Summary
Dette verket beskriver kloning av en Ustilago maydis trojansk hest belastning for i situ levering av utskilles mais proteiner i tre typer mais vev.
Abstract
Inspirert av Homer´s Trojan hest myte, vi utviklet mais patogen Ustilago maydis å levere utskilles proteiner i mais apoplast tillater i vivo fenotypiske analyse. Denne metoden er avhengig ikke av mais transformasjon, men utnytter mikrobiell genetikk og sekretoriske evner av patogener. Dette dokumentet, innrømmer den inspeksjon av i vivo levert utskilles proteiner med høy spatiotemporal oppløsning på forskjellige typer infeksjon nettsteder og vev. Trojansk hest strategien kan benyttes for å utfylle mais tap-av-funksjon fenotyper, funksjonelt betegner protein domener, analysere off-målet protein effekter eller studere onside protein overdosage, gjør det et kraftig verktøy for transiently protein studier i mais beskjære systemet. Dette arbeidet inneholder en presis protokoll på hvor å utvikle en trojansk hest belastning etterfulgt av standardiserte infeksjon-protokoller for å bruke denne metoden på tre forskjellige mais vev typer.
Introduction
Biotrophic patogen Ustilago maydis er den utløsende agenten av mais sote sykdom1. Den infiserer alle antennen deler av mais som resulterer i store svulster som inneholder melanized, svart sporer. På det globale nivået anslås U. maydis for å forårsake en årlig tap på rundt 2% av mais avkastning, mens svulster er verdsatt som en gastronomisk delikatesse i Mexico. Anlegget infeksjon er initiert av en appressorium som skiller celleveggen lysing enzymer for å trenge gjennom det første laget av mais epidermal celler. Fra en primær infeksjon nettsted, U. maydis vokser intracellulært og intercellularly, invadere en til to cellen lag hver dag1,2. Vellykket infeksjon resultater i anlegget hypertrofi som blir synlige svulster på fem dager legge infeksjon1,3,4. Under alle infeksjon stadier invaginate fungal hyfer plante cytoplasma membranen uten noen direkte kontakt til verten cytoplasma1,2. Stram apoplasmic avstanden mellom de infisere hyfer og plante plasma membranen anses å være vert/patogen interaktive området, kalt biotrophic samspill sonen. For å overvinne plante medfødte immunsystemet, ut U. maydis en rekke effektor proteiner i biotrophic interaksjon sone1. Noen effektor er tatt opp av plante celler, mens andre forblir i biotrophic interaksjon sone5,6,7,8. En apoplastic effektor er UmPit2, som kommuniserer med apoplastic mais proteaser å hindre utgivelsen av signalnettverk peptid ZmZIP1 fra ZmPROZIP av apoplastic protease aktivitet9,10.
De siste tiårene, U. maydis ble ikke bare en modell for sopp genetikk i plante-patogen interaksjon, men også et verdifullt verktøy i bioteknologi på grunn av en godt forstått livssyklus, lett genetisk tilgjengelighet og heterologous uttrykk for utskilles proteiner11,12,13. Signaler for begge konvensjonelle og ukonvensjonelle protein sekresjon har fastslått at kontroll av posttranslational modifikasjoner14. U. maydis ble nylig ansatt som et trojansk hest-verktøy for å studere små, utskilles mais proteiner i situ15. Trojansk hest tilnærming ble brukt til å analysere funksjonen til små, utskilles protein ZmMAC1 som er involvert i anther utvikling. ZmMAC1 induserer periclinal delingen av pluripotent celler og celle skjebne spesifikasjon av nydannede celler15. På samme måte, ble biologiske funksjonen av mais skade-assosiert peptid ZmZIP1 avslørt. U. maydis sekresjon mais ZmZIP1 resulterte i nedsatt tumor formasjon10. Dermed trojansk hest tilnærming representerer en verdifull alternativ rute til proteinet i situ studier med spatiotemporal med høy oppløsning som ikke verken krever generasjon stabil mais transformasjon linjer eller vev infiltrasjon med heterologously uttrykt og renset proteiner. Spesielt kan trojansk hest strategien utskillelsen av noen heterologous protein i mais apoplast og direkte sammenligning av infiserte versus ikke-infiserte anlegget celler i samme vev.
