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Biochemistry

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58727
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Team Mechanobiology, Immunity and Cancer, Institute for Advanced Biosciences, INSERM U1209, CNRS UMR5309, 2Université Grenoble Alpes, 3Pôle Recherche, Centre Hospitalier Universitaire des Alpes

Summary

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Abstract

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto. Le varie funzioni di queste cellule sono legate alla loro Stati di attivazione, che è anche chiamato polarizzazione. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia del macrofago. È attualmente riconosciuto che un approccio multidimensionale è necessario descrivere come polarizzazione è controllata da segnali ambientali. In questo rapporto, descriviamo un protocollo progettato per ottenere la firma di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Questo protocollo è basato su una quantificazione dell'espressione della proteina del macrofago ottenuto da Lys C/tripsina-digerito lisi cellulare contenuti e frazionati in gel privo di etichetta. Forniamo anche un protocollo basato sulla soluzione in digestione e frazionamento da utilizzare come alternativa di messa a fuoco isoelettrico. Perché la concentrazione di ossigeno è un parametro ambientale rilevante nei tessuti, utilizziamo questo protocollo per esplorare composizione come atmosferica o un ambiente di ossigeno basso colpisce la classificazione di polarizzazione del macrofago.

Introduction

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto, compresa la rimozione delle cellule apoptotiche e rimodellamento della matrice extracellulare1. Queste cellule sono caratterizzate da una forte plasticità fenotipica2 che si traduce in un molti Stati di attivazione possibili, che sono anche chiamati polarizzazioni. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia di macrofago3. È stato proposto di classificare queste polarizzazioni utilizzando la cosiddetta dicotomia M1/M2, in cui M1 rappresenta pro-infiammatorie e M2 rappresenta i macrofagi infiammatori. Questo modello si adatta bene in varie situazioni patologiche, come le infezioni acute, l'allergia e l'obesità4. Tuttavia, in tessuti cronicamente infiammati e cancro, è stato dimostrato che questa classificazione è in grado di cogliere il vasto repertorio fenotipico che i macrofagi presentano in determinati ambienti cellulari5,6, 7. il consenso corrente è che la polarizzazione del macrofago è meglio descritto utilizzando un modello multidimensionale di integrare segnali specifici microambientali8. Questa conclusione è stata confermata attraverso l'analisi trascrittomica dei macrofagi umani, mostrando che il modello M1/M2 è inefficiente nel descrivere le polarizzazioni ottenuti9.

Lo studio presentato si propone di fornire un protocollo per ottenere le firme di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Descriviamo come differenziare i macrofagi umani negli ambienti dei vari livelli di ossigeno e ottenere peptidi dal macrofago intero proteoma per eseguire una quantificazione privo di etichetta. Questa quantificazione permette il confronto dei livelli di espressione di varie proteine. Come la ricerca sulle cellule staminali ha rivelato l'importanza di ossigeno come un parametro chiave ambientale10, cerchiamo di capire come questo parametro di tessuto può influenzare la polarizzazione del macrofago in esseri umani. La pressione parziale di ossigeno è stata trovata per gamma da 3 a 20% (del totale pressione atmosferica) nel corpo umano, dove il 20% corrisponde approssimativamente a quello comunemente usato in un'incubatrice di coltura cellulare (il valore esatto è di circa 18,6% durante l'assunzione di presenza di acqua in considerazione).

Il lavoro precedente ha indicato che alveolare differiscono dai macrofagi interstiziali da funzionale e morfologica punto di vista11 e che queste differenze sono probabilmente parzialmente dovuto i livelli di ossigeno differente a cui sono esposte12. Inoltre, derivate da midollo osseo macrofagi mostrano una maggiore capacità di phagocytize batteri quando esposti ad un ambiente di ossigeno basso12. L'effetto opposto è stato trovato per macrofagi umani differenziati THP113, ma questi risultati sostengono l'idea che l'ossigeno è un regolatore della biologia del macrofago e che è necessario chiarire questo ruolo a livello molecolare in macrofagi umani. In uno studio precedente, abbiamo applicato un approccio di proteomica per risolvere questi problemi. Misurando i livelli di espressione di migliaia di proteine contemporaneamente, abbiamo messo in evidenza l'impatto di ossigeno sulla polarizzazione e fornito un elenco di nuovi marcatori molecolari. Siamo stati anche in grado di correlare questi risultati per alcune funzioni di macrofagi. In particolare, abbiamo trovato che il tasso di fagocitosi delle cellule apoptotiche aumentava nei macrofagi IL4/IL13-polarizzato, che era legato al upregulation di ALOX15, come rivela l' analisi proteomica14. Nello studio presente, descriviamo come effettuare tale analisi.

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Protocol

Campioni di sangue umano (LRSC) da donatori sani, de-identificati sono stati ottenuti da EFS (servizio nazionale di sangue francese) come parte di un protocollo autorizzato (CODECOH DC-2018 – 3114). I donatori hanno dato il consenso firmato per l'uso di sangue.

