Summary
I denne protokollen beskriver vi fullstendig arbeidsflyten for rask isolering av ekstracellulære blemmer fra menneskelig fullblod og karakterisering av spesifikke indikatorer fluorescens-baserte hydrogenion sporing analysen. Presentert resultatene viser høy reproduserbarhet og kan justeres til celle kultur supernatants.
Abstract
Ekstracellulære blemmer (EVs), inkludert exosomes, er spesialisert membranous nano-størrelse blemmer i kroppsvæsker som utgis constitutively fra mange celletyper og spille en avgjørende rolle i å regulere celle-celle kommunikasjon og en rekke biologiske prosesser. Mange ulike metoder for karakterisering av EVs nattestid. Men har de fleste av disse metodene ulempen at utarbeidelse og karakterisering av prøvene er svært tidkrevende, eller det er ekstremt vanskelig å analysere bestemte indikatorer rundt sin lille størrelse og mangel på diskret bestander. Mens metoder for analyse av EVs har vært betydelig forbedret det siste tiåret, finnes det fortsatt ingen standardisert metode for kategorisering av enkelt EVs. Her viser vi en semi-automatisert metode for kategorisering av enkelt EVs fluorescens-baserte hydrogenion sporing analysen. Protokollen som presenteres løser vanlige problemet med mange forskere i dette feltet og gir fullstendig arbeidsflyten for rask isolering av EVs og karakterisering med PKH67, et generelt cellemembranen linker, samt bestemte overflate markører slik som CD63, CD9, vimentin og lysosomale-assosiert membran protein 1 (lampe-1). Presentert resultatene viser høy reproduserbarhet, som bekreftes av andre metoder, som vestlige blotting. I de utført eksperimentene, vi brukt utelukkende EVs isolert fra koagulasjon, men denne metoden er også egnet for plasma- eller andre kroppsvæsker, og kan justeres for karakteristikk av EVs fra celle kultur supernatants. Uavhengig av fremtidige utviklingen av forskning på EV biologi gir protokollen som presenteres her en rask og pålitelig metode for rask karakterisering av enkelt EVs med spesifikke indikatorer.
Introduction
Ekstracellulære blemmer (EVs), inkludert exosomes, er spesialisert membranous nano-størrelse blemmer (20-150 nm) som inneholder bestemte kombinasjoner av lipider, vedheft og intercellulære signalnettverk molekyler, samt andre cytosolic funksjonskomponenter som microRNA (miRNA) og mRNA og spille en avgjørende rolle i å regulere celle-celle kommunikasjon1,2. EVs utgis i miljøet fra mange forskjellige celletyper, f.eks endotelceller, immun celler og kreftceller, og kan påvises i kroppsvæsker som serum sæd, urin, morsmelk, spytt eller Cerebrospinalvæske3, 4. økende antall studier høydepunkt mangfoldig bidrag av EVs som potensielle biomarkers for tidlig diagnostisering av flere sykdommer og/eller prediksjon sykdom progresjon5,6. Exosomes er ofte beskrevet av tilstedeværelsen av molekyler som de er spesielt forbundet med, uavhengig av hvilken celle som de utlede fra7. For eksempel exosomes inneholder ulike tetraspanins (CD9, CD63, CD81), store histocompatibility kompleks klassen jeg (MHC jeg) molekyler, ulike transmembrane proteiner, typisk cytosolic proteiner (tubulin og utgangen), molekyler involvert i multivesicular kroppen ( MVB) biogenesis (TSG101 og alix), varme sjokk proteiner (HSP 70 og HSP 90) og proteiner som deltar i signal signaltransduksjon (protein kinaser)8.
