Summary

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Published: January 07, 2019
doi:

Summary

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Abstract

Os macrófagos são células do sistema imune inatas envolvido com uma série de funções fisiológicas, variando das respostas de patógenos infecciosos a homeostase do tecido. As várias funções dessas células estão relacionadas aos seus Estados de ativação, que é também chamado de polarização. A descrição molecular precisa destas várias polarizações é uma prioridade no campo da biologia do macrófago. Atualmente é reconhecido que uma abordagem multidimensional é necessária para descrever como a polarização é controlada por sinais ambientais. Neste relatório, descrevemos um protocolo projetado para obter a assinatura de proteomic de várias polarizações em macrófagos humanos. Este protocolo é baseado em uma rótulo livre quantificação da expressão da proteína de macrófago obtido de fracionada em gel e conteúdo de lise celular Lys C/tripsina-digerido. Nós também fornecemos um protocolo baseado na solução de digestão e isoeléctrico focando fracionamento para usar como uma alternativa. Porque a concentração de oxigênio é um parâmetro ambiental relevante nos tecidos, usamos este protocolo para explorar a composição atmosférica como ou um ambiente de baixo oxigênio afeta a classificação de polarização de macrófagos.

Introduction

Os macrófagos são células do sistema imune inatas envolvido com uma série de funções fisiológicas, variando das respostas de patógenos infecciosos a homeostase do tecido, incluindo a remoção de pilhas apoptotic e remodelação da matriz extracelular1. Estas células são caracterizadas por uma forte plasticidade fenotípica2 , que se traduz em um muitos Estados possíveis de ativação, que também são chamados de polarizações. A descrição molecular precisa destas várias polarizações é uma prioridade no campo do macrófago biologia3. Foi proposto para classificar estas polarizações usando a chamados dicotomia M1/M2, em que M1 representa pro-inflamatórios e M2 representa macrófagos anti-inflamatórios. Este modelo se encaixa bem em diversas situações patológicas, como infecções agudas, alergia e obesidade4. No entanto, em tecidos cronicamente inflamados e câncer, foi demonstrado que esta classificação é incapaz de compreender o amplo repertório fenotípico que macrófagos presentes em certos ambientes celulares5,6, 7. o consenso atual é que polarização macrófago é melhor descrita usando um modelo multidimensional para integrar sinais específicos microenvironmental8. Esta conclusão foi confirmada através da análise de transcriptomic de macrófagos humanos, mostrando que o modelo M1/M2 é ineficiente em descrever as polarizações obtidos9.

O estudo apresentado tem como objetivo proporcionar um protocolo para obter assinaturas de proteomic de várias polarizações em macrófagos humanos. Descrevemos como diferenciar os macrófagos humanos em ambientes de vários níveis de oxigênio e obter peptídeos o proteome macrófago toda para realizar uma rótulo livre de quantificação. Esta quantificação permite a comparação dos níveis de expressão de várias proteínas. Como pesquisas sobre células-tronco tem revelado a importância de oxigênio como um parâmetro chave ambiental10, procuramos entender como esse parâmetro de tecido pode influenciar a polarização do macrófago em seres humanos. A pressão parcial de oxigênio foi encontrada para o intervalo de 3 a 20% (de pressão atmosférica total) no corpo humano, onde 20% corresponde mais ou menos o que é comumente usado em uma incubadora de cultura celular (o valor exato é de cerca de 18,6%, tendo a presença de água em conta).

Trabalhos anteriores tem mostrado que alveolar diferem dos macrófagos intersticiais de funcionais e morfológico ponto de vistas11 e que essas diferenças são provavelmente parcialmente devido aos níveis de oxigênio diferentes a que estão expostos12. Além disso, os macrófagos da medula óssea-derivado mostram uma habilidade aumentada para phagocytize bactérias quando expostos a um ambiente de oxigênio baixo12. O efeito oposto foi encontrado por macrófagos humanos diferenciadas THP113, mas estes resultados suportam a ideia de que o oxigênio é um regulador da biologia do macrófago e que é necessário clarificar este papel a nível molecular em macrófagos humanos. Em um estudo anterior, nós aplicamos uma abordagem proteômica para solucionar esses problemas. Medindo os níveis de expressão de milhares de proteínas simultaneamente, nós destacou o impacto do oxigênio na polarização e forneceu uma lista de novos marcadores moleculares. Também fomos capazes de relacionar esses achados para algumas funções de macrófagos. Em particular, nós encontramos que a taxa de fagocitose das células apoptóticas foi aumentada em macrófagos IL4/IL13-polarizada, que estava relacionado com o upregulation de ALOX15, como revelado pela análise proteômica14. No presente estudo, descrevemos como executar tal análise.

