Summary
ここでは、強化された緑色蛍光タンパク質発現大腸菌を用いたマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するためのプロトコルを提案する.
Abstract
本稿では、貪食能の分析を実行するシンプルかつ再現可能な方法について説明します。このメソッドの最初の部分では、ペット相撲 EGFP ベクターの構築 (相撲 = 小さなユビキチン様修飾) と表現する緑色蛍光タンパク質 (EGFP)エシェリヒア属大腸菌(BL21DE)。37 ° C で 1 時間のマクロファージの EGFP 発現大腸菌を coincubated します。培養陰性対照グループは、時間の同量のため氷の上。その後、マクロファージは評価の準備ができています。この手法の利点は、そのシンプルでわかりやすい手順と貪食能は両方の流れの cytometer 蛍光顕微鏡で測定できます。EGFP 発現大腸菌が安定していると、マクロファージはパラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されません。このメソッドはマクロファージ細胞株あるいは体外プライマリ マクロファージの評価に適したが、末梢血単核細胞における顆粒球や単球の貪食能の評価にも適しただけではありません。若い (8 週齢) マウス腹腔マクロファージの貪食機能に高齢者 (16 ヶ月歳) マウスからマクロファージの細胞よりも高い結果を示す.要約すると、このメソッドは、マクロファージの貪食能を測定、生得の免疫組織の機能を勉強に適しています。
Introduction
マクロファージの食作用の試金は、自然免疫の研究に使われます。生得の免疫反応伝染への感受性があります。マクロファージ細胞は免疫学研究で広く使用されます。ただし、拡張通路遺伝子の損失を引き起こす可能性があります、これらの細胞免疫機能を侵害します。したがって、プライマリのマクロファージ、細胞機能1を研究するための理想的なオブジェクトです。
生得の免疫反応は、高齢者の体にそのままと思われたが貧食能が、年下でボディ2,3と比較して低下します。ここでは、若い (8 週齢) と EGFP 発現大腸菌、便利、迅速、かつ経済的に実現可能であるを使用して高齢者 (16 ヶ月歳) マウスの腹腔マクロファージの貪食能を評価する方法を示します。
EGFP 発現大腸菌株の使用は、これらの細菌は安定しており、マクロファージが 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されないので、このアッセイの利点の 1 つです。また、EGFP 発現大腸菌を用いた研究者必要はありませんさらに染色細胞貪食は、時間を節約できます。さらに、マクロファージがエシェリヒア属大腸菌抗原、大腸菌の EGFP 発現菌類またはフルオレスセイン分類されたビーズを使用するよりも適して食作用の試金のためを作るための immunoresponsive です。
EGFP 発現大腸菌と食作用の試金、簡単に 2 h で達成し、両方流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、研究者の目的に応じてで測定します。以来、このメソッドは、貪食能力を直接測定、結果、その他の間接的な方法よりも再現性。
このメソッドは、RAW264.7 細胞ラインで検証されている、ひと末梢血単核細胞の4。下のテキストはこの分析を実行する詳細な手順について説明し、ハイライト重要なステップが研究者が彼らの実験のニーズに合わせて変更。
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Protocol
ケアと実験動物の使用のため国家機関の健康の指針の下ですべての手順を行ったし、プロトコルは、動物愛護と大連医科大学の使用委員会によって承認されました。16 ヶ (30-35 g の体重) と、8 週齢 (20-25 g) SPF (特定病原体フリー) 男性 c57bl/6 マウスは大連医科大学の SPF 動物センターから得られました。すべてのマウスは、食糧および水の自由にアクセスで動物飼育で保管されました。20-24 ° C に保たれた温度、湿度は 40% から 70% に、照明は暗いの 12 h 光/12。動物は、実験前に少なくとも 7 日間環境に適応する許されました。
1. ペット相撲 EGFP プラスミドとの EGFP 発現誘導の建設
- EGFP 遺伝子のフラグメントを合成 (カスタム遺伝子合成サービスによって合成 717 bp シーケンスには、シーケンスの材料表と補足ファイル 1が参照してください)、前方のプライマー (フラグメントを増幅5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') 逆プライマー (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3')、忠実度の高い Taq DNA ポリメラーゼを用いたします。
- ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 製品が単一 3' 次のステップで TA のクローニングのためのオーバー ハング アデニンができるようにには、最後のサイクル (PCR 条件の補足のファイル 1を参照してください) の後に 72 ° C で 30 分拡張子を使用します。Agarose のゲルの電気泳動で PCR の製品を確認してください。
- ペット相撲ベクトルに PCR の製品をクローン (材料表参照) TA クローニング法5 T4 DNA リガーゼを使ってします。30 分間室温 (20-25 ° C) で反応を孵化させなさい。653 と 1 bp の 5 ' の各鎖に T オーバー ハングで 654 のヌクレオチドの間ベクトルが線形化されます。
- 化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌BL21(DE) ひずみに結紮製品を次のように変換: 5 μ L を追加 (100 ng) BL21(DE) 90 42 ° C で熱ショックによって有能なセルの 100 μ L に PCR の製品の s;3 分間氷の上の混合物を維持し、37 ° c、1 h 37 ° C で 120 rpm の振動予熱ホストゲノム スープ (LB) 媒体の 400 μ L を追加します。
- 降伏 EGFP 式ひずみとインデューサ ラクトース (0.5 mmol/L)、LB カナマイシン (100 μ g/mL) プレートの表面に細菌の 100 μ L を接種します。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
注: EGFP を表明正常にいくつかの植民地が暗闇の中で光る緑色の光として観察できます。- DNA の配列によって挿入された EGFP フラグメントを検証するコロニーを選択します。DNA 塩基配列のプライマー: 前方、5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3';逆、5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'。
- 100 μ g/mL カナマイシンと LB 培地 5 mL に肯定的なコロニーを接種します。2 時間 120 rpm でインキュベーターを揺れ 37 ° C の孵化し、0.5 ミリ モル/L の最終的な集中にインデューサ乳糖を追加し、6 h、EGFP の発現を誘導するために振るを続行します。経験的に、6 h、600 の光学濃度の振動と nm (OD600) が 0.7 に達する可能性があります以上。
- スライドに細菌培養液の 10 μ L を加えて、coverslip でそれをカバー倒立蛍光顕微鏡下で EGFP の発現を調べる。EGFP 発現細菌は、数週間 2-8 ° C でメディアに格納できます。
2. マウス腹腔マクロファージの分離と培養
- チオグ リコール酸の 3.5 g を 100 mL の蒸留水とオートクレーブを使用する前に無菌性の混合物に追加します。マウス腹腔内注射用フードで 1 mL 滅菌注射器にチオグ リコール酸培地をポンプします。感染を避けるために注射器ごとの 1 つのマウスを使用します。チオグ リコール酸の使用は、マクロファージの数を増やすことができます。腹腔マクロファージは分離することができますマクロファージが得られますチオグ リコール酸がなくても低い。
- ローカル アニマル ・ ケアおよび使用委員会によって承認されたメソッドを使用してマウスを麻酔します。マウスの腹腔内に 23 G 針を用いて 1 mL 注射器 3.5% チオグ リコール酸培地 1 mL を注入します。
注: 麻酔を誘導することによって腹腔内注入が簡単に行えます、注入によって引き起こされる内部の臓器に傷害の危険を減らします。 - 3 日間の水や食料の自由でマウスを維持します。動物の体の重量と食品の摂取量を毎日監視します。3 日以内に体重を 10% より大きい場合は、実験から動物を除外します。
- 3 日後に、急速にクローズド ボックスでセボフルランによる麻酔を誘導した後頚部転位によってマウスを安楽死させます。また、マウスを安楽死地元の動物のケアおよび使用委員会によって承認されているメソッドを使用します。
- 滅菌、75% エタノール (直径 10 cm) と皿にマウスを置くし、フードにすぐに転送。皿の上にマウスを置くし、マウスの位置を固定するボードに前足をピンします。
- 20 G に接続されている 5 mL シリンジを使用して針を 30 ° ~ 40 ° の角度で針ベベルを配置する注入 5 mL 冷 (4-10 ° C) のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 下腹部にマウスの腹腔内腸を穿刺を避けること。腸 (または他の器官) をパンクすると場合、マウスおよびそのセルもはや使用できます実験、これは初代細胞培養に適していないセルをアクティブに可能性がありますと。
- マウスの腹部の両側に優しくマッサージを実行します。その後、静かにゆっくりと液体を吸い出しなさい。腹腔液を 50 mL の遠心管に分配します。次の手順は 2 倍または 3 倍を繰り返します。