1. Media e preparazione di Buffer

  1. Preparare il supporto di macrofago [glutamax RPMI + 10 mM HEPES + 1 x aminoacidi non essenziali (NEAA)] e riscaldarla a 37 ° C.
  2. Preparare il macrofago medium + 10% di siero umano dal plasma AB (SAB), filtrare (filtro di 0,22 µm), poi riscaldarla a 37 ° C (indicato come macrofago medium + 10% SAB in appresso).
  3. Preparare il tampone di ordinamento [1 x tamponato fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina di siero bovino (BSA) + acido etilendiamminotetracetico 2mm (EDTA)], filtrare (filtro di 0,22 µm) e mantenerla a 4 ° C.

2. isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) dalla camera di Leukoreduction System (LRSC)

  1. Mettere 15 mL di soluzione di separazione cellulare gradiente di densità (Vedi Tabella materiali) in un mL 50 centrifugazione tubo quindi può scaldare a temperatura ambiente (TA) prima di ricevere il LRSC.
    Nota: Densità dipende dalla temperatura. Come questo prodotto è conservato a 4 ° C, questo passaggio deve essere fatto in anticipo in modo che può equilibrare a RT.
  2. Svuotare il LRSC in una provetta di centrifugazione di 50 mL, aggiungere fino a 50 mL di PBS 1X e mescolare. Molto lentamente, aggiungere 25 mL della miscela preparata durante passaggio 2.2 sopra 15 mL di soluzione di gradienti di densità riscaldato durante passaggio 2.1.
    Nota: Fare attenzione a non mescolare le fasi durante questo passaggio. Il sangue deve essere aggiunto alla soluzione gradienti di densità senza alcuna dispersione di questa fase.
  3. Centrifugare entrambi tubi di centrifugazione per 25 min a 700 x g senza interruzioni.
    Nota: Al termine della centrifugazione in gradiente di densità, gli strati dal basso verso l'alto sono: gli eritrociti e granulociti formando il pellet, fase di soluzione gradienti di densità, strato di PBMCs e nel plasma.
  4. Con una pipetta, passare attraverso la fase di plasma senza aspirazione si e raccogliere lo strato PBMC in un nuovo tubo di centrifugazione di 50 mL. Aggiungere fino a 50 mL di 1X PBS in PBMCs come una fase di lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
  5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 40 mL di terreno del macrofago.

3. magnetico etichettatura e isolamento di CD14+ cellule (monociti)

  1. Contare i PBMCs in una camera di Malassez. Prelevare la quantità di PBMCs necessarie per condurre l'esperimento (in genere 100-300 x 106 cellule), inserirli in un tubo di centrifugazione e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
  2. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 80 µ l di buffer di ordinamento preparato durante il passaggio da 1.3 a 107 PBMCs. aggiungere 20 µ l di microsfere di CD14 ogni 107 PBMCs. Mix ed incubare per 15 min a 4 ° C sotto agitazione costante.
  3. Aggiungere 1 mL di tampone a 107 PBMCs di ordinamento come una fase di lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone per 108 PBMCs di ordinamento.
  4. Posto una colonna nel campo magnetico del separatore. Preparare la colonna sciacquandolo con 3 mL di tampone di ordinamento.
  5. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna. La colonna dipende dal numero di cellule per essere isolato (qui, LS colonne per fino a 109 PBMCs vengono utilizzate). Raccogliere il flusso continuo contenenti celle adenoide.
    Nota: A partire da questo passaggio, tutti i tubi (selezioni positivi e negativi) sono conservati per più tardi il controllo delle diverse fasi tramite flusso cytometry.
  6. Lavare la colonna con 3 x 3 mL di tampone di ordinamento. Raccogliere le cellule senza etichetta, passando attraverso il tubo stesso dal passaggio 3.12. Eseguire i passaggi di lavaggio dal buffer di ordinamento aggiungendo, essere attenti a non far asciugare la vostra colonna. Posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna e rimuoverlo dal separatore.
  7. Pipettare 5 mL di tampone di ordinamento nella colonna. Sciacquare immediatamente le cellule magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Per aumentare la purezza del CD14+ cellule, la frazione eluita è arricchita nel corso di una seconda colonna.
  8. Ripetere i passaggi da 3.4 a 3.7 con una nuova colonna.

4. placcatura dei monociti

  1. Contare i monociti in una camera di Malassez. Verificare la purezza del CD14+ cellule tramite flusso cytometry. Prelevare la quantità di monociti necessari per l'esperimento e metterli in un tubo di centrifugazione.
  2. Centrifugare per 10 minuti a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere il pellet di monociti nel mezzo del macrofago. Le cellule del piatto e lasciarli accontentarsi di 50 min a 1 h. aspirare il mezzo e sostituirlo con il mezzo di macrofago + 10% SAB + 25 ng/mL del macrofago stimolante le colonie di fattore (M-CSF) per indurre la differenziazione.

