Summary
Her presenterer vi en protokoll for å vurdere musen peritoneal macrophage fagocytose med forbedret grønne fluorescens protein-uttrykke Escherichia coli.
Abstract
Dette manuskriptet beskriver en enkel og reproduserbar metode for å utføre en fagocytose analysen. Den første delen av denne metoden innebærer å bygge en pET-SUMO-EGFP vektor (SUMO = liten ubiquitin-lignende modifikator) og uttrykke forbedret grønne fluorescens protein (EGFP) i Escherichia coli (BL21DE). EGFP-uttrykke E. coli er coincubated med makrofager 1t på 37 ° C; negativ kontrollgruppen er ruges på is for samme mengde tid. Så er makrofagene klar for vurdering. Fordelene med denne teknikken inkluderer enkel og grei trinnene og fagocytose kan måles ved begge flyt cytometer og fluorescens mikroskop. EGFP-uttrykke E. coli er stabile og viser en sterk fluorescens signalet selv etter makrofagene er løst med paraformaldehyde. Denne metoden er ikke bare egnet for vurdering av macrophage linjer eller primære makrofager i vitro men også egnet for vurdering av granulocytt og monocytt fagocytose i perifert blod mononukleære celler. Resultatene viser at phagocytic evnen til peritoneal makrofager fra unge (åtte uke gamle) mus er høyere enn makrofager fra alderen (16-måned gamle) mus. I sammendraget, denne metoden måler macrophage fagocytose og er egnet for å studere funksjonen medfødte immunsystemet.
Introduction
Macrophage fagocytose analyser brukes ofte til å studere medfødte immunforsvar. Medfødte immunforsvaret kan indikere mottakelighet for infeksjon. Macrophage linjer er mye brukt i immunologi studier. Men lengre passasje kan forårsake genet tap og svekket immunforsvar funksjoner i disse linjer. Dermed er de primære peritoneal makrofagene ideelle objektet i å studere celle funksjon1.
Selv om medfødte immunforsvaret var tenkt å være intakt i alderen kroppen, kan phagocytic evnen redusere forhold til at i yngre kroppen2,3. Her viser vi en metode for å vurdere fagocytose av peritoneal makrofager fra young (åtte uke gamle) og alderen (16-måned gamle) mus ved hjelp av EGFP-uttrykke E. colisom er praktisk, rask og økonomisk gjennomførbart.
Bruk av en EGFP-uttrykke E. coli belastning er en av fordelene med denne analysen fordi disse bakteriene er stabile og vise et sterk fluorescens signal, selv etter makrofager er løst av 4% (w/v) paraformaldehyde. I tillegg bruker den EGFP-uttrykke E. coli, forskere trenger ikke videre flekker etter fagocytose, noe som sparer tid. Videre er makrofager immunoresponsive for E. coli overflate antigen, gjør E. coli mer egnet for fagocytose analysen enn EGFP-uttrykke sopp eller fluorescein-merket perler.
Med EGFP-uttrykke E. coli, kan en fagocytose analysen lett oppnådd i 2t og målt ved begge flyt cytometri og fluorescens mikroskopi, avhengig av forskerens hensikt. Siden denne metoden måler direkte phagocytic evnen, er resultatene mer reproduserbar enn andre indirekte metoder.
Denne metoden har også blitt validert i en RAW264.7 celle linje og menneskelige perifert blod mononukleære celler4. Teksten nedenfor inneholder detaljerte trinnvise instruksjoner for å utføre denne analysen og uthever de avgjørende skritt som forskerne kan endre for å møte behovene til sine eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført under nasjonale institutter for helse retningslinjene og bruk av forsøksdyr, og protokollene ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen av Dalian Medical University. Seksten måneder gamle (med en kroppsvekt på 30-35 g) og åtte uke gamle (20-25 g) SPF (spesifikke patogen-gratis) mannlige C57BL/6 mus ble innhentet av SPF dyr Dalian medisinske universitet. Alle mus ble holdt i dyr boliger med tilgang til mat og vann ad libitum. Temperaturen ble holdt på 20-24 ° C, luftfuktighet var 40% - 70%, og belysningen var 12t lys/12 h mørke. Dyrene ble tillatt å acclimate til miljøet i minst 7 dager før eksperimentet.