Denne protokollen illustrerer de viktigste trinnene for å generere en U. maydis trojansk hest belastning å studere et protein av interesse. Ytterligere inkluderer presis informasjon om infeksjon prosedyrer av tre forskjellige mais vev (voksen blader, dusker og ører) med U. maydis, som er en forutsetning for å studere spatiotemporal infeksjon progresjon og protein funksjonen i disse mål vev. Ingen ytterligere spesifikasjoner er gitt på mais gene forsterkning og mikroskopiske imaging teknikker, siden disse trinnene er målet spesifikke og instrument-avhengige. Derfor er denne protokollen adressert til erfarne brukere av standard molekylærbiologi teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bygging av en U. maydis trojansk hest
Merk: Se figur 1.
- Forsterke et genet av interesse fra mais cDNA gen-spesifikke primer og en korrekturlesing DNA polymerase. Klone primære PCR produktet og Konstruer forvandle E. coli følge plasmider leverandørens instrukser. Kontroller riktig genet av interesse av Sanger sekvensering før bruk neste kloning trinnene.
Merk: PCR spesifikasjoner må optimaliseres primer sekvens særegenheter og optimal DNA polymerase reaksjonen forhold. - Design primere å forsterke mais genet av interesse uten sekvensen koding et signal peptid (SP).
- Utvide 5´ slutten av omvendt primer med RSIATA motivet og en Ncojeg kutte nettsted (tabell 1).
- Forsterke mais genet av interesse med en korrekturlesing DNA polymerase bruker PCR Konstruer generert i 1.1 som malen PCR.
- Dobbel-digest PCR produktet og U. maydis transformasjon plasmider, p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, Xbajeg og Nco I. renser fordøyd PCR produkt og plasmider.
- Ligate fordøyd PCR produktet i p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha malen T4 DNA ligase følge instruksjonene for manufacturer´s. Forvandle ligation produktet til E. coli og verifisere riktig genet av interesse av Sanger sekvensering.
- Linearize den p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgenet av interesse-mCherry-Ha med begrensning enzymet Sspjeg og transformere DNA i solopathogenic U. maydis belastning SG20016. Isolere U. maydis transformants ved carboxin utvalg og bekrefte isolert transformants av sørlige blot analyse16.
Merk: For hver protein av interesse, minst tre uavhengige U. maydis transformants skal være isolerte og analyseres for å beregne noen fenotypen effekter av tilfeldig bakgrunn mutasjoner.
2. kultur medier
- Forberede YEPSlight flytende medium16: 1,0% (w/v) gjærekstrakt, 0,4% (w/v) Bacto-pepton og 0,4% (w/v) sukrose. Oppløse alle komponenter i ddH2O og autoklav 121 ° c i 15 min; autoklavering ved høyere temperatur, for en lengre periode eller gjentatte ganger vil redusere kvaliteten på mediet.
- Forberede potet-druesukker-agar (PD-agar)20: 3,9% (w/v) potet druesukker agar, og 1,0% (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0,01 M). Bland alle komponenter i flasken for autoklavering og legge ddH2O pluss en magnetic røre bar. Autoclave 121 ° c i 15 min; autoklavering ved høyere temperatur, for en lengre periode eller gjentatte ganger vil redusere kvaliteten på mediet.
- Forberede PD-kull agar20: 3,9% (w/v) potet druesukker agar, 1% (w/v) kull og 1,0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0,01 M). Bland alle komponenter i flasken for autoklavering og legge ddH2O pluss en magnetic røre bar. Autoclave 121 ° c i 15 min; autoklavering ved høyere temperatur, for en lengre periode eller gjentatte ganger vil redusere kvaliteten på mediet.