5. polarizzazione dei macrofagi al giorno 6

  1. Aspirare il mezzo. Sostituirlo con del macrofago medium + 10% SAB con vari stimoli. Ad esempio, aggiungere 10 ng/mL interferone gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) per ottenere la polarizzazione M1, o 20 ng/mL interleuchina 4 (IL4) + 20 ng/mL interleuchina 13 (IL13) per polarizzazione M2.
    Nota: La stimolazione può essere eseguita tra 24 e 48 h prima di procedere ad altri test.
  2. Raccogliere le cellule utilizzando una soluzione distaccante o un raschietto di cella.

6. cella cultura in condizioni di ossigeno basso

  1. A partire dal passaggio 4, mantenere i monociti e quindi macrofagi in un ambiente di ossigeno controllato per eseguire l'analisi in condizioni di ipossia. Utilizzare una stazione di lavoro di ipossia per mantenere le cellule sotto la pressione parziale di ossigeno desiderata durante l'esperimento.
    Nota: Quando si lavora sotto pressione bassa dell'ossigeno, è importante preparare tutti i supporti e buffer di lavaggio sotto la stazione ed attendere sufficientemente per ottenere la corretta pressione parziale nel liquido. Ad esempio, 10 mL di PBS in un 60mm di Petri richiede circa 2 ore per raggiungere 25 mmHg per la pressione parziale di O2 a partire da pressioni atmosferiche (come abbiamo misurato utilizzando un sensore a fibra ottica). In molte stazioni ipossiche o incubatori, la pressione dell'ossigeno è impostata come una percentuale della pressione atmosferica. Se le misure precise sono necessari, è preferibile utilizzare una stazione che autorizza per impostare direttamente la pressione dell'ossigeno in mmHg.

7. Lisi e digestione In-Gel (protocollo 1)

Nota: In questa e nelle sezioni seguenti, sono descritti due protocolli utilizzati per ottenere peptidi ed eseguire analisi LC-MS/MS. Protocollo n. 1 vengono descritti lisi cellulare e frazionamento in gel e digestione e protocollo 2 lisi delle cellule in soluzione, seguita da digestione in soluzione e frazionamento utilizzando un metodo di messa a fuoco isoelettrico.

  1. Eseguire lisi cellulare nel Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glicerolo, 33,3% (v/v) β-mercaptoetanolo, blu di bromofenolo 0,2% p/v]. Caricare l'equivalente proteico di 300.000 cellule per ogni campione su gel di acrilammide bis-Tris di 4-12%.
  2. Controllare la durata della migrazione elettroforetica per consentire ogni campione della proteina sia suddiviso in 6 gel bande come esemplificato nella Figura 3.
  3. Fissare il gel con una soluzione di fissaggio (30% etanolo + acido acetico 7.5% per 20 min), quindi aggiungere la soluzione colorante (R-250 Coomassie blu per 45 min). Aggiungere la soluzione decolorante (30% etanolo + 7,5% acetico finché non vengono visualizzate bande) prima di asportare le bande proteiche con un bisturi pulito.
  4. Tagliare a dadini ogni banda asportato prima introduzione in tubi di 500 µ l. Una superficie di vetro pulita è autorizzata per evitare la contaminazione con le cheratine (soluzione SDS al 5% in acqua deionizzata può essere utilizzato per pulire le superfici).
  5. Lavare le fette del gel 3 volte in 200 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM per 20 min a 37 ° C, seguita da un lavaggio in bicarbonato di ammonio di 25 mM e acetonitrile (50% v/v). Disidratare i pezzi di gel con 200 µ l di acetonitrile 100% per 10 min.
  6. Incubare ogni pezzo di gel con 10 mM DTT (dithiothreitol) in bicarbonato di ammonio di 25mm per 45 min a 56 ° C (200 µ l), seguita da iodoacetamide 55 mM a 25 mM di bicarbonato di ammonio (200 µ l) per 35 min al buio a TA.
  7. Per interrompere alchilazione, Incubare ogni pezzo di gel con 200 µ l di 10 mM DTT in bicarbonato di ammonio di 25 mM per 10 min a RT. Wash i pezzi di gel in 200 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM, quindi disidratare con 200 µ l di acetonitrile 100% per 10 min.
  8. Digerire le proteine durante la notte a 37 ° C con tripsina/Lys-C mix secondo le istruzioni del produttore.
  9. Estrarre i peptidi risultanti da pezzi gel aggiungendo 50 μL di 50% acetonitrile per 15 minuti, poi 50 μL di acido formico al 5% per 15 min e infine, 50 μL di 100% acetonitrile per 15 min. piscina e asciugare ogni frazione in tubi di basso assorbimento per limitare l'assorbimento dei peptidi e perdita del campione. Conservare i campioni a-80 ° C fino a ulteriori analisi.