Mange ulike metoder har blitt beskrevet for karakterisering av EVs9. Vanligste og utbredt metodene som brukes for EV analyse er flyt cytometri10, skanning elektronmikroskop (SEM) og overføring elektronmikroskop (TEM)11. Den best etablerte og brukte metoden for biokjemiske karakterisering av EV innhold er Western blotting12,13. SEM og TEM tillater påvisning av EVs over hele størrelsen spekteret, er svært begrenset identifikasjon av spesifikke overflaten proteiner en særlig ulempe av disse metodene. I kontrast, flowcytometri er et kraftig verktøy for identifikasjon av bestemte EV overflate markører, men terskelen til denne metoden begrenser analyse for å EVs størrelse mer enn 500 nm. Dermed er analyse av isolerte EVs med påvisning av bestemte overflate markører ikke tilgjengelig via en av disse tre veletablerte metodene. Vi beskrev tidligere en annen høylig følsom metode for visualisering og analyse av EVs, hydrogenion sporing analyse (NTA)14. Kort, denne metoden kombinerer to forskjellige fysiske prinsipper. Først punktdiagram partikler lys når de er bestrålt med en laserstråle, og det andre prinsippet, kjent som Brownsk bevegelse, innebærer at spredningen av ulike partikler i en flytende suspensjon er omvendt proporsjonal med størrelsen. Halvautomatisk desktop hydrogenion analyse instrumentet for flytende prøver består av partikkel sporing analyzer med en software-basert analyse, der digitale bilder av spredte lys fra enkelt partikler registreres. Partikler og bevegelse av partikler oppdages av laser spredning mikroskop med et videokamera. Laserstrålen er orientert vertikalt, mens den optiske aksen er vannrett og fokusert i cellen kanalen fylt med prøven. Dataene fra tomter spredte lyse flekker og deres fart bevegelse aktiverer fastsettelse av totale partikkel antall og størrelse distribusjon. Etter bestråling av laser, partikler spre lyset, som er registrert av en digital video kameraet via mikroskop14. Fremme våre tidligere metoden er innsetting av en 500 nm lang bølge-pass (LWP) cut-off filter mellom laser (bølgelengden til 488 nm) og celle kanalen, som muliggjør direkte analyse av fluorescens-merket partikler (figur 1). Våre protokollen løser vanlige etterspørselen av mange forskere i dette feltet for rask karakteristikk av enkelt EVs, f.eks etter deres foreldre opprinnelse. I denne protokollen beskriver vi fullstendig arbeidsflyten for rask isolering av EVs fra menneskelig fullblod og rask karakterisering av spesifikke indikatorer fluorescens-baserte nanopartikler sporing analysen. EVs kan oppdages av flekker med PKH67, et generelt cellemembranen linker, og bestemte exosomal markører, f.eks CD63, CD9 og vimentin. Våre protokollen er også egnet for EDTA og citrerte plasma, samt andre kroppsvæsker og celle kultur supernatants.
Protocol
Institusjonelle etiske styrets University Düsseldorf har godkjent eksperimenter i dette arbeidet (referansenummeret: 3381).
1. EV isolasjon fra menneskelig fullblod
- Isolere EVs exosome nedbør løsning.
- Samle 2 mL av menneskelig fullblod i serum-skille rør (SST) via venipuncture og ruge røret i 15 min ved romtemperatur (RT) til koagulering er ferdig.
- Sentrifuge SST 1700 x g i 10 min på RT skille celler fra serum og overføre 1 mL av serum slik 1,5 mL reaksjon. Sentrifuge blodplater-rich plasma (PRP) 3000 x g i 15 min på 4 ° C å fjerne blodplater og overføre 100 μL blodplater-fattige plasma (PPP) til en ny 1,5 mL reaksjon tube.
- Legg til 25 µL exosome nedbør løsning (4 deler PPP, 1 del exosome nedbør løsning) og vortex grundig. Inkuber utvalget for 30 min på is. Holde røret oppreist og ikke rotere eller blande røret under inkubasjonstiden.
- Sentrifuge prøven 1500 x g i 30 min på 4 ° C pellets EVs. Etter sentrifugering vises EVs som beige eller hvit pellets nederst på fartøyet. Sug opp nedbryting og sentrifuge prøven 1500 x g i 5 min på 4 ° C.
- Fjerne alle spor av væske og å avbryte pellet 100 µL fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) av ofte pipettering opp og ned. Lagre EV suspensjon ved-80 ° C når analyse ikke utføres umiddelbart.
Merk: Når isolere EVs fra plasma, fibrinogen og fibrin kan hindre effektiv utvinning og rørets er tyngre og tar mer tid.
- Isolere EVs med ultracentrifugation.
- Ta pre-avkjølt rotoren (TLA-55 fast-vinklet) fra kjøleskap og avkjøles ultracentrifuge før bruk.