- 冷却遠心機 (4-8 ° C) で 400 × gで 10 分間の浮遊細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、10% 牛胎児血清 (FBS) RPMI 1640 媒体で細胞ペレットを再懸濁します。セルをカウントします。経験的に、細胞密度は、セル培地 10 mL で再停止されるとき約 5 × 106セル/mL と同じです。
- 流れの cytometry の試金の蛍光顕微鏡用 24 ウェル プレートによくあたり 5 x 10 の5セル 6 ウェル プレートの各ウェルに 5 x 10 の6セルを追加します。一晩で 5% CO2インキュベーター 37 ° C の細胞を培養します。これらのほとんどはリンパ球であるので非粘着性のセルを削除する 3 時間後、培養液を更新できます。付着性のセルは主にマクロファージ、組織文化処理プラスチックによく付着することができます彼ら。
3 蛍光顕微鏡を用いたマクロファージ貪食能アッセイ
- 細胞生存率、細胞密度を評価する明視野顕微鏡で細胞を観察します。
- 24 ウェル プレートから培養培地を削除します。新鮮な培養液を 100 μ l 添加と細菌懸濁液 (約 2 x 10 の7セル) の 10 μ L を各ウェルの表 1に示すように追加します。1 h 37 ° C、5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
- Noninternalized 細菌を洗浄する井戸あたり 500 μ L 冷 PBS の x-5 3 x は水洗い。
- 30 分間室温で PBS で 4% のホルムアルデヒドとセルを孵化させなさい。
- 3 固定セルを洗浄して PBS の x (500 μ L/ウェル)。
- 蛍光ファロイジン 633 を 200 μ l 添加色素共役実用的なソリューションを追加 (参照材料表) F-アクチンを染色します。60 分間室温で暗く、湿気の多い場所 (60%-80%) に保管のリンスの細胞 3 x PBS (500 μ L/ウェル) 任意の余分な電子を削除します。F-アクチンを染色によって細胞質を概観して内面化された細菌を区別するのに役立ちます。
- 細胞核を染色し、室温で暗く、湿気の多い場所で 5 分間インキュベート DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 使用液 (1 μ g/mL) 200 μ L を追加します。1x PBS で洗浄 (500 μ L/ウェル) と等量の蒸留水と 1 x。セルは、倒立蛍光顕微鏡下で観察の準備になります。
4 フローサイトメトリーを用いたマクロファージ貪食能アッセイ
- 実験の誤差を最小限に抑えると結果の適切な解釈をする、グループを設定し、表 2に記載されている実験のための管を制御します。
- コントロール グループのする氷 (表2 グループ 4) に配置されます 6 ウェル プレートからメディアを取り出して、それを洗う PBS で 1 x。セルをデタッチし、流れの cytometry チューブに移して同様に 70 mM 冷たい EDTA の 1 mL を追加します。チューブの細菌懸濁液 50 μ L を追加、1 h の氷の上に置きます。
- 他のグループは、培養培地を削除します。各ウェルに新鮮な媒体の 1 つの mL を追加します。表 2に説明されているようにグループの設定によると井戸に細菌懸濁液を 50 μ l 添加を追加します。その後、37 ° C、1 時間 5% CO2インキュベーターに 6 ウェル プレートを配置します。
- Noninternalized大腸菌の蛍光を癒やす、井戸に 0.8% (CV) クリスタル バイオレット水溶液 200 μ L を追加しの表面に EGFP 発現大腸菌バインディングによって偽陽性の結果を回避するため、すぐに影響を与える、マクロファージ、内面が。3 セルを洗浄して任意の残留の CV を削除する PBS の x。
- セルをデタッチし、流れの cytometry チューブに移して同様に 70 mM 冷たい EDTA の 1 mL を追加します。
- 400 x gで 5 分でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。
- 細胞を再懸濁しますに PBS 100 μ L を追加します。グループの設定によると、チューブ、または使用 IgG2a PE アイソタイプに F4/80 PE 標識抗体 (マウスのマクロファージに発現する表面抗原) の 5 μ L を追加します。渦を簡単にし、暗闇の中で 5-10 分のための氷のサンプルをインキュベートします。
- 各管に 1 mL の PBS を追加し、400 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。フローサイトメトリー解析のための PBS の 200-300 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。各チューブを実行し、F4/80+細胞の少なくとも 10,000 のイベント用のデータを取得します。
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Representative Results
