Summary
Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.
Abstract
Homer´s Truva atı mit esinlenerek, Mısır patojen Ustilago maydis salgılanan proteinler içinde vivo fenotipik analiz izin Mısır apoplast sunmak için tasarlanmış. Bu yöntem Mısır dönüşüm üzerinde dayanmaz Ancak mikrobiyal genetik ve patojenlerin salgı yetenekleri olağanüstü başarı. Burada, içinde vivo incelenmesi salgılanan proteinler kronolojik zamanmekansal çözünürlükte yüksek enfeksiyon siteleri ve doku çeşitleri ile teslim sağlar. Truva atı strateji-ebilmek var olmak kullanmak geçici işlevsel olarak protein etki alanları, hedef protein etkilerini incelemek veya ofsayt protein overdosage, güçlü bir araç yapmak için çalışmaya karakterize etmek için Mısır işlev kaybı fenotipleri tamamlayacak protein çalışmaları Mısır ürün sistem. Bu eser üç farklı Mısır doku türü için bu yöntemi uygulamak için standart enfeksiyon protokolleri takip bir Truva atı yük oluşturmak nasıl kesin bir iletişim kuralını içerir.
Introduction
Biotrophic patojen Ustilago maydis Mısır kurum hastalığı1hastalığının olduğunu. Mısır melanized, siyah sporları içeren büyük tümör içinde kaynaklanan tüm hava parçaları bozar. Küresel düzeyde, U. maydis tümörü Meksika'da lezzetin bir incelik olarak takdir edilmektedir iken Mısır verimi, yaklaşık % 2 yıllık bir kaybına neden tahmin edilmektedir. Bitki enfeksiyon Mısır epidermal hücrelerin ilk tabakası nüfuz hücre duvarı lysing enzimler salgılar bir appressorium tarafından başlatılır. Bir birincil enfeksiyon sitesinden bir-iki hücreyi istila katmanlar her gün1,2, intracellularly ve intercellularly U. maydis yetişir. Beş gün üzerine görünür tümör dönüşüyor bitki hipertrofisi sonuçlarında başarılı enfeksiyon enfeksiyon1,3,4posta. Bütün enfeksiyon aşamaları sırasında mantar hif bitki sitoplazma membran ana makine sitoplazma1,2için doğrudan herhangi bir temas olmadan invaginate. Bitki plazma zarı arasındaki bulaşmasını hif sıkı apoplasmic alanı biotrophic etkileşim bölgesi adı verilen ana bilgisayar/patojen interaktif sitesi olarak kabul edilir. Bitki doğuştan gelen bağışıklık sistemi üstesinden gelmek için U. maydis bir dizi efektör proteinlerin biotrophic etkileşim bölgesi1salgılar. Diğerleri biotrophic etkileşim bölgesi5,6,7,8' kalır bazı effectors bitki hücreleri tarafından alınır. Bir apoplastic efektör UmPit2, sinyal peptid ZmZIP1 apoplastic proteaz aktivitesi9,tarafından ZmPROZIP üzerinden10sürümü önlemek için apoplastic Mısır proteaz ile etkileşim olduğunu.
