Summary
Dit werk beschrijft het klonen van een Ustilago maydis Trojaans paard stam voor de in-situ levering van secreted maïseiwitten in drie verschillende types van maïs weefsels.
Abstract
Geïnspireerd door Homer´s Trojan paard mythe, we ontworpen de maïs pathogen Ustilago maydis secreted eiwitten om in te leveren de maïs apoplast toelaat in vivo fenotypische analyse. Deze methode niet afhankelijk is van maïs transformatie maar exploiteert microbiële genetica en secretoire mogelijkheden van ziekteverwekkers. Hierin staat het inspectie van in vivo geleverd secreted eiwitten met een hoge Spatio resolutie op verschillende soorten infectie sites en weefsels. De strategie van het paard van Troje kan worden gebruikt om de Transient aanvulling op maïs verlies-van-functie fenotypen, functioneel karakteriseren eiwit domeinen, af-target eiwit effecten te analyseren, of om te studeren van onside eiwit overdosering, waardoor het een krachtig hulpmiddel voor eiwit studies in het systeem van maïs gewas. Dit werk bevat een precieze protocol over het maken van een paard van Troje stam gevolgd door gestandaardiseerde infectie protocollen bij deze methode toepassen op drie verschillende maïs weefseltypes (HLA).
Introduction
De biotrophic pathogen Ustilago maydis is de verwekker van de maïs smut ziekte1. Het infecteert alle luchtfoto delen van maïs resulterend in grote tumoren die melanized, zwarte sporen bevatten. Op mondiaal niveau, wordt U. maydis geraamd op een jaarlijks verlies van ongeveer 2% van de opbrengst van maïs, veroorzaken terwijl tumoren worden gewaardeerd als een gastronomische delicatesse in Mexico. Infectie van de plant wordt geïnitieerd door een appressorium die scheidt van de celwand lysing enzymen te dringen de eerste laag van maïs epidermale cellen. Van een primaire infectie site, U. maydis groeit intracellulair en intercellularly, invasie van één tot twee cel lagen elke dag1,2. Succesvolle infectie resultaten in hypertrofie van de plant dat in zichtbaar tumoren op vijf dagen verandert post infectie1,3,4. Tijdens alle stadia van de infectie invaginate schimmeldraden van de schimmel de plant cytoplasma membraan zonder ieder rechtstreeks contact naar de host cytoplasma1,2. De strakke apoplasmic ruimte tussen de infecteren schimmeldraden en de plant plasmamembraan wordt beschouwd als de host/pathogen interactieve site, genaamd de biotrophic interactie zone. Om te overwinnen van het aangeboren immuunsysteem van de plant, scheidt U. maydis een array van effector eiwitten in de biotrophic interactie zone1. Sommige effectoren worden overgenomen door plantencellen, terwijl anderen in de biotrophic interactie zone5,6,7,8 blijven. Één die apoplastisch effector is UmPit2, die samenwerkt met die apoplastisch maïs proteasen het vrijkomen van de signalering peptide ZmZIP1 van ZmPROZIP door die apoplastisch protease activiteit9,10te voorkomen.
In de afgelopen decennia, U. maydis werd niet alleen een model voor schimmel genetica in plant-pathogen interactions, maar ook een waardevol hulpmiddel in de biotechnologie als gevolg van een goed begrepen life cycle, genetische bereikbaarheid en heterologe uitdrukking van uitgescheiden eiwitten11,12,13. Signalen voor de secretie van zowel conventionele en onconventionele eiwit zijn vastgesteld waarmee de posttranslationele modificaties14. Onlangs, U. maydis was werkzaam als een paard van Troje hulpmiddel om te studeren klein, maïseiwitten in situ15uitgescheiden. Het paard van Troje aanpak werd met succes gebruikt voor het analyseren van de functie van de kleine, secreted eiwit ZmMAC1 dat is betrokken bij helmknop ontwikkeling. ZmMAC1 induceert de periclinal verdeling van pluripotente cellen en cel lot specificatie van de nieuw gevormde cellen15. Op dezelfde wijze, werd de biologische functie van de maïs schade-geassocieerde peptide ZmZIP1 geopenbaard. U. maydis afscheidende de maïs die zmzip1 resulteerde in verminderde tumor vorming10. Dus, het paard van Troje aanpak vormt een waardevolle alternatieve route naar eiwit in situ studies met hoge Spatio resolutie dat noch doet vereisen generatie van stabiele maïs transformatie lijnen noch weefsel infiltratie met geïnfecteerd uitgedrukt en de zuivere eiwitten. In het bijzonder, maakt het paard van Troje-strategie de secretie van een heteroloog eiwit in de maïs apoplast en directe vergelijking van besmette versus niet-besmette plantencellen binnen de dezelfde weefsel.
