’étude de la prolifération relative de génome-édité des cellules avec des cellules de type sauvage dans le même bien. L’augmentation proportionnelle ou la diminution en pourcentage de cellules transduite de sgRNA a été utilisée comme une mesure visant à traduire les effets fonctionnels de sgRNA médiée par délétion de gène dans les cellules MOLM13-Cas9. Si votre gène d’intérêt est importante pour la prolifération des cellules test AML, puis perturbation induite par le sgRNA de ce gène entraînera la diminution relative du BFP exprimant le sgRNA + ve cellules en comparaison avec les cellules BFP-ve au cours de l’essai, considérant que sgRNAs ciblant la luciférase, GFP ou non essentiels gènes conservera le BFP + ve/ve ratio au fil du temps.
À l’aide de 2 séparé anti-RPA3 sgRNAs, nous avons observé une baisse progressive et significative du pourcentage de BFP + ve cellules par rapport à la BFP-ve untransduced homologues. En revanche, le pourcentage de sgRNA anti-AAVS1 exprimant les cellules BFP est demeurée relativement constant au fil du temps, ce qui démontre que le ciblage de AAVS1 n’a aucun effet sur la prolifération des cellules MOLM13 (Figure 4 a). De même, dans les cellules de MLL-AF9-Cas9 souris, nous avons testé les effets de sgRNAs ciblant la rhodopsine (Rho1), le gène de pigmentation des yeux comme contrôle négatif et Dot1l, un régulateur épigénétique, connu pour être nécessaire à la prolifération des cellules leucémiques MLL-AF9 au fil du temps . Dans cette étude, le BFP + le ve transduites avec 2 autre anti-DOT1L sgRNAs des cellules de MLL-AF9-Cas9 souris a montré une perte dramatique et progressive au fil du temps par rapport aux cellules de sgRNA non-transduites BFP-ve (Figure 4 b). En revanche, le ratio de sgRNA anti-Rho1 est demeurée relativement stable au fil du temps. Ces résultats démontrent la vulnérabilité de la MLL-AF9 exprimant des cellules de leucémie de souris à l’appauvrissement de la couche Dot1l, confirmant les résultats déjà publiés.
Figure 1 : représentant Western blot résultats montrant différents niveaux Cas9. Clones de cellule de la lignée cellulaire MOLM13 AML transduites avec CAS9 ont été sondés pour drapeau-Cas9 les niveaux d’expression utilisant des anticorps anti-drapeau. Clones présentant la plus haute expression de Cas9 ont été sélectionnés pour poursuivre ses études. Les cellules HEK293-T transfectées avec un Cas9 plasmide d’expression furent utilisés comme témoin positif et Cas9 non-transduites MOLM13 cellules comme témoins négatifs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse représentative de génome d’édition au locus Dot1l évalué par analyse des glaces. Un amplicon PCR centré autour du site de cible sgRNA Dot1l était Sanger séquencé et analysé à l’aide d’analyse des glaces. Une comparaison de la séquence sgDot1l (ligne orange) à la séquence d’ADN non ciblée (ligne verte) illustre le haut niveau d’efficacité dans les cellules de sgDot1l ciblés autour du site de cible sgRNA d’édition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : flux de travail schématique des méthodes proposées. sgRNAs sont clonés dans le vecteur d’expression sgRNA co exprimant une protéine fluorescente comme BFP. Cible les cellules transduites à 30 à 60 % les taux de transduction et suivies par cytométrie en flux-tous les 2 – 3 jours. sgRNAs ciblant les gènes nécessaires à la prolifération des cellules AML montrera l’appauvrissement relatif au fil du temps, comme indiqué. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : représentant résulte d’analyses de la compétition chez les humains et les cellules de souris AML. (un) résultats montrent une progression statistiquement hautement significative diminution RPA3 transduites cellules clone B3 MOLM13-Cas9. En revanche, sgRNAs ciblant le site AAVS1 n’ont aucun effet. sgRNAs (b) ciblant les Dot1l montrent un déclin remarquable et progressif en prolifération compétitif, contrairement à sgRNAs, ciblant la rhodopsine (Rho). p > 0,05. p < 0,05. Barres d’erreur représentent déviation standard de la moyenne (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : schéma général du protocole. (a) temps pour chaque étape de la production de virus Cas9 et sgRNA clonage décrite. Conception et le clonage de sgRNAs peuvent être effectuées pendant la génération des simples clones de lignées cellulaires AML avec expression Cas9 stable. protocole général (b) pour la transduction des lignées cellulaires AML avec sgRNAs et essai de croissance compétitive FACS est montré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Cycles | Durée du Cycle | Température |
| 1 | 2 min | 95 ° C |
| 35 | 30 s | 95 ° C |
| 30 s | 55 ° C | |
| 30 s | 72 ° C | |
| 1 | 5 min | 72 ° C |
| Maintenez | infini | 4 ° C |
Tableau 1 : programme PCR amplification locus AAVS1 de l’ADN Genomic. Programme PCR utilisé pour l’amplification du locus AAVS1 de l’ADN génomique pour tests efficacité de coupe accrue de Cas9 en Cas9, exprimant des clones.