Son on yıl boyunca U. maydis mantar genetik bitki patojeni etkileşim içinde aynı zamanda iyi anlaşılmış bir yaşam döngüsü, kolay genetik erişilebilirlik nedeniyle biyoteknoloji değerli bir araç için sadece bir model oldu değil ve kapaklı ifade salgılanan proteinler11,12,13. Her iki geleneksel ve sıradışı protein salgılanması için sinyalleri ardından değişiklikler14kontrol sağlayan tespit edilmiştir. Son zamanlarda, küçük, çalışmaya bir Truva atı araç salgılanan gibi Mısır proteinler in situ15 U. maydis istihdam edildi. Truva atı yaklaşım şekilde küçük, salgılanan protein anter geliştirmede söz konusu ZmMAC1 işlev analiz etmek için kullanıldı. ZmMAC1 pluripotent hücreler ve yeni kurulan hücreleri15hücre kader tayini periclinal bölümü neden olmaktadır. Aynı yöntemle Mısır hasar ilişkili peptid ZmZIP1 biyolojik fonksiyonu ortaya çıktı. ZmZIP1 sonuçlandı Mısır salgılayan U. maydis tümör oluşumu10Engelli. Böylece, Truva atı yaklaşım temsil in situ çalışmalar ne yapar kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüklü protein için değerli bir alternatif yol istemek istikrarlı Mısır dönüştürme satırları ne de doku infiltrasyonu ile nesil heterologously ifade ve saf protein. Özellikle, Truva atı strateji Mısır apoplast kapaklı herhangi bir protein salgılanması ve aynı doku içindeki sigara enfekte bitki hücreleri enfekte karşı doğrudan karşılaştırma sağlar.
Bu iletişim kuralı bir protein ilgi çalışmaya bir U. maydis Truva atı gerginlik getirici için başlıca adımları göstermektedir. Hangi kronolojik zamanmekansal enfeksiyon ilerleme ve protein işlevi eğitim için bir önkoşuldur U. maydisile daha fazla üç farklı Mısır doku türü (yetişkin yapraklar, püsküllü ve kulakları) enfeksiyon yordamları hakkında kesin bilgiler içerir Bu hedef dokulara. Daha fazla hiçbir belirtim Mısır gene amplifikasyon üzerinde verilen ve mikroskobik adımları hedef özgü ve enstrüman bağımlı olduğundan teknikleri, görüntüleme. Böylece, bu iletişim kuralı standart moleküler biyoloji teknikleri deneyimli kullanıcılara yöneliktir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bir U. maydis Truva atı inşaatı
Not: Bkz: Şekil 1.
- Bir gen Mısır cDNA gene özgü astar ve proofreading bir DNA polimeraz kullanarak dan ilgi yükseltmek. Birincil PCR ürünü klon ve plazmid satıcının talimatları. E. coli inşa dönüştürmek Faiz sırası Sanger sıralama sonraki klonlama adımlar için kullanmadan önce tarafından doğru gen doğrulayın.
Not: PCR özellikleri astar sıra özelliklerine ve en uygun DNA polimeraz reaksiyon koşulları nedeniyle optimize edilmiş olması gerekir. - Mısır gen ilgi olmadan bir sinyal peptid (SP) kodlama sırası yükseltmek için tasarım astar.
- RSIATA motifi ve bir Astsubayile ters astar 5´ sonunu uzat ben kesme makinası (Tablo 1).
- 1.1 PCR şablon olarak oluşturuldu PCR yapı kullanarak okuma DNA polimeraz ile ilgi Mısır gen yükseltmek.
- Çift-Özet PCR ürünü ve U. maydis dönüştürme plazmid, p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha15, Xbaile ben ve Astsubay I. arındırmak sindirilir PCR ürünü ve plazmid.
- Sindirilir PCR ürünü T4 DNA ligaz manufacturer´s talimatları kullanarak p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Ha şablonu içine ligate. E. coli tüp ligasyonu ürün dönüştürmek ve faiz sırası Sanger tarafından doğru gen doğrulayın sıralama.
- P123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmfaiz-mCherry gen-Ha Restriksiyon enzimi Sspile linearize ben ve dönüşüm solopathogenic U. DNA'ya Maydis SG20016süzün. U. maydis transformants carboxin seçime göre ayırmak ve izole transformants Güney tarafından analiz16leke onaylayın.
Not: Her protein ilgi, en az üç bağımsız U. maydis için transformants izole ve rasgele arka plan mutasyonlar herhangi bir fenotip etkilerini tahmin etmek için analiz.
2. Kültür medya
- YEPSlight sıvı orta16hazırlamak: %1.0 (w/v) maya ekstresi, (w/v) Bacto-pepton % 0,4 ve % 0,4 (w/v) sükroz. GKD2O ve basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de tüm bileşenlerinde dağıtılması; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.