8. proteine estrazione e digestione In soluzione (protocollo n. 2)

  1. Eseguire la lisi cellulare (2 x 106 cellule) con 150 µ l di buffer di lisi seguenti:
    1. 7m urea, 2m tiourea, 40 mM Tris e 4% CHAPS, completati con inibitori della proteasi (mini completa, inibitore della proteasi EDTA-free cocktail).
  2. Omogeneizzare le soluzioni per 30 min a RT con un agitatore. Centrifugare a 13.800 x g per 20 min RT e mantenere il supernatante.
  3. Rimuovere i contaminanti con un kit di pulizia 2D:
    1. Il kit contiene soluzione precipitante, soluzione co-precipitante, tampone di lavaggio e lavaggio additivo.
    2. Aggiungere 300 µ l di soluzione precipitante e mescolare bene. Incubare in ghiaccio per 15 min. aggiungere 300 µ l di soluzione di co-precipitante. Centrifugare le provette (almeno) a 12.000 x g per 5 min. Una piccola pallina dovrebbe essere visibile. Procedere rapidamente alla fase successiva per evitare risospensione o dispersione del pellet. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet.
    3. Centrifugare le provette nuovamente con il tappo-cerniera e pellet rivolta verso l'esterno per portare il liquido rimanente alla parte inferiore del tubo. Un breve impulso è sufficiente. Non ci dovrebbe essere nessun liquido rimanente visibile nei tubi.
    4. Senza disturbare il pellet, aggiungere 40 µ l di soluzione di co-precipitante. Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare per 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il lavaggio. Aggiungere 25 µ l di acqua deionizzata. Vortexare ciascuna provetta per 5-10 s. Il pellet dovrebbe disperdersi ma non si dissolve in acqua.
    5. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio (pre-raffreddato per almeno 1 h a-20 ° C) e 5 µ l di additivo di lavaggio. Vortice fino a quando la pallina è completamente dispersa. Incubare le provette a-20 ° C per almeno 30 min. Vortex per 20-30 secondi ogni 10 min
      Nota: I tubi sono memorizzabili a-20 ° C fino a 1 settimana con degradazione minima della proteina o la modifica.
    6. Centrifugare le provette (almeno) a 12.000 × g per 5 min. con attenzione rimuovere e scartare il surnatante. Una pallina bianca dovrebbe essere visibile. Lasciar il pellet airdry per non più di 5 min (se troppo asciutto, che sarà difficile risospendere il pellet).
  4. Risospendere il pellet di proteina in 300 µ l di bicarbonato di ammonio di urea e 0,1 M 8 M. Vortice fortemente per 1 min. determinare la concentrazione di proteine utilizzando un saggio colorimetrico.

9. in-soluzione digestione (protocollo n. 2)

  1. Ridurre i ponti disolfuro aggiungendo 5,1 µ l di una soluzione acquosa di 700 mM DTT (concentrazione finale 12,5 mM) per le proteine sedimento da passaggio di 8,4 e incubare a 37 ° C per 30 min con un agitatore. Alchilata residui di cisteina aggiungendo 20,3 µ l di una soluzione acquosa di iodoacetamide 700mm (concentrazione finale 40 mM) e incubando a 25° C per 30 min al buio con un agitatore.
  2. Aggiungere 990 µ l di bicarbonato di ammonio 0,1 M al campione. Aggiungere un volume corrispondente di tripsina/Lys-C mix (substrato enzimatico: rapporto 1: 100 w/w). Incubare a 37° C durante la notte con un agitatore.

10. pulizia cartuccia (protocollo n. 2)

  1. Bagnare una cartuccia con 1 colonna-volume (1 mL) di metanolo. Pulire la cartuccia con 1 colonna-volume (1 mL) di acqua di 80% acetonitrile/HPLC-grado e scartare il flusso continuo. Equilibrare la cartuccia con 4 colonna-volumi (4 mL) di acqua di acido formico/HPLC-grado di 0,1% e scartare il flusso continuo.
  2. Acidificare campioni con 90 µ l di acqua a pH 2-3 (controllare il pH con un indicatore di pH) o 10% acido formico. Caricare i campioni acidificati e raccogliere il flusso continuo. Ricaricare il flusso continuo (contenente i peptidi non-mantenuta). Lavare la cartuccia con colonna-volume 6 (6 mL) di acqua di acido formico/HPLC-grado di 0.1%.
  3. Eluire peptidi dalla cartuccia con 1 colonna-volumi (1 mL) di acqua di acetonitrile/HPLC-grado acid/50% formico 0.1%. Trasferire in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL. Concentrare il campione utilizzando un concentratore a vuoto (150 x g, vuoto a 160 mBar).

11. frazionamento mediante focalizzazione isoelettrica (protocollo n. 2)

Nota: I peptidi sono separati secondo loro punti isoelettrici utilizzando un frazionatore di gel off su una striscia di 13 cm che copre un range di pH da 3 a 10. Abbiamo usato il seguente protocollo fornito dal fornitore (riassunto di seguito):

  1. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione (600 µ l di soluzione di glicerolo, 60 µ l di tampone OFFGEL, 4,34 mL di acqua ultrapura) e soluzione B (1,776 mL di soluzione A) e 444 µ l di acqua ultrapura.
  2. Assemblare le strisce IPG, cornici ed elettrodi secondo le istruzioni del produttore.
  3. Risospendere il campione con 1,8 mL di soluzione B. aggiungere 40 µ l di soluzione B in ciascun pozzetto. Caricare 150 µ l di campione in ciascun pozzetto.
  4. Selezionare il metodo di default per i peptidi: OG12PE00 (metodo di default OFFGEL per peptidi per l'utilizzo con un 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, 12-pozzetti fotogrammi. Attendere che questo metodo è stato completato (~ 20 h). Raccogliere le frazioni in tubi correttamente etichettati.

