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Biochemistry

Nanoparticle-ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ मानव रक्त में एकल Extracellular बुलबुले के तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित लक्षण वर्णन

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58731
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiovascular Surgery, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम मानव पूरे रक्त और प्रतिदीप्ति आधारित nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विशिष्ट मार्कर के लक्षण वर्णन से extracellular बुलबुले के तेजी से अलगाव के लिए पूरा कार्यप्रवाह का वर्णन । प्रस्तुत परिणाम reproducibility के एक उच्च स्तर दिखाने के लिए और कोशिका संस्कृति supernatants के लिए समायोजित किया जा सकता है ।

Abstract

Extracellular बुलबुले (ईवीएस), exosomes सहित, विशेष झिल्लीदार नैनो आकार के शारीरिक तरल पदार्थ है कि कई सेल प्रकार से जारी constitutively है और सेल-सेल संचार और एक विविध रेंज के विनियमन में एक निर्णायक भूमिका निभाते पाया बुलबुले हैं जैविक प्रक्रियाओं । ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए कई विभिंन तरीकों का वर्णन किया गया है । हालांकि, इन तरीकों का सबसे नुकसान है कि तैयारी और नमूनों के लक्षण वर्णन बहुत समय लेने वाली हैं, या यह बहुत ही अपने छोटे आकार के कारण ब्याज की विशिष्ट मार्करों का विश्लेषण और असतत की कमी के कारण मुश्किल है आबादी. जबकि ईवीएस के विश्लेषण के लिए तरीके काफी पिछले दशक में सुधार किया गया है, वहां अभी भी एक EV एस के लक्षण वर्णन के लिए कोई मानकीकृत विधि है। यहां, हम प्रतिदीप्ति-आधारित nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा एकल ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक अर्द्ध स्वचालित विधि का प्रदर्शन । प्रोटोकॉल है कि प्रस्तुत किया जाता है इस क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं के आम समस्या पते और PKH67 के साथ ईवीएस और लक्षण वर्णन के तेजी से अलगाव के लिए पूरा कार्यप्रवाह प्रदान करता है, एक सामांय कोशिका झिल्ली linker, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट सतह मार्करों के साथ ऐसे के रूप में CD63, CD9, vimentin, और lysosomal-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन 1 (दीपक-1) । प्रस्तुत परिणाम reproducibility के एक उच्च स्तर दिखाने के लिए, जैसे पश्चिमी सोख्ता के रूप में अंय तरीकों, द्वारा की पुष्टि की । आयोजित प्रयोगों में, हम विशेष रूप से मानव सीरम नमूनों से पृथक ईवीएस इस्तेमाल किया, लेकिन इस विधि भी प्लाज्मा या अन्य शरीर के तरल पदार्थ के लिए उपयुक्त है और सेल संस्कृति supernatants से ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए समायोजित किया जा सकता है. EV जीवविज्ञान पर अनुसंधान के भविष्य की प्रगति की परवाह किए बिना, प्रोटोकॉल है कि यहां प्रस्तुत किया जाता है विशिष्ट मार्करों के साथ एकल ईवीएस के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है ।

Introduction

Extracellular बुलबुले (ईवीएस), exosomes सहित, विशेष झिल्लीदार नैनो आकार के बुलबुले (20-150 एनएम) लिपिड, आसंजन और सेलुलर संकेत अणुओं, साथ ही अन्य कार्यात्मक cytosolic घटकों के कुछ संयोजनों से युक्त कर रहे हैं जैसे microRNA (miRNA) और mRNA, और सेल-सेल संचार1,2को विनियमित करने में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । ईवीएस कई विभिंन प्रकार के सेल से अपने वातावरण में जारी कर रहे हैं, जैसे, endothelial कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और ट्यूमर कोशिकाओं, और सीरम वीर्य, मूत्र, स्तन के दूध, लार, या मस्तिष्कमेरु द्रव3 के रूप में शरीर के तरल पदार्थ में पाया जा सकता है, 4. अध्ययन की बढ़ती संख्या कई रोगों के जल्दी निदान और रोग की प्रगति5,6की भविष्यवाणी के लिए संभावित उपमार्क्स के रूप में ईवीएस के विविध योगदान पर प्रकाश डाला । Exosomes अक्सर अणुओं की उपस्थिति है कि वे के साथ विशेष रूप से जुड़े रहे है द्वारा वर्णित हैं, सेल प्रकार वे7से प्राप्त की परवाह किए बिना । उदाहरण के लिए, exosomes में विभिन्न tetraspanins (CD9, CD63, CD81), प्रमुख histocompatibility जटिल वर्ग मैं (MHC i) अणु, विभिन्न transmembrane प्रोटीन, विशिष्ट cytosolic प्रोटीन (tubulin और actin), multivesicular शरीर में शामिल अणुओं ( MVB) (TSG101 और alix), हीट शॉक प्रोटीन (HSP ७० और HSP ९०), और प्रोटीन है कि संकेत transduction (प्रोटीन kinases)8में भाग लेते हैं ।