- Patates dekstroz agar (PD-agar)20hazırlamak: (w/v) % 3.9 patates dekstroz agar ve %1.0 (w/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0.01 M). Tüm bileşenlerinde doğrudan şişeyi ısıyla için mix ve GKD2O artı bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.
- PD-kömür agar20hazırlamak: (w/v) % 3.9 patates dekstroz agar, %1 (w/v) kömür ve %1.0 (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (FC 0.01 M). Tüm bileşenlerinde doğrudan şişeyi ısıyla için mix ve GKD2O artı bir manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Basınçlı kap 15dk için 121 ° C'de; ısıyla daha yüksek bir ısıda daha uzun bir süre için art arda zaman veya orta kalitesini azaltmak.
3. bitki enfeksiyon
- Truva atı (Örneğin, mikroskobu tabanlı hücre sayımı) protein teslim yanıt olarak Mısır hücre bölünmesi analizini gerçekleştirmek önceden. U. maydiskaynaklı Mısır hücre çoğalması ve 4-5 gün sonrası enfeksiyon sonraki tümör oluşumu başlar. Nicel hastalığı değerlendirmeler doku bağımlıdır ve 6 ila 14 gün sonrası enfeksiyon için yapılmalıdır.
Not: Farklı Mısır çeşitlerin U. maydis enfeksiyona yatkınlık farklı düzeylerde gösterir. Mısır cvs W23, A188, Gaspe flint, erken Golden ufak tefek veya Va35 Bu patojen karşı duyarlılık göstermek ve böylece Truva atı çalışmaları için uygun çeşitlerin çoğu. - U. maydis inoculum hazırlanması
- Enfeksiyon üzerinde yan etkileri tarafından transgenik zorlanma tahmin etmek için tüm Truva atı deneylerde bir negatif kontrol olarak yaratıcı zorlanma SG200 içerir. Burada, bir negatif kontrol olarak ilgi protein olmayan salgılanan sürümünü ifade bir U. maydis zorlanma kullanın. Ancak, pratiklik (Örneğin, daha büyük gösterimleri) nedenlerle progenitör zorlanma denetiminin daha kolay seçim olabilir.
- Deneme başlamadan önce enfeksiyon kültür ne miktarda ihtiyaç vardır tahmin ediyoruz. Enfeksiyon her bitkinin U. maydis süspansiyon 1-1.5 mL gerektirir Mısır doku türüne bağımlı unutmayın.
Not: Bir gecede kültür yaklaşık 1 mL 0,2 20 mL YEPSışık orta bir OD600 seyreltme için yeterli ve bir U. maydis kültür 25 mL bir doz600 0.8-1.0 ile 13-16 bitkilerin enfeksiyon için yeterli. - Kazı-kazan U. maydis PD agar üzerinden bir steril Pasteur pipet kullanarak plaka, 5 mL YEPShafif orta aşılamak ve 28 ° C'de sabit 16 h için 200 devirde sallayarak ile büyümek kültür izin.
- Enfeksiyon önce uygun büyüme ve 400 X büyütme, bakteriyel kontaminasyon için standart ışık mikroskobu tarafından U. maydis aşılama kültürünü incelemek.
Not: Uygun bir kültür, sadece puro şeklinde mantar görülebilir (Şekil 2) olduğunu. - Taze YEPSışık , 900 µL gecede Kültür 100 µL ile karıştırıp spektrofotometre analizde boş olarak YEPSışık orta kullanarak OD600 ölçmek.
- Taze YEPShafif orta 0.2 OD600 ile gecede kültür sulandırmak ve 28 ° C'de orta günlük büyüme aşaması ulaşan aşırı doz tarafından belirtilen kadar sürekli 200 devir / dakikada sallayarak ile büyümek kültür izin600 nm 0.8-1.0.