3. anlegget infeksjon
- Utføre analyse av mais celledeling trojansk hest levert protein (f.eks mikroskopi-baserte celle teller) som svar på forhånd. U. maydis -indusert mais celle spredning og påfølgende tumor formasjon starter rundt 4-5 dager innlegget infeksjon. Kvantitativ sykdom vurderinger er vev-avhengige og skal utføres fra 6 til 14 dager innlegget infeksjon.
Merk: Forskjellige mais sorter viser ulike nivåer av mottakelighet for U. maydis infeksjon. Mais cg. W23, A188, Gaspe flint, tidlig Golden Bantam eller Va35 viser mottakelighet mot denne patogen og er dermed egnet kultivarer for trojaneren studier. - Utarbeidelse av U. maydis inoculum
- Inkluder stamfar belastningen SG200 som en negativ kontroll alle trojansk hest eksperimenter for å anslå bivirkninger på infeksjon av transgene belastningen. Her, bruk en U. maydis belastning uttrykke en ikke-utskilles versjon av proteinet rundt som en negativ kontroll. Men på grunn av gjennomførbarhet (f.eks større visninger), kan stamfar belastningen være enklere valg av kontroll.
- Før du starter eksperimentet, kan du anslå hvilke mengder infeksjon kultur er nødvendig. Husk på at infeksjon av hver plante krever 1-1,5 mL U. maydis suspensjon avhengig av hvilken type mais vev.
Merk: Ca 1 mL av en overnatting kultur er tilstrekkelig for fortynning et OD600 0,2 i 20 ml YEPSlys middels 25 mL av en U. maydis kultur med et OD600 0,8-1,0 er tilstrekkelig for infeksjon i 13-16 planter. - Scratch U. maydis fra en PD agar plate med en bakteriefri Pasteur pipette, vaksinere i 5 mL YEPSlys middels og la kulturen vokse på 28 ° C med konstant rister på 200 rpm 16 h.
- Før infeksjon, undersøke U. maydis inoculation kulturen ved standard * lys for riktig vekst og bakteriell forurensning på 400 X forstørrelse.
Merk: I en egnet kultur er bare sigar-formet soppen synlig (figur 2). - Bland 900 µL av fersk YEPSlys med 100 µL av natten kultur og måle OD600 med YEPSlys medium som en tom i spektrofotometer analysen.
- Fortynne overnatting kulturen med fersk YEPSlys medium til et OD600 av 0,2 og la kulturen vokse på 28 ° C med konstant rister på 200 rpm til nå midt Logg vekstfase angitt med et OD600 nm 0,8-1,0.
Merk: U. maydis celler kopiere hver 2t under disse forholdene, dermed ønsket OD600 nås etter 4-5 h dyrking. - Høste cellene på OD600 0,8-1,0 av snurrende 3000 x g i 10 min og kast nedbryting.
- Vask celle pellet én gang med ddH2O. For dette formålet, legge til en kultur volum av ddH2O, spinne 3000 x g i 10 min og kast nedbryting.
- Resuspend celle pellet nøye i ddH2O ved hjelp av en 20-mL glass pipette, og justere den endelige OD600 3.0 (for en trojansk hest analysen) eller 1.0 (for sykdom rating).
- Verifisering av trojaneren: i planta utskillelsen av mais fusion protein
- Infisere mais planter med en trojansk hest belastning17.
- Utføre mikroskopiske bildebehandling av infiserte frøplanter på 2-3 dager innlegget infeksjon med AC confocal laser-skanning mikroskop. Dette avgiftsdirektoratet et rektangulært stykke blad 1 cm nedenfor poenget med injeksjon, plasser prøven på en microscope skyve og legge en dråpe ddH2O. For å visualisere mCherry fusion protein, opphisse prøven på λ = 561 nm og posten utslipp på λ = 580-630 nm.
- Infeksjon av voksen mais blader
- Dyrke mais planter til stadium av voksen blader (når minst blad 7 vokser i stilken).