12. pulizia Harvard Apparatus colonna inversa C18 Post-IEF (protocollo n. 2)

  1. Aggiungere progressivamente μL pochi alla volta dell'1% TFA in acqua deionizzata per ogni frazione di acidificare il campione. Verifica tramite carta di pH il pH è circa 3 o inferiore.
  2. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione 1 (5 mL di acetonitrile, 10 µ l di acido formico, 4,99 mL di acqua ultrapura) e soluzione 2 (0,5 mL di acetonitrile, 10 µ l di acido formico, 9,49 mL di acqua ultrapura).
  3. Pre-bagnato la colonna di spin con 150 µ l di soluzione 1. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo. Lavare la colonna di spin con 150 μL di soluzione 2. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo.
  4. Passare la frazione attraverso la colonna. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo. Lavare con 150 μL di soluzione 2. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo.
  5. Eluire la frazione con 50 μL di soluzione 1. Centrifuga per 90 s a 750 x g. Ripetere la procedura una volta di più.
  6. A secco-frazione utilizzando un concentratore a vuoto (150 x g, vuoto 160 mBar) e conservare a-80 ° C

13. analisi dei dati di proteomica e bioinformatica18

  1. Analizzare i dati ottenuti da un nano-LC-MS/MS utilizzando il motore di ricerca di Andromeda e quantificazione software come MaxQuant (versione 1.5.2.8) di spettrometro di massa.
  2. Impostare tasso di falsi scoperta (FDR) all'1% per una lunghezza minima di 7 aminoacidi e proteine e peptidi. Impostare la specificità degli enzimi come C-terminale di Arg e Lys. Consentire 2 fenditure perse alle obbligazioni di prolina. Selezionare carbamidomethylation di cisteina come una variante fissa e ossidazione N-terminale della proteina acetilazione e metionina come variabile modifiche.
  3. Analizzare ulteriormente i dati con software di analisi statistica. Eseguire un'analisi di arricchimento funzionale utilizzando il software FunRich (www.funrich.org/). Eseguire un'analisi di arricchimento di ontology del gene utilizzando software di DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).

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Representative Results

A partire da cellule mononucleari di sangue periferico (PBMCs) ottenute per centrifugazione differenziale, il protocollo consente l'ottenimento di una popolazione di CD14+ monociti con un valutati purezza superiore al 98% da citometria a flusso (Figura 1). Questi monociti sono secondariamente differenziati verso varie polarizzazioni (Figura 2). Quando viene scelto un frazionamento su gel, la migrazione su gel di SDS-page è adattata per ottenere il numero di bande desiderate e le bande sono asportate (Figura 3). La digestione avviene secondariamente nelle bande asportate del gel, quindi vengono estratti i peptidi. I peptidi sono analizzati utilizzando una nano-LC (cromatografia liquida)-MS/MS spettrometro di massa. Gli spettri MS/MS dare l'identità di varie proteine secondo l'annotazione di spettri ottenuti per peptidi noti (Figura 4A). La quantificazione dell'abbondanza di una proteina è quindi calcolata in relazione alla quantità di peptidi identificati provenienti dalla proteina utilizzando software pubblicati e database15,16. Questo protocollo con digestione in-gel dà circa 4000 proteine identificate, e la gamma dinamica è stata trovata per coprire 5 unità in scala logaritmica (Figura 4B). Analisi dell'espressione differenziale di queste proteine identificate può essere utilizzato per determinare il raggruppamento di varie polarizzazioni nell'ambito degli ambienti ossigeno differente.

