Summary
I denne protokol beskriver vi fuldstændig arbejdsgangen for hurtige isolering af ekstracellulære vesikler fra humant fuldblod og karakterisering af specifikke markører af fluorescens-baserede nanopartikel-tracking analyse. De præsenterede resultater viser en høj grad af reproducerbarhed og kan justeres til celle kultur analysere.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EVs), herunder exosomes, er specialiserede hindeagtige nano-størrelse vesikler fundet i kropsvæsker, der frigives constitutively fra mange celletyper og spille en central rolle i reguleringen af celle-celle kommunikation og en bred vifte af biologiske processer. Mange forskellige metoder til karakterisering af evt er blevet beskrevet. Men de fleste af disse metoder har den ulempe, at forberedelse og karakterisering af prøverne er meget tidskrævende, eller det er yderst vanskeligt at analysere specifikke markører af interesse på grund af deres lille størrelse og på grund af manglende diskrete populationer. Mens metoder til analyse af evt er blevet betydeligt forbedret i det seneste årti, er der stadig ingen standardiseret metode til karakterisering af enkelt EVs. Her viser vi en halvautomatisk metode til karakterisering af enkelt evt af fluorescens-baserede nanopartikel-tracking analyse. Den protokol, der er præsenteret omhandler den fælles problem for mange forskere på dette område og giver den komplette workflow for hurtig isolation af evt- og karakterisering med PKH67, en generel cellemembranen linker, samt specifikke celleoverflademarkører sådanne som CD63, CD9, vimentin og lysosomale-associerede membranen protein 1 (lampe-1). Præsenteres resultaterne viser en høj grad af reproducerbarhed, som bekræftet af andre metoder, såsom Western blotting. I de gennemførte eksperimenter, vi anvendes udelukkende evt isoleret fra menneskelige serumprøver, men denne metode er også velegnet til plasma eller andre kropsvæsker og kan justeres til karakterisering af evt fra celle kultur analysere. Uanset den fremtidige udvikling af forskning på EV biologi giver den protokol, der er præsenteret her en hurtig og pålidelig metode til hurtig karakterisering af enkelt evt med specifikke markører.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EVs), herunder exosomes, er specialiserede hindeagtige nano-størrelse vesikler (20-150 nm) indeholdende visse kombinationer af lipider, vedhæftning og intercellulære signaling molekyler samt andre funktionelle cytosole komponenter som mikroRNA (miRNA) og mRNA og spille en central rolle i reguleringen af celle-celle kommunikation1,2. Evt er udgivet i deres miljø fra mange forskellige celletyper, f.eks endotelceller, immun celler og tumorceller, og kan påvises i kropsvæsker som serum sæd, urin, brystmælk, spyt eller cerebrospinalvæske3, 4. stigende antal undersøgelser fremhæve evt forskelligartede bidrag som potentielle biomarkører for tidlig diagnosticering af flere sygdomme og/eller forudsigelse af sygdom progression5,6. Exosomes er ofte beskrevet af tilstedeværelsen af molekyler, som de er specielt forbundet med, uanset hvilken celletype de hidrører fra7. For eksempel, exosomes indeholder forskellige tetraspanins (CD9, CD63, CD81), major histocompatibility komplekse klasse jeg (MHC jeg) molekyler, forskellige transmembrane proteiner, typisk cytosole proteiner (tubulin og aktin), molekyler involveret i () multivesicular krop MVB) Biogenese (TSG101 og alix), heat shock proteiner (HSP 70 og HSP 90), og proteiner, der deltager i signal transduktion (protein kinaser)8.
