Proteomiska analys av mänskliga makrofag polarisering Under en låg syrehalt miljö
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att hämta proteomiska signaturer av mänskliga makrofager och tillämpa detta att fastställandet av verkningarna av en låg syrehalt miljö på makrofag polarisering.
Abstract
Makrofager är innate immuna celler involverade i ett antal fysiologiska funktioner alltifrån Svaren till smittsamma patogener till vävnad homeostas. De olika funktionerna i dessa celler är relaterade till deras aktivering stater, som också kallas polarisering. Den exakta molekylära beskrivningen av dessa olika polarizations är en prioritering i fältet av makrofag biologi. Det erkänns för närvarande att en flerdimensionell strategi är nödvändigt att beskriva hur polarisering styrs av Miljösignaler. I den här rapporten beskriver vi ett protokoll som syftar till att erhålla proteomiska undertecknandet av olika polarizations i mänskliga makrofager. Detta protokoll baseras på en etikett-fri kvantifiering av makrofag proteinuttryck framställs i-gel fractionated och Lys C/trypsin-rötas Lys innehåll. Vi ger också ett protokoll baserat på i-lösning matsmältningen och isoelektrisk fokusering fraktionering att använda som ett alternativ. Eftersom syrehalten är en relevanta miljömässiga parameter i vävnader, vi använder detta protokoll för att utforska hur atmosfärens sammansättning eller en låg syrehalt miljö påverkar klassificeringen av makrofag polarisering.
Introduction
Makrofager är innate immuna celler involverade i ett antal fysiologiska funktioner alltifrån Svaren till smittsamma patogener till vävnad homeostas, inklusive borttagning av apoptotiska celler och ombyggnationer av extracellulär matrix1. Dessa celler kännetecknas av en stark fenotypisk plasticitet2 som översätter till en många möjliga aktiveringen stater, som också kallas polarisationer. Den exakta molekylära beskrivningen av dessa olika polarizations är en prioritering i fältet av makrofag biologi3. Det har föreslagits att klassificera dessa polarizations som använder så kallade M1/M2 dikotomin, där M1 representerar proinflammatoriska och M2 representerar antiinflammatoriska makrofager. Denna modell passar bra i olika patologiska situationer som akuta infektioner, allergi och fetma4. Dock i kroniskt inflammerade vävnader och cancer, har det visats att denna klassificering är oförmögna att förstå den bred fenotypiska repertoar som makrofager presenterar i vissa cellulära miljöer5,6, 7. den nuvarande uppfattningen är att makrofag polarisering bättre beskrivs med en flerdimensionell modell för att integrera specifika microenvironmental signaler8. Denna slutsats har bekräftats genom transcriptomic analys av mänskliga makrofager visar att modellen M1/M2 är ineffektiva i att beskriva den erhållna polarizations9.
Studien presenteras syftar till att ge ett protokoll för att hämta proteomiska signaturer av olika polarizations i mänskliga makrofager. Vi beskriver hur att skilja mänskliga makrofager i miljöer av olika syrenivåer och erhålla peptider från det hela makrofag proteomet att utföra en etikett-fri kvantifiering. Denna kvantifiering tillåter jämförelse av uttrycksnivåerna för olika proteiner. Som forskning på stamceller har visat betydelsen av syre som en miljö viktig parameter10, försöker vi förstå hur denna vävnad parameter kan påverka makrofag polarisering i människor. Partialtrycket för syre har hittats till utbud från 3 till 20% (av totalt atmosfärstryck) i den mänskliga kroppen, där 20% motsvarar ungefär vad används ofta i en cell kultur inkubator (det exakta värdet är cirka 18,6% samtidigt som förekomsten av vatten i beräkningen).
Tidigare arbete har visat att alveolära skiljer sig från interstitiell makrofager från funktionella och morfologisk synpunkt visningar11 och att dessa skillnader är förmodligen delvis på grund av olika syrehalten som de är exponerade12. Benmärg-derived makrofager visar dessutom en ökad förmåga att fagocytera bakterier när de utsätts för en låg syrehalt miljö12. Motsatt effekt har hittats för THP1-differentierade mänskliga makrofager13, men dessa resultat stöder idén att syre är en regulator av makrofag biologi och att det är nödvändigt att klargöra denna roll på molekylär nivå i mänskliga makrofager. I en tidigare studie, har vi tillämpat en proteomik strategi för att hantera dessa frågor. Genom att mäta uttrycksnivåerna för tusentals proteiner samtidigt, vi belyst effekten av syre på polarisering och en lista över nya molekylära markörer. Vi var också kunna relatera dessa fynd till vissa makrofager funktioner. Vi hittade noterbart att graden av fagocytos av apoptotiska celler höjdes i IL4/IL13-polariserade makrofager, som var kopplad till uppreglering av ALOX15 som framkommit vid proteomiska analys14. I föreliggande studie beskriver vi hur du utför en sådan analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom proteomik är ett kraftfullt verktyg att studera uttrycket av olika proteiner från en hel cell eller subcellulär fack, har optimering av protokollet cell lysis och nedbrytning av proteiner tagits upp av ett antal studier. Det finns tre klasser av metoder, bland annat i-gel matsmältningen (matsmältningen av proteiner i polyakrylamid gelmatrisen)17, matsmältningen i lösning18 och filter-aided prov förberedelse19. Denna sista metod, för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AM finansieras av programmet ung grupp ledare (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), av la Ligue Nationale contre le Cancer och la Fondation ARC pour la recherche sur le Cancer. Vi tackar Mariette Matondo från den Mass Spectrometry för biologi plattform (UTECHS MSBIO, Pasteurinstitutet, Paris). Vi tackar Lauren Anderson för hennes läsning av manuskriptet.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
References
- Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J. Macrophage Polarization. Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).
- Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation. Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- Xue, J., et al. Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation. Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).
- Csete, M. Oxygen in the cultivation of stem cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).
- Johansson, A., et al. Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).
- Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).
- Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line. PLoS One. 8 (1), e54926 (2013).
- Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).
- Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
- Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Court, M., et al. Toward a standardized urine proteome analysis methodology. Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
- Liebler, D. C., Ham, A. -. J. L. Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics. Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).
- Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis. Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells. Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
- Lengner, C. J., et al. Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations. Cell. 141 (5), 872-883 (2010).
- Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology. Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).