Con questo metodo, possiamo anche riconoscere i cluster delle proteine che sono up-regolati quando esposti ad una concentrazione bassa di ossigeno del 3% (Figura 5, tabella 1). Per valutare l'efficienza della digestione, che è non è possibile quando si utilizza un protocollo di in-gel, abbiamo proposto un metodo di digestione in soluzione che è stato adattato ai macrofagi umani (Figura 6A). Con questo metodo, possiamo facilmente ottenere (dopo digestione nella soluzione) identificazione di 3600 proteine senza frazionamento, significato quel frazionamento con volontà IEF sensibilmente aumentare questo numero (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: flusso cytometry analisi dell'espressione di CD14 di PBMC prima dell'ordinamento (pannello di sinistra) e dopo l'ordinamento (pannello di destra) Mostra la purezza ottenuta dopo selezione biglie magnetiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: immagini di contrasto di fase dei macrofagi umani differenziati risultati eterogeneità delle morfologie ottenute per due diverse polarizzazioni. Barra della scala rappresenta 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: formazione immagine di Coomassie blu macchiata gel mostrando le varie bande che saranno escisse [qui, 6 bande in macrofagi M(Ø)] per 5 polarizzazioni dei macrofagi esposti a un ambiente di ossigeno basso. IC = immunocomplessi, DXM = desametasone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: spettro MS/MS e quantificazione. (A) un esempio di uno spettro di MS/MS. Mostrato qui è lo spettro di CID (dissociazione indotta da collisione) di un peptide trovato a m/z 597.29 sullo spettro MS con una carica elettrica + 2. La sequenza corrispondente è stata determinata da questo spettro come Val-Ala-Glu-Leu-Glu-Asn-Ser-Glu-Phe-Arg dalla proteina CD58. (B) rank ordinato quantificazione privo di etichetta per ciascuna delle proteine identificate (registro10 IFQ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: mappa termica che rappresenta il raggruppamento gerarchico di polarizzazione tutti stati utilizzando differenzialmente espresse proteine. L'analisi rivela un cluster delle proteine overexpressed in tutte le polarizzazioni nella condizione2 O il 3% (rettangolo rosso). La scala dei colori rappresenta z-score (log2 intensità). Ogni riga è una proteina e ogni colonna è un campione. Questa figura ha provenuta da una precedente pubblicazione14. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: SDS-PAGE e cromatogramma. (A) gel di SDS-PAGE argento-macchiate con proteina da lisi cellulare e dopo digestione nella soluzione che mostra l'assenza di degradazione durante la lisi e l'efficienza della digestione. (B) cromatogramma ottenuto da dopo la digestione nella soluzione senza frazionamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Cluster proteinID Nomi di proteina Nomi di gene Peptidi Rasoio + unici peptidi Peptidi unici Proteina ID
Rosso P0DMV9 Shock termico 70 kDa proteina 1B HSPA1A 40 37 4 P0DMV9; P0DMV8; A8K5I0; Q59EJ3; B4DNT8; B4DWK5; B4DFN9; B4DI39; B4E1S9; B4DVU9; V9GZ37; B3KTT5; B4DNX1; B4E1T6; B4DNV4; Q9UQC1
Rosso P54709 Sodio/potassio-trasporto ATPasi subunità beta-3 ATP1B3 8 8 8 P54709; D3DNF9; C9JXZ1; C9JA36; H7C547; F8WBY4; Q58I18
Rosso O00462 Beta-mannosidase YAMANBA 14 13 13 O00462; A7LFP5; A8K6D3; E9PFW2; B4DT18; Q59EG5
Rosso Q8NAS7 Proteina ferro-zolfo di NADH deidrogenasi [ubichinone] 7, mitocondriale NDUFS7 4 4 4 Q8NAS7; Q6ZQU6; F5H5N1; B7Z1U1; A8K0V6; Q7LD69; F5GXJ1; O75251; B7Z4P1; Q9H3K5; A0A087WXF6; A0A087WTI3; Q6ZS38
Rosso Q8WWQ0 Proteina d'interazione PH PHIP 5 5 4 Q8WWQ0; Q9NWP3