कई विभिंन तरीकों9ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए किया गया है । EV विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम और प्रचलित तरीके10cytometry, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)11हैं । EV सामग्री के जैव रासायनिक लक्षण वर्णन के लिए सबसे स्थापित और सामांयतः प्रयुक्त विधि पश्चिमी सोख्ता12,13है । जबकि SEM और उनि पूरे आकार स्पेक्ट्रम भर में ईवीएस का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं, विशिष्ट सतह प्रोटीन की बहुत ही सीमित पहचान इन तरीकों का एक विशेष नुकसान है । इसके विपरीत, प्रवाह cytometry विशिष्ट EV सतह मार्करों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, लेकिन इस विधि की दहलीज विश्लेषण ५०० एनएम से अधिक आकार के साथ ईवीएस करने के लिए सीमा । इसलिए, विशिष्ट सतह मार्करों का पता लगाने के साथ पृथक ईवीएस का विश्लेषण वर्तमान में इन तीन अच्छी तरह से स्थापित तरीकों में से किसी के माध्यम से सुलभ नहीं है । हम पहले दृश्य और ईवीएस, nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्)14के विश्लेषण के लिए एक और अति संवेदनशील तरीका बताया । संक्षेप में, इस विधि दो अलग भौतिक सिद्धांतों को जोड़ती है । पहले, कणों तितर बितर प्रकाश जब वे एक लेज़र बीम के साथ विकिरणित हैं, और दूसरा सिद्धांत, Brownian गति के रूप में जाना जाता है, तात्पर्य है कि एक तरल निलंबन में विभिंन कणों के प्रसार उनके आकार के लिए व्युत्क्रम आनुपातिक है । अर्द्ध स्वचालित डेस्कटॉप nanoparticle विश्लेषण उपकरण तरल नमूनों के लिए एक सॉफ्टवेयर आधारित विश्लेषण के साथ कण ट्रैकिंग विश्लेषक के होते हैं, जहां एकल कणों से बिखरे हुए प्रकाश की डिजिटल छवियों को दर्ज कर रहे हैं । कणों और कणों की आवाजाही एक वीडियो कैमरा के साथ एक लेजर कैटरिंग माइक्रोस्कोप से पता चला रहे हैं. लेजर बीम खड़ी उंमुख है, जबकि ऑप्टिकल अक्ष क्षैतिज और सेल नमूना से भरा चैनल में केंद्रित है । बिखरे हुए प्रकाश स्थलों और गति की उनकी गति के भूखंडों द्वारा प्रदान की डेटा कुल कण गिनती और आकार वितरण के निर्धारण में सक्षम हैं । लेजर द्वारा विकिरण के बाद, कण प्रकाश है, जो14माइक्रोस्कोप के माध्यम से एक डिजिटल वीडियो कैमरा द्वारा दर्ज की गई है तितर बितर । हमारे पूर्व विधि के लिए उंनति एक ५०० एनएम के सम्मिलन लंबी लहर-पास (LWP) लेजर (४८८ एनएम की तरंग दैर्ध्य) और सेल चैनल है, जो प्रतिदीप्ति-लेबल कणों के प्रत्यक्ष विश्लेषण (चित्रा 1) के बीच कट ऑफ फिल्टर । हमारे प्रोटोकॉल एकल ईवीएस के एक तेजी से लक्षण वर्णन के लिए इस क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं की आम मांग के पते, जैसे, उनके पैतृक मूल के अनुसार । इस प्रोटोकॉल में, हम मानव पूरे रक्त और प्रतिदीप्ति आधारित नैनोकणों ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विशिष्ट मार्करों के तेजी से लक्षण वर्णन से ईवीएस के तेजी से अलगाव के लिए पूरा कार्यप्रवाह का वर्णन । ईवीएस PKH67 के साथ दाग से पता लगाया जा सकता है, एक सामांय कोशिका झिल्ली लिंक, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट exosomal मार्करों के साथ, जैसे , CD63, CD9, और vimentin । हमारे प्रोटोकॉल भी EDTA और साइट्रेट प्लाज्मा के लिए उपयुक्त है, साथ ही साथ अंय शरीर के तरल पदार्थ और कोशिका संस्कृति supernatants ।

Protocol

डसेलडोर्फ विश्वविद्यालय के संस्थागत एथिकल बोर्ड ने इस कार्य में प्रस्तुत प्रयोगों (संदर्भ संख्या: ३३८१) को मंजूरी दे दी है.