- Overføre 1,25 mL av PPP (forberedt i trinn 1.1) til en egnet 1,5 mL ultracentrifugation tube med cap og sentrifuge prøven 110.000 x g i 90 minutter på 4 ° C. Kontroller at rotoren belastningen er balansert før du starter.
- Dekanter nedbryting og sted rør opp-ned på et papirhåndkle for 2 min. å avbryte pellet 500 μL PBS og sentrifuge prøven 110.000 x g i 90 minutter på 4 ° C.
- Sug opp nedbryting og å avbryte pellet 50 μL av PBS.
Merk: Bruk bare rotorer og utformet for ultracentrifuge som er i bruk. Pretest rør i rotoren med vann fordi styrken på rørene kan variere mye.
2. flekk av prøvene
- Flekken prøver med PKH67.
- Forberede flekker løsningen ved å legge til 1 μL PKH67 ethanolic fargestoff løsningen 50 μL av fortynningsmiddel C (inkludert i pakken) i en 1,5 mL reaksjon rør og bland godt.
- Overføre 10 μL flekker løsningen til 20 μL EV suspensjon (forberedt i trinn 1.1) til reaksjon røret, bland godt og ruge i 5 min på RT i mørket.
- Fortynne 50 μL av farget EV suspensjon med 2,5 mL destillert vann i en 15 mL reaksjon tube, bland godt og bruke denne siste suspensjon for partikkel måling.
Merk: Det er avgjørende å bruke vann som fortynner for EV suspensjon, fordi andre løsningsmidler (f.eks PBS) kan svekke målingen. Når bruker lagret EV-oppheng, tine prøvene på is og bland godt før farging.
- Flekken prøver med spesifikke antistoffer.
- Fortynne 10-20 μL EV suspensjon (forberedt i trinn 1.1) med 50 μL destillert vann i en 1,5 mL reaksjon rør og bland godt.
- Tilsett 2.5-5 μL av spesifikke antistoffer (tabell 1) reaksjon røret, bland godt og ruge i 30 min på RT i mørket.
- Overføre 50 μL av farget EV suspensjon til 2,5-10 mL destillert vann (tabell 1) i en 15 mL reaksjon tube, bland godt og bruke denne siste suspensjon for partikkel måling.
Merk: I noen tilfeller, konsentrasjonen av brukte antistoffer må være justert (tabell 1).
3. behandling av prøvene
Merk: Grunnleggende av denne metoden var grundig beskrevet tidligere og under den protokoll fokuserer på fremgangsmåten nødvendig for analyse av fluorescens-merket EVs14.
- Utføre det oppstart fremgangsmåten.
- Presse fluorescens filteret i den optiske banen av mikroskopet og kameraet. Start programmet og følger instruksjonene på skjermen for automatisert implementering.
- Velg riktig celle nummeret (Z158_C1149_Fluor) i kategorien "Celle sjekk" (celledefinisjon) for fluorescens måling. Velg referanse posisjon for optikk sørge for at laser og mikroskopet er i et felles fokus (laser og mikroskopet flytte til denne posisjonen automatisk).
- Tøm celle kanalen med en sprøyte fylt med 10 mL destillert vann. Kontroller at målet cellen er fri for luftbobler og injisere ikke luftbobler i systemet.
- Forberede en kalibrering suspensjon som inneholder uniform 200 nm størrelse fluorescens-merket polystyren partikler som har carboxylate grupper på overflaten deres. Fortynne 10 μL partikler med 990 μL destillert vann. Deretter fortynne 10 μL partikkel løsningen i en 15 mL tube med 10 mL destillert vann å oppnå nødvendig konsentrasjon.
- Injisere 2,5 mL av utvannet partikkel løsningen i cellen kanalen og klikk "Optimalisere fokus" justere kameraet.
- Måle prøven.
- Tøm celle kanalen flere ganger med en sprøyte fylt med 10 mL destillert vann før hver eksempel måling. Injisere farget EV suspensjon (forberedt i trinn 2) i celle kanalen.
- Juster følgende hovedkameraet parametere i kategorien "Celle sjekk" i programvaren som trengs (tabell 2). Bruk referanse posisjonen eller plassere 0.41193 for å justere parametere.
- For følsomhet, finne den optimale følsomhet ved å klikke på knappen "Antall partikler vs følsomhet" vise en kurve målt partikler per skjermen for ulike følsomhet.