Dit protocol illustreert de belangrijke stappen voor het genereren van een soort paard van Troje U. maydis om een proteïne van belang bestuderen. Verder bevat precieze informatie over infectie procedures van drie verschillende maïs weefseltypes (HLA) (volwassen bladeren, kwastjes en oren) met U. maydis, dat is een voorwaarde voor het bestuderen van de spatio infectie progressie en eiwit-functie in deze onderzoeken weefsels. Geen bijkomende specificaties zijn bepaald op maïs gene versterking en microscopische beeldvormende technieken, aangezien deze stappen doelgroepen gerichte en instrument-afhankelijk zijn. Dus, dit protocol is bedoeld voor ervaren gebruikers van standaard moleculaire biologietechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bouw een U. maydis paard van Troje
Opmerking: Zie Figuur 1.
- Het versterken van een gen van belang van maïs cDNA met behulp van gen-specifieke primers en een corrigeren polymerase van DNA. Kloon van het primaire product van PCR en transformeren van de constructie in E. coli instructies van de leverancier van de plasmide. Controleer of het juiste gen van belang opeenvolging van Sanger sequencing prior te gebruiken voor de volgende klonen stappen.
Opmerking: PCR specificaties dienen te worden geoptimaliseerd door primer reeks specifieke kenmerken en optimale polymerase van DNA reactie omstandigheden. - Inleidingen tot de maïs gen van belang te versterken zonder de volgorde codering een signaal peptide (SP) te ontwerpen.
- Uitbreiden van het 5´-einde van de omgekeerde primer met het motief van de RSIATA en een Ncoik snijden site (tabel 1).
- Versterken de maïs gen van belang met een corrigeren polymerase van DNA, met behulp van de PCR-construct gegenereerd in 1.1 als de PCR-sjabloon.
- Dubbel-digest het PCR product en de U. maydis transformatie plasmide, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, met Xbaik en Nco I. zuiveren het verteerd PCR product en de plasmide.
- Afbinden het verteerd PCR-product naar de p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha sjabloon met behulp van T4 DNA ligase volgens de instructies van de manufacturer´s. De afbinding product transformeren in E. coli en controleer of het juiste gen van belang volgorde door Sanger sequencing.
- De p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgen van belang-mCherry-Ha met het beperkingsenzym SspLinearize ik en transformatie DNA in het solopathogenic U. maydis stam SG20016. Isoleren van U. maydis transformants door carboxin te selecteren en bevestig geïsoleerde transformants door Southern blot analyse16.
Opmerking: Voor elk eiwit van belang, ten minste drie onafhankelijke U. maydis transformants moeten worden geïsoleerd en geanalyseerd om te schatten van eventuele fenotype effecten van willekeurige achtergrond mutaties.
2. kweekmedia
- YEPSlight vloeibare middellange16bereiden: 1,0% (m/v) gistextract, 0,4% (m/v) Bacto-pepton, en 0,4% (m/v) sacharose. Los van alle componenten in ddH2O en autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.
- Aardappel-dextrose-agar (PD-agar)20bereiden: 3,9% (m/v) aardappel dextrose agar en 1,0% (m/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Meng alle onderdelen direct in de fles voor de autoclaaf en voeg ddH2O plus een magnetische roer bar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.
- Bereiden van PD-houtskool agar20: 3,9% (m/v) aardappel dextrose agar, 1% (m/v) houtskool en 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8,0 (FC 0,01 M). Meng alle onderdelen direct in de fles voor de autoclaaf en voeg ddH2O plus een magnetische roer bar. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten; autoclaaf bij een hogere temperatuur, voor een langere periode van tijd of herhaaldelijk afbreuk doen aan de kwaliteit van het medium.
3. plant infectie
- Analyses van maïs celdeling uit te voeren in antwoord op een Trojaans paard geleverd eiwit (bijvoorbeeld microscopie gebaseerde cel tellen) vooraf. U. maydis -geïnduceerde maïs celproliferatie en latere tumor vorming begint rond 4-5 dagen post infectie. Kwantitatieve ziekte evaluaties zijn afhankelijk van weefsel en van 6 tot 14 dagen bericht infectie moeten worden uitgevoerd.