1. मानव पूरे रक्त से EV अलगाव

  1. exosome वर्षण समाधान के साथ ईवीएस को अलग करना ।
    1. venipuncture के माध्यम से सीरम अलग ट्यूबों (एसएसटी) में मानव पूरे रक्त की 2 मिलीलीटर लीजिए और जमावट समाप्त होने तक कमरे के तापमान पर 15 मिनट (आरटी) के लिए ट्यूब की मशीन ।
    2. आरटी में 10 मिनट के लिए १,७०० x g पर एसएसटी के लिए सीरम से अलग कोशिकाओं और एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए सीरम के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा (पीआरपी) ३,००० x g पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटलेट्स निकालने के लिए और एक नया १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए प्लेटलेट्स खराब प्लाज्मा (पीपीपी) के १०० μL स्थानांतरित करने के लिए ।
    3. exosome वर्षा समाधान के 25 µ एल जोड़ें (4 भागों पीपीपी, 1 भाग exosome वर्षा समाधान) और भंवर अच्छी तरह से । बर्फ पर 30 मिनट के लिए नमूना मशीन । ट्यूब ईमानदार रखें और घुमाएं नहीं या मशीन अवधि के दौरान ट्यूब मिश्रण ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए १,५०० एक्स जी में नमूना केंद्रापसारक ईवीएस गोली । केंद्रापसारक के बाद, ईवीएस पोत के तल पर एक बेज रंग या सफेद गोली के रूप में दिखाई देते हैं । महाप्राण supernatant और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए १,५०० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    5. तरल पदार्थ के सभी निशान निकालें और फिर से १०० µ एल में गोली निलंबित फॉस्फेट के-बफर खारा (पंजाब) अक्सर ऊपर और नीचे pipetting द्वारा । विश्लेषण तुरंत नहीं किया जाता है जब-८० ° c पर EV निलंबन स्टोर ।
      नोट: जब प्लाज्मा से ईवीएस अलग, फाइब्रिनोजेन और फाइब्रिन कुशल वसूली में बाधा और resuspension कर सकते है भारी है और अधिक समय लगता है ।
  2. ultracentrifugation के साथ ईवीएस को अलग करना ।
    1. फ्रिज से प्री-कूल्ड रोटर (TLA-५५ फिक्स्ड-angled) लें और उपयोग से पहले ultracentrifuge को ठंडा करें ।
    2. पीपीपी के १.२५ एमएल स्थानांतरण (१.१ चरण में तैयार) कैप के साथ एक उपयुक्त १.५ मिलीलीटर ultracentrifugation ट्यूब के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए ११०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । सुनिश्चित करें कि रोटर लोड प्रारंभ करने से पहले संतुलित है ।
    3. supernatant और जगह ट्यूब उल्टा के लिए एक कागज तौलिया पर नीचे 2 min. Re-पंजाब के ५०० μL में गोली निलंबित और 4 डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए ११०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
    4. महाप्राण supernatant और फिर से ५० μL में गोली निलंबित पंजाबियों ।
      नोट: उपयोग में है जो ultracentrifuge के लिए डिज़ाइन किया गया केवल रोटर्स और सहायक उपकरण का उपयोग करें । क्योंकि ट्यूबों की ताकत बहुत सारे के बीच भिंन हो सकते है पानी का उपयोग करके रोटर में ट्यूबों का परीक्षण ।

2. नमूनों का धुंधला होना

  1. PKH67 के साथ दाग नमूने ।
    1. मंदक सी के ५० μL के लिए PKH67 इथेनॉल डाई समाधान के 1 μL जोड़ने के द्वारा धुंधला समाधान तैयार (किट में शामिल) एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. हस्तांतरण 10 μL के दाग समाधान के 20 μL EV निलंबन के लिए (१.१ कदम में तैयार) प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए, अच्छी तरह से मिश्रण और अंधेरे में आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. पतला ५० μL एक 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में २.५ मिलीलीटर आसुत पानी के साथ दाग EV निलंबन के, अच्छी तरह से मिश्रण है, और कण माप के लिए इस अंतिम निलंबन का उपयोग करें ।
      नोट: यह EV निलंबन के लिए मंदक के रूप में पानी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि अंय diluents (जैसे, पंजाब) माप ख़राब कर सकते हैं । संग्रहीत EV-सस्पेंशन का उपयोग करते समय, नमूनों को बर्फ पर गल लें और धुंधला होने से पहले अच्छी तरह से मिलाएं ।
  2. विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ नमूने दाग ।
    1. पतला 10-20 μL EV निलंबन (१.१ चरण में तैयार) ५० μL के साथ आसुत जल की एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. विशिष्ट एंटीबॉडी के 2.5-5 μL जोड़ें (तालिका 1) प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए, अच्छी तरह से मिश्रण, और अंधेरे में आर टी पर 30 मिनट के लिए गर्मी ।
    3. स्थानांतरण ५० μL के लिए दाग EV निलंबन की 2.5-10 मिलीलीटर आसुत जल (तालिका 1) में एक 15 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब, अच्छी तरह से मिश्रण है, और कण माप के लिए इस अंतिम निलंबन का उपयोग करें ।
      नोट: कुछ परिस्थितियों में, एकाग्रता का इस्तेमाल किया एंटीबॉडी समायोजित किया जाना चाहिए (तालिका 1).

3. नमूनों की प्रोसेसिंग

नोट: इस पद्धति की बुनियादी बातों के बड़े पैमाने पर पहले से ही वर्णित थे और नीचे प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रतिदीप्ति के विश्लेषण के लिए आवश्यक कदम-लेबल ईवीएस14पर केंद्रित है ।

