Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم البلعمه بلعم البريتوني الماوس استخدام الفلورية الخضراء تعزيز البروتين-الإعراب عن الإشريكيّة القولونية.
Abstract
ويصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة واستنساخه للقيام مقايسة البلعمه. الجزء الأول من هذا الأسلوب ينطوي على بناء ناقل الحيوانات الأليفة-سومو-اجفب (سومو = الصغيرة مثل أوبيكويتين المعدل) وإذ تعرب عن تعزيز البروتينات الفلورية الخضراء (اجفب) في الإشريكيّة القولونية (BL21DE). إذ تعرب عن اجفب كولاي هو كوينكوباتيد مع الضامة ح 1 في 37 درجة مئوية؛ هو المحتضنة مجموعة المراقبة السلبية على الجليد لنفس المقدار من الوقت. ثم، الضامة جاهزة للتقييم. وتشمل مزايا هذا الأسلوب في خطوات بسيطة وواضحة، والبلعمه يمكن أن يقاس مجهر سيتوميتير والأسفار كل تدفق. إذ تعرب عن اجفب كولاي مستقرة، وعرض إشارة قوية الأسفار حتى بعد أن يتم إصلاحها الضامة مع بارافورمالدهيد. هذا الأسلوب ليس فقط مناسبة لتقييم خطوط الخلايا بلعم أو الضامة الأولية في المختبر ولكن أيضا مناسبة لتقييم البلعمه المحببات والوحيدات في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى. وتبين النتائج أن قدرة متجولة الضامة البريتوني من صغار الفئران (الأسبوع عمرها 8) أعلى من الضامة من الفئران (16 عاماً) الذين تتراوح أعمارهم بين. باختصار، هذا الأسلوب تدابير بلعم البلعمه وهو مناسبة لدراسة وظيفة نظام المناعة الفطرية.
Introduction
بلعم البلعمه سلالاته تستخدم غالباً لدراسة وظيفة المناعة الفطرية. الاستجابة المناعية الفطرية قد تشير إلى قابلية للإصابة. بلعم خطوط الخلايا تستخدم على نطاق واسع في دراسات علم المناعة. ومع ذلك، مرور الموسعة قد يؤدي إلى فقدان الجينات والشبهة وظائف المناعة في خطوط الخلايا هذه. وهكذا، الضامة البريتوني الأولية هي الكائن المثالي لدراسة وظيفة الخلية1.
رغم أنه يعتقد الاستجابة المناعية الفطرية سليمة في الجسم الذين تتراوح أعمارهم بين، قد إنقاص قدرة متجولة مقارنة بأن الهيئة في الأصغر سنا2،3. هنا، وسوف ندلل على أسلوب لتقييم البلعمه الضامة البريتوني من الشباب (ثماني أسبوع من العمر) والمسنين (16 شهرا) الماوس باستخدام التعبير عن اجفب كولاي، التي مريحة وسريعة ومجدية اقتصاديا.
استخدام عبئا معربا عن اجفب كولاي واحدة من مزايا هذا التحليل لهذه البكتيريا مستقرة وعرض إشارة قوية الأسفار، وحتى بعد أن يتم إصلاحها الضامة بواسطة بارافورمالدهيد 4% (w/v). بالإضافة إلى ذلك، باستخدام التعبير عن اجفب كولاي، لا يحتاج الباحثون كذلك تلطيخ بعد البلعمه، مما يوفر الوقت. وعلاوة على ذلك، يتم الضامة إيمونوريسبونسيفي كولاي مستضد السطحي، مما يجعل كولاي أكثر مناسبة للمقايسة البلعمه من استخدام الفطريات معربا عن اجفب أو الخرز المسمى فلوريسسين.
مع الإعراب عن اجفب كولاي، يمكن بسهولة إنجازه في ح 2 الإنزيم البلعمه وتقاس بكلا التدفق الخلوي والأسفار مجهرية، تبعاً للغرض للباحث. منذ مباشرة إجراءات هذا الأسلوب قدرة متجولة، النتائج أكثر استنساخه من الأساليب غير المباشرة الأخرى.