Mange forskellige metoder er blevet beskrevet for karakterisering af evt-9. De mest almindelige og udbredte metoder anvendes til EV analyse er flow flowcytometri10, scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmissions Elektron Mikroskopi (TEM)11. Den best-established og almindeligt anvendte metode til biokemiske karakterisering af EV indhold er Western blotting12,13. Mens SEM og TEM giver mulighed for påvisning af evt på tværs af hele størrelse spektrum, er meget begrænset identificering af specifikke overflade proteiner en særlig ulempe ved disse metoder. Derimod flowcytometri er et kraftfuldt værktøj til identifikation af specifikke EV overflade markører, men tærsklen til denne metode begrænser analysen til evt med en størrelse større end 500 nm. Derfor, analyse af isolerede evt med påvisning af specifik overflade markører er i øjeblikket ikke tilgængelig via enhver af disse tre veletablerede metoder. Vi har tidligere beskrevet en anden yderst følsom metode for visualisering og analyse af evt, nanopartikel-tracking analyse (NTA)14. Kort, denne metode kombinerer to forskellige fysiske principper. Først, partikler scatter lys, når de er bestråles med en laserstråle, og det andet princip, kaldet Brownske bevægelser, indebærer, at udbredelsen af forskellige partikler i en flydende suspension er omvendt proportional med deres størrelse. Semi-automatiske desktop nanopartikel analyse instrument for flydende prøver består af partiklen tracking analyzer med et software-baseret analyse, hvor digitale billeder af spredt lys fra én partikler registreres. Partiklerne og bevægelse af partikler er opdaget af en laser spredning mikroskop med et videokamera. Laserstrålen er orienteret vertikalt, mens den optiske akse er vandret og fokuseret ind i cellen kanal fyldt med prøven. Oplysningerne fra parceller af spredt lys steder og deres hastighed af motion aktiverer bestemmelse af total partikel antal og størrelse distribution. Efter bestråling af laser, partiklerne scatter lys, som er registreret af en digital video kamera via mikroskop14. Avancement til vores tidligere metode er indsættelsen af en 500 nm lang bølge-pass (LWP) cut-off filter mellem laser (bølgelængde på 488 nm) og celle-kanal, som gør det muligt for den direkte analyse af fluorescens-mærket partikler (figur 1). Vores protokol adresser mange forskere i feltet fælles efterspørger en hurtig karakterisering af enkelt evt, fx efter deres forældres oprindelse. I denne protokol beskriver vi fuldstændig arbejdsgangen for hurtige isolering af evt fra humant fuldblod og hurtig karakterisering af specifikke markører af fluorescens-baserede nanopartikler-tracking analyse. Evt kan påvises ved farvning med PKH67, en generel cellemembranen linker, samt særlige exosomal markører, fx CD63, CD9, og vimentin. Vores protokol er også velegnet til EDTA og værdier plasma, samt andre kropsvæsker og celle kultur analysere.
Protocol
Den institutionelle etiske nævn Universitet Düsseldorf har godkendt de eksperimenter, der præsenteres i dette arbejde (referencenummer: 3381).
1. EV Isolation fra humant fuldblod
- Isolere evt med exosome nedbør løsning.
- Indsamle 2 mL af humant fuldblod i serum-adskillelse rør (SST) via venepunktur og inkuberes tube i 15 min. ved stuetemperatur (RT) indtil koagulation er færdig.
- Der centrifugeres SST på 1.700 x g i 10 min. på RT for at adskille celler fra serum og overføres 1 mL serum til en 1,5 mL reaktion tube. Der centrifugeres trombocyt-rich plasma (PRP) ved 3.000 x g i 15 min. ved 4 ° C til at fjerne blodplader og 100 μL af trombocyt-fattige plasma (PPP) overføres til en ny 1,5 mL reaktion tube.
- Tilsæt 25 µL af exosome nedbør løsning (4 dele PPP, 1 del exosome nedbør løsning) og vortex grundigt. Inkuber prøve for 30 min på is. Holde røret oprejst og ikke rotere eller blande røret under inkubationstiden.
- Der centrifugeres prøve ved 1.500 x g i 30 min. ved 4 ° C at sammenpresse evt. Efter centrifugering vises den europæiske volontørtjeneste som en beige eller hvid pellet i bunden af skibet. Opsug supernatanten og centrifugeres prøve på 1.500 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Fjerne alle spor af væske og genopslæmmes pellet i 100 µL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved ofte pipettering op og ned. Gemme EV suspension ved-80 ° C, når analysen ikke udføres umiddelbart.