1. bygging av pET-SUMO-EGFP plasmider og induksjon av EGFP uttrykk
- Syntetisere EGFP gene fragmentet (en 717 bp sekvens syntetisert av en egendefinert gen syntese tjeneste, se Tabell av materialer og supplerende fil 1 for forløp) og forsterke fragmentet med fremover primer ( 5-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3 ") og reversere primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3"), med Hi-Fi-Taq DNA utvalg.
- For å sikre at polymerase kjedereaksjon (PCR) produktene har enkelt 3' adenine overheng for TA kloning i neste trinn, kan du bruke filtypen 30 min ved 72 ° C etter siste syklus (se utfyllende fil 1 for PCR forhold). Sjekk PCR produktet av agarose gel geleelektroforese.
- Klone PCR produktet i pET-SUMO vektor (se Tabell for materiale) bruker TA kloning metode5 med T4 DNA ligase. Inkuber reaksjonen ved romtemperatur (20-25 ° C) i 30 min. Vektoren er linearized mellom nukleotider 653 og 654 med en 1 bp 5 ' T-overheng på hver strand.
- Forvandle ligation produktet kjemisk kompetent BL21(DE) E. coli belastningen som følger: legge til 5 µL (100 ng) PCR produkt til 100 µL BL21(DE) kompetent celler via heten støt ved 42 ° C i 90 s; Hold blandingen på is 3 min, og deretter legge til 400 µL lysogeny kjøttkraft (LB) medium forvarmet til 37 ° C, riste den 1t på 37 ° C og 120 rpm.
- Vaksinere 100 µL av bakterier på overflaten av en LB-kanamycin (100 µg/mL) plate med inducer laktosefri (0,5 mmol/L), gir EGFP uttrykk belastningen. Inkuber platen på 37 ° C over natten.
Merk: Hvis EGFP uttrykkes vellykket, noen kolonier kan observeres som lysende grønt lys i mørket.- Eventuelt velge kolonier kontrollere innsatt EGFP fragment av DNA sekvensering. Grunning for DNA sekvensering er: fremover, 5-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; omvendt, 5-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3 ".
- Vaksinere en positiv koloni i 5 mL av LB medium med 100 µg/mL kanamycin. Inkuber i en 37 ° C risting inkubator på 120 rpm 2 h, og deretter legge til inducer laktosefri en siste konsentrasjon på 0,5 mmol/L og fortsetter å ryste 6 h, inducing EGFP uttrykk. Empirisk, når rister for 6 h og optisk densitet ved 600 nm (OD600) kan nå 0,7 eller høyere.
- Legge 10 µL av bakteriell kultur medium på et lysbilde, dekke det med en dekkglassvæske og undersøke uttrykk for EGFP under en invertert fluorescens mikroskop. EGFP-uttrykke bakterier kan lagres i middels på 2-8 ° C i flere uker.
2. musen peritoneal macrophage isolasjon og primære kultur
- Legge til 3,5 g tioglykolat 100 mL destillert vann og autoklav blandingen til sterilitet før bruk. Pumpe tioglykolat mediet i 1 mL steril sprøyten i panseret for musen peritoneal injeksjon. Bruk en mus per sprøyte for å unngå infeksjon. Bruk av tioglykolat kan øke antall makrofager. De fastboende peritoneal makrofagene kan isoleres uten tioglykolat, men med lavere macrophage gir.
- Bedøve musen bruker en metode som er godkjent av lokale dyr omsorg og bruk komiteen. Sette inn 1 mL av 3,5% tioglykolat medium i musen er bukhulen med 1 mL sprøyte, bruker en 23 G nål.