Not: U. maydis hücreleri yinelenen her 2 h bu koşullar altında böylece istenen OD600 ekimi 4-5 h sonra ulaşılır. - 3000 x g 10 dk de iplik tarafından OD600 0.8-1.0 hücre hasat ve süpernatant atın.
- Hücre Pelet GKD2O. bir kez yıkamak Bu amaçla, GKD2O, spin ile 3000 x g 10 min için bir kültür hacmi ekleyin ve süpernatant atın.
- Hücre Pelet dikkatle GKD220 mL Cam Pipet kullanarak O böylece 3.0 (için bir Truva atı tahlil) veya 1.0 (hastalık rating için) son OD600 ayarlama resuspend.
- Truva atı doğrulanması: Mısır füzyon proteinin planta salgı içinde
- Bir Truva atı zorlanma17ile Mısır fidan bulaştırmak.
- 2-3 gün sonrası enfeksiyon confocal lazer tarama mikroskop kullanarak, virüslü fidan mikroskobik görüntüleme gerçekleştirmek. Bu amaçla, yaprak enjeksiyon puanın altına 1 cm dikdörtgen bir parçasını tüketim, örnek bir mikroskop slayt üzerine yerleştirin ve bir damla GKD2O. eklemek MCherry füzyon protein görselleştirmek için numune λ, heyecanlandırmak 561 nm ve kayıt emisyon, λ = 580-630 nm =.
- Enfeksiyon yetişkin Mısır yaprak
- Yetişkin yapraklar sahneye mısır bitkileri yetiştirmek (ne zaman en az yaprak 7 büyür içinde SAP).
Not: Bu aşamada 14 h, 28 ° C gün/10 h, 22 ° C gece ritim cv. W23 kullanarak sera koşullarında Ekim üzerine dört hafta sonra ulaşılır. Süre ile Mısır çeşidinde ve sera koşulları değişebilir. - U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.
- Sap sap meristem doku dikkatle yerelleştirmek için tuşuna basın. Meristem tabanının yumuşak doku daha zor sapı bir geçiş tarafından ayrılır.
- Meristem bir kalem kullanarak sap üzerinde işaretlemek.
- U. maydis kültür ateş meristem veya önümüzdeki meristem yukarıda 1 cm 1,5 mL enjekte.
- Hastalık belirtileri, 6 ve 12 gün sonrası enfeksiyon oranı.
- Yetişkin yapraklar sahneye mısır bitkileri yetiştirmek (ne zaman en az yaprak 7 büyür içinde SAP).
- Püsküllü enfeksiyonu
- Püskül sahne erişene dek Mısır bitkiler büyümek.
Not: Mısır cv. W23 anter ve Püskül kalkınma üzerinde ayrıntılı zaman çizelgesi yukarıda açıklanan1819oldu. Önceden segregasyonun jwiles içeren püsküllü U. maydis enfeksiyon için son derece açıktır; Mısır cv. W23 püsküllü 4-7 cm büyüklügündedir. - SAP dikkatle kök Püskül yerelleştirmek için tuşuna basın.
- Mark ucu ve bir kalem kullanarak kök üzerinde Püskül Bankası.
- U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.
- Püskül çevresinde inoculum 1,5 mL enjekte. İnoculum eşit dağılımını sağlamak için yavaş yavaş 0.5 mL ucu, orta bölümü ve kalemle işaretlenmiş Püskül baz yerleştirin.
- Hastalık belirtileri 10 gün sonrası enfeksiyon oranı.
- Püskül sahne erişene dek Mısır bitkiler büyümek.
- Kulak enfeksiyonu
Not: kulak doku geliştirme ayrı Mısır çeşitlerin ve sera şartlarında farklıdır ve aşı önce dikkatle uyulmalıdır. İpek büyümek yaramaya kulakları U. maydis enfeksiyon için son derece açıktır.- U. maydis kültür aktarım (3.2.9 bakınız) 20 G x 1 Hipodermik iğne 3 mL şırınga içine.