  1. स्टार्टअप प्रक्रिया निष्पादित करें ।
    1. माइक्रोस्कोप और कैमरे के ऑप्टिकल पथ में प्रतिदीप्ति फ़िल्टर पुश । प्रोग्राम प्रारंभ करें और स्वचालित कार्यांवयन के लिए स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
    2. प्रतिदीप्ति माप के लिए "कक्ष जांच" टैब (कक्ष परिभाषा) में सही कक्ष संख्या (Z158_C1149_Fluor) का चयन करें । प्रकाशिकी के लिए संदर्भ स्थिति का चयन करें सुनिश्चित करें कि लेजर और माइक्रोस्कोप एक आम ध्यान में है बनाने के लिए (लेजर और माइक्रोस्कोप इस स्थिति के लिए स्वचालित रूप से कदम) ।
    3. आसुत जल के 10 मिलीलीटर से भरा एक सिरिंज के साथ सेल चैनल फ्लश । सुनिश्चित करें कि माप सेल हवा के बुलबुले से मुक्त है और प्रणाली में हवा के बुलबुले सुई नहीं है ।
    4. वर्दी २०० एनएम आकार प्रतिदीप्ति-लेबल polystyrene कणों कि उनकी सतह पर carboxylate समूहों है युक्त एक अंशांकन निलंबन तैयार करें । ९९० μL आसुत जल के साथ कणों की 10 μL पतला । फिर इस कण समाधान के 10 μL एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में आसुत पानी की 10 मिलीलीटर के साथ पतला करने के लिए आवश्यक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ।
    5. सेल चैनल में पतला कण समाधान के २.५ मिलीलीटर सुई और क्लिक करें "अनुकूलन फोकस" कैमरे को समायोजित करने के लिए ।
  2. नमूना उपाय ।
    1. एक नमूना माप करने से पहले आसुत पानी की 10 मिलीलीटर से भरा एक सिरिंज के साथ सेल चैनल कई बार फ्लश. (चरण 2 में तैयार) सेल चैनल में सना हुआ EV निलंबन इंजेक्षन ।
    2. सॉफ्टवेयर में "सेल चेक" टैब में निम्न मुख्य कैमरा पैरामीटर आवश्यकतानुसार समायोजित करें (तालिका 2). पैरामीटर समायोजित करने के लिए संदर्भ स्थिति या स्थिति ०.४११९३ का उपयोग करें ।
      1. संवेदनशीलता के लिए, विभिन्न संवेदनशीलता के स्तर के लिए स्क्रीन प्रति मापा कणों का एक वक्र प्रदर्शित करने के लिए बटन "संवेदनशीलता बनाम कणों की संख्या" पर क्लिक करके इष्टतम संवेदनशीलता रेंज लगता है ।
        नोट:
      2. शटर के लिए, समय की अवधि को समायोजित करें कि कैमरा प्रकाश एक निर्धारित अंतराल के लिए पारित करने की अनुमति देता है ।
      3. पोस्ट-प्राप्ति पैरामीटर्स के लिए, 20 की न्यूनतम चमक, 20 एनएम का न्यूनतम आकार और माप के लिए ५०० एनएम का अधिकतम आकार चुनें ।
    3. प्रदर्शन से दृष्टि के क्षेत्र में गिने गए खोजे गए कणों की संख्या नोट करें । कैटरिंग बार नारंगी रेंज (50-300 कणों) के लिए हरे रंग में होना चाहिए । यदि कैटरिंग बार लाल है, तितर बितर व्यक्तिगत कणों को भ्रमित करेगा और वे एक एकल कण के रूप में गिना जाता है, इस प्रकार झूठी परिणाम के लिए अग्रणी । ऐसी स्थिति में, आगे कणों के अतिव्यापी से बचने या संवेदनशीलता को कम करने के लिए नमूना पतला ।
    4. माप प्रारंभ करने से पहले "कक्ष जांच" टैब में "चेक कण बहाव पर 0 V" पर क्लिक करें । बहाव 5 माइक्रोन/एस से अधिक है, तो माप जारी रखने के लिए प्रवाह बंद हो जाता है जब तक प्रतीक्षा करें ।
      नोट: यदि बहाव माप की शुरुआत में बहुत अधिक है, दोहराया माप अलग कर सकते है और परिणाम में मिलावट । ंत् के अंतर्निहित सिद्धांतों के कारण, एक प्रासंगिक बहाव निर्धारित कण आकार में एक प्रभाव हो सकता है, के रूप में सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की ।
    5. "माप" टैब में "चलाएँ वीडियो प्राप्ति" पर क्लिक करें. (3-5) प्रयोगों की संख्या और उन्हें (0 मिनट) के बीच समय देरी का चयन करें.
    6. (व्यक्तिगत उपमात्रा-) पदों की संख्या (11) और (माप) चक्र की संख्या (10) प्रत्येक माप की स्थिति पर, जहां कणों का विश्लेषण किया जाना चाहिए परिभाषित
    7. किसी फ़ोल्डर का चयन करें, कोई नया फ़ाइल नाम बनाएं, और माप प्रारंभ करने के लिए "ठीक" क्लिक करें ।

4. परिणामों की व्याख्या

  1. माप के बाद "विश्लेषण" टैब पर परिणाम और पैरामीटर्स देखें. कक्ष चैनल सफाई से पहले विश्लेषण के बाद निम्न पैरामीटर्स की जाँच करें: स्थिति प्रति कणों की औसत संख्या, ट्रेस्ड कणों और कण एकाग्रता की कुल संख्या, कणों की वितरण चौड़ाई (x10, x50, और x90 मान), के मूल्य मतलब और मानक विचलन । यदि आवश्यक हो तो नमूना के माप को दोहराएँ ।
    नोट: परिणाम भी एक. pdf या. txt फ़ाइल के रूप में सहेजे जाते हैं ।
  2. माप के बाद गणना किए गए ग्राफ़ को देखने के लिए "विश्लेषण" टैब पर क्लिक करें, जो आकार द्वारा खोजे गए कणों का वितरण दिखाता है. "विश्लेषण" टैब में "प्रदर्शन" पर क्लिक करें और समायोजित करें और विशेष आवश्यकताओं के लिए ग्राफ सेटिंग्स बदलने के लिए माउस का उपयोग.