Merk: Ved å fremkalle anestesi, peritoneal injeksjon kan utføres enkelt og reduserer risikoen for skader de indre organene injeksjon. - Opprettholde musen med vann og mat annonse libitum i 3 dager. Overvåke kroppen vekt og mat inntak av dyr hver dag. Hvis kroppen vekttap er større enn 10% innen 3 dager, utelukke dyret fra eksperimentet.
- Etter 3 dager, euthanize musen av cervical forvridning etter raskt inducing anestesi av desflurane i en lukket. Alternativt bruke en metode som er godkjent av den lokale dyr omsorg og bruk komiteen å avlive musen.
- Inn musen et fat (med 10 cm diameter) med 75% etanol å sterilisere og overføre den raskt til panseret. Plassere musen på en tallerken og feste foran labben til styret å fikse musen er posisjon.
- Bruker en 5 mL sprøyte knyttet til en 20 G injisere nål, plassere nål skråkant opp på en 30° - 40° vinkel, 5 mL kaldt (4-10 ° C) fosfat-bufret saltvann (PBS) på nedre del av magen i musen er bukhulen, unngå punktering tarm. Hvis tarm (eller andre organ) er punktert, kan musen og celler ikke lenger brukes i eksperimenter, som dette kan aktivere celler som ikke er egnet for primær cellekultur.
- Utfør en skånsom massasje på de to sidene av musen er magen. Deretter Sug opp væske sakte og forsiktig. Dispensere peritoneal væske inn i et 50 mL sentrifuge rør. Gjenta disse trinnene 2 x eller 3 x.
- Sentrifuge suspendert celler for 10 min 400 x g i en nedkjølt sentrifuge (4-8 ° C). Forkast nedbryting og resuspend celle pellet i RPMI 1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS). Telle celler. Empirisk, er celle tetthet omtrent lik 5 x 106 celler/mL når cellene er resuspended i 10 mL av medium.
- Legge til 5 x 106 celler i hver brønn av en 6-vel plate for flyt cytometri analysen og 5 x 105 celler per brønn i en 24-vel plate for fluorescens mikroskop. Kultur cellene på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator over natten. Kultur medium kan oppdateres etter 3 h å fjerne nonadherent celler fordi de fleste av disse er lymfocytter. Tilhenger cellene er hovedsakelig makrofager, og de kan følge godt til vev kultur-behandlet plast.
3. macrophage fagocytose analysen av fluorescens mikroskopet
- Observere cellene under et mikroskop lyse felt å vurdere celle levedyktighet og celle tetthet.
- Fjerne kultur medium fra 24-vel plate. Legg 100 µL av fersk kultur medium og 10 µL av bakteriell suspensjon (ca 2 x 107 celler) i hver brønn som beskrevet i tabell 1. Inkuber 1t i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Forsiktig vaske 3 x-5 x med 500 µL av kaldt PBS per brønn bleke noninternalized bakterier.
- Inkuber cellene med 4% formaldehyd i PBS ved romtemperatur for 30 min.
- Vask fast cellene 3 x med PBS (500 µL/vel).
- Legge til 200 µL av phalloidin 633 fluorescens fargestoff konjugert fungerende løsning (se Tabell for materiale) stain F-utgangen. Butikken i en mørk, humid sted (60% - 80%) ved romtemperatur for 60 min. skyll cellene 3 x med PBS (500 µL/vel) å fjerne alle overflødig phalloidin. Flekker F-utgangen, cytoplasma avtegner seg og bidra til å skille internalisert bakterier.
- Legge til 200 µL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) arbeider løsningen (1 µg/mL) å flekk cellekjernen og Inkuber i 5 minutter i en mørk, humid sted ved romtemperatur. Skyll 1 x med PBS (500 µL/vel) og 1 x med samme volum destillert vann. Deretter blir cellene klar for observasjon under en invertert fluorescens mikroskop.
4. macrophage fagocytose analysen ved hjelp av flowcytometri
- Å redusere de eksperimentelle og gjøre et riktig tolkning av resultatene, angir gruppene og kontrollere rør for eksperimentet som oppført i tabell 2.