Fichier supplémentaire : séquences d’oligo sgRNA. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour effectuer un test de croissance compétitive CRISPR dotés de Cas9 pour enquêter sur le rôle des gènes candidats dans des lignées cellulaires AML cytométrie-dans les cellules humaines/murin AML (Figure 5). L’objectif du test est d’identifier l’effet de la suppression du gène sur l’entretien de la prolifération cellulaire AML pendant deux à trois semaines sur une échelle de débit moyen. Certaines étapes critiques doivent être suivis attentivement afin de faciliter l’intensification du protocole décrit. Dans la production de Cas9 lentivirus, il est nécessaire de filtrer le milieu conditionné de virus à travers un filtre de 0,45 µM pour éviter l’attraction des cellules 293 t au virus contenant le liquide surnageant. Au cours de la spinfection, enveloppant la plaque spinfection avec film alimentaire ou parafilm permet d’éviter une contamination potentielle lors de la centrifugation. Cependant, l’écharpe doit être enlevée avant de placer la plaque de spinfected retour en incubateur de culture de tissus. Il est très important d’évaluer les clones exprimant Cas9 pour montage de l’efficacité. Clones avec efficacité édition basse-génome reflètent l’activité Cas9 inadéquate et peuvent affecter le taux de réussite de l’expérience. Dans nos expériences, nous avons tout d’abord transduites des clones humains AML Cas9 avec sgRNAs ciblant le locus AAVS1 et séquencer leur ADN génomiques pour l’édition de l’efficacité. Comparaison de la AAVS1 sous la direction et les séquences de type sauvage peuvent être évaluées à l’aide des outils en ligne sur le web telles que TIDE8 (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) ou de la glace (https://ice.synthego.com/#/). Ces programmes comparent Sanger séquence traces de potentiellement édité PCR fragment à la séquence de type sauvage ou référence inédite et estiment la fréquence des changements. Il s’agit d’un moyen rapid d’évaluer mutationnels changements provoqués par la sgRNA de test, qui est la mesure de l’activité cellulaire de Cas9. Alternativement, le clonage de la PCR produit dans un plasmide PCR-clonage tel que le TOPO émoussé, vecteur de clonage peut être effectué, suivie par Sanger séquençage des colonies individuelles pour évaluer l’efficacité édition de génome par alignement de séquences de chaque clone à la type-sauvage. Nous préférons l’ancienne méthode, compte tenu de sa facilité et la rentabilité par rapport à la méthode de clonage. En règle générale, la découverte de paires de bases change par exemple de mutations ponctuelles, indels, etc.., dans ou autour du site de découpe de sgRNA dans une grande majorité des clones séquencés indiquent la présence d’un Cas9 très actif. Ainsi, nous avons choisi une leucémie MOLM13 ou MLL-AF9 clones B3 et 8, respectivement, avec la plus grande efficacité de montage pour les autres expériences.