Merk: Denne scene er nådd etter fire uker på såing under drivhus forhold 14 h, 28 ° C dag/10 h, 22 ° C natt rytme med cv. W23. Varighet kan variere med mais sorten og drivhus forhold. - Overføre U. maydis kultur (se 3.2.9) i en 3-mL sprøyte med en 20G x 1 sprøyte nål.
- Trykk stilken nøye for å lokalisere meristem vevet i stilken. Grunnlaget for meristem kan være preget av en overgang fra vanskeligere stilken til mykere vev.
- Merk meristem stengel bruke penn.
- Injisere 1,5 mL U. maydis kultur 1 cm over skyte meristem eller sitter meristem.
- Vurdere sykdomssymptomer på 6 og 12 dager innlegget infeksjon.
- Dyrke mais planter til stadium av voksen blader (når minst blad 7 vokser i stilken).
- Infeksjon av frynser
- Dyrke mais planter fram dusk scenen.
Merk: En detaljert tidslinje på anther og dusk i mais cv. W23 var tidligere beskrevet1819. Dusker med pre meiotic anthers er svært utsatt for U. maydis infeksjon; den mais cv. W23 er dusker størrelsen på 4-7 cm. - Trykk stilken nøye for å lokalisere dusken i stammen.
- Merk spissen og undersiden av dusken på stammen bruke penn.
- Overføre U. maydis kultur (se 3.2.9) i en 3-mL sprøyte med en 20G x 1 sprøyte nål.
- Injisere 1,5 mL inoculum rundt dusken. For å sikre lik fordeling av inoculum, langsomt plass 0,5 mL spissen, den midtre delen, og bunnen av dusken merket med pennen.
- Rangere sykdomssymptomer på 10 dager innlegget infeksjon.
- Dyrke mais planter fram dusk scenen.
- Infeksjon ører
Merk: øret vev utvikling skiller distinkte mais sorter og drivhus forhold og må følges nøye før vaksinering. Ørene begynner å vokse silke er svært utsatt for U. maydis infeksjon.- Overføre U. maydis kultur (se 3.2.9) 3 mL sprøyter med en 20 G x 1 sprøyte nål til.
- Injisere inoculation nålen i mellomrommet mellom skrelle bladene så dypt som mulig uten å skade øret.
- Slipp 1,5 mL inoculum rundt øret.
- Fjern sprøyten og nål og forsiktig massasje cob å distribuere U. maydis løsningen like.
- Rangere sykdomssymptomer på 14 dager innlegget infeksjon.
- Bekrefte levedyktigheten til U. maydis inoculum
- Slippe 10 µL av inoculum på en PD trekull agar plate og ruge ved romtemperatur for 2 dager.
Merk: Hvis de respektive U. maydis kultur er kjøpedyktig skjemaet filamenter, myke, hvite mycel blir synlig (figur 5)
- Slippe 10 µL av inoculum på en PD trekull agar plate og ruge ved romtemperatur for 2 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruksjoner for U. maydis trojansk hest eksperimenter er klonet i plasmider p123-PUmpit2-SpUmpit2-genet av interesse-mCherry-Ha. Mais genet av interesse er smeltet mCherry fluorescens reporter og en epitope HA-kode. Uttrykket av fusion protein er under kontroll U. maydis Umpit2 som aktiveres spesielt under infeksjon21. Å direkte sekresjon av protein av interesse peptid samhandling-sonen biotrophic, er koding regionen smeltet signal peptid sekvensen U. maydis Umpit221 (figur 1). På U. maydis transformasjon av transgene settes inn i SG200 ip-locus av homologe rekombinasjon, og målrettet genomet innsetting kan verifiseres ved Southern blot analyse. Utskillelsen av fusion protein er bekreftet av AC confocal laserskanning mikroskopiske imaging i frøplante forlater infisert med en trojaner belastning (Figur 3). Som et eksempel, seedlings infisert med enten U. maydis trojansk hest belastningen SG200Zmmac1 sekresjon en ZmMAC1-mCHERRY eller en trojansk hest kontroll belaste uttrykke noSP-Zm-mac1-mCHERRY som mangler Umpit2- SP og deretter ikke ikke hemmeligheten til ZmMAC1-mCHERRY-HA protein, er vist i Figur 315. Hyfer sekresjon ZmMAC1 er omgitt av fluorescerende mCherry signal (figur 3A). Derimot viser ikke-sekresjon hyfer bare fluorescens signal i fungal cytoplasma (figur 3B).