5. पश्चिमी सोख्ता द्वारा EV पता लगाने के द्वारा मांयता

  1. EV गोली भंग (1 चरण में तैयार) RIPA lysis और निष्कर्षण बफर में, अच्छी तरह से पिपेट और 30 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी । ८,००० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में नमूना केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate स्पष्ट और एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  2. एक Lowry प्रोटीन परख किट द्वारा कुल प्रोटीन उपाय । RIPA बफर के ४९ μL के साथ अलग EV निलंबन के 1 μL पतला और विश्लेषण के लिए triplicates में 5 μL का उपयोग करें । ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2 µ g/μL और हीट के अंतिम एकाग्रता के लिए 2x Laemmli लोडिंग बफर के साथ EV सस्पेंशन को पतला करें ।
  3. प्रति अच्छी तरह से प्रोटीन के 20 μg लोड । अलग और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार polyacrylamide जेल ट्रो और टैंक सोख्ता द्वारा प्रोटीन हस्तांतरण ।
  4. (०.२ माइक्रोन polyvinylidene difluoride) गोजातीय दूध पाउडर के साथ ब्लॉक (5%) आरटी में 1 ज के लिए और विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी (CD9, CD63, और vimentin) 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के साथ झिल्ली की मशीन ।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी एक 1:1000 कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया जाता है ।
  5. TBST 3x 5 मिनट के साथ झिल्ली धो और सहिजन peroxidase (एचआरपी) के साथ झिल्ली की मशीन-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:20000 TBST में) RT पर ६० मिनट के लिए ।
  6. TBST 3x 5 मिनट के साथ झिल्ली धोने और एक इमेजिंग प्रणाली पर एक उच्च संवेदनशीलता सब्सट्रेट समाधान के साथ chemiluminescence द्वारा प्रोटीन का पता लगाने ।
    नोट: क्योंकि CD63 प्रतिजन बड़े पैमाने पर और परिवर्तनशील ग्लाइकोसिलेटेड है, आणविक भार भिन्न हो सकते हैं, और बैंड 40-65 केडीए के बीच दिखाई दे सकते हैं.