كما تم التحقق من هذا الأسلوب في خط خلية RAW264.7 وخلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى4. النص الموجود أدناه يوفر الإرشادات المفصلة خطوة بخطوة لإجراء هذا التحليل ويسلط الضوء على الخطوات الحاسمة التي قد تعدل الباحثون تلبية الاحتياجات للتجارب التي تقوم بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كانت جميع الإجراءات المضطلع بها في إطار "المبادئ معاهد الصحة الوطنية" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والبروتوكولات وقد أقر العناية بالحيوان واستخدام اللجنة في داليان الطبية جامعة. ستة عشر شهرا (بوزن جسم ز 30-35) وعمرها ثماني الأسبوع (20-25 غ) منتدى جنوب المحيط الهادئ (الخاصة بالعوامل الممرضة خالية) ذكور الفئران C57BL/6 تم الحصول عليها من مركز الجامعة الطبية داليان الحيوان منتدى جنوب المحيط الهادئ. وأبقى جميع الفئران في مساكن الحيوانات مع إمكانية الوصول إلى الغذاء والمياه libitum الإعلانية. أبقى درجة الحرارة في 20-24 درجة مئوية، والرطوبة 40%-70%، والإضاءة كانت ح 12 الضوء/12 ح الظلام. وسمح الحيوانات إلى تأقلم بالبيئة لمدة 7 أيام على الأقل قبل التجربة.
1-تشييد بلازميد الحيوانات الأليفة-سومو-اجفب والتعريفي للتعبير اجفب
- تجميع الجزء جين اجفب (تسلسل bp 717 توليفها من قبل خدمة توليف الجيني مخصصة، انظر الجدول للمواد و التكميلية الملف 1 للتسلسل) وتضخيم الجزء مع (التمهيدي إلى الأمام أتجتجاجكاججكجاجاجك 5 '-3') وعكس التمهيدي (5 '-كتجتاكاجكتكجتككاتجككج-3')، استخدام بوليميراز "الدنا بوليميراز" عالية الدقة.
- لضمان أن منتجات التفاعل المتسلسل (PCR) بوليميريز الأدنين يتدلى واحدة 3 ' لاستنساخ تا في الخطوة التالية، استخدم ملحق 30 دقيقة عند 72 درجة مئوية بعد آخر دورة (انظر 1 ملف التكميلية لظروف PCR). التحقق من المنتج بكر بالتفريد [اغروس] هلام.
- استنساخ المنتج PCR إلى ناقل الحيوانات الأليفة-سومو (انظر الجدول للمواد) استخدام تا استنساخ الأسلوب5 مع ليجاسى T4 الحمض النووي. تبني رد الفعل في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة. هو خطيا الناقل بين النيوكليوتيدات 653 و 654 مع 5 1 ' بي بي تي-عبء على كل حبلا.
- تحويل المنتج ربط إلى سلالة BL21(DE) كولاي كيميائيا المختصة على النحو التالي: إضافة 5 ميليلتر (100 نانوغرام) منتج PCR إلى 100 ميليلتر BL21(DE) الخلايا المختصة عن طريق صدمة الحرارة في 42 درجة مئوية ل 90 s; إبقاء الخليط على الجليد لمدة 3 دقائق ومن ثم إضافة 400 ميليلتر من ليسوجيني مرق (رطل) متوسطة يسخن عند 37 درجة مئوية، تهتز لها عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة.
- تلقيح 100 ميليلتر من البكتيريا على السطح من صفيحة كاناميسين رطل (100 ميكروغرام/مل) مع اللاكتوز محفز (0.5 مليمول/لتر)، مما أسفر عن سلالة التعبير اجفب. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: إذا أعرب عن اجفب بنجاح، يمكن ملاحظة بعض المستعمرات كالضوء الأخضر متوهجة في الظلام.- اختيارياً، حدد المستعمرات التحقق من الجزء اجفب المدرج بتسلسل الحمض النووي. يتم الإشعال لتسلسل الحمض النووي: الأمام، 5 '-أجاتكتجتاكجاكجتاتاج-3'؛ عكس، 5 '-تاجتاتجكتكاجكجتج-3'.