Opmerking: Verschillende maïs cultivars tonen verschillende niveaus van gevoeligheid voor U. maydis infectie. Maïs cvs. W23, A188, Gaspe flint, vroege gouden Bantam of Va35 Toon gevoeligheid naar deze pathogenen en zijn dus geschikt cultivars voor paard van Troje studies. - Bereiding van het entmateriaal U. maydis
- Omvatten de voorlopercellen stam SG200 als een negatieve controle in alle Trojaans paard experimenten om te kunnen inschatten van bijwerkingen op de infectie door de transgene stam. Hier, gebruik een U. maydis stam uiting geven aan een niet-afgescheiden versie van de proteïne van belang als een negatieve controle. Om redenen in verband met uitvoerbaarheid (bijvoorbeeld grotere vertoningen), kan de voorvader stam evenwel de gemakkelijker keuze van controle.
- Voordat u het experiment start, schatten welke bedragen van infectie cultuur nodig zijn. Houd in gedachten dat besmetting van elke plant 1 tot 1,5 mL van U. maydis schorsing vereist afhankelijk van de maïs weefseltype.
Opmerking: Ongeveer 1 mL van een overnachting cultuur is voldoende voor verdunning een OD600 van 0,2 in 20 mL van YEPSlicht medium, en 25 mL van een cultuur van U. maydis met een OD-600 voor 0.8-1.0 volstaan voor infectie van 13-16 planten. - Kras U. maydis van een PD-agar plaat met behulp van een steriele Pipet van Pasteur, enten in 5 mL YEPSlicht voedingsbodem en laat de cultuur groeien bij 28 ° C met constante schudden bij 200 t/min voor 16 h.
- Voorafgaand aan de infectie, onderzoeken de U. maydis inoculatie cultuur door standaard de lichte microscopie van voor de juiste groei en bacteriële besmetting bij 400 X vergroting.
Opmerking: In een geschikte cultuur is alleen de sigaar-vormige schimmel zichtbaar (Figuur 2). - Meng 900 µL van verse YEPSlicht met 100 µL van de overnachting cultuur en meten van de OD600 YEPSlicht medium als een leeg in de analyse van de spectrofotometer gebruiken.
- Verdun de overnachting cultuur met verse YEPSlicht medium op een OD600 van 0,2 en laat de cultuur groeien bij 28 ° C met constante schudden bij 200 t/min, totdat het bereiken van de mid log groeifase door een OD aangegeven600 nm voor 0.8-1.0.
Opmerking: U. maydis cellen dupliceren elke 2 h onder deze omstandigheden, dus de gewenste OD600 wordt bereikt na 4-5 uur van de teelt. - Oogst van de cellen bij OD600 van 0.8-1.0 door spinnen bij 3000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Wassen van de cel pellet één keer met ddH2O. Voor dit doel, voeg cultuur volumedeel ddH2O, spin met 3000 x g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel zorgvuldig in ddH2O met behulp van een 20-mL glazen pipet, waardoor aanpassing van de definitieve OD600 naar 3.0 (voor een paard van Troje-assay) of 1.0 (voor ziekte rating).
- Verificatie van het Trojaanse paard: in planta secretie van de maïs fusieproteïne
- Maïs zaailingen met een paard van Troje stam17infecteren.
- Microscopische beeldvorming van besmette zaailingen op 2-3 dagen post-infectie met behulp van een confocale laser scanning microscoop uitvoeren Te dien einde een rechthoekig stuk van het blad 1 cm onder het punt van injectie accijnzen, leg het monster op een microscoopglaasje en voeg een druppel ddH2O. Om te visualiseren mCherry fusieproteïne, prikkelen specimens op λ = 561 nm en record emissie bij λ = 580-630 nm.
- Infectie van volwassen maïs bladeren
- Maïs planten naar het werkgebied van volwassen bladeren cultiveren (wanneer ten minste blad 7 groeit in de stengel).
Opmerking: Dit stadium wordt bereikt na vier weken na het zaaien van 14 h, 28 ° C dag/10 h, 22 ° C nacht ritme met cv. W23 voorwaarden broeikasgassen. Duur kan variëren met de maïs cultivar en broeikasgassen voorwaarden. - Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3-mL spuit met een 20G x 1 hypodermische naald.
- Druk op de stengel zorgvuldig te lokaliseren het meristeem weefsel in de stengel. De basis van het meristeem kan worden onderscheiden door een overgang van moeilijker stengel naar zachtere weefsel.