Spesielt avhengig dusk infeksjon med U. maydis riktig vev inoculation, som beskrevet i trinn 3.5. Uriktig dusk lokalisering eller skjeve fordelingen av inoculum kan resultere i ikke-infiserte dusk (figur 4A) eller bare delvis infeksjon av dusken (figur 4B). For å sikre jevn fordeling, må inoculum frigis sakte på vaksinering p å kjøpe hele vev infeksjon (figur 4C). Levedyktigheten til inoculum kan verifiseres ved å plassere et slippverktøy på PD-kull agar. Smittsomme stammer danner filamenter vises som skriver fluff på tallerkenen som vises solopathogenic trojansk hest stamfar belastning SG200 (figur 5A) mens U. maydis belastningen FB1 krever paring før smittsomme filament dannelse ( Finne 5B).
| navn | Primer-tillegg | Sekvens (5´→3´) |
| Fremover | XbaI-mais genet | GCTCTAGA... |
| Omvendt | NcoI-RSIATA-mais genet | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG... |
Tabell 1: Sekvenser av primer tillegg til begrensning sider og RSIATA motivet koding rekkefølge til mais genet av interesse.
Figur 1 : Skjematisk oversikt over den U. maydis trojansk hest plasmider kloning strategi. ZMmac1 (lys grå) er utgitt av dobbel digest fra p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha. Parallelt, er genet av interesse (gul) forsterket av PCR. For kloning formål, forover og bakover grunning er utformet som inkluderer Xbajeg og Ncojeg kloning områder og et RSIATA linker (lilla). PCR produktet er fordøyd med Xbajeg og Ncojeg. Etter hemorroider, trojaner plasmider inneholder følgende elementer: drevet av Umpit2 selskapet, en Umpit2-SP (blå) er smeltet N-Terminal til en mais genet av interesse ORF (gul). C-terminus, et RSIATA linker, en mCHERRY reporter genet (rød) og en HA epitope kode (grønn) er smeltet etterfulgt av en stopp codon. Før U. maydis transformasjon, trojaner plasmider er fordøyd med Sspjeg tillate homologe integrering i U. maydisip-locus (grå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Lys-mikroskopisk undersøkelse av U. maydis inoculation kultur. Flere sigarformet U. maydis sporidia er synlige, hvorav gjennomgå spirende (angitt med stjerner). Ingen ytterligere celler finnes noe som skulle tilsi en forurensning av kulturen. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : I planta AC confocal laserskanning mikroskopiske avbildning av en Ustilago Trojansk hest belastning. Bildebehandling av mCherry-smeltet mais protein ZmMAC1 etter mais frøplante infeksjon trojansk hest belastningen SG200Zmmac1 (A) eller en trojansk hest belastning SG200Zmmac1- noSP mangler Umpit2-SP (B). Skilles ut ZmMAC1-mCHERRY-HA fusion protein ligger på overflaten av U. maydis hyfer (A)15, angitt med pilen hodene. SG200Zmmac1- noSP bare cytoplasmatiske lokalisering av ZmMAC1 er synlig (B), angitt av stjerne 15. Skalere barer = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Tassel infeksjon med U. maydis. Mislykket infeksjon av dusken U. maydis (A), delvis dusk infeksjon (B) og fullstendig dusk infeksjon (C) dager etter smitte vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Inoculum levedyktighet analysen på PD-kull agar. Den solopathogenic stammen SG2001 ble brukt for trojaneren generasjon. SG200 selv stimulerende og danner smittsomme filamenter på en PD-kull agar plate (A). Haploid U. maydis belastning FB1 krever paring med en kompatibel belastning før trådformede vekst (B)22. Skalere barer = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Moderne beskjære forskning krever protokoller for molekylær analyse på genetisk og protein nivå. Genetisk tilgjengelighet via transformasjon er ikke tilgjengelig eller ineffektiv og tidkrevende for beskjære artene som