Bemærk: Når isolere evt fra plasma, fibrinogen og fibrin kan hindre effektiv inddrivelse og resuspension er tungere og tager længere tid.
- Isolere evt med ultracentrifugering.
- Tage pre afkølede rotoren (TLA-55 fast-vinklet) fra køleskabet og cool ned ultracentrifuge før brug.
- Overføre 1,25 mL af PPP (udarbejdet i trin 1.1) til en egnet 1,5 mL ultracentrifugering tube med hætte og centrifugeres prøve på 110.000 x g i 90 min. ved 4 ° C. Sørg for, at rotoren belastning er afbalanceret før du starter.
- Den dekanteres og sted tube hovedet på et stykke køkkenrulle for 2 min. genopslæmmes pellet i 500 μL af PBS og centrifugeres prøve på 110.000 x g i 90 min. ved 4 ° C.
- Opsug supernatanten og genopslæmmes pellet i 50 μL af PBS.
Bemærk: Brug kun rotorer og tilbehør designet til den ultracentrifuge, der er i brug. Pretest rør i rotoren ved hjælp af vand, fordi styrken af rørene kan variere mellem masser.
2. farvning af prøver
- Pletten prøver med PKH67.
- Forbered Farvningsopløsningen ved at tilføje 1 μL PKH67 ethanoliske farvestof løsning til 50 μL af fortyndingsmiddel C (medfølger i sættet) i en 1,5 mL reaktion tube og bland grundigt.
- Overføre 10 μL Farvningsopløsningen til 20 μL af EV suspension (udarbejdet i trin 1.1) til reaktion tube, blandes grundigt, og der inkuberes i 5 min på RT i mørke.
- Fortyndet 50 μL af bejdset EV suspension med 2,5 mL destilleret vand i en 15 mL reaktion tube, blandes grundigt, og bruge denne endelige suspension for partikel måling.
Bemærk: Det er afgørende at bruge vand som fortyndingsmiddel EV suspension, fordi andre fortyndingsmidler (fx PBS) kan påvirke målingen. Når ved hjælp af oplagret EV-suspension, tø prøver på is og bland grundigt før farvning.
- Pletten prøver med specifikke antistoffer.
- Fortyndet 10-20 μL EV suspension (udarbejdet i trin 1.1) med 50 μL af destilleret vand i en 1,5 mL reaktion tube og bland grundigt.
- Tilføje 2,5-5 μl af det specifikke antistof (tabel 1) til reaktion tube, blandes grundigt, og Inkuber i 30 min. ved RT i mørke.
- Overføre 50 μL af bejdset EV suspension til 2,5-10 mL destilleret vand (tabel 1) i en 15 mL reaktion tube, blandes grundigt, og bruge denne endelige suspension for partikel måling.
Bemærk: Under visse omstændigheder, skal koncentrationen af den anvendte antistof justeret (tabel 1).
3. behandling af prøverne
Bemærk: Var de grundlæggende elementer i denne metode udførligt beskrevet tidligere og under protokollen fokuserer, på de specifikke skridt nødvendige for analyse af fluorescens-mærket evt-14.
- Udføre startprocedure.
- Skub filteret fluorescens i den optiske bane af mikroskop og kamera. Start programmet og følg vejledningen på skærmen for automatiseret implementering.
- Vælg den rigtige celle nummer (Z158_C1149_Fluor) i "Celle Check" fanen (celle definition) til fluorescens målingen. Vælg reference placering for Optik til at sikre, at laser og mikroskop er i et fælles fokus (laser og mikroskop Flyt til denne placering automatisk).
- Skyl den celle kanal med en sprøjte fyldt med 10 mL destilleret vand. Sikre, at cellen måling er fri for luftbobler og ikke injicere luftbobler i systemet.
- Forberede en kalibrering suspension, der indeholder ensartede 200 nm størrelse fluorescens-mærket polystyren partikler, der har carboxylat grupper på deres overflade. Fortyndet 10 μL af partikler med 990 μL destilleret vand. Derefter fortyndes 10 μL af denne partikel løsning i en 15 mL tube med 10 mL destilleret vand til at opnå den nødvendige koncentration.