Nous avons conçu sgRNAs ciblant des gènes différents mentionnés dans le protocole à l’aide de http://crispr.mit.edu/, un logiciel web qui donne une liste de sgRNAs. Il est recommandé de choisir sgRNAs haut score de la liste afin d’éliminer ceux qui ont des effets hors cible prévus. Le sgRNAs conçu peut être cloné en utilisant les protocoles publiés tels que celui sur le site Web (http://www.addgene.org/67974/). Sens et antisens oligos sont d’abord phosphorylés et recuits selon l’étape 2.1.5. La première étape à 37 ° C est importante pour la phosphorylation des oligos avec la kinase T4 et les cycles PCR sont importants pour le recuit des sens et des oligonucléotides anti-sens en ADN double brin. Il est important d’avoir une protéine fluorescente dans le vecteur de clonage de sgRNA qui est crucial pour le suivi des cellules transduite de sgRNA plus loin dans les analyses de la compétition. sgRNA clonage est intensifié avec l’utilisation d’une plaque bien 96 à toutes les étapes y compris recuit et ligature. Pour la ligature, nettoyer les microtubes PCR bandes peuvent également être utilisés, car elles sont compatibles avec les pipettes multicanaux. Dans le cas que la transformation d’un ensemble plus vaste de clones de sgRNA est nécessaire, une plaque à 96 puits dans lequel 10 μL des cellules compétentes sont pré-aliquotés dans chaque puits et congelé à-80 ° C peuvent être utilisé pour accélérer le processus. Le placage des réactions de ligature vise à prélever des colonies individuelles, qui est difficile à réaliser dans le format 96 puits. Par conséquent, pour la transformation bactérienne, il y a une légère perte une évolutivité maximale. Pourtant, même pour l’électrodéposition des réactions de transformation d’une ensemble plaque 96 puits, il faudra seulement un total de seize plaques 6 puits pour l’ensemble du projet. Il faut être prudent dans la prochaine étape du retrait des colonies sur les plaques de transformation. Tout en stries une colonie sur une place marquée, assurez-vous que l’endroit est clairement isolé des autres les taches. Marquant une grille carrée sur le bas de la boîte de pétri avec un marqueur permanent noir permet d’éviter la contamination croisée des clones bactériens.
Une fois que les minipreps de sgRNA constructions sont prêts, le virus peut être fait dans le format 96 puits. À ce niveau de débit, il est impossible de filtrer 200 µL du virus contenant le liquide surnageant. Par conséquent, le surnageant viral doit être congelé au moins une nuit ou plus à éviter la contamination croisée par des cellules 293 t reportées dans le surnageant. Il peut également être stocké dans 50 µL d’extraits en tube PCR stérile bandes pour éviter gel dégel du liquide surnageant. En outre, les surnageants de ces virus conditionné servent à transduction cellules AML. Dans l’affaire qui bas des titres de transduction virale sont observées, telles qu’évaluées par la faible fréquence de BFP + ve cellules, alors il peut être important déterminer le titre viral et essais transductions multiplication différente des infections (MOI) pour 40 à 60 % taux de transduction. Détermination du titre viral et MOI calcul est décrit en détail ici17. Dans le test de concurrence, tel que décrit à l’étape 3 du protocole, il est très important d’exclure des cellules non viables pour prévenir les fausses objets d’auto-fluorescence tout en analysant le BFP ratio non-BFP. Au moment de la FACS, avant d’analyser des échantillons d’essai, l’utilisation de BFP négatif et de témoins positifs BFP est fortement recommandée pour définir avec précision les tensions. À chaque moment re-électrodéposition, le volume des cellules d’être re-plaqué dépend de la concentration des cellules au point de temps donnée. Nous généralement re-plaqué 20 μL d’un total de 200 μL à chaque instant dans un puits fraîche avec 180 μl de milieu frais. Un mélange intime des cellules en pipettant également doucement de haut en bas juste avant la modification des plaques est fortement recommandée. En règle générale, nous avons observé que le dosage doit être effectué pendant 15 à 20 jours à avis fort change dans le BFP + ve/ve rapports, même si cela varie en fonction du gène à gène.
