Undersøkelse av genetisk avhengigheter ved hjelp av CRISPR-Cas9-baserte konkurranse analyser
Summary
Dette manuskriptet beskriver en gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar (CRISPR) CRISPR-Cas9-basert metode for enkel og rask undersøkelse av rollen som flere kandidat gener i akutt myelogen leukemi AML celle spredning i parallell. Denne teknikken er skalerbar og kan brukes i andre kreftcelle linjer også.
Abstract
Gene forstyrrelsene studier har blitt brukt å undersøke rollen av enkelte gener i AML patogenesen. For å oppnå fullstendig genet avbrudd, mange av disse studiene har gjort bruk av komplekse genetiske knockout modeller. Disse studiene med knockout mus tilbyr et elegant og velprøvde system for å undersøke genotype til fenotypen relasjoner, en rask og skalerbar metode for å vurdere kandidat gener som spiller en rolle i AML celle spredning eller overlevelse i AML modeller hjelpe akselerere parallelle avhør av flere kandidat gener. Nylige fremskritt innen genomet-redigering teknologiene har dramatisk forbedret vår evne til å utføre genetiske forstyrrelser i et enestående omfang. Et slikt system genomet redigering er CRISPR-Cas9-baserte metoden som kan brukes til å gjøre rask og effektiv endringer i målet cellen genomet. Den enkle og skalerbarheten til CRISPR/Cas9-mediert genet sletting gjør det en av de mest attraktive teknikkene for avhør av et stort antall gener i fenotypiske analyser. Her presenterer vi en enkel analysen bruker CRISPR/Cas9 mediert gen-avbrudd kombinert med høy gjennomstrømming flyt-cytometri-baserte konkurranse analyser for å undersøke rollen av gener som kan spille en viktig rolle for utbredelsen eller overlevelsen av menneskelige og murine AML linjer.
Introduction
De siste tiårene har sett mange forskningsinnsats fokusert på å identifisere bidrag fra viktige molekylær stier i akutt myelogen leukemi (AML) patogenesen. Tradisjonelt, er Gen-avbrudd i AML celler utført ved hjelp av betinget knockout mus eller kort-hårnål RNA (shRNA). Knockout mus tilbyr et sofistikert system for spatio-temporale kontroll av genet sletting, er genererer genet knockout mus arbeidskrevende, tidkrevende og kostbar. Videre gen-fortrenging rekombinasjon strategier er ikke lett skalerbar; disse strategiene egner ikke seg godt til avhør av flere gener parallelt. Etter oppdagelsen av RNA forstyrrelser metoder for å slå ned endogene mRNAs lite forstyrrende RNA (siRNA) eller shRNA, begynte mange grupper med RNA forstyrrelser teknikker for å undersøke hvilken rolle bestemte gener i AML. Siden både murine og menneskelige AML celler er notorisk vanskelig å transfect med tradisjonelle lipid-baserte transfection metoder, de fleste studier ansatt lentivirally eller retrovirally-kodede shRNA for å studere gen funksjon i AML celler. Den nylige oppdagelsen av gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) og de tilhørende Cas-nucleases (CRISPR-Cas9) har revolusjonert genet målretting teknologier1,2,3. Bruker CRISPR-Cas9, kan bestemte gener og genomisk regioner slettes, redigert eller merket med effektivitet og brukervennlighet. CRISPR-Cas9-baserte gen-redigering fremstår nå som metoden for valg for å undersøke genotype til fenotypen relasjoner i ulike celletyper enkelhet, effektivitet og bred anvendelse av denne teknikken. CRISPR-Cas9-baserte metoder er også blitt metoden for valg i AML, ikke bare for avhør enkelte gener, men også som en måte å målrette flere gener i plassert eller gruppert genetisk skjermer å undersøke flere gener parallelt som mulig AML-avhengigheter4,5,6.