- Aşı iğne kabuğu yapraklar arasındaki boşluğa gibi derin kulak ağır yaralı olmadan enjekte et.
- Sürüm 1.5 mL inoculum kulak çevresinde.
- Şırınga ve iğne kaldırmak ve dikkatle U. maydis çözüm eşit olarak dağıtmak için cob masaj.
- Hastalık belirtileri 14 gün sonrası enfeksiyon oranı.
- U. maydis inoculum canlılığı onaylamak
- İnoculum 10 µL PD kömür agar tabakta bırakın ve oda sıcaklığında 2 gün kuluçkaya.
Not: Eğer ilgili U. maydis kültür formu filamentler için mümkün, kabarık, beyaz miselyum olur görülebilir (Şekil 5)
- İnoculum 10 µL PD kömür agar tabakta bırakın ve oda sıcaklığında 2 gün kuluçkaya.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
U. maydis Truva atı deneyler için yapıları plazmid p123-PUmpit2-SpUmpit2-faiz-mCherry gene-Haklonlanır. Mısır gen ilgi mCherry floresan muhabir ve bir epitope HAerimiş-etiket. Özellikle enfeksiyon21sırasında aktif U. maydis Umpit2 Düzenleyicinin kontrolü altında füzyon protein ifadesidir. Biotrophic etkileşim bölgesi haline için doğrudan salgı faiz peptid protein Kodlayıcı bölge U. maydis Umpit221 (Şekil 1) sinyal peptid dizisine eritilmiş olan. U. maydis dönüşümü transgene SG200 IPeklenir-locus Homolog rekombinasyon ve hedeflenen genom ekleme tarafından Southern blot Analizi tarafından doğrulanmadı. Füzyon proteini salgılanmasını fide mikroskobik görüntüleme bir Truva atı gerilme (Şekil 3) ile enfekte bırakır confocal lazer tarama tarafından onaylanır. Örnek olarak, fidan SG200Zmmac1 ZmMAC1 mCHERRY salgılayan ya U. maydis Truva atı gerilme ile enfekte veya bir Truva atı denetim zorlanma Umpit2yoksun ifade noSP-Zmmac1-mCHERRY - SP ve daha sonra gizli ZmMAC1-mCHERRY-HA protein, Şekil 315' te gösterilen. ZmMAC1 salgılayan hif floresan mCherry sinyal (Şekil 3A) ile çevrilidir. Buna ek olarak, Sigara salgılayan hif yalnızca mantar sitoplazma (Şekil 3B) Floresan sinyal göster.
Özellikle, püskül enfeksiyon U. maydis ile 3.5 adımda anlatıldığı gibi uygun doku aşılama üzerinde dayanır. Uygunsuz Tassel'dan yerelleştirme veya inoculum eşitsiz dağılımı sigara enfekte Püskül (Şekil 4A) veya yalnızca kısmi enfeksiyon Püskül (Şekil 4B) ile sonuçlanabilir. Hatta dağıtım sağlamak için inoculum tüm doku enfeksiyonu (Şekil 4 c) elde etmek için aşı iğne yavaş yavaş serbest bırakılması gereken. İnoculum canlılığı PD-kömür agar üzerinde bir damlacık yerleştirerek doğrulanabilir. Bulaşıcı filaman oluşumu ( önce çiftleşme FB1 gerektirir U. maydis zorlanma sırasında kabartmak plaka üzerinde solopathogenic Truva atı progenitör zorlanma SG200 için gösterildiği gibi (Şekil 5A) yazmak gibi görünen filamentler bulaşıcı suşları formu Şekil 5B).
| Adı | Astar ek | Sıra (5´→3´) |
| İleri | XbaI-Mısır gen | GCTCTAGA... |
| Ters | NcoI-RSIATA-Mısır gen | CATGCCATGGAGGCGGTGGCGATCGAGCG... |
Tablo 1: kısıtlama yan ve Mısır gen ilgi sırasına kodlama RSIATA motifi eklemek için astar eklemeler dizisi.