- Injicere 2,5 mL af fortyndede partikel i celle-kanal og klik "Optimere fokus" til at justere kameraet.
- Måle prøven.
- Skyl den celle kanal flere gange med en sprøjte fyldt med 10 mL destilleret vand før hver prøve måling. Tilføre den celle kanal farves EV suspension (udarbejdet i trin 2).
- Justere parametrene følgende hovedkameraet i "Celle Check" fanen i softwaren som nødvendige (tabel 2). Brug positionen reference eller placere 0.41193 for at justere parametrene.
- For følsomhed, finde den optimale følsomhed ved at klikke på knappen "Antallet af partikler vs følsomhed" til at vise en kurve af målte partikler pr. skærm for forskellig følsomhed niveauer.
Bemærk: - Lukkeren, justere tidsrum at kameraet tillader lys at passere for et bestemt interval.
- For efter købet parametre, Vælg et minimum lysstyrke på 20, en mindstestørrelse på 20 nm, og en maksimal størrelse på 500 nm for måling.
- For følsomhed, finde den optimale følsomhed ved at klikke på knappen "Antallet af partikler vs følsomhed" til at vise en kurve af målte partikler pr. skærm for forskellig følsomhed niveauer.
- Bemærk antallet af fundne partikler tælles i synsfelt fra displayet. Baren spredning skal være i grøn til orange område (50-300 partikler). Hvis værktøjslinjen spredning er rød, scatter vil sammensmelte enkelte partikler og de tælles som en enkelt partikel, hvilket fører til forkerte resultater. I så fald yderligere fortyndes prøven for at undgå overlapning af partikler eller sænke følsomheden.
- Klik på "Check partikel drift på 0 V" i fanen "Celle Check" før du begynder målingen. Hvis drivgarn er højere end 5 μm/s, vente, indtil prøven stopper flyder for at fortsætte målingen.
Bemærk: Hvis drivgarn er for høj i begyndelsen af målingen, kan de gentagne målinger varierer og sofistikeret resultaterne. På grund af de underliggende principper i NTA, kan en relevant drift indvirke i beslutsomme partikelstørrelse, som beregnet af softwaren. - Klik på "Kør Video erhvervelse" i "Måling" tab. Vælg antallet af eksperimenter (3-5) og tidsforsinkelse mellem dem (0 min).
- Define antallet af (individuelle subvolume-) positioner (11) og antallet (måling) cyklusser (10) ved hver måling position, hvor partikler skal analyseres
- Vælg en mappe, oprette et nyt filnavn, og klik på "OK" for at starte målingen.
4. fortolkning af resultaterne
- Se resultater og parametre under fanen "Analyse" efter måling. Kontroller følgende parametre efter analyse før rengøring celle kanal: gennemsnitligt antal partikler per stilling, samlede antal røbestof partikler og partikel koncentration, distribution bredden af partikler (x10, x50 og x90 værdier), værdi af middelværdi og standardafvigelse. Gentag målingen af prøven, hvis det kræves.
Bemærk: Resultaterne er også gemt som en PDF- eller .txt-fil. - Klik på "Analyser" for at se grafen beregnet efter den måling, der viser fordelingen af de fundne partikler af størrelse. Klik på "Skærm" i fanen "Analyse" og bruge ikonerne til at justere og ændre indstillingerne grafen for særlige krav.
5. validering via EV påvisning af Western Blotting
- Opløse EV pellet (udarbejdet i trin 1) i RIPA lysis og udvinding buffer, afpipetteres grundigt og inkuberes i isbad i 30 min. Centrifuge prøve på 8.000 x g i 10 min. ved 4 ° C for at klarlægge de lysate og overføre supernatanten til en ny tube.
- Måle den samlede protein af en Lowry protein assay kit. Fortyndes 1 μL af isolerede EV suspension med 49 μL af RIPA buffer og bruge 5 μl i tre analyse. Fortynd EV suspension med 2 x Laemmli loading bufferen til en slutkoncentration på 2 µg/μL og varme i 10 min. ved 95 ° C.