- Markeer het meristeem op de stengel met behulp van een pen.
- Injecteren van 1,5 mL van U. maydis cultuur 1 cm boven de shoot meristeem of bloeiwijze meristeem.
- Stem op symptomen van de ziekte bij 6 en 12 dagen post infectie.
- Maïs planten naar het werkgebied van volwassen bladeren cultiveren (wanneer ten minste blad 7 groeit in de stengel).
- Infectie van kwasten
- Maïs planten groeien tot het bereiken van de fase van de kwast.
Opmerking: Een gedetailleerde tijdlijn ontwikkelingssamenwerking helmknop en kwast in maïs cv. W23 was eerder beschreven1819. Kwastjes met vooraf Meiotische helmknoppen zijn zeer gevoelig voor U. maydis infectie; in de maïs cv. W23 zijn kwasten de grootte van 4-7 cm. - Druk op de stengel zorgvuldig te lokaliseren van de kwast in de stengel.
- Mark de tip en de boekwaarde van de kwast op de stengel met behulp van een pen.
- Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3-mL spuit met een 20G x 1 hypodermische naald.
- Injecteren van 1,5 mL van het entmateriaal rond de kwast. Gelijke verdeling van het entmateriaal, langzaam uitgevoerd 0,5 mL elke bij het uiteinde, het middengedeelte, en de basis van de kwast gemarkeerd met de pen.
- 10 dagen post infectie die de ziekte symptomen snelheid.
- Maïs planten groeien tot het bereiken van de fase van de kwast.
- Infectie van oren
Opmerking: de oor weefsel ontwikkeling verschilt in verschillende maïs cultivars en broeikasgassen voorwaarden en voorafgaand aan de enting moet worden geobserveerd. Oren beginnen te ontgroeien zijde zijn zeer gevoelig voor U. maydis infectie.- Overdracht van de U. maydis cultuur (zie 3.2.9) in een 3 mL spuit met een 20 G x 1 hypodermische naald.
- Injecteren de inoculatie naald in de ruimte tussen de bladeren van de schil zo diep mogelijk zonder verwonden van het oor.
- Versie 1.5 mL van het entmateriaal rond het oor.
- Verwijder de injectiespuit plus naald en zorgvuldig massage de kolf om de oplossing voor U. maydis gelijkmatig moeten verdelen.
- 14 dagen bericht infectie die de ziekte symptomen snelheid.
- Bevestigen van de levensvatbaarheid van U. maydis entmateriaal
- 10 µL van het entmateriaal op een PD houtskool agarplaat neerzet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
Opmerking: Als de respectieve U. maydis cultuur vermag formulier filamenten, pluizige, witte mycelium wordt zichtbaar (Figuur 5)
- 10 µL van het entmateriaal op een PD houtskool agarplaat neerzet en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Constructies voor U. maydis Trojaans paard experimenten zijn gekloond in de plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gen van belang-mCherry-Ha. De maïs gen van belang is gesmolten tot een verslaggever van de fluorescentie mCherry en een epitoop HA-label. De uitdrukking van de fusieproteïne is onder controle van de promoter van U. maydis Umpit2 die specifiek is geactiveerd tijdens de infectie21. Om directe secretie van de proteïne van belang peptide in de biotrophic interactie zone, is de codering regio gesmolten in de reeks van de peptide signaal van U. maydis Umpit221 (Figuur 1). Bij U. maydis transformatie, de transgenic wordt ingevoegd aan het SG200 ip-locus door homologe recombinatie en gerichte genoom invoeging door zuidelijke vlekkenanalyse kan worden geverifieerd. Secretie van de fusieproteïne wordt bevestigd door confocale laser scanning microscopische beeldvorming in zaailing verlaat geïnfecteerd met een Trojaans paard stam (Figuur 3). Als voorbeeld, zaailingen die besmet zijn met ofwel de spanning U. maydis Trojaans paard SG200Zmmac1 afscheidende een ZmMAC1-mCHERRY of een niet-Trojaans paard besturingselement stam waarin noSP-Zm-mac1-mCHERRY die mist de Umpit2- SP en nadien niet geheim de ZmMAC1-mCHERRY-HA eiwit, worden weergegeven in Figuur 315. Hyphae afscheidende ZmMAC1 zijn omringd door fluorescerende mCherry signaal (figuur 3A). Daarentegen Toon niet-afscheidende schimmeldraden alleen fluorescentie signaal in de schimmel cytoplasma (figuur 3B).