Merk: - Nedleggelse, justere tiden som kameraet tillater lyset passerer for et bestemt intervall.
- Etter oppkjøp parametere, Velg en minimum lysstyrke på 20, en minimum størrelse 20 nm og en maksimal størrelse på 500 nm for måling.
- For følsomhet, finne den optimale følsomhet ved å klikke på knappen "Antall partikler vs følsomhet" vise en kurve målt partikler per skjermen for ulike følsomhet.
- Merk antall oppdaget partikler telles i synsfeltet fra skjermen. Baren spredning må være grønn til oransje område (50-300 partikler). Hvis baren spredning er rød, scatter vil sikringen personlige partikler og de telles som en enkelt partikkel, dermed fører til falske resultater. I slike tilfeller videre fortynne prøven for å unngå overlapping av partikler eller redusere følsomheten.
- Klikk på "Sjekk partikkel drift på 0 V" i kategorien "Celle sjekk" før du starter målingen. Hvis drift er høyere enn 5 μm/s, vente til prøven stopper opp for å fortsette målingen.
Merk: Hvis drift er for høy i begynnelsen av måling, gjentatte målinger kan variere og sophisticate resultatene. På grunn av de underliggende prinsippene for NTA, kan en relevant drift ha innvirkning på bestemt partikkelstørrelse, utregnet med programvaren. - Klikk på "Kjør Video erverv" i kategorien "Measurement" Velg antall eksperimenter (3-5) og tidsforsinkelsen mellom dem (0 min).
- Definere antall (personlige subvolume-) stillinger (11) og antall () målesykluser (10) på hver måling posisjon, der partikler bør analyseres
- Velg en mappe, oppretter et nytt navn, og klikk "OK" for å starte målingen.
4. tolkning av resultatene
- Vis resultater og parametere i kategorien "Analyse" etter måling. Sjekk følgende parametere etter analyse før rengjøring celle kanalen: gjennomsnittlig antall partikler per stilling, antall sporede partikler og partikkel konsentrasjon, distribusjon bredden på partikler (x10, x50 og x90 verdier), verdien av middelverdi og standardavvik. Gjenta måling av prøven hvis nødvendig.
Merk: Resultatene lagres også som en PDF- eller txt-fil. - Klikk på "Analyse" kategorien for visning av diagrammet beregnes etter målingen, som viser fordelingen av oppdaget partikler av størrelse. Klikk på "Vis" i kategorien "Analyse" og bruk ikonene for å justere og endre graph for spesielle krav.
5. validering via EV gjenkjenning av vestlige Blotting
- Oppløse EV pellet (forberedt i trinn 1) RIPA lyse og utvinning buffer, Pipetter grundig og ruge på is 30 min. sentrifuge prøven 8000 x g for 10 min på 4 ° C for å avklare den lysate og overføre nedbryting slik ny.
- Mål totalt protein av en Lowry protein analysen. Fortynne 1 μL isolert EV suspensjon med 49 μL RIPA bufferen og bruke 5 μL i triplicates for analyse. Fortynne EV suspensjon med 2 x Laemmli lasting buffer til en siste konsentrasjon av 2 µg/μL og varme i 10 minutter til 95 ° C.
- Laste 20 μg protein per brønn. Separate og overføre proteiner ved polyakrylamid gel gelelektroforese og tanken blotting ifølge standardprotokoller.
- Blokkere membranen (0,2 μm polyvinylidene difluoride) med bovin melkepulver (5%) 1t på RT og Inkuber membranen med spesifikke primære antistoffer (CD9, CD63 og vimentin) overnatting på 4 ° C.
Merk: Primære antistoffer brukes på en 1:1,000 fortynning. - Vask membranen med TBST 3 x 5 min og Inkuber membranen med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert sekundære antistoff (1:20, 000 i TBST) for 60 min på RT.
- Vask membranen med TBST 3 x 5 min og oppdage proteiner ved chemiluminescence med en høy følsomhet substratløsningen på et tenkelig system.
Merk: Fordi CD63 antigen er mye ulik glycosylated, Molekylvekten kan variere og band kan vises mellom 40-65 kDa.