Resim 1 : Şematik genel bakış U. maydis strateji klonlama Truva atı plazmid. ZMmac1 (açık gri) p123-PUmpit2-SpUmpit2Zm -mac1-mCherry-Hadan Çift Kişilik digest tarafından yayımlanır. Buna paralel olarak, faiz (sarı) gen PCR ile güçlendirilmiş. Amaçlı klonlama için ileriye ve geriye doğru astar Xbadahil tasarlanmıştır ben ve Astsubayben siteleri ve RSIATA bağlayıcı (mor) klonlama. PCR ürünü Xbaile sindirilmiş ben ve Astsubayben. Sonra tüp ligasyonu, Truva atı plazmid aşağıdaki öğeleri içerir: Umpit2 düzenleyici bir Umpit2tarafından tahrik -SP (mavi) faiz ORF (sarı) Mısır bir gen için erimiş N-ölümcül. C-terminus, RSIATA bağlayıcı, bir mCHERRY muhabir gen (kırmızı) ve HA epitope etiketi (yeşil) bir stop kodon tarafından izlenen erimiş. U. maydis dönüşüm önce Sspile Truva atı plazmid hazmedildiginde ben U. maydisiphomolog entegrasyonu sağlamak için-locus (gri). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Işık mikroskobik incelenmesi U. maydis aşılama kültür. Birkaç puro şeklinde U. maydis sporidia görünür, bazıları (yıldız işareti tarafından gösterilen) tomurcuklanma tabi. Yok daha fazla da bir kirlenme kültür gösteriyor mevcut hücrelerdir. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Planta içinde confocal lazer mikroskobik görüntüleme tarama bir Ustilago Truva atı zorlanma. MCherry erimiş Mısır protein ZmMAC1 Truva atı zorlanma SG200Zmmac1 (a)veya bir Truva atı yük SG200Zmmac1- noSP Umpit2-SP (B) eksik kullanarak Mısır fide enfeksiyon sonra görüntüleme. Salgılanan ZmMAC1-mCHERRY-HA füzyon protein U. maydis hif(a)15ok uçları tarafından belirtilen, yüzeyinde yer alır. SG200Zmmac1- noSP ZmMAC1 sadece sitoplazmik yerelleştirilmesini olduğunu görünür (B), yıldız işareti 15tarafından gösterilir. Ölçek çubukları 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Püskül enfeksiyon ile U. maydis. U. maydis (a), kısmi Püskül (B) ve tam Püskül bulaşması (C) 12 gün sonra enfeksiyon Püskül başarısız enfeksiyon gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : İnoculum canlılığı tahlil PD-kömür agar. Solopathogenic gerilme SG2001 Truva atı üretimi için kullanıldı. SG200 kendi kendini uyarıcı ve bulaşıcı filamentler PD-kömür agar tabağa(a)oluşturur. Haploid U. maydis zorlanma FB1 gerektirir ipliksi büyüme (B)22önce uyumlu bir yük ile çiftleşme. Ölçek çubukları = 2 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modern ürün araştırma genetik moleküler analiz ve protein düzeyleri için protokoller talep ediyor. Genetik erişilebilirlik ile dönüşüm kullanılabilir veya verimsiz ve Mısır gibi birçok bitki türünün zaman alıcı değil. Ayrıca, güvenilir genetik organizatörü muhabir sistemleri gibi farklı doku siteleri kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlükte yerinde protein işleviyle çalışmaya zor kılan kıt, araçlardır. Apoplastic protein heterologously ifade ve saf protein infiltrasyon doku içine tarafından incelenecektir. Ancak, kapaklı protein ifadesindeki gelişmeler rağmen zor ve genellikle protein fonksiyonel analiz için verimli ürün dokuların içine hedeflenen infiltrasyon kalır. Dönüştürme veya protein infiltrasyon gerektirmez alternatif bir yaklaşım Truva atı stratejisidir. Mısır patojen U. maydissalgılanması cihazları istihdam ederek, bitki apoplast hastalıklı doku içine ilgi teorik olarak herhangi bir proteinin teslim elde edilebilir. Bir protein ilgi boyutu ile ilgili olarak, bu teknik sınırlarını henüz keşfedilmeyi gerekiyor. Eski deneyleri içinde mCherry için Cmu1 erimiş 290 amino asitler U. maydis efektör başarıyla salgılanan7yaşındaydım. Ancak, daha büyük proteinler Truva atı yöntemine uygulanabilirliği test edilecek kalır. Protein ardından değişiklikler ilgi eklemeler istenmeyen iseniz, alışılmamış salgı klasik salgısı ile SP14için alternatif bir yol olarak kullanılabilir.