In het bijzonder afhankelijk kwast infectie met U. maydis van goede weefsel inoculatie, zoals beschreven in stap 3.5. Oneigenlijk pluim lokalisatie of ongelijke verdeling van het entmateriaal kan resulteren in niet-besmette kwast (figuur 4A) of slechts gedeeltelijke infectie van de kwast (figuur 4B). Om te verzekeren de gelijkmatige verdeling, moet het entmateriaal worden langzaam vrijgegeven van de inoculatie naald te verwerven van de gehele weefsel infectie (figuur 4C). Levensvatbaarheid van de entmateriaal kan worden geverifieerd door een druppel op de PD-houtskool agar te plaatsen. Besmettelijke stammen vormen door samensmelting van filamenten verschijnen zoals schrijven pluis op de plaat als de solopathogenic paard van Troje voorlopercellen stam SG200 getoond (figuur 5A) terwijl de stam van de U. maydis die fb1 vereist paring voordat besmettelijke gloeidraad vorming ( Figuur 5B).
| Naam | Primer toevoeging | Volgorde (5´→3´) |
| Voorwaarts | Gene XbaI-maïs | GCTCTAGA... |
| Omgekeerde | NcoI-RSIATA-maïs gen | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG... |
Tabel 1: Sequenties van primer toevoegingen beperking zijden en de RSIATA motif codering volgorde naar de maïs gen van belang toe te voegen.
Figuur 1 : Schematisch overzicht van de U. maydis paard van Troje plasmide klonen strategie. ZMmac1 (lichtgrijs) is vrijgegeven door dubbele digest van p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha. Daarnaast heeft wordt het gen van belang (geel) versterkt door PCR. Voor het klonen van doel, voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn ontworpen waaronder Xbaik en Ncoik klonen sites en een RSIATA linker (paars). Het PCR-product wordt verteerd met Xbaik en Ncoik. Na afbinding, het paard van Troje plasmide bevat de volgende elementen: gedreven door de Umpit2 promotor, een Umpit2-SP (blauw) N-terminaal is gesmolten tot een maïs gen van belang ORF (geel). Bij de C-terminus, de linker van een RSIATA, een mCHERRY verslaggever gen (rood) en een HA epitoop tag (groen) worden gevolgd door een stop codon gesmolten. Voorafgaand aan U. maydis transformatie, het paard van Troje plasmide wordt verteerd met Sspik toe homologe integratie in de U. maydisip-locus (grijs). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Licht-microscopisch onderzoek van U. maydis inoculatie cultuur. Verschillende sigaar-vormige U. maydis sporidia zichtbaar zijn, waarvan sommige ondergaan ontluikende (aangegeven met een asterisk). Geen verdere cellen zijn aanwezig die wijzen op een besmetting van de cultuur. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : In planta confocale laser scanning van microscopische beeldvorming van een Ustilago Paard van Troje stam. Beeldvorming van het mCherry-gesmolten maïs eiwit ZmMAC1 na maïs zaailing infectie met behulp van het paard van Troje stam SG200Zmmac1 (A) of een niet-Trojaans paard stam SG200Zmmac1- noSP ontbreekt de Umpit2-SP (B). Secreted ZmMAC1-mCHERRY-HA fusieproteïne bevindt zich op het oppervlak van U. maydis schimmeldraden (A)15, aangegeven door de pijl hoofden. In SG200Zmmac1- noSP alleen cytoplasmatische lokalisatie van ZmMAC1 is zichtbaar (B), aangegeven door het sterretje 15. Schaal bars = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Klosje infectie met U. maydis. Mislukte infectie van kwast met U. maydis (A), gedeeltelijke kwast infectie (B) en volledige kwast infectie (C) 12 dagen na infectie worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Entmateriaal levensvatbaarheid assay op PD-houtskool agar. De solopathogenic-stam SG2001 werd gebruikt voor paard van Troje generatie. SG200 is zelf stimulerende en besmettelijke gloeidraden vormt op een PD-houtskool agarplaat (A). De haploid U. maydis stam FB1 vereist paring met een compatibel stam voorafgaand aan draadvormige groei (B)22. Schaal bars = 2 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Moderne gewas onderzoek eist protocollen voor moleculaire analyse van genetische en eiwitniveaus. Genetische toegankelijkheid via transformatie is niet beschikbaar of inefficiënte en tijdrovende voor de meeste soorten van gewassen zoals maïs. Bovendien zijn betrouwbare genetische hulpmiddelen zoals promotor verslaggever systemen schaars