Representative Results

ईवीएस पूरे खून से अलग थे और fluorescing रिएजेंट के साथ nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विशेषता । अनदाग कणों की माप के लिए इष्टतम संवेदनशीलता हमारे प्रयोगों के दौरान ७०% पर सीमा को पहचाना गया था । समायोजन और माप के अंशांकन के लिए इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट मोती ८५% (चित्रा 2a) की एक संवेदनशीलता पर एक इष्टतम सेटिंग दिखाया । ७०% और ९०% की संवेदनशीलता के बीच, पता चला कणों की संख्या तेजी से वृद्धि हुई है, जबकि आगे संवेदनशीलता बढ़ाने कण आकार वितरण की गिरावट के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जहां कणों की संख्या फिर से छोड़ रहा है. कैमरे की सेटिंग में एक तेज तस्वीर (चित्रा 2बी) और दोहराया माप प्रदर्शित कम मानक विचलन (चित्रा 2c) दिखाया । Insofar, ईवीएस के नमूनों के प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल इतना समायोजित किया गया था कि सभी माप एक ही सेटिंग्स (तालिका 2) के साथ आयोजित किया जा सकता है । वितरण चौड़ाई x-अक्ष, x10, x50, और x90 पर तीन मानों द्वारा परिभाषित किया गया है । x50, या माध्य कण आकार का व्यास है जिस पर जनसंख्या का आधा इस मूल्य के नीचे निहित है । इसी तरह, x10 और x90 व्यास जिस पर 10% और पता चला कणों का ९०% रिपोर्ट आकार के तहत कर रहे है संकेत मिलता है । एक फ्लोरोसेंट सेल लिंक है कि कोशिका झिल्ली के लिपिड क्षेत्रों में लंबे aliphatic पूंछ के साथ एक हरी फ्लोरोसेंट डाई शामिल है, संवेदनशीलता और की संख्या के बीच एक मजबूत संबंध का प्रदर्शन सहित PKH67 सेल लिंकर किट, के साथ धुंधला कणों मापा (3 ए चित्रा) । PKH67 अक्सर प्रसार निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी exosome या liposome के रूप में अच्छी तरह के रूप में vivo सेल ्े में के लिए निगरानी के लिए उपयोगी साबित कर दिया है । PKH67 के गैर-विशिष्ट लेबलिंग के कारण, ईवीएस की एक विस्तृत विविधता लेबल और पता लगाया जा सकता है । कणों का वितरण २६६ एनएम (x10) और १९४६ एनएम (x90) के बीच एक श्रेणी में था ८५७ एनएम (x50) और माप (२८.१ एनएम) के बीच एक कम मानक विचलन के साथ एक चोटी पर अधिकतम के साथ । दीपक-1, भी lysosome-एसोसिएटेड झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन 1 के रूप में जाना जाता है, और CD107a मुख्य रूप से lysosomal झिल्ली के पार रहते हैं । एक Alexa Fluor ४८८ के साथ दाग के बाद दीपक के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी लेबल-1, कणों पर्वतमाला का वितरण २२० एनएम (x10) से ११४५ एनएम (x90) के लिए ५४१ एनएम (x50) और ११.७ एनएम के एक मानक विचलन के साथ (आंकड़ा 3बी) । ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए, हम Alexa Fluor ४८८ आम exosomal मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी लेबल का इस्तेमाल किया और पश्चिमी सोख्ता द्वारा हमारे निष्कर्षों की पुष्टि की । Alexa Fluor ४८८-लेबल CD9-एंटीबॉडी के साथ धुंधला के बाद, कणों के वितरण से २५१ एनएम (x10) के लिए ११३९ एनएम (x90) ५४८ एनएम पर एक चोटी अधिकतम के साथ और एक दूसरी छोटी चोटी पर लगभग 25 एनएम (चित्रा 4a) । Alexa Fluor ४८८ लेबल CD63 (चित्रा 4B) और vimentin (चित्रा 4c) के साथ धुंधला इसी तरह परिणाम मिले । पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण हमारे यहां इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए सकारात्मक परिणाम पुष्ट । दोहराया माप इस रिपोर्ट में इस्तेमाल सभी एंटीबॉडी के लिए reproducible परिणाम दिखाया. नियंत्रण के रूप में, हम पुटिका-संबंधित एंटीबॉडी के साथ मुफ्त पानी (आंकड़ा 5 ए), जहां PKH67 और LAMP1 एंटीबॉडी वस्तुतः कोई EV १००% के करीब एक संवेदनशीलता को पता दाग । vimentin के उदाहरण का प्रयोग, उच्च संवेदनशीलता उभरते कलाकृतियों की संख्या में वृद्धि हुई है, यहां तक कि जब नमूना अनिवार्य रूप से कणों से मुक्त है । अगर माप शुरू कर दिया है जब बहाव अभी भी उच्च (> 5 µm/एस), व्यक्तिगत पुनरावृत्ति अलग आपस में विचलित (चित्रा 5B) । के रूप में तीन अलग एंटीबॉडी के साथ प्रतिनिधित्व किया है, यह महत्वपूर्ण है कि बहाव के रूप में माप शुरू करने से पहले संभव के रूप में कम है । हमारे अनुभव के अनुसार, माप में fluorochrome परिणामों के रूप में fluorescein isothiocyanate (FITC) का उपयोग करना जो सटीक और reproducible नहीं है क्योंकि FITC रैपिड फोटो ब्लीचिंग (फिगर 5C) से ग्रस्त है । इसलिए, हम विशेष रूप से Alexa Fluor EV लक्षण वर्णन के लिए ४८८ लेबल एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं । इस प्रोटोकॉल में, ईवीएस पॉलीथीन ग्लाइकोल युक्त एक बहुलक आधारित exosome वर्षा समाधान द्वारा पृथक किया गया । यह सुनिश्चित करने के लिए कि हमारे परिणाम लागू अलगाव विधि द्वारा ूःतुत नहीं हैं, हम ultracentrifugation के साथ अलगाव के बाद ईवीएस विशेषता । के रूप में PKH67 और दो अलग एंटीबॉडी के साथ प्रतिनिधित्व किया (CD63 और दीपक-1), exosome वर्षा समाधान के साथ हमारे लागू अलगाव के परिणाम (चित्रा 6A) ईवीएस के माध्यम से अलग ultracentrifugation के साथ तुलनीय हैं (चित्रा घमण्ड ). दुर्भाग्य से, ultracentrifugation के बाद ईवीएस के गरीब उपज के कारण, अलगाव के लिए सीरम के प्रारंभिक सेट स्पष्ट रूप से उच्च exosome वर्षा समाधान के साथ अलगाव की तुलना में होना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण के योजनाबद्ध सेटअप । माइक्रोस्कोप/वीडियो अक्ष और लेजर बीम एक दूसरे को केंद्रित orthogonally, सेल चैनल पार अनुभाग पर पार कर रहे हैं । एक प्रतिदीप्ति फिल्टर सेल चैनल और माइक्रोस्कोप के बीच रखा गया है । प्रकाश कणों से बिखरे हुए सॉफ्टवेयर के "लाइव देखें" विंडो में प्रदर्शित किया जाता है । अधिग्रहण के बाद, परिणाम एक आकार वितरण वक्र निर्देशांक प्रणाली के रूप में प्रदर्शित होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिदीप्ति लेबल मोतियों के साथ अंशांकन । (A) एक स्वचालित संवेदनशीलता स्कैन के दौरान समय में एक बिंदु पर एक स्थिति में कणों बनाम संवेदनशीलता वक्र कणों की संख्या प्रदर्शित करता है । (ख) लाइव देखें स्क्रीन पर कणों का दृश्य. (ग) दोहराया माप के बाद कण आकार वितरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: PKH67 और दीपक के साथ दाग के बाद प्रतिनिधि परिणाम-1 । संवेदनशीलता वक्र बनाम कणों की संख्या (1), लाइव देखें स्क्रीन पर कणों के दृश्य (2), और कण आकार वितरण (3) PKH67 के साथ धुंधला होने के बाद (A) और लैंप-1 (B). कणों की एक समान आकार वितरण मनाया जाता है, जबकि एक समान लेकिन अभी तक पता चला कणों की पूरी तरह से समान परिवर्तन नहीं करने के लिए नेतृत्व में संवेदनशीलता की स्थापना में परिवर्तन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Alexa Fluor ४८८ लेबल CD9, CD63, और vimentin के साथ दाग के बाद प्रतिनिधि परिणाम । संवेदनशीलता वक्र बनाम कणों की संख्या (1), लाइव देखें स्क्रीन पर कणों के दृश्य (2), कण आकार वितरण (3), और दो अलग EV निलंबन के प्रतिनिधि पश्चिमी दाग (4) CD9 के लिए (24-27 केडीए, ए), CD63 (26 केडीए, ख), और vimentin (५४ केडीए, सी). बढ़ती संवेदनशीलता के साथ कण संकेतों की देर घटना (x-अक्ष) पश्चिमी दाग विश्लेषण में कम संकेत तीव्रता के साथ संबद्ध, संबंधित कण सतह मार्कर की कम राशि की पुष्टि (जैसे, vimentin बनाम CD63) । सभी विश्लेषण मार्करों उच्च reproducibility (3) का संकेत के लिए प्रतिनिधि माप के लगभग समान घटता ध्यान दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रयुक्त नियंत्रण और संभावित त्रुटि स्रोतों के लिए प्रतिनिधि परिणाम । (क) पुटिका-मुक्त पानी से सना हुआ PKH67 (१), दीपक-१ (२), और vimentin (३) के रूप में नियंत्रण. (ख) प्रतिनिधि कण आकार वितरण लैंप के साथ धुंधला होने के बाद-1 (1), CD63 (2), और CD9 (3), और माप प्रदर्शन जब निलंबन बहाव अभी तक बहुत अधिक है । (ग) कणों की संख्या बनाम संवेदनशीलता वक्र (1) और कण आकार वितरण (2) FITC-बला CD63 एंटीबॉडी के साथ दाग के बाद । एक स्पष्ट ब्लीचिंग प्रभाव प्रत्येक माप के बाद मनाया जाता है, जिसका परिणाम उत्तरोत्तर कम कण संख्या में होता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: ईवीएस के लिए विभिंन आइसोलेशन विधियों की तुलना । कण के आकार का वितरण ईवीएस के साथ पृथक exosome वर्षा समाधान (A) और ultracentrifugation (B) PKH67 (1), लैंप-1 (2), और CD63 (3) के साथ धुंधला होने के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