Representative Results
EVs ble isolert fra fullblod og preget av hydrogenion sporing analyse med fluorescing reagenser. Optimal følsomheten for måling av unstained kvinne partikler ble identifisert å rekkevidde på 70% under våre eksperimenter. Fluorescerende perlene justering og kalibrering av målingen viste en optimal innstilling på en følsomheten til 85% (figur 2A). Mellom en følsomhet på 70% og 90%, oppdaget partikler økt raskt, mens ytterligere øker følsomheten kan føre til en forverring av størrelsesDistribusjon partikkel der partikler er å slippe. Innstillingene for kameraet vises et skarpt bilde (figur 2B) og gjentatte målinger viste lav standardavvik (figur 2C). Så langt, ble protokollen for prosessering prøver av EVs justert slik at alle mål kunne utføres med samme innstillinger (tabell 2). Distribusjon bredden defineres av tre verdier på x-aksen, x10, x50 og x90. X50, eller median partikkelstørrelse er diameteren hvor halvparten av befolkningen ligger under denne verdien. Tilsvarende angir x10 og x90 diameter som 10% og 90% av oppdaget partiklene er under de rapporterte størrelsen. Flekker med PKH67 celle koblingsfunksjonalitet kit, inkludert et fluorescerende celle linker som inkorporerer en grønn fluorescerende farge med lang alifatisk haler i lipid regioner i cellemembranen, vist en sterk sammenheng mellom følsomhet og antall partikler målt (figur 3A). PKH67 brukes ofte for spredning overvåking, men har også vist seg nyttig for overvåking exosome eller liposome opptaket så vel som i vivo celle menneskehandel. På grunn av ikke-spesifikk merkingen av PKH67, kan en rekke EVs merkes og oppdaget. Fordelingen av partikler var mellom 266 nm (x10) og 1946 nm (x90) med en topp maksimum ved 857 nm (x50) og med en lav standard avvik mellom målinger (28,1 nm). LAMPE-1, også kjent som lysosome-assosiert membran glykoprotein 1 og CD107a bor hovedsakelig over lysosomale membraner. Etter farging med en Alexa Fluor 488 merket spesifikt antistoff mot lampe-1, distribusjon av partikler varierer fra 220 nm (x10) til 1145 nm (x90) med en topp maksimum ved 541 nm (x50) og et standardavvik på 11,7 nm (figur 3B). For kategorisering av EVs, vi brukte Alexa Fluor 488 merket antistoffer mot vanlige exosomal indikatorer og bekreftet våre funn av vestlige blotting. Etter med Alexa Fluor 488-merket CD9-antistoff fordelingen av partikler varierer fra 251 nm (x10) til 1139 nm (x90) med en topp maksimum ved 548 nm og en andre mindre peak på ca 25 nm (figur 4A). Flekker med Alexa Fluor 488 kalt CD63 (figur 4B) og vimentin (figur 4C) ga lignende resultater. Western blotting analyse underbygget vår positivt resultat for antistoffer brukes her. Gjentatte målinger viste reproduserbar resultater for alle antistoffer brukes i denne rapporten. Kontroller farget vi vesicle-fritt vann med respektive antistoffer (figur 5A), hvor PKH67 og LAMP1 antistoffer nesten oppdaget ingen EV til en følsomhet nær 100%. Vi bruker eksemplet med vimentin, økte høy følsomhet antallet nye gjenstander, selv når prøven er i hovedsak gratis partikler. Hvis målingen startes når drift er ennå for høy (> 5 µm/s), personlige repetisjoner tydelig avviker seg (figur 5B) imellom. Som representert med tre forskjellige antistoffer, er det avgjørende at drift er så lav som mulig før måling. Vår erfaring med fluorescein isothiocyanate (FITC) som fluorochrome resulterer i målinger som ikke er nøyaktig og reproduserbar fordi FITC er utsatt for rask bilde bleking (figur 5C). Derfor anbefaler vi bruker utelukkende Alexa Fluor 488 merket antistoffer for EV karakterisering. I denne protokollen, var EVs isolert av en polymer-baserte exosome nedbør løsning som inneholder polyetylenglykol. For å sikre at våre resultater ikke er falsifisert av metoden anvendt isolasjon, preget vi EVs etter isolasjon med ultracentrifugation. Som representert med PKH67 og to forskjellige antistoffer (CD63 og lampe-1), er resultatene av våre anvendt isolasjon med exosome nedbør løsning (figur 6A) sammenlignbare med EVs isolert via ultracentrifugation (figur 6B ). Dessverre, på grunn av dårlig avkastningen av EVs etter ultracentrifugation, det første settet av serum isolering må være tydelig høyere sammenlignet isolasjon med exosome nedbør løsning.