Protocol

Amostras de sangue humano (LRSC) de doadores saudáveis, elimina identificados foram obtidas de EFS (serviço nacional de sangue da francesa) como parte de um protocolo autorizado (DC CODECOH-2018 – 3114). Os doadores deram consentimento assinado para o uso de sangue. 1. mídia e preparação de Buffer Prepare o suporte de macrófagos [glutamax RPMI + 10 mM HEPES + 1 x não aminoácidos essenciais (timina)] e aquecê-lo a 37 ° C. Preparar o macrófago médio + 10% de sor…

Representative Results

A partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) obtidas através da centrifugação diferencial, o protocolo permite a obtenção de uma população de CD14+ monócitos com uma pureza avaliou mais de 98% por citometria de fluxo (Figura 1). Estes monócitos secundariamente são diferenciados em direção a várias polarizações (Figura 2). Quando um fracionamento em gel é escolhido, a migração em gel…

Discussion

Porque proteomics é uma poderosa ferramenta para estudar a expressão de diferentes proteínas de uma célula inteira ou compartimentos subcelulares, otimização do protocolo de lise celular e digestão de proteínas tem sido abordadas por um número de estudos. Existem três classes principais de métodos, que incluem em-gel digestão (digestão de proteínas em gel de poliacrilamida matriz)17, digestão em solução18 e de preparação de amostra auxiliado por filtro<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AM é financiado pelo programa de líder do grupo de jovens (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), por la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC da Fondation pour la recherche sur le Cancer. Agradecemos a Mariette Matondo partir a espectrometria de massa para a plataforma de biologia (UTECHS MSBIO, Instituto Pasteur, Paris). Agradecemos a Lauren Anderson para a leitura do manuscrito.

Materials

Hypoxia Working Station Oxford Optronix Hypoxylab
C6 Flow cytometer BD Accuri C6
Urea Agilent Technologies 5188-6435
Formic acid (FA) ARISTAR 450122M
R-250 Coomassie blue Biorad 1,610,436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) Calbiochem 437627
2D clean-up kit GE Healthcare 80-6484-51
RPMI 1640 medium, glutamax supplement Gibco 61870044
HEPES 1 M Gibco 15630-080
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X Gibco 11140-035
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Gibco 14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column Harvard Apparatus 74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Invitrogen AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12% Life Technologies SAS NP0321 BOX
CD14 Microbeads human Miltenyi Biotec 130-050-201
MACS separation column LS Miltenyi Biotec 130-042-401
Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) Miltenyi Biotec 130-096-485
Interleukin 4 (IL4) Miltenyi Biotec 130-093-917
Interleukin 13 (IL13) Miltenyi Biotec 130-112-410
Interferon gamma (INFγ) Miltenyi Biotec 130-096-482
CD14-FITC (clone TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701
MACSmix Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753
Trifluoroacetic Acid (TFA) Pierce 28904
Trypsin/Lys-C Mix PROMEGA V5073
Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail Roche 11836170001
Density Gradient Solution (Histopaque 1077) Sigma Aldrich 10771-100ML
Accumax Sigma Aldrich A7089-100ML
Human Serum from human male AB plasma (SAB) Sigma Aldrich H4522-100ML
Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% Sigma Aldrich A9576-50ML
Trisma-base Sigma Aldrich T1503
Glycerol Sigma Aldrich 49767
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Bromophenol blue Sigma Aldrich 114405
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% Sigma Aldrich 5030
Ammonium bicarbonate Sigma Aldrich 9830
Acetonitrile Sigma Aldrich 34888
Dithiothreitol Sigma Aldrich 43819
Iodoacetamide Sigma Aldrich 57670
Thiourea Sigma Aldrich T8656
CHAPS Sigma Aldrich C9426
Micro BCA Assay Kit ThermoFisher 23235
5 mL sterile plastic pipette VWR 612-1685
Thermomixer C Eppendorf VWR 460-0223
Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg Waters WAT036820

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Cite This Article
Court, M., Malier, M., Millet, A. Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment. J. Vis. Exp. (143), e58727, doi:10.3791/58727 (2019).

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