- Belastning 20 μg af protein pr. brønd. Adskille og overføre proteinerne af polyacrylamid gelelektroforese og tank blotting ifølge standardprotokoller.
- Blokere membran (0,2 μm polyvinylidene xenondifluorid) med bovin mælkepulver (5%) i 1 time på RT og inkuberes membran med specifikke primære antistoffer (CD9, CD63 og vimentin) natten over ved 4 ° C.
Bemærk: De primære antistoffer bruges ved 1:1,000. - Vaske membran med TBST 3 x 5 min og inkuberes membran med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof (1:20, 000 i TBST) for 60 min. ved RT.
- Vaske membran med TBST 3 x 5 min og opdage proteinerne ved chemiluminescence med en høj følsomhed substratopløsning på et billedbehandlingssystem.
Bemærk: Fordi CD63 antigen er omfattende og trinløst glykosyleret, Molekylær vægt kan variere, og bands kan vises mellem 40-65 kDa.
Representative Results
Evt var isoleret fra fuldblod og karakteriseret ved nanopartikel tracking analyse med fluorescerende reagenser. Optimal følsomhed for måling af unstained partikler blev identificeret til rækkevidde på 70% under vores eksperimenter. Fluorescerende perler bruges til justering og kalibrering af måling viste en optimal indstilling på en følsomhed på 85% (figur 2A). Mellem en følsomhed på 70% og 90%, antallet af fundne partikler steget hurtigt, mens yderligere øge følsomheden kan føre til en forringelse af partikelstørrelsesfordeling hvor antallet af partikler er igen slippe. Indstillingerne for kameraet vises et skarpt billede (figur 2B) og gentagne målinger viste lav standardafvigelsen (figur 2 c). For så vidt, blev protokollen til behandling af prøver af evt justeret så der alle målinger kan foretages med de samme indstillinger (tabel 2). Distribution bredde er defineret tre værdier på x-aksen, x10, x50 og x90. X50 eller medianen partikelstørrelse er diameteren på som halvdelen af befolkningen ligger under denne værdi. Ligeledes, x10 og x90 angiver diameteren på som 10% og 90% af de registrerede partikler er under den rapporterede størrelse. Farvning med PKH67 celle linker kit, herunder en fluorescerende celle linker, der indarbejder en grøn fluorescerende farvestof med lange alifatiske hale i lipid regioner i cellemembranen, viste en stærk korrelation mellem følsomhed og antallet af partikler målt (figur 3A). PKH67 bruges ofte til spredning overvågning men har også vist sig nyttig til overvågning af exosome eller Liposom optagelse så godt som i vivo celle handel. På grund af ikke-specifik mærkning af PKH67, kan en lang række evt mærket og registreret. Fordelingen af partiklerne var i et interval mellem 266 nm (x10) og 1946 nm (x90) med et maksimum på 857 peak nm (x50) og med en lav standardafvigelse mellem målingerne (28.1 nm). LAMPE-1, også kendt som lysosomet-associerede membran glykoprotein 1, og CD107a findes primært på tværs af lysosomale membraner. Efter farvning med en Alexa Fluor 488 mærket specifikt antistof mod lampe-1, fordelingen af partiklerne spænder fra 220 nm (x10) til 1145 nm (x90) med et maksimum ved 541 peak nm (x50) og en standardafvigelse på 11,7 nm (figur 3B). Til karakterisering af elbiler, vi brugte Alexa Fluor 488 mærket antistoffer mod fælles exosomal markører og bekræftet vores resultater ved Western blotting. Efter farvning med Alexa Fluor 488-mærket CD9-antistof, fordelingen af partiklerne spænder fra 251 nm (x10) til 1139 nm (x90) med et maksimum på 548 peak nm og en anden mindre peak på ca 25 nm (figur 4A). Farvning med Alexa Fluor 488 mærket CD63 (figur 4B) og vimentin (figur 4 c) givet lignende resultater. Western blotting analyse dokumenteret vores positive resultat for antistoffer bruges her. Gentagne målinger viste reproducerbare resultater for alle antistoffer bruges i denne betænkning. Som kontrol plettet vi vesikel-gratis vand med respektive antistoffer (figur 5A), hvor påvist PKH67 og LAMP1 antistoffer næsten ingen EV op til en sensitivitet tæt på 100%. Bruger eksemplet med vimentin, øget høj følsomhed antallet af nye artefakter, selv når prøven er stort set fri for partikler. Hvis målingen er begyndt, når drivgarn er endnu alt for høj (> 5 µm/s), de enkelte gentagelser udpræget afvige indbyrdes (figur 5B). Repræsenteret med tre forskellige antistoffer, er det afgørende, at