- For kontrollgruppen, som vil bli plassert på is (gruppe 4 i tabell 2), fjerne mediet fra 6-vel platen og vaske det 1 x med PBS. Deretter legge til 1 mL av 70 mM kaldt EDTA i brønnen koble cellene og overføre dem til flyt cytometri røret. Legge til 50 µL av bakteriell suspensjon inn i røret, og plasser den på is 1t.
- For andre grupper, kan du fjerne kultur medium. Legge til 1 mL av fersk medium i hver brønn. Legge til 50 µL av bakteriell suspensjon i brønnene i henhold til gruppeinnstillingen for, som beskrevet i tabell 2. Deretter plassere 6-vel platen i 37 ° C, 5% CO2 inkubator 1t.
- For å slukke fluorescens av noninternalized E. coli, legge til 200 µL av 0,8% crystal violet (CV) vann løsning i brønnen og svaier kort tid, dermed unngår en falske positive resultatet av EGFP-uttrykke E. coli bindingen til overflaten av den makrofager men ikke internalisert. Vask cellene 3 x med PBS å fjerne eventuelle gjenværende CV.
- Deretter legge til 1 mL av 70 mM kaldt EDTA i brønnen koble cellene og overføre dem til flyt cytometri røret.
- Sentrifuge rørene på 400 x g i 5 min og kast nedbryting.
- Legg 100 µL av PBS skal resuspend cellene. Legge til 5 µL av F4/80-PE-konjugerte antistoffer (en overflate antigen på musen makrofager) inn i rør, eller bruk IgG2a-PE isotype, i henhold til gruppeinnstillingen. Vortex kort og Inkuber prøvene på is i 5-10 min i mørket.
- Legg 1 mL av PBS i hver rør og sentrifuge 400 x g for 5 min. forkaste nedbryting. Resuspend celle pellets med 200-300 µL av PBS for flyt cytometri analyse. Kjør hver rør og hente dataene for minst 10.000 hendelser F4/80+ celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PET-SUMO vektoren benytter en liten ubiquitin-lignende modifikator tillatelse uttrykket native proteiner i E. coli. SUMO fusion kan betydelig forbedre EGFP løselighet, slik at den kan oppdages lett. Hvis det EGFP uttrykket er vellykket indusert av laktose, kan grønne kolonier observeres i mørket (figur 1A). Grønne prikker, som representerer den EGFP-uttrykke E. coli, kan observeres under fluorescens mikroskop med en 40 x linsen (figur 1B).
Mikroskopi analyse viser fluorescens bilder (figur 1 c) av peritoneal makrofager fra gruppene unge og eldre. Figur 1 c viser den røde fluorescensen av F-utgangen, den grønne fluorescensen av EGFP-uttrykke E. coli, den blå fluorescensen for DAPI kjernefysiske flekker, og det sammenslåtte bildet på alle tre fluorescens stasjonene. De 16-måned gamle mus, som ble ansett som de alderen mus, var tilsvarende 60 - 65 år gamle mennesker. Disse bildene foreslår at makrofager fra de unge mus presentert en sterkere fagocytose evne enn de fra alderen musene.
Flowcytometri (figur 2) ble brukt for å kvantifisere og sammenligne macrophage fagocytose fra gruppen unge og eldre. Figur 2A viser en representant flyt cytometri analyse av unge, alderen og kontroll grupper. Antistoffer F4/80-PE ble brukt til å identifisere og gate i makrofager, og EGFP-positive signaler angir makrofager som phagocytosed E. coli. Andelen F4/80+ og EGFP+ celler indikerer phagocytic evne til makrofager. Resultatet (figur 2B) av unge gruppen var 62,7% ± 5,1% (gjennomsnittlig ± SEM), som var betydelig høyere enn 35,2% ± 2,9% (mener ± SEM) av alderen. Disse resultatene er konsistente med utviklingen av fluorescens mikroskopi resultater.