दीपक-1 CD9 CD63 Vimentin
एंटीबॉडी (µ l) 5 2.5-5 2.5-5 5
ईवी सस्पेंशन (µ l) 10 20 10 10
दाग के लिए एच2ओ (µ एल) ५० ५० ५० ५०
अंतिम वॉल्यूम (mL) 5-10 2.5-5 5 10

तालिका 1: प्रयुक्त एंटीबॉडी की सूची और नमूनों की कमजोर पड़ने रेंज.

अधिग्रहण पैरामीटर
संवेदनशीलता (%) ८५
शटर ७०
Min. चमक 20
अधिकतम. आकार (एनएम) ५००
Min. Size (एनएम) 20
Polarity नकारात्मक
वोल्टेज बंद
कण पर बहाव 0 V (µm/ < 5
पदों 11
चक्र 10
एकाधिक अधिग्रहण 3-5
समय विलंब (min) 0

तालिका 2: nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए अधिग्रहण मापदंडों ।

Discussion

हम पूरे रक्त और प्रतिदीप्ति-आधारित नैनोकणों ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ विशिष्ट सतह मार्करों के तेजी से लक्षण वर्णन से ईवीएस के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । आयोजित प्रयोगों में, हम विशेष रूप से सीरम के नमूनों से पृथक ईवीएस इस्तेमाल किया, लेकिन इस विधि भी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और साइट्रेट प्लाज्मा के लिए उपयुक्त है और यह भी मूत्र, स्तन के दूध, लार के रूप में अंय शारीरिक तरल पदार्थ के लिए विस्तारित किया जा सकता है, मस्तिष्कमेरु द्रव, और वीर्य । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सेल संस्कृति supernatants से ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए समायोजित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, EV निलंबन १०० μL से सीरम का एक exosome वर्षण रिएजेंट है, जो एक मालिकाना बहुलक है कि धीरे exosomes और ईवीएस 30 एनएम के लिए २०० एनएम से लेकर एक कणिका आकार के अनुसार होता है का उपयोग कर उत्पंन किया गया था, जिससे 10-20 μL ईवीएस के प्रत्येक सतह मार्कर के लक्षण वर्णन के लिए नियुक्त किया गया । दुर्भाग्य से, अलगाव कदम अपरिहार्य है, क्योंकि सीरम नमूनों में प्रोटीन की उच्च मात्रा (जैसे, एल्ब्युमिन और globulin) एंटीबॉडी धुंधला प्रक्रिया और पृष्ठभूमि और परिष्कृत निष्कर्षों के उच्च स्तर में परिणाम के साथ हस्तक्षेप । इसके अलावा, नमूनों में exosomes की जैविक उपलब्धता के आधार पर, प्रसंस्करण से पहले कार्यरत EV निलंबन की राशि के साथ-साथ अन्य स्रोत सामग्रियों के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । कई नमूनों की तुलना करने के लिए, नमूनों के कमजोर पड़ने के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सुसंगत अधिग्रहण मापदंडों (संवेदनशीलता, शटर, आदि) आवश्यक है । एक अंय महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि माप जब तक बहाव कम नहीं है (हमारे हाथ में, < 5 माइक्रोन/ यदि बहाव बहुत अधिक था, नमूना का दोहराया माप खुद के बीच उच्च मानक विचलन उपज, लेकिन एक कम बहाव के साथ, परिणामी डेटा अत्यधिक संगत थे और reproducibility के एक उच्च स्तर की पुष्टि की. यह महत्वपूर्ण है कि चयनित एंटीबॉडी एक उपयुक्त fluorochrome है । एंटीबॉडी Alexa Fluor ४८८ के साथ संयुग्मित होना चाहिए, क्योंकि FITC फोटो ब्लीचिंग की एक उच्च दर है । संभवतः अधिक स्थिर fluophores निश्चित रूप से भविष्य में वृद्धि की परख स्थिरता के लिए नेतृत्व करेंगे । आम तौर पर, कई शोधकर्ताओं EV एस के लिए एक मंदक के रूप में पंजाबियों का उपयोग करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, यह EV निलंबन के लिए एक मंदक के रूप में आसुत जल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । जब ईवीएस fluorescing रंजक के साथ लेबल कर रहे हैं, उच्च परासरणीयता और ऐसे पंजाबियों के रूप में अंय diluents की आयन एकाग्रता, माप के साथ हस्तक्षेप और बदल परिणामों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