Figur 1: skjematisk oppsett av hydrogenion sporing analyse. Mikroskopet/video akse og laser strålen er orientert ortogonalt til hverandre, krysset på cellen kanalen tverrsnitt. Filtere fluorescens plasseres mellom cellen kanalen og mikroskopet. Lys spredt av partikler vises i vinduet "live-view" av programvaren. Etter oppkjøpet vises resultatene som et størrelse distribusjon kurve koordinatsystem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kalibrering med fluorescens merket perler. (A) antall partikler vs følsomhet kurven viser partikler i en posisjon på et tidspunkt i tide under en automatisk følsomhet skanning. (B) visualisering av partikler på skjermbildet bo utsikt. (C) partikkel størrelse fordeling etter gjentatte målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant resultater etter farging med PKH67 og lampe-1. Antall partikler vs følsomhet kurve (1), visualisering av partikler på bo utsikt skjermen (2) og partikkel størrelsesDistribusjon (3) etter farging med PKH67 (A) og lampe-1 (B). En lignende størrelsesDistribusjon av partikler er observert, mens endringer i følsomheten innstillingen føre til en lignende men ennå ikke helt identiske oppdaget partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultater etter farging med Alexa Fluor 488 merket CD9, CD63 og vimentin. Antall partikler vs følsomhet kurve (1), visualisering av partikler på bo utsikt skjermen (2), partikkel størrelsesDistribusjon (3) og representative vestlige blots av to forskjellige EV suspensjoner (4) for CD9 (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, B), og vimentin (54 kDa, C). Sen forekomsten av partikkel signaler langs økende følsomheten (x-aksen) samsvarer med lavere signal intensitet i vestlige blot analyse, bekrefter den lavere summen av respektive partikkel overflaten markøren (f.eks vimentin g. CD63). Merk den nesten identisk kurver av representant mål for alle analysert merkene indikerer høy reproduserbarhet (3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant resultater for brukte kontrollene og mulige feilkilder. (A) Vesicle-fritt vann farget med PKH67 (1), lampe-1 (2) og vimentin (3) som kontroller. (B) representant partikkel størrelse distribusjoner etter farging med lampe-1 (1), CD63 (2) og CD9 (3), og målinger utført når suspensjon drift er ennå for høy. (C) antall partikler vs følsomhet kurve (1) og partikkel størrelsesDistribusjon (2) etter farging med FITC-merket CD63 antistoff. En klar bleking effekt er observert etter hver måling resulterer i gradvis lavere partikkel tall. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: sammenligning av ulike isolasjon EVs. Partikkel størrelsesDistribusjon av EVs isolert med exosome nedbør løsning (A) og ultracentrifugation (B) etter farging med PKH67 (1), lampe-1 (2) og CD63 (3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| LAMPE-1 | CD9 | CD63 | Vimentin | |
| Antistoff (µL) | 5 | 2.5-5 | 2.5-5 | 5 |
| EV suspensjon (µL) | 10 | 20 | 10 | 10 |
| H2O (µL) til farging | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Siste volum (mL) | 5-10 | 2.5-5 | 5 | 10 |
Tabell 1: Liste over brukte antistoffer og fortynning rekke eksempler.
| Oppkjøpet parametere | |
| Følsomhet (%) | 85 |
| Lukkeren | 70 |
| Min. lysstyrke | 20 |
| Max. Størrelse (nm) | 500 |
| Min. størrelse (nm) | 20 |
| Polaritet | Negativ |
| Spenning | Av |
| Partikkel drift på 0 V (µm/s) | < 5 |
| Posisjoner | 11 |
| Sykluser | 10 |
| Masseanskaffelser | 3-5 |
| Tidsforsinkelsen (min) | 0 |
Tabell 2: Oppkjøp parametere for hydrogenion sporing analyse.
Discussion
Vi viser en detaljert protokoll for isolering av EVs fra fullblod og rask karakterisering av bestemte overflate markører med fluorescens-baserte nanopartikler sporing analyse. I de utført eksperimentene, vi brukt utelukkende EVs isolert fra serumprøver, men denne metoden er også egnet for ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) og citrerte plasma og kan også utvides til andre kroppsvæsker som urin, morsmelk, spytt, Cerebrospinalvæske og sæd. Dessuten, denne protokollen kan justeres for karakteristikk av EVs fra celle kultur supernatants. I denne protokollen, EV suspensjon ble generert fra 100 μL serum ved bruk av en exosome nedbør reagens, som inneholder en proprietær polymer som forsiktig precipitates exosomes og EVs i henhold til en corpuscular størrelse fra 30 nm til 200 nm, der 10-20 μL på Evens ble utnevnt for karakteristikk av hver overflate indikator. Dessverre er isolasjon trinnet uunngåelig, fordi den høye mengden protein i serumprøver (f.eks albumin og globulin) griper antistoffer flekker prosedyre og resulterer i høy bakgrunn og sofistikert funn. Videre må basert på biologiske tilgjengeligheten av exosomes i prøvene, mengden av næringsdrivende EV suspensjon samt fortynning før behandling justeres for andre kildemateriale. Sammenligne flere eksempler, en standardisert metode for fortynning av prøver, samt konsekvent oppkjøpet parametere (følsomhet, nedleggelse, etc.) er nødvendig. Et annet viktig poeng er at målingene ikke er startet før drift er lav (i våre hender, < 5 μm/s). Hvis drift var for høyt, gjentatte målinger av prøven gitt høy standardavvik seg imellom, men med en lav drift, resultatdataene var svært konsekvent og bekreftet høy reproduserbarhet. Det er viktig at valgte antistoffer har en riktig fluorochrome. Antistoffer må være likt med Alexa Fluor 488, fordi FITC har en høy grad av foto-bleking. Muligens vil mer stabil fluophores helt sikkert føre til økt analysen stabilitet i fremtiden. Vanligvis bruke mange forskere PBS som en fortynner for EVs. For denne protokollen er det avgjørende å bruke destillert vann som en fortynner for EV suspensjoner. Når EVs er merket med fluorescing fargestoffer, høye osmolality og konsentrasjon av andre løsningsmidler, som PBS, kan forstyrre målingen og føre til forandret resultatet.
Mens metoder for analyse av EVs har vært betydelig forbedret det siste tiåret, er det fortsatt ingen standardisert metode for isolering og karakterisering av EVs. Den store ulempen av flowcytometri, der EVs er ofte bundet til perler å gi en større overflate, er at mange EVs dock på overflaten for å gi en sterk og detectable signal10. SEM og TEM har ulempen at utarbeidelse av prøvene er tidkrevende og EVs kan bare være preget av sin størrelse og morfologi11. Opp til dags dato den best etablerte og brukte metoden for kvalitativ (dvs. biokjemiske) er EV karakteristikk Western blotting, der proteiner kan analyseres med spesifikke antistoffer12,13. Men ligger ulempene av alle disse metodene i manglende evne til å analysere enkelt EVs for bestemte overflate markører. Videre innebære den lange behandlingstider og lang vask/isolering prosedyrer brukes av mange av dagens protokoller arbeidskrevende trinn, noe som gjør dem uegnet for høy utvalg ytelse og karakterisering av enkelt EVs. Våre protokollen gir en komplett arbeidsflyt for rask isolering og karakterisering av enkelt EVs bestemt overflate markører som CD63, CD9, vimentin og CD107a, og kan utvides for et bredt spekter av andre overflate markører å fastslå opprinnelsen til utgitt EVs. På grunn av et permanent tekniske fremskritt NTA enheten bekreftet vi våre funn i samarbeid med produsenten med den nyeste analyzer. Uavhengig av fremtidige utviklingen av forskning på EV biologi, spesielt om exosomes, vil protokollen som presenteres her gi en rask og pålitelig metode for kategorisering av enkelt EVs med spesifikke indikatorer. Samling av EVs under isolasjon og flekker prosedyren er så langt uunngåelig, bør fremtidig forskning fokusere på å utvikle metoder for å hindre EV aggregering og aktiverer en nøyaktig størrelse bestemmelse av fluorescerende-merket EVs.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker partikkel Metrix GmbH for delvis dekker publikasjonen kostnadene for dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