Figur 1 : EGFP-uttrykke E. coli og dens fagocytose av makrofager. (A) EGFP-uttrykke E. coli kolonier. PET-SUMO-EGFP plasmider ble forvandlet til BL21(DE) celler. Bakterien ble inokulert på en LB-kanamycin (100 µg/mL) plate. Et belegg av 0,5 mmol/L laktose på LB tallerken overflaten ble brukt som den induser, gir det EGFP uttrykket. Hvis EGFP uttrykkes vellykket, er gulaktig grønn koloniene observert bruker UV-lys i mørket. (B) fluorescens mikroskopi av EGFP-uttrykke E. coli. Grønne signalet representerer EGFP-uttrykke E. coli. Skala bar = 50 µm. (C) flerkanals fluorescens bilder av makrofager som var phagocytosing E. coli. Cellene ble inkubert med EGFP-uttrykke E. coli (grønn) 1t, etterfulgt av en vask med PBS, fiksering med 4% paraformaldehyde, og flekker for F-utgangen bruker phalloidin 633 konjugat fungerende løsning (rød) og DAPI (blå). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flow cytometri resultater. (A) representant flyt cytometri analyse av unge, alderen og kontroll grupper. Peritoneal makrofager var farget med F4/80-PE etter coincubation med EGFP-uttrykke E. coli. F4/80+ og EGFP+ celler var sjeldne benektende kontroll og kontroll (gruppe 4: unge gruppen på is) grupper. Unge og eldre cytometric tomter representerer grupper 5 og 6, henholdsvis. (B) resultater fra flyt cytometri analyse av de unge og eldre. En Mann-Whitney test ble brukt til å undersøke forskjellen mellom disse to gruppene. Andelen F4/80+ og EGFP+ celler i den unge gruppen var betydelig høyere enn i gruppen alderen (*P < 0,05). Feilfeltene representerer standard feil av gjsnitt (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gruppe | navn | Celler | EGFP E. coli | Co inkubasjonstiden |
| 1 | Young | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 h |
| 2 | Alderen | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 h |
Tabell 1: gruppere innstillingen for fluorescens mikroskopi. To grupper, gruppen alderen (16-måned gamle C57BL/6, n = 3) og gruppen unge (8-uke-gamle C57BL/6, n = 3), ble brukt til å forberede peritoneal makrofager. Peritoneal makrofager av hver musen ble lagt til separat brønner. Ca 2 x 105 celler i et volum på 100 µL ble lagt i hver brønn; så, omtrent 2 x 107 EGFP-uttrykke E. coli celler i et volum på 10 µL ble lagt til hver godt og coincubated 1t på 37 ° C.
| Gruppe | Navn og tilstand | Celler | EGFP | F4/80-PE | PE ISOTYPE |
| E. coli | |||||
| 1 | Isotype kontroll på 37° C | 2 x 106 | - | - | Tilsett 5 μL |
| 2 | PE Positive kontroll på 37° C | 2 x 106 | - | Tilsett 5 μL | - |
| 3 | EGFP Positive kontroll på 37° C | 2 x 106 | 1 x 10-8 | - | - |
| 4 | Unge gruppen på is | 2 x 106 | 1 x 10-8 | Tilsett 5 μL | - |
| 5 | Unge gruppen på 37° C | 2 x 106 | 1 x 10-8 | Tilsett 5 μL | - |
| 6 | Aldersgruppen på 37° C | 2 x 106 | 1 x 10-8 | Tilsett 5 μL | - |
Tabell 2: gruppere innstillingen for flowcytometri. De primære peritoneal makrofagene fra ung og gammel mus ble satt i seks grupper. Gruppe 1 ble satt som isotype kontroll; grupper 2 og 3 ble satt som enkelt positiv kontroll for PE eller EGFP kanalen, henholdsvis. For å sikre at den internalisert fluorescensen gjelder fagocytose, ble gruppe 4 inkubert på is. Fagocytose stoppes på is på grunn av lav temperatur. Inkubasjon tiden var 1t for alle grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trinnene i denne protokollen er ganske enkel og grei. En av de avgjørende skritt er å indusere EGFP uttrykk på E. coli. Vanligvis når et gen fra eukaryoter, som EGFP, er planlagt å uttrykke prokaryoter som E. coli, er det en risiko for at protein vil danne inaktive aggregater (inkludering organer), som endrer protein's opprinnelige struktur og aktivitet. Ved hjelp av pET-SUMO vektoren og lage pET-SUMO-EGFP plasmider, EGFP-SUMO fusion protein uttrykt vellykket, og lyssignal var sterk nok til å bli oppdaget av både fluorescens mikroskop og en flyt cytometer.