Rosso E5RHK8 Dynamin-3 DNM3 11 2 2 E5RHK8; Q9UQ16; B3KPF2; E5RIK2
Rosso A0A024QZ64 Fruttosio-bifosfato aldolasi C ALDOC 18 14 7 A0A024QZ64; P09972; B7Z1Y2; B7Z3K9; B7Z1N6; B7Z3K7; A8MVZ9; J3KSV6; J3QKP5; B7Z1L5; C9J8F3; K7EKH5; J3QKK1; B7Z1H6
Rosso O75489 Proteina ferro-zolfo di NADH deidrogenasi [ubichinone] 3, mitocondriale NDUFS3 12 12 12 O75489; Q9UF24; Q53FM7; E9PS48; E9PKL8; G3V194
Rosso P21912 Succinato deidrogenasi [ubichinone] ferro-zolfo subunità mitocondriale SDHB 11 11 11 P21912; A0A087WXX8; A0A087WWT1
Rosso A0A024R1Y7 GH3 dominio contenenti proteine LGP1; GHDC 7 7 7 A0A024R1Y7; Q8N2G8; B3KVB0; K7ESN3; K7EJT7; K7EQ41; K7EL54
Rosso E5KRK5 NADH-ubiquinone ossidoreduttasi 75 kDa subunità mitocondriale NDUFS1 29 29 29 E5KRK5; P28331; B4DJ81; Q9P1A0; C9JPQ5; F8WDL5
Rosso A0A024QZ30 Succinato deidrogenasi [ubichinone] flavoproteina subunità mitocondriale SDHA 17 17 17 A0A024QZ30; P31040; D6RFM5; B3KT34; A0A087X1I3; Q0QF12; B4DYN5; B3KYA5; B4DNB2; H0Y8X1; B7Z6J5
Rosso A0A024R2F9 Proteina del transmembrane 43 TMEM43 16 16 16 A0A024R2F9; Q9BTV4; Q8TEP9; V9GY05
Rosso A0A024R5K3 Proteina ferro-zolfo di NADH deidrogenasi [ubichinone] 8, mitocondriale NDUFS8 5 5 5 A0A024R5K3; E9PPW7; O00217; E9PN51; F8W9K7; E9PKH6; B4DYI3; Q53G17
Rosso O76003 Glutaredossina-3 GLRX3 13 13 13 O76003
Rosso Q1HBJ4 Chinasi di proteina mitogene-attivata; Chinasi di proteina mitogene-attivata 1 MAPK1 26 26 21 Q1HBJ4; P28482; B4DHN0; Q499G7; K7ELV1; K7EN18; B4E104; P31152; Q16659
Rosso Q13151 Ribonucleoproteina nucleare eterogenea A0 HNRNPA0 8 8 8 Q13151
Rosso V9HWN7 Fruttosio-bifosfato aldolasi A FRANCESCO 36 36 14 V9HWN7; P04075; J3KPS3; H3BQN4; H3BUH7; H3BR04; H3BMQ8; H3BU78; H3BR68; A4UCS9; A4UCT0
Rosso B4DVJ0 Glucosio-6-fosfato isomerasi GPI 32 32 23 B4DVJ0; P06744; B4DE36; A0A0A0MTS2; K7EQ48; K7EP41; K7EPY4; K7ELR7; K7ERC6; K7ENA0; K7ESF4; K7EIL4; K7ERK8; Q59F85
Rosso V9HWB9 L-lattato deidrogenasi; L-lattato deidrogenasi A catena LDHA 36 36 34 V9HWB9; P00338; B4DJI1; F5GXY2; F5GYU2; F5GXH2; F5H5J4; F5H6W8; F5GZQ4; F5H8H6; F5GXC7; F5GWW2; F5GXU1; A0A087WUM2; Q96L19; Q6ZMR3
Rosso P13674 4-idrossilasi di prolyl subunita ' alfa-1 P4HA1 26 26 26 P13674; Q5VSQ6
Rosso Q6FHV6 Gamma-enolasi; Enolasi ENO2 18 15 14 Q6FHV6; P09104; A8K3B0; F5H0C8; F5H1C3; U3KQP4; U3KQQ1; Q9NPL4
Rosso Q99798 Aconitato idratasi, mitocondriale ACO2 40 40 40 Q99798; B4DZ08; B2RBW5; A2A274; B4DJW1; B4DLY4; Q71UF1; B4DEC3; B4DW08; O75944
Rosso P17858 Tipo 6-fosfofruttochinasi, fegato ATP-dipendente PFKL 32 29 28 P17858; Q7L2M7; Q9BSP4; B3KNQ7; B4E108; Q59GI2; F8WEU2; Q7Z3R9; Q6MZK4
Rosso A0A024R872 Niban-come proteina 1 FAM129B 32 32 32 A0A024R872; Q96TA1; Q9H8K1; Q2YD88; Q9H6L6
Rosso A0A024RC61 Aminopeptidasi N ANPEP 58 58 25 A0A024RC61; P15144; Q59E93; B4DV63; B4DP01; B4DP96; H0YKT6; H0YLZ8; Q71E46; H0YMC1; Q8IVL7
Rosso V9HWF4 Deficit di fosfoglicerato chinasi; Deficit di fosfoglicerato chinasi 1 PGK1 41 41 35 V9HWF4; P00558; B4E1H9; B4DHM5; B4DHB3; B4DWQ3; Q16444
Rosso Q12882 Diidropirimidina deidrogenasi [NADP(+)] DPYD 44 44 44 Q12882; B4DML1
Rosso B4DEQ0 Electron transfer flavoproteina-ossidoriduttasi dell'ubiquinone, mitocondriale ETFDH 9 9 9 B4DEQ0; Q547S8; A7UNU5; Q16134; D6RAD5
Rosso D9UAX9 L'antigene MHC di classe I HLA-B 13 3 2 D9UAX9
Rosso V9HWK1 Trioso fosfato isomerasi TPI1 29 29 17 V9HWK1; P60174; Q53HE2; B4DUI5; U3KPZ0; U3KQF3; U3KPS5
Rosso Q96HE7 Alfa ERO1-come proteina ERO1L 28 28 28 Q96HE7; G3V3E6; G3V5B3; G3V2H0; G3V503; Q5TAE8; B2RD00; Q86YB8
Rosso P14868 Aspartato - ligasi tRNA citoplasmatica DARS 29 29 2 P14868; Q53T60; Q53R85; H7BZ35; H7C278
Rosso P36871 Fosfoglucomutasi-1 PGM1 24 24 5 P36871; B4DFP1; Q9H1D2