ペット相撲ベクターは、大腸菌でのネイティブ蛋白質の表現を許可する小さいユビキチンのような修飾子を利用しています。相撲の融合は、簡単に検出することができます、EGFP の溶解度を大きく向上できます。EGFP の発現は正常にラクトース誘発性、緑コロニーが (図 1 a) 暗闇の中で観察できます。EGFP 発現大腸菌を表し、緑のドットは、40 倍対物レンズ (図 1 b) を使用して蛍光顕微鏡下で観察できます。
顕微鏡による解析では、若者や高齢者のグループから腹腔内マクロファージの蛍光画像 (図 1) を示しています。図 1は、EGFP 発現大腸菌の蛍光グリーン、DAPI 核染色の青色蛍光、3 つの蛍光チャンネルの統合画像 F アクチンの赤い蛍光性を示しています。老齢マウスとみなされた、16 ヶ月齢マウス 60-65 年古い人間の同等であった。これらのイメージは、若いマウスのマクロファージが老齢マウスからのそれらより強い貪食能力を提示されている提案します。
フローサイトメトリー (図 2) は、定量化し、若者と高齢者のグループからのマクロファージ貪食能を比較に使用されました。図 2 aは、若者、高齢者、および制御グループの代表的なフロー フローサイトメトリー解析を示しています。F4/80-PE 抗体を用いて識別し、マクロファージをゲートし、EGFP 陽性信号は大腸菌を貪食マクロファージを示します。F4/80+と EGFP+細胞の割合は、マクロファージの貪食能力を示しています。若いグループの結果 (図 2 b) は 62.7% 35.2% ± 2.9% (平均 ± SEM) 高齢者群よりも有意に高かった ± 5.1% (平均 ± SEM)。これらの結果は、蛍光顕微鏡の結果の傾向と一致しています。
図 1: EGFP 発現大腸菌とマクロファージの貪食します。(A) EGFP 発現大腸菌コロニー。ペット相撲 EGFP プラスミドに変身した BL21(DE) 細胞;細菌は、LB カナマイシン (100 μ g/mL) プレートに接種しました。LB プレート表面に 0.5 モル/L の乳糖のコーティングは、EGFP の発現を降伏、インデューサとして使用されました。EGFP を正常に表現すると場合、黄色がかった緑コロニーは暗闇で紫外線を使用して観察されます。(B) EGFP 発現大腸菌の蛍光顕微鏡像。緑の信号は、EGFP 発現大腸菌を表します。スケールバー = 50 μ m。 (C) マルチ蛍光大腸菌を phagocytosing したマクロファージの画像。EGFP 発現大腸菌(緑) 1 h の 4% パラホルムアルデヒド固定、PBS で洗浄後、F アクチン染色と培養細胞ファロイジン 633 共役作業ソリューション (赤) および DAPI (青) を使用しています。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 流れの cytometry の結果。(A) 代表的なフロー フローサイトメトリー解析若者、高齢者、および制御グループ。腹腔マクロファージは EGFP 発現大腸菌を coincubation 後 F4/80-PE でよごれていた。F4/80+と EGFP+細胞は否定的にまれであったコントロールおよびコントロール (グループ 4: 氷の上の若いグループ) グループ。若齢および老齢流れフローサイトメトリーによるプロットは、グループ 5 と 6 をそれぞれ表しています。(B) 若者と高齢者グループの流れフローサイトメトリー解析の結果。マンホイットニー検定は、これらの 2 つのグループの違いを調べるに使用されました。F4/80+と若いグループに EGFP+細胞の割合は高齢者群よりも有意に高い (*P < 0.05)。誤差範囲 (SEM) 平均値の標準誤差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| グループ | 名 | セル | EGFP 大腸菌 | 共同培養時間 |
| 1 | 若い | 2 x 10 の5 | 2 x 107 | 1 h |
| 2 | 高齢者 | 2 x 10 の5 | 2 x 107 | 1 h |
表 1: 蛍光顕微鏡用の設定をグループ化します。2 つのグループ、高齢者のグループ (16 ヶ月歳 C57BL/6, n = 3) と若いグループ (8 週齢 C57BL/6、 n = 3)、腹腔マクロファージの準備に使われました。各マウスの腹腔マクロファージを別の井戸を追加しました。100 μ L のボリュームの約 2 x 10 の5のセルが追加された各ウェル;その後、約 2 × 107 EGFP 発現大腸菌細胞 10 μ L のボリュームではそれぞれよくと 37 ° C で 1 時間の coincubated に追加しました。
| グループ | 名前と条件 | セル | EGFP | F4/80-PE | PE アイソタイプ |
| エシェリヒア属大腸菌 | |||||
| 1 | 37 ° C でアイソタイプ コントロール | 2 x 106 | - | - | 5 μ L を追加します。 |
| 2 | 37 ° C で PE 肯定的な制御 | 2 x 106 | - | 5 μ L を追加します。 | - |
| 3 | 37 ° C で EGFP 陽性コントロール | 2 x 106 | 1 x 10 の8 | - | - |
| 4 | 氷の上の若いグループ | 2 x 106 | 1 x 10 の8 | 5 μ L を追加します。 | - |
| 5 | 37 ° C で若いグループ | 2 x 106 | 1 x 10 の8 | 5 μ L を追加します。 | - |
| 6 | 37 ° C で年齢 | 2 x 106 | 1 x 10 の8 | 5 μ L を追加します。 | - |
表 2: フローサイトメトリー用設定をグループ化します。若齢および老齢マウスから主な腹腔マクロファージは、六つのグループとして設定されました。グループ 1 は、アイソタイプ コントロールとして設定されました。グループ 2 と 3 は、それぞれ PE または EGFP のチャネルの 1 つの肯定的な制御として設定されました。内面の蛍光は貪食する特定するには、グループ 4 は氷上孵化します。貪食は、低温のためアイスで停止されます。インキュベーション時間のすべてのグループの 1 時間であった。
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Discussion
このプロトコルの手順は非常にシンプルで簡単です。エシェリヒア属大腸菌の EGFP 発現を誘導するために重要な手順の 1 つです。通常、EGFP のような真核生物の遺伝子は大腸菌のような原核生物で表現する予定されている場合蛋白質のネイティブ構造と活性を変化する蛋白質が非アクティブな集計 (封入体) を形成、リスクがあります。ペット相撲ベクトルを使用し、ペット相撲 EGFP プラスミドを構築、EGFP 相撲融合タンパク質が正常に表現され、光信号が蛍光顕微鏡、フローサイトによって検出されるのに十分であった。
他の重要なステップは、ない大食細胞によって内面化された細菌の蛍光性を抑制することです。かに (FITC) の蛍光を癒やすためトリパン ブルーが示されているが-ラベル、熱殺された細菌、動作しませんでしたライブエシェリヒア属大腸菌のため。0.8% のクリスタル ・ バイオレット水溶液を使用して細胞表面に結合するエシェリヒア属大腸菌の蛍光性のほとんどを消すことができます。いくつかの文献を示唆するいると洗浄トリパン ブルーの代わりに抗生物質、蛍光を癒すに役立つことがありますが、この実験10に効果はなかった。
細胞密度は、この手法を制限があります。マクロファージは通常数が不十分な可能性がありますマウス腹腔から細胞を収穫するとき、検定から計算した細胞密度より低いため細胞はリンパ球とマクロファージの混合物から成っている、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡の細胞。マクロファージの不十分な数の場合食作用の試金のため 2 つに同じグループ内の 3 つのマウスから細胞を混合してもよい。マクロファージ細胞株 RAW264.7 などに応用されたときセルの損失可能性があります懸念、これらの細胞は比較的非粘着性;したがって、セルが洗濯処理中に失われます。優しく洗うか細胞処理の表面は、細胞接着を高める可能性がありますと培養皿を使用します。
貪食能力を評価する他の多くの方法があります。古典的な方法のひとつとして、鶏赤血球またはステンド グラスの死細胞が貪食能のマーカーとして使用されました。これらの方法の感度は、結果のかなりの変化によって限られていた。貪食能を検査するための別の代替方法、いくつかの時間、細菌に感染した細胞を使用し、トリトン X-100 および LB 寒天培地 37 ° C で一晩シャーレ上の板の細胞を溶解させます。貪食能はコロニー形成単位 (CFUs)6の数をカウントすることによって決定されます。このメソッドは CFU データを取得する 2 日間限り必要し、セル lysates は数回を希釈されてので、カウント数値の差異が大きかった。その後、FITC 標識ビーズ7や大腸菌は、食作用の試金8の導入されました。これらのビーズに特定の表面抗原が欠けていたので追加 preopsonization は最適な吸収のため必要でした。また、FITC 標識細菌を用いる方法は、FITC 妥協される細菌の病原性9ので貪食を妨げる可能性があります。
Ph に敏感とそれらがなくなり、焼入手順10、酸性リソソーム中一度のみ蛍光を発する商品化された染料を使用する別の新たに導入された方法です。ただし、コストは法外事業化キットがあります。EGFP 発現大腸菌株を構築すると、細菌が簡単に再現、蛍光安定した数週間、シンプルで経済的なこのメソッドになります。EGFP は強い蛍光があるためこのメソッドは不透明の 96 ウェル プレート11うことができますマクロファージの貪食能を評価する高スループット蛍光法に変更できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
中国の国家自然科学基金 (第 31800046)、遼寧省 (第 20170540262) の自然科学の基礎は、この仕事を支えた。この作品は、第 2 病院の大連医科大学科学研究センターの研究所で達成されました。著者は、小琳、フローサイトメトリーによる彼女の援助のために歌ったとボ クとビデオの生産に彼らの支援のための東傳陽に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