I dette manuskriptet beskriver vi en enkel konkurransedyktig vekst analysen for å måle virkningen av gen-avbrudd på veksten av AML celler, basert på stabil CRISPR-Cas9-mediert gen-redigering etterfulgt av høy gjennomstrømming flowcytometri. Denne metoden er enkel, effektiv og skalerbar til medium gjennomstrømming eksperimenter for å undersøke rollen av flere gener parallelt i AML celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskriptet beskrive vi en detaljert protokoll for å gjennomføre en CRISPR-Cas9-baserte konkurransedyktig vekst analysen for å undersøke rollen kandidat gener i AML cellelinjer bruke flowcytometri i menneskelige/murint AML celler (figur 5). Målet med analysen er å identifisere effekten av genet sletting på vedlikehold i AML celle spredning over to til tre uker i medium gjennomstrømming skala. Noen kritiske trinn må følges nøye for å lette skalere opp beskrevet protokolle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCW-Cas9 plasmider var en gave fra Eric Lander & David Sabatini (Addgene plasmider # 50661) og pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) – PGKpuro2ABFP – W plasmider fra Yusa lab (Addgene plasmider #67974. Vi ønsker å takke flowcytometri kjernen SBP medisinsk Discovery Institute for betimelig hjelp med flyt analyse og sortering. Vi ønsker å erkjenne støtte fra Lady Tata Memorial Foundation til A.D. Vi ønsker å erkjenne også støtte fra følgende finansiering kilder: NIH/NCI P30 CA030199 Cancer Center sponset Grant, V-stiftelsen og San Diego NCI kreft sentre (C3) #PTC2017to A.J.D.
Materials
| FLAG-M2 Antibody | sigma-aldrich | F3165, lot # SLBS3530V | |
| Anti-mouse Antibody | Invitrogen | 31446, lot # TA2514341 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Fisher | 34095 | |
| ChemiDoc Imaging System | BIO RAD | 17001401 | |
| Sorvall Legend RT centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Blasticidin | Thermo Fisher | R21001 | |
| SYTOX Red | Thermo Fisher | S34859 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965-092 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030081 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | SAFC | 12303C | |
| single gRNA vector | Addgene #67974 | pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W | |
| CelLytic Nuclear extraction kit | sigma-alorich | NXTRACT | |
| XtremeGENE 9 | sigma-alorich | 6365787001 | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| T4 PNK | NEBioLabs | M0201S | |
| T4 DNA ligation buffer | NEBioLabs | B0202S | |
| T4 DNA Ligase enzyme | NEBioLabs | M0202S | |
| Ampicillin | Fisher scientific | BP1760-25 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP9724-500 | |
| LB Broth | Fisher scientific | BP9731-500 | |
| Qiagen mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | NanoDrop One | |
| Recombinant Murine IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Peprotech | 216-16 | |
| Recombinant Murine M-CSF | Peprotech | 315-02 | |
| Stable competent cells | NEBiolabs | C3040I | |
| 10 cm Tissue Culture dishes | Fisher Scientific | 353003 | |
| Cell lysis solution | Qiagen | 158906 | |
| Protein precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| DNA hydration solution | Qiagen | 158914 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| BbSI | New England BioLabs | R0539S | |
| APEX 2.0 X Taq Red Master Mix Kit | Genessee Scientific | 42-138 | |
| Puromycin | Fisher scientific | BP2956100 | |
| 50 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495949A | |
| 15 mL polypropylene conical tubes | Fisher scientific | 1495970C |
References
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Method. 10 (10), 957-963 (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Shi, J., et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 33 (6), 661-667 (2015).
- Kuhn, M. W., et al. Targeting Chromatin Regulators Inhibits Leukemogenic Gene Expression in NPM1 Mutant Leukemia. Cancer Discovery. 6 (10), 1166-1181 (2016).
- Erb, M. A., et al. Transcription control by the ENL YEATS domain in acute leukaemia. Nature. 543 (7644), 270-274 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Research. 46 (10), 58 (2018).
- Nguyen, A. T., Zhang, Y. The diverse functions of Dot1 and H3K79 methylation. Genes & Development. 25 (13), 1345-1358 (2011).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. 125 (4), 593-605 (2016).
- Bernt, K. M., et al. MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT1L. Cancer Cell. 20 (1), 66-78 (2011).
- Daigle, S. R., et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 20 (1), 53-65 (2011).
- Jo, S. Y., Granowicz, E. M., Maillard, I., Thomas, D., Hess, J. L. Requirement for Dot1l in murine postnatal hematopoiesis and leukemogenesis by MLL translocation. Blood. 117 (18), 4759-4768 (2011).
- Nguyen, A. T., Taranova, O., He, J., Zhang, Y. DOT1L, the H3K79 methyltransferase, is required for MLL-AF9-mediated leukemogenesis. Blood. 117 (25), 6912-6922 (2011).
- Zuber, J., et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nature Biotechnology. 29 (1), 79-83 (2011).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Li, M. J., Rossi, J. J. Lentivirus transduction of hematopoietic cells. CSH Protocols. 2007, (2007).