Tabella 1: Elenco delle proteine sovra-espresse per macrofagi umani comuni a ogni polarizzazione sotto tensione dell'ossigeno basso.

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Discussion

Perché la proteomica è un potente strumento per studiare l'espressione di proteine differenti da una cellula intera o compartimenti subcellulari, ottimizzazione del protocollo lisi cellulare e digestione delle proteine è stati affrontati da una serie di studi. Ci sono tre classi principali di metodi, che includono la digestione in-gel (digestione delle proteine nella matrice del gel di poliacrilammide)17, digestione in soluzione18 e filtro-aided campione preparazione19. Quest'ultimo metodo, inizialmente descritto come universale, è stato segnalato a mostrare scarsa riproducibilità e possibile perdita delle proteine sul filtro20. Digestione in-gel è un metodo affidabile che può essere che richiede tempo e svantaggioso in quanto valutare l'efficienza della digestione non è facile, se possibile. Digestione in soluzione offre questa possibilità, ma richiede la pulizia dei campioni dopo digestione e IEF. Quando questi due metodi sono confrontati fra lo stesso campione, digestione in soluzione con protocollo di frazionamento IEF produce un numero maggiore di proteine identificate (con lo stesso numero di frazioni) di digestione21in gel.

Nonostante questo vantaggio, è necessario considerare la degradazione delle proteine possibili durante la lisi nella soluzione a causa di proteasi intracellulare (soprattutto nelle cellule mieloidi). È anche importante tenere a mente che queste tecniche sono basate sulla digestione di proteine e solo in grado di analizzare le proteine che presentano tripsina siti di taglio specifico. È possibile utilizzare un approccio di proteomica top-down che allevia questo vincolo di digestione ma aggiunge punti di analisi di dati e bioinformatica ressources22. La solubilizzazione delle proteine da vari compartimenti cellulari può anche essere difficile da ottenere, specialmente da membrane plasmatiche, portando a un campionamento incontrollato del proteoma cellulare. Al fine di procedere ad un'analisi di uno spettrometro di massa di nano-LC-MS/MS dei campioni, è importante ottenere una quantità sufficiente di peptidi, che può dipendere lo spettrometro di massa utilizzato (di solito, a partire della proteina totale dovrebbe essere almeno 1 µ g per una condizione, e è implicito per aumentare questa quantità in base al numero di frazione utilizzata con IEF). Questo vincolo può essere uno svantaggio se la popolazione delle cellule in fase di studio è scarsa, che differenzia proteomica da tecniche genomiche in cui è possibile l'amplificazione della materia prima.

Anche dopo le opere seminali di Richer e colleghi23 e Packer e Fuehr24, l'importanza di ossigeno nelle colture cellulari è stato sufficientemente riconosciuto. Ora sappiamo che la coltura delle cellule sotto bassi livelli di ossigeno favorisce adesione, durata della vita e la divisione. È riconosciuto che questo è della massima importanza in cellula formativa ricerca25. Il problema tecnico principale per colture cellulari in condizioni controllate di ossigeno è relativo al mantenimento della concentrazione ossigeno desiderata durante l'intero esperimento. Questo richiede di pre-incubazione di tutti i mezzi per impedire il rilascio di ossigeno disciolto e utilizzare hypoxic stazioni di lavoro per consentire la manipolazione di cellule sotto ossigeno basso (elaborazione camera con vano portaoggetti) e prevenire transitoria esposizione a condizioni di ossigeno ad alta .

Il protocollo descritto è stato utilizzato per ottenere le firme molecolari di varie polarizzazioni dei macrofagi monocito-derivati umani e studiare gli effetti di modulazione di ossigeno su queste firme. Questo studio ha dato conoscenza sulla descrizione di tali polarizzazioni e ha rivelato alcune conseguenze funzionali. Ad esempio, abbiamo trovato che molte proteine coinvolte nel fagosoma sono stati modulati da un ambiente a basso tenore di ossigeno. Questo approccio proteomico, basato sul protocollo descritto, presenta l'opportunità di esplorare come macrofago funzioni di modifica dei parametri ambientali e di come questi segnali possono essere utilizzati per la progettazione di nuovi approcci terapeutici14.

L'approccio proteomico descritto in questo lavoro è complementare alla genomici approcci che sono stati utilizzati negli ultimi anni nel campo degli studi di polarizzazione del macrofago umano. Proteomica offerta il vantaggio di quantificazione della proteina, che può presentare un'espressione diversa rispetto a loro mRNA corrispondenti a causa di modificazioni post-traduzionali e portano alla scoperta di nuovi biomarcatori. Nonostante questo vantaggio, proteomica dati sono solitamente difficili da interpretare, in parte dovuto l'alta sensibilità di spettrometria di massa, portando a spettri MS molto complessi e rilevamento del falso positivo di peptidi. Recentemente, software di analisi ha guadagnato l'efficienza al fine di evitare questo. Anche se è una situazione che cambia, proteomica anche affronta bassa riproducibilità oltre genomica26 ed è associato con passaggi di convalida utilizzando altre tecniche (citometria a flusso, immunoblotting) per confermare le modifiche quantitative della proteina livelli di espressione.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

AM è finanziato dal programma Leader di gruppo di giovani (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC Fondation pour la recherche sur le Cancer. Ringraziamo Mariette Matondo dalla spettrometria di massa per la piattaforma di biologia (UTECHS MSBIO, Istituto Pasteur, Parigi). Ringraziamo Lauren Anderson per la sua lettura del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

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References

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Biochimica numero 143 macrofago polarizzazione proteoma LC MS/MS ipossia frazionamento gel off
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Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

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