mais. Videre er pålitelig genetisk verktøy som formidler reporter systemer knappe, som gjør det vanskelig å studere i situ protein funksjon med høy spatiotemporal oppløsning på forskjellige vev steder. Apoplastic proteiner kan studeres ved infiltrasjon av heterologously uttrykt og renset proteiner i vev. Til tross for fremskritt i heterologous protein uttrykk imidlertid målrettet infiltrasjon i avling vev vanskelig og ofte ineffektive for protein funksjonsanalyse. Trojansk hest strategien er en alternativ tilnærming som ikke krever transformasjon eller protein infiltrasjon. Ved å bruke sekresjon apparatet av mais patogen U. maydis, kan levering av teoretisk noen protein rundt i anlegget apoplast av infiserte vev oppnås. Om størrelsen på et protein av interesse, grensene for denne teknikken har ennå å bli utforsket. I tidligere analyser var 290 aminosyrer U. maydis effektor Cmu1 del mCherry vellykket utskilles7. Men gjenstår anvendelsen av metoden trojansk hest større proteiner å bli testet. Hvis tillegg posttranslational modifikasjoner til protein av interesse er uønsket, kan ukonvensjonelle sekret brukes som en alternativ rute til klassisk sekresjon via SP14.
U. maydis er ansatt som et standardverktøy i protein bioteknologi på grunn av pålitelig proteinfolding posttranslational endring og sekresjon effektivitet11,12,13. Likevel må protein sekresjon for hver ny trojansk hest belastning analyseres nøye som beskrevet i trinn 3. Det anbefales å utføre en innledende testingen av alle nyopprettede trojaneren belastning ved å infisere planter som er enkle å infisere og inspisere av mikroskopiske tenkelig.
SG200 er en solopathogenic stamme som ikke krever paring før trojansk hest eksperimenter og er derfor lettere å håndtere. Selv om infeksjon effektiviteten av kompatibel stammer som FB1 og FB2 er høyere23, effektiviteten av SG200 er tilstrekkelig for trojaneren eksperimenter. Noen U. maydis effektor proteiner er tatt opp av vertsceller, mens andre forblir i apoplast. Differensiering mellom begge grupper synes å være en kontrollert og bestemt prosess. men de underliggende mekanismene forblir unnvikende8 og kan ikke tas i betraktning når du utformer et eksperiment. Derfor finnes proteiner av interesse som må integreres i cellen vegg eller som må handle intracellulært ingen passende kandidater for trojaneren tilnærming.
Siden U. maydis er allmektig i infisere mangfoldig antenne mais vev, trojaner-metoden kan brukes for flere proteiner, i forskjellige vev og annen plante utviklingsstadier, som frøplante blader, voksen blader, dusker, og ører. For å nevne bare noen nyttige programmer, kan trojaneren teste lokale overdosage, offside protein effekter eller funksjonell karakteristikk av forskjellige protein domener.
Opprettholde en forurenset U. maydis er kultur avgjørende for alle beskrevet eksperimenter siden co infeksjon med mye bakterier utløser anlegget immunrespons og endrer sin reaksjon mot protein av interesse, dermed gjengi noen resultater mangelfulle. Trojansk hest studier i voksen blader, dusker og ører må utføres med maksimalt 1,5 mL infeksjon kultur som høyere volumer kan føre til skade på vev. Dusk og øret infeksjoner kan trenes med mat farge-beiset vann i stedet for Ustilago inoculum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella og Armin Hildebrand for å gi lab plass og plante materiale. Den opprinnelige arbeidet på trojansk hest metoden ble støttet av en Leopoldina postdoktor fellesskap og NSF prosjekt IOS13-39229. Arbeidet presentert i denne artikkelen ble støttet av SFB924 (prosjekter A14 og B14) av DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