drivgarn er så minimal som muligt før du starter målingen. Ifølge vores erfaring, ved hjælp af fluorescein isothiocyanat (FITC) som fluorokrom resulterer i målinger, der ikke er nøjagtige og reproducerbare fordi FITC er udsat for hurtig foto blegning (figur 5 c). Derfor, vi anbefaler at bruge udelukkende Alexa Fluor 488 mærket antistoffer for EV karakterisering. I denne protokol, blev evt isoleret af en polymer-baserede exosome nedbør løsning indeholdende polyethylen glycol. For at sikre, at vores resultater ikke er forfalsket af metoden anvendt isolation, karakteriseret vi evt efter isolation med ultracentrifugering. Repræsenteret med PKH67 og to forskellige antistoffer (CD63 og lampe-1), kan resultaterne af vores anvendt isoleret med exosome nedbør løsning (figur 6A) sammenlignes med evt-isolerede via ultracentrifugering (fig. 6B ). Desværre, på grund af det ringe udbytte evt efter ultracentrifugering, det første sæt af serum for isolation skal være tydeligt højere sammenlignet med isolation med exosome nedbør løsning.
Figur 1: skematisk opsætningen af nanopartikel tracking analyse. Mikroskop/video akse og laser stråle er orienteret vinkelret på hinanden, krydser hinanden i cellen kanal tværsnit. Et fluorescens filter er placeret mellem den celle kanal og mikroskop. Lys spredt af partikler er vises i vinduet "live-view" af softwaren. Efter købet vises resultaterne som en størrelse fordeling curve koordinatsystem. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kalibrering med fluorescens mærket perler. (A) antallet af partikler vs følsomhed kurven viser partikler i en stilling på et tidspunkt i gang under en automatisk følsomhed scanning. (B) visualisering af partikler på skærmbilledet live view. (C) partikel størrelse fordeling efter gentagne målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant resultat efter farvning med PKH67 og lampe-1. Antallet af partikler vs følsomhed kurven (1), visualisering af partikler på live view skærm (2), og partikel størrelse distribution (3) efter farvning med PKH67 (A) og lampe-1 (B). En lignende størrelse fordeling af partikler er observeret, mens ændringer i følsomheden indstilling bly til en lignende men endnu ikke helt identisk ændring af detekterede partikler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentant resultat efter farvning med Alexa Fluor 488 mærket CD9, CD63 og vimentin. Antallet af partikler vs følsomhed kurven (1), visualisering af partikler på live view skærmen (2), partikelstørrelsesfordeling (3) og repræsentative Western blots af to forskellige EV suspensioner (4) for CD9 (24-27 kDa, A), CD63 (26 kDa, B), og vimentin (54 kDa, C). Sen forekomsten af partikel signaler langs den voksende følsomhed (x-aksen) korrelerer med lavere signal intensitet i Western blot analyse, bekræfter de den lavere respektive partikel overflade markør (fx vimentin vs CD63). Bemærk de næsten identiske kurver af repræsentative målinger for alle analyserede markører angiver høj reproducerbarhed (3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentant resultater af anvendte kontrol og mulige fejlkilder. (A) vesikel-gratis vandet farves med PKH67 (1), lampe-1 (2) og vimentin (3) som kontrol. (B) repræsentative partikel størrelse distributioner efter farvning med lampe-1 (1), CD63 (2), og CD9 (3), og målinger skal udføres, når suspension drift er endnu for højt. (C) antal partikler vs følsomhed kurven (1) og partikelstørrelsesfordeling (2) efter farvning med FITC-mærkede CD63 antistof. En klar blegende effekt er observeret efter hver måling, hvilket resulterer i gradvist lavere partikel numre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: sammenligning af forskellige isolation metoder for evt. Partikelstørrelsesfordeling evt isoleret med exosome nedbør løsning (A) og ultracentrifugering (B) efter farvning med PKH67 (1), lampe-1 (2) og CD63 (3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| LAMPE-1 | NDT | CD63 | Vimentin | |
| Antistof (µL) | 5 | 2,5-5 | 2,5-5 | 5 |
| EV suspension (µL) | 10 | 20 | 10 | 10 |
| H2O (µL) til farvning | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Endelige volumen (mL) | 5-10 | 2,5-5 | 5 | 10 |
Tabel 1: Liste over anvendte antistoffer og fortynding vifte af prøver.