- تطعيم مستعمرة إيجابية إلى 5 مل متوسطة رطل مع 100 ميكروغرام/مل كاناميسين. احتضان في 37 درجة مئوية تهز الحاضنة 120 لفة في الدقيقة ح 2، وإضافة اللاكتوز محفز لتركيز نهائي 0.5 مليمول/لتر ثم تواصل زعزعة ح 6، الذي يحفز التعبير اجفب. تجريبيا، عندما تهتز ل 6 ح، الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) قد تصل إلى 0.7 أو أعلى.
- إضافة 10 ميليلتر من مستنبت البكتيريا إلى شريحة وتغطية ذلك مع ساترة والتعبير عن اجفب تحت مجهر مقلوب الأسفار دراسة. يمكن تخزين البكتيريا معربا عن اجفب في الأجل المتوسط في 2-8 درجة مئوية لعدة أسابيع.
2-الفأر بلعم البريتوني العزلة والثقافة الأولية
- إضافة 3.5 g ثيوجليكولاتي إلى 100 مل من الماء المقطر والاوتوكلاف المخلوط للعقم قبل الاستخدام. مضخة المتوسطة ثيوجليكولاتي في 1 مل المحاقن المعقمة في هود للحقن البريتوني الماوس. استخدام الماوس واحد كل حقنه لتجنب العدوى. يمكن استخدام ثيوجليكولاتي زيادة عدد الضامة. يمكن عزل الضامة البريتوني المقيمين دون thioglycolate ولكن مع انخفاض غلة بلعم.
- تخدير الماوس استخدام أسلوب وافقت عليه لجنة الاستخدام ورعاية الحيوانات المحلية. حقن 1 مل متوسطة thioglycolate 3.5 ٪ في التجويف الصفاقى للماوس مع المحاقن 1 مل، باستخدام إبرة ز 23.
ملاحظة: بتحريض التخدير، الحقن البريتوني يمكن أن يؤديها بسهولة ويقلل من خطر الإصابات إلى الأجهزة الداخلية الناجمة عن الحقن. - الحفاظ على الماوس مع الماء والغذاء libitum الإعلانية لمدة 3 أيام. رصد كمية الوزن والغذاء الجسم من الحيوان كل يوم. إذا كان فقدان وزن الجسم أكبر من 10% في غضون 3 أيام، استبعاد الحيوان من التجربة.
- وبعد 3 أيام، euthanize الماوس بخلع عنق الرحم بعد حمل سرعة التخدير التي سيفوفلوراني في صندوق مغلق. وبدلاً من ذلك، استخدم أسلوب الذي وافقت عليه اللجنة الرعاية واستخدام الحيوانات المحلية euthanize الماوس.
- وضع الماوس في طبق (يبلغ قطرها 10 سم) مع الإيثانول 75% لتعقيم، ونقلها بسرعة إلى غطاء محرك السيارة. ضع الماوس على لوحة ودبوس مخلب الجبهة إلى المجلس لإصلاح الموقف الماوس.
- استخدام حقنه 5 مل يعلق على غ 20 إبرة، وضع إبرة المجسم مشطوف الحواف أعلى بزاوية 30°-40°، حقن 5 مل الباردة (4-10 درجة مئوية) مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) في أسفل البطن في التجويف الصفاقى للماوس، تجنب ثقب الأمعاء. إذا كان هو ثقب الأمعاء (أو أي جهاز آخر)، الماوس وخلاياه لم يعد استخدامها للتجارب، كهذا قد ينشط الخلايا التي ليست مناسبة لزراعة الخلايا الأولية.
- إجراء تدليك لطيف في كلا الجانبين من البطن الماوس. ثم نضح السائل بلطف وببطء. الاستغناء عن السائل البريتوني في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. كرر الخطوات 2 x أو 3 x.
- الطرد المركزي الخلايا مع وقف التنفيذ لمدة 10 دقائق في 400 x ز في أجهزة الطرد مركزي مبردة (4-8 درجة مئوية). تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط RPMI 1640 مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS). عد الخلايا. تجريبيا، كثافة الخلية يساوي تقريبا 5 × 106 خلايا/مل عند الخلايا حراكه في 10 مل متوسطة.