is, waardoor het moeilijk is om te studeren in situ eiwitfunctie met hoge Spatio resolutie op verschillende weefsel sites. Die apoplastisch eiwitten kunnen worden bestudeerd door infiltratie van geïnfecteerd uitgedrukt en de zuivere eiwitten in weefsels. Echter, ondanks de vooruitgang in heterologe eiwit expressie, gerichte infiltratie in gewas weefsels blijft moeilijk en vaak inefficiënt voor eiwit functionele analyse. De strategie van het paard van Troje is een alternatieve benadering die geen transformatie of eiwit infiltratie vereist. Door gebruik te maken van het apparaat van de secretie van de maïs pathogen U. maydis, kan levering van theoretisch een proteïne van belang in de apoplast van de plant van geïnfecteerd weefsel worden bereikt. Met betrekking tot de grootte van een proteïne van belang, de grenzen van deze techniek nog moeten worden onderzocht. In de voormalige testen was de 290 aminozuren U. maydis effector die cmu1 tot mCherry gesmolten met succes secreted7. De toepasbaarheid van de methode van het paard van Troje aan grotere eiwitten moet echter nog worden getest. Als toevoegingen van posttranslationele modificaties aan de proteïne van belang ongewenst zijn, kan onconventionele secretie worden gebruikt als een alternatieve route naar klassieke secretie via SP14.
U. maydis is werkzaam als een standaardhulpmiddel in eiwit biotechnologie vanwege betrouwbare eiwitvouwing, posttranslationele modificatie en secretie efficiëntie11,12,13. Eiwit secretie voor elke nieuwe paard van Troje stam moet echter zorgvuldig worden geanalyseerd zoals beschreven in stap 3. Het wordt aanbevolen om een eerste testen van elke stam nieuw gegenereerde Trojaans paard door het infecteren van zaailingen die makkelijk zijn te infecteren en te inspecteren door microscopische beeldvorming.
SG200 is een stam van de solopathogenic die vereist geen paring voorafgaand aan de experimenten van het paard van Troje en dus gemakkelijker te hanteren is. Hoewel de infectie efficiëntie van compatibele stammen zoals FB1 en FB2 is hogere23, de efficiëntie van SG200 is voldoende voor paard van Troje experimenten. Sommige U. maydis effector eiwitten worden overgenomen door de cellen van de gastheer, terwijl anderen in de apoplast blijven. Het onderscheid tussen beide groepen lijkt te zijn van een gecontroleerde en specifieke proces; echter de onderliggende mechanismen blijven elusive8 en niet in aanmerking worden genomen bij het ontwerpen van een experiment. Eiwitten van belang die moeten worden geïntegreerd in de celwand of dat moet handelen intracellulair zijn daarom geen geschikte kandidaten voor de aanpak van het paard van Troje.
Aangezien U. maydis almachtig is in het infecteren van uiteenlopende luchtfoto maïs weefsels, het paard van Troje-methode kan worden toegepast voor meerdere eiwitten, in verschillende weefsels en bij verschillende plant ontwikkelingsstadia, zoals zaailing bladeren, volwassen bladeren, kwasten, en oren. Om slechts een paar nuttige toepassingen te noemen, kunt het paard van Troje testen lokale overdosering, buitenspel eiwit effecten of functionele karakterisering van verschillende eiwitten domeinen.
Handhaving van een niet-verontreinigde U. maydis is cultuur van cruciaal belang voor alle beschreven experimenten omdat co-infectie met een grote hoeveelheid bacteriën de immuunrespons van de plant activeert en haar reactie naar de proteïne van belang verandert, waardoor een resultaten niet overtuigend. Paard van Troje studies in volwassene verlaat, kwastjes en oren moeten worden uitgevoerd met maximaal 1,5 mL infectie cultuur zoals hogere volumes leiden weefselschade tot kunnen. Kwast en oorinfecties kunnen worden getraind met behulp van voedsel kleur-gekleurd water in plaats van Ustilago entmateriaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedank Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella en Armin Hildebrand voor het verstrekken van lab ruimte en plant materiaal. Het originele werk op het paard van Troje-methode werd gesteund door een Leopoldina postdoc fellowship en NSF project IOS13-39229. Het werk gepresenteerd in dit artikel werd gesteund door SFB924 (projecten A14 en B14) van de DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