जबकि ईवीएस के विश्लेषण के लिए तरीके काफी पिछले दशक में सुधार किया गया है, वहां अभी भी अलगाव और EV s के लक्षण वर्णन के लिए कोई मानकीकृत विधि है। प्रवाह cytometry के प्रमुख नुकसान, जहां ईवीएस अक्सर मोती के लिए एक बड़ा सतह प्रदान करने के लिए बाध्य कर रहे हैं, यह है कि सतह पर कई ईवीएस गोदी के लिए एक मजबूत और जासूसी संकेत10प्रदान करते हैं । SEM और उनि नुकसान है कि नमूनों की तैयारी समय लेने वाली है और ईवीएस केवल उनके आकार और आकृति विज्ञान11द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । अप टू डेट, गुणात्मक के लिए सबसे स्थापित और आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि (यानी, जैव रासायनिक) EV लक्षण वर्णन पश्चिमी सोख्ता, जहां प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी12,13के साथ विश्लेषण किया जा सकता है । हालांकि, इन सभी तरीकों के नुकसान विशिष्ट सतह मार्करों के लिए एकल ईवीएस का विश्लेषण करने के लिए अक्षमता में झूठ । इसके अलावा, लंबे समय प्रसंस्करण समय और लंबे समय से धोने/अलगाव प्रक्रियाओं वर्तमान प्रोटोकॉल के कई द्वारा प्रयुक्त श्रम गहन कदम शामिल है, उंहें उच्च नमूना प्रवाह और एकल EV s के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त नहीं बना। हमारा प्रोटोकॉल ऐसे CD63, CD9, vimentin, और CD107a के रूप में विशिष्ट सतह मार्करों के साथ त्वरित अलगाव और एकल ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक पूर्ण कार्यप्रवाह प्रदान करता है, और अंय सतह मार्करों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए विस्तारित किया जा सकता है की उत्पत्ति का निर्धारण जारी ईवीएस. ंत् डिवाइस की एक स्थाई तकनीकी प्रगति की वजह से, हम नवीनतम विश्लेषक के साथ निर्माता के साथ सहयोग में हमारे निष्कर्षों की पुष्टि की । EV जीवविज्ञान पर अनुसंधान के भविष्य की प्रगति की परवाह किए बिना, विशेष रूप से exosomes के विषय में, प्रोटोकॉल है कि यहां प्रस्तुत किया जाता है विशिष्ट मार्करों के साथ एकल ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय विधि प्रदान करेगा । क्योंकि अलगाव और धुंधला प्रक्रिया के दौरान ईवीएस का एकत्रीकरण अभी तक अपरिहार्य है, भविष्य के अनुसंधान के तरीकों को विकसित करने के लिए ev एकत्रीकरण को रोकने और फ्लोरोसेंट-लेबल ev s का एक सटीक आकार निर्धारण सक्षम करने के लिए ध्यान केंद्रित करना चाहिए।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों का शुक्र है कण Metrix GmbH आंशिक रूप से इस काम के प्रकाशन लागत को कवर करने के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Serum-separation tube BD 366882 BD Vacutainer
Ampuwa water Fresenius Kabi 10060
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma 56064C
Falcon tube, 15 mL Greiner Bio One 188271
Falcon tube, 50 mL Greiner Bio One 227270
Microcentrifuge tube, 1.5 mL Eppendorf 30120086 Speciality tubes for ultra centrifugation
Tube with Snap-On Cap 1.5 mL Beckman Coulter 357448
Polybeads Microspheres 0.2 µm Polysciences, Inc. 7304 Alignment Solution
Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres beads 0.2 µm Polysciences, Inc. 09834-10 Alignment Solution
Syringe, 2 mL Braun 4606027V
Syringe, 10 mL Braun 4606728V
Exoquick SBI EXOQ20A-1 EV precipitation solution
Laemmli Sample Buffer (2x) BioRad 1610737
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112 Lowry prtein assay
PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit Sigma PKH67GL-1KT For general membrane labelling
Alexa Fluor 488 anti-human CD107a Antibody BioLegend 328609 Lysosomal-associated membrane protein-1 (LAMP-1)
Human CD9-Alexa Fluor 488 R&D Systems FAB1880G
Anti-CD9 Antibody SBI EXOAB-CD9A-1
CD63-Alexa Fluor 488 ThermoFisher MA5-18149
FITC anti-human CD63 Antibody BioLegend 353005
CD63. Antibody, polyclonal SantaCruz Sc-15363
Alexa Fluor 488 anti-vimentin Antibody BioLegend 677809
Anti-Vimentin Antibody SBI EXOAB-VMTN-1
Goat anti mouse IgG + IgM Jackson Immuno 315-035-048
Goat anti rabbit IgG Dianova 111-035-003
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate ThermoFisher 34094
ZetaView Particle Metrix PMX 100, Type
Centrifuge Eppendorf 5804R
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP
Chemiluminescence Imager GE Healthcare Amersham Imager 600

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References

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जैव रसायन अंक १४३ Exosomes nanovesicles कण ट्रैकिंग विश्लेषण CD63 CD9 vimentin सीरम
Nanoparticle-ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ मानव रक्त में एकल Extracellular बुलबुले के तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित लक्षण वर्णन
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Weber, A., Wehmeyer, J. C., Schmidt, V., Lichtenberg, A., Akhyari, P. Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis. J. Vis. Exp. (143), e58731, doi:10.3791/58731 (2019).

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