- إضافة 5 × 106 خلايا في كل من لوحة 6-جيدا للتدفق الخلوي المقايسة والخلايا 5 × 105 الواحدة وكذلك في لوحة 24-جيدا مجهر الأسفار جيدا. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% بين عشية وضحاها. يمكن أن يتم تحديث المتوسط الثقافة بعد 3 ساعات لإزالة الخلايا نوناديرينت لأن معظم هذه الخلايا الليمفاوية. الخلايا ملتصقة الضامة أساسا، وأنها يمكن أن تنضم أيضا إلى البلاستيك الأنسجة-الثقافة-تعامل.
3-بلعم باستخدام مجهر الأسفار الإنزيم البلعمه
- مراقبة الخلايا تحت مجهر مشرق الميدانية لتقييم جدوى الخلية وكثافة الخلية.
- إزالة المتوسطة الثقافة من لوحة 24-جيدا. إضافة 100 ميليلتر من جديد الثقافة المتوسطة و 10 ميليلتر من تعليق البكتيرية (حوالي 2 × 107 الخلايا) في كل بئر كما هو موضح في الجدول 1. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
- بلطف تغسل 3 x x-5 مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة كل بئر تغسل البكتيريا نونينتيرناليزيد.
- احتضان الخلايا مع 4% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- تغسل الخلايا الثابتة 3 x مع برنامج تلفزيوني (500 ميليلتر في البئر).
- إضافة 200 ميليلتر من الأسفار فالويدين 633 صبغ مترافق العامل الحل (انظر الجدول للمواد) لوصمة عار والاكتين. مخزن في مكان المظلمة والرطبة (60%-80%) في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 60 شطف الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني (500 ميليلتر/جيد) لإزالة أي فالويدين الزائدة. تلطيخ والاكتين، يمكن إيجاز السيتوبلازم وتساعد على التمييز بين البكتيريا المدخلة.
- إضافة 200 ميليلتر DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي) العامل حل (1 ميكروغرام/مل) لوصمة عار نواة الخلية واحتضان لمدة 5 دقائق في مكان مظلم ورطب في درجة حرارة الغرفة. شطف x 1 مع برنامج تلفزيوني (500 ميليلتر في البئر) و 1 x مع نفس الحجم من الماء المقطر. بعد ذلك، سيكون جاهزاً للمراقبة تحت مجهر مقلوب الأسفار الخلايا.
4-بلعم باستخدام التدفق الخلوي الإنزيم البلعمه
- لتقليل الأخطاء التجريبية وتقديم تفسير سليم للنتائج، وتعيين المجموعات ومراقبة أنابيب للتجربة كما هو موضح في الجدول 2.
- لمجموعة المراقبة، التي سوف توضع على الجليد (المجموعة 4 في الجدول 2)، وإزالة المتوسطة من لوحة 6-جيدا وغسله x 1 مع برنامج تلفزيوني. ثم أضف 1 مل يدتا الباردة 70 ملم في البئر لفصل الخلايا وتحويلها إلى أنبوب التدفق الخلوي. إضافة 50 ميليلتر من تعليق البكتيرية في الأنبوب ووضعه على الجليد ح 1.
- للمجموعات الأخرى وإزالة الثقافة المتوسطة. أضف 1 مل متوسطة جديدة في كل بئر. إضافة 50 ميليلتر من تعليق البكتيرية في الآبار وفقا لإعداد المجموعة، كما هو موضح في الجدول 2. ثم، ضع لوحة 6-جيدا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة ح 1.
- إخماد الأسفار من نونينتيرناليزيد كولاي، إضافة 200 ميليلتر من 0.8% الكريستال البنفسجي (CV) المياه الحل في البئر والتأثير في وقت قصير، وبالتالي تجنب نتيجة إيجابية كاذبة بالربط الإعراب عن اجفب كولاي إلى السطح الضامة ولكن لم تستوعب. تغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي بقايا من السيرة الذاتية.
- ثم أضف 1 مل يدتا الباردة 70 ملم في البئر لفصل الخلايا وتحويلها إلى أنبوب التدفق الخلوي.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 400 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- إضافة 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ريسوسبيند الخلايا. إضافة 5 ميليلتر من جسم F4/80-PE-مترافق (مستضد سطح عن الماوس الضامة) في الأنابيب