Ce système expérimental est bien adapté aux essais de plusieurs gènes en parallèle dans plusieurs lignées de cellules AML pour identifier rapidement le rôle des gènes candidats dans la survie ou la prolifération des cellules de l’AML. Une mise en garde de l’analyse de prolifération concurrentiel décrit ici est qu’il ne considère pas cell-extrinsèques potentiels tels que paracrine événements de signalisation des cellules ciblées gène susceptibles d’influencer la population de cellules non ciblée au sein du même bien. Même si cela pourrait être un fait rarissime, ce facteur faut avoir à l’esprit lorsqu’il procède à cet essai. Bien que nous avons utilisé les AML à titre d’exemple pour les dosages de concurrence fondée sur les Cas9-CRISPR décrits dans ce manuscrit, cette méthode peut être utilisée pour une lignée de cellules cancéreuses à identifier le rôle des gènes multiples en parallèle. Il y a divers avantages du gène-suppression à l’aide de CRISPR-Cas9 au gène-knockdown à l’aide de l’interférence d’ARN. Tout d’abord, contrairement aux interférents, qui présentent généralement un large éventail d’inhibition d’ARNm cible, sgRNAs couplés avec la nucléase Cas9 que prenne effet masquage complet de gènes cibles. Cela peut entraîner des phénotypes plus dramatiques et plus cohérentes avec CRISPR Cas9-méthodes, même s’il doit être averti que l’efficacité de ciblage des sgRNAs individuelles, mais aussi les interférents peut-être varier considérablement.
L’essai d’écoulement cytometry-concurrence axée offre plusieurs avantages sur les tests de prolifération traditionnel dans lequel un nombre fixe de cellules est plaqué pour mesurer l’activité proliférative relative des cellules perturbées de gène. Un avantage est que l’activité proliférative relative des cellules peut être rapidement et facilement mesurée par cytométrie en flux-pendant plusieurs jours, sans passer par la nécessité d’une cellule de comptage à chaque étape de l’électrodéposition. Ceci est utile lors de tests à un grand nombre de candidats sgRNAs ciblant plusieurs gènes, comme tous les puits de comptage est lourd et peut conduire à des inexactitudes. Contrairement, mesure ATP par dosages pour la croissance cellulaire, cytométrie en flux-peut être réalisée sur un échantillon de cellules vivantes, ce qui rend cette méthode utile pour l’analyse à long terme. Ceci est particulièrement utile dans l’étude des facteurs tels que les modulateurs épigénétiques, qui peuvent présenter des effets de fin d’action sur la prolifération des cellules de l’AML et peuvent exiger des essais à long terme. Deuxièmement, la présence de cellules transduites non au sein du même bien permet pour une population de cellules bien contrôlée qui peut être utilisée pour définir le niveau de référence pour le dosage. Troisièmement, lors de l’installation dans un format de 96 puits, l’essai peut presque complètement s’effectuent à l’aide de pipettes multicanaux, considérablement accélérer tout le processus de clonage de sgRNAs à préparation de virus et, éventuellement, cytométriques évaluation des fluorescence.
La méthode décrite ici peut être efficacement mis à l’échelle en place pour l’enquête de sgRNAs jusqu'à 96 en parallèle dans un écran rangé. En supposant que 4 à 6 sgRNAs par gène, cette méthode peut donc être utilisée pour l’interrogatoire rapide d’au moins 16 – 24 gènes en parallèle. Dans le cas de plus grand nombre de gènes, comme une voie moléculaire entière qui doit être interrogé dans les cellules de l’AML, mise en commun des écrans CRISPR dotés de Cas9 sera plus utiles.
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Disclosures
A.J.D est un consultant pour A2A pharmaceuticals (New Jersey) et Salgomed Therapeutics (San Diego). D’autres auteurs n’ont aucun conflit à déclarer.
Acknowledgments
Le plasmide de pCW-Cas9 était un cadeau de Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmide 50661 #) et le pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - plasmide W du labo Yusa (plasmide #67974 de Addgene. Nous tenons à remercier le noyau de la cytométrie en flux SBP Medical Discovery Institute pour une aide opportune avec analyse en flux et tri. Nous tenons à souligner le soutien de la Lady Tata Memorial Foundation AP. j.-c. Nous tenons à remercier également les sources de financement suivantes : NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center parrainé par Grant, la Fondation-V et les San Diego NCI Cancer Centers (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
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