| Erhvervelse parametre | |
| Følsomhed (%) | 85 |
| Lukkeren | 70 |
| Min. lysstyrke | 20 |
| Max. Størrelse (nm) | 500 |
| Min. størrelse (nm) | 20 |
| Polaritet | Negative |
| Spænding | Off |
| Partikel drift på 0 V (µm/s) | < 5 |
| Positioner | 11 |
| Cykler | 10 |
| Masseanskaffelser | 3-5 |
| Forsinkelse (min) | 0 |
Tabel 2: Erhvervelse parametre for nanopartikel tracking analyse.
Discussion
Vi demonstrere en detaljeret protokol til isolation af evt fra fuldblod og hurtig karakterisering af specifikke overflade markører med fluorescens-baserede nanopartikler tracking analyse. I de gennemførte eksperimenter, vi anvendes udelukkende evt isoleret fra serumprøver, men denne metode er også velegnet til ethylendiamintetra syre (EDTA) og værdier plasma og kan også udvides til andre kropsvæsker såsom urin, modermælk, spyt, cerebrospinalvæsken, og sæd. Denne protokol kan desuden justeres til karakterisering af evt fra celle kultur analysere. I denne protokol, EV suspension blev genereret fra 100 μL serum ved hjælp af en exosome udfældning reagens, som indeholder en navnebeskyttet polymer, der forsigtigt udfældes exosomes og evt en corpuscular størrelse spænder fra 30 nm til 200 nm, hvorved 10-20 μL evt blev udnævnt til karakterisering af hver overflade markør. Desværre, trinnet isolation er uundgåelig, fordi den store mængde af protein i serumprøver (fx albumin og globulin) forstyrrer antistof farvning procedure og resultater i høj grad af baggrund og sofistikeret resultater. Desuden skal baseret på den biologiske tilgængelighed af exosomes i prøverne, den erhvervsdrivende EV suspension samt fortynding før behandling være justeret for andre udgangsmaterialer. At sammenligne flere prøver, en standardiseret tilgang til fortynding af prøver samt konsekvent erhvervelse parametre (sensitivitet, lukkeren, etc.) er nødvendige. Et andet vigtigt punkt er, at målingerne ikke er startet endnu indtil drivgarn er lav (i vores hænder, < 5 μm/s). Hvis drivgarn var for høj, gentagne målinger af prøven viste høj standardafvigelse indbyrdes, men med en lav drift, de resulterende data var meget konsekvent og bekræftet en høj grad af reproducerbarhed. Det er vigtigt, at de valgte antistoffer har en passende fluorokrom. Antistoffer skal konjugeret med Alexa Fluor 488, fordi FITC har en høj foto-blegning. Eventuelt vil mere stabil fluophores helt sikkert føre til øget assay stabilitet i fremtiden. Normalt, bruger mange forskere PBS som en fortyndingsmiddel for EVs. For denne protokol er det afgørende at bruge destilleret vand som et fortyndingsmiddel for EV suspensioner. Hvornår evt er mærket med fluorescerende farvestoffer, høj osmolalitet og ion koncentration af andre fortyndingsmidler, såsom PBS, kan forstyrre målingen og føre til ændret resultater.