U. maydis standart bir araç protein biyoteknoloji güvenilir protein katlanması, ardından değişiklik ve salgı verimliliği11,12,13nedeniyle istihdam edilmektedir. Yine de, protein salgılanması her yeni Truva atı zorlanma için adım 3'te açıklandığı gibi dikkatli bir şekilde çözümlenmesi gerekiyor. Bu bir ilk her yeni oluşturulan Truva atı suşu are basit-e doğru bulaştırmak ve incelemek için fidan bulaşmasını tarafından test gerçekleştirmek için mikroskobik görüntüleme tarafından önerilir.
SG200 Truva atı deneyler önce çiftleşme gerektirmez ve böylece kolay bir solopathogenic yük olduğunu. Uyumlu suşları enfeksiyon verimliliğini tarihlerde FB1 ve FB2 daha yüksek23, SG200 verimliliğini Truva atı deneyler için yeterli olsa da. Diğerleri apoplast içinde kalır bazı U. maydis efektör proteinler konak hücreleri tarafından alınır. Her iki grup arasındaki farklılaşma kontrollü ve belirli bir süreç gibi görünüyor; Ancak, temel mekanizmaları zor8 kalır ve bir deney tasarlarken dikkate alınamaz. Bu nedenle, bu hücre duvarı entegre edilmesi veya intracellularly davranmaya ilgi Truva atı yaklaşım için uygun hiçbir aday proteinlerdir.
U. maydis çeşitli hava Mısır doku bulaşmasını her şeye gücü yeten olduğundan, Truva atı yöntemi birden çok protein, farklı dokular ve fide yaprakları, Yetişkin yapraklar, püsküllü, gibi farklı bitki gelişim dönemleri için uygulanabilir ve kulaklar. Bir kaç yararlı uygulama adlandırmak için yerel overdosage, ofsayt protein efektleri veya farklı protein etki alanlarının işlevsel karakterizasyonu test Truva atı sağlar.
Beri çok miktarda bakteri ile birlikte enfeksiyon bitkinin immün yanıt tetikler ve böylece herhangi bir işleme ilgi onun tepki-protein doğru değiştirir kirlenmemiş bir U. maydis Bakımı kültür tüm açıklanan deneyler için çok önemlidir sonuçlar kesin. Truva atı çalışmalar, Yetişkin bırakır, püsküllü ve kulakları daha yüksek birim doku zarar verebilir gibi sonuna kadar 1,5 mL enfeksiyon kültürü ile yapılması gerekiyor. Püskül ve kulak enfeksiyonları gıda renk lekeli su Ustilago inoculum yerine kullanarak eğitilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella ve Armin Hildebrand laboratuvar alanı ve bitki malzeme sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Truva atı yöntemi özgün çalışmalarına Leopoldina postdoc Bursu ve NSF proje IOS13-39229 tarafından desteklenmiştir. Bu makalede sunulan iş DFG (A14 ve B14 projeler) SFB924 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23 G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 mm x 4 mm x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
References
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R. Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