Det andre viktige skrittet er å slukke fluorescens av bakterier som ikke var har internalisert makrofagene. Selv om Trypan Blue har vist å slukke fluorescens av fluorescein isothiocyanate (FITC)-merket, varme-drepte bakterier, det fungerte ikke for den levende E. coli. Bruke en 0,8% crystal violet vann løsning kan slukke mesteparten av fluorescens av E. coli som binder på cellens overflate. Noen litteratur antyder at vaskemaskinen med antibiotika i stedet for med Trypan blå kan hjelpe for å slukke fluorescensen, men det var ikke effektive i dette eksperimentet10.
Cellen tetthet kan begrense denne teknikken. Fordi cellene består av en blanding av lymfocytter og makrofager, er makrofagene vanligvis lavere enn cellen tetthet beregnet fra hemocytometer når høste celler fra bukhulen musen, noe som kan resultere i et lite antall celler for flowcytometri og fluorescens mikroskopi. I tilfelle utilstrekkelig antall makrofager, kan celler fra to til tre mus innen samme gruppe blande for fagocytose analysen. Når denne teknikken brukes på macrophage cellelinjer, for eksempel RAW264.7, kan tap av cellen være et problem, fordi disse cellene er relativt nonadherent; Dermed kan celler gå tapt under vask prosedyren. Vask forsiktig eller bruke kultur plater med celle-behandlede flater, som kan øke celle vedheft.
Det er mange andre metoder for å vurdere fagocytose evne. Som en av de klassiske metodene, ble kylling erytrocytter eller beiset døde celler brukt som markører for fagocytose. Følsomheten til disse metodene var begrenset av den store variasjonen av resultatene. En annen alternativ metode for å undersøke fagocytose er å bruke celler infisert med bakterier i flere timer, så lyse cellene med Triton X-100 og plate på en LB agar Petriskål overnatting på 37 ° C. Phagocytic kapasitet bestemmes ved å telle antall colony-forming enheter (CFUs)6. Denne metoden så lenge 2 dager for å anskaffe seg CFU, og variansen av telt tallene var stor fordi cellen lysates er utvannet flere ganger. Så, FITC-merket perler7 eller E. coli ble introdusert for fagocytose analyser8. Fordi disse perlene manglet bestemt overflaten antigener, var ekstra preopsonization nødvendig for optimal opptak. Metoden med å bruke FITC-merket bakterier kan også hindre fagocytose fordi FITC kompromittert bakteriell virulens9.
En annen nylig introduserte metode er å bruke kommersialiserte fargestoffer, som pH følsom og bare fluoresce når de er inne den sure lysosome, dermed slukke trinn10. Kommersialiserte kit kan imidlertid være kostnadseffektivt uoverkommelige. Når EGFP-uttrykke E. coli belastningen er konstruert, bakterier gjengis lett og fluorescensen er stabil i flere uker, noe som gjør denne metoden enkel og økonomisk. Fordi EGFP har en sterk fluorescens, kan denne metoden også endres til en høy gjennomstrømming fluorometric teknikk å vurdere macrophage fagocytose, som kan utføres i en ugjennomsiktig 96-brønns plate11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Den National Natural Science Foundation i Kina (nr. 31800046) og Natural Science Foundation av provinsen Liaoning (nr. 20170540262) støttet dette arbeidet. Dette arbeidet ble gjort i laboratoriene i Scientific Research Center ved Universitetet i andre sykehus for Dalian medisinsk. Forfatterne vil gjerne takke Xiao-Lin Sang for henne hjelp med flowcytometri, og Bo Qu og Dong-Chuan Yang for deres hjelp i å produsere videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E.
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