Mens metoder til analyse af evt er blevet betydeligt forbedret i det seneste årti, er der stadig ingen standardiseret metode til isolering og karakterisering af EVs. Den store ulempe ved flowcytometri, hvor evt er ofte bundet til perler til at give en større overflade, er, at mange evt dock overfladen, til at give en stærk og påviselige signal10. SEM og TEM har den ulempe, at forberedelsen af prøver er tidskrævende og evt kan kun adskilles på deres størrelse og morfologi11. Op til dato, den best-established og almindeligt anvendte metode til kvalitativ (dvs. biokemiske) er EV karakterisering Western blotting, hvor proteiner kan analyseres med specifikke antistoffer12,13. Men ulemperne ved alle disse metoder ligge i manglende evne til at analysere enkelt evt for specifikke overflade markører. Desuden omfatte lange sagsbehandlingstider og lange vask/isolation procedurer anvendes af mange af de nuværende protokoller arbejdskrævende trin, hvilket gør dem ikke velegnet til høje prøve overførselshastighed og karakterisering af enkelt EVs. Vores protokol giver en komplet workflow for hurtig isolering og karakterisering af enkelt evt specifikke overflade markører som CD63, CD9, vimentin og CD107a, og kan udvides til et bredt spektrum af andre overflade markører til at fastslå oprindelsen af frigivne EVs. På grund af et permanent tekniske fremskridt af NTA enhed bekræftet vi vores resultater i samarbejde med fabrikanten med den nyeste analyzer. Uanset den fremtidige fremskridt af forskning på EV biologi, særlig hvad angår exosomes, vil den protokol, der er præsenteret her give en hurtig og pålidelig metode til karakterisering af enkelt evt specifikke markører. Fordi sammenlægning af evt under isolation og farvning procedure er hidtil uundgåelig, bør fremtidig forskning fokusere på at udvikle metoder til at forhindre EV sammenlægning og muliggøre en nøjagtig størrelsesbestemmelse af fluorescerende-mærket EVs.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke partikel Metrix GmbH for delvist omkostningsdækning offentliggørelsen af dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Serum-separation tube | BD | 366882 | BD Vacutainer |
| Ampuwa water | Fresenius Kabi | 10060 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Sigma | 56064C | |
| Falcon tube, 15 mL | Greiner Bio One | 188271 | |
| Falcon tube, 50 mL | Greiner Bio One | 227270 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Speciality tubes for ultra centrifugation |
| Tube with Snap-On Cap 1.5 mL | Beckman Coulter | 357448 | |
| Polybeads Microspheres 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 7304 | Alignment Solution |
| Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm | Polysciences, Inc. | 09834-10 | Alignment Solution |
| Syringe, 2 mL | Braun | 4606027V | |
| Syringe, 10 mL | Braun | 4606728V | |
| Exoquick | SBI | EXOQ20A-1 | EV precipitation solution |
| Laemmli Sample Buffer (2x) | BioRad | 1610737 | |
| DC Protein Assay Kit II | BioRad | 5000112 | Lowry prtein assay |
| PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH67GL-1KT | For general membrane labelling |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody | BioLegend | 328609 | Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1) |
| Human CD9-Alexa Fluor 488 | R&D Systems | FAB1880G | |
| Anti-CD9 Antibody | SBI | EXOAB-CD9A-1 | |
| CD63-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | MA5-18149 | |
| FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353005 | |
| CD63. Antibody, polyclonal | SantaCruz | Sc-15363 | |
| Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody | BioLegend | 677809 | |
| Anti-Vimentin Antibody | SBI | EXOAB-VMTN-1 | |
| Goat anti mouse IgG + IgM | Jackson Immuno | 315-035-048 | |
| Goat anti rabbit IgG | Dianova | 111-035-003 | |
| SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | ThermoFisher | 34094 | |
| ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Chemiluminescence Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 |
References
- Ibrahim, A., Marban, E. Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology. Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).
- Su, S. A., et al. Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling. Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).
- Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, 9 (2011).
- Li, M., et al. Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers. Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
- Lin, J., et al. Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis. The Scientific World Journal. 2015, 657086 (2015).
- Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. Exosomes: the future of biomarkers in medicine. Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes. Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments. (95), 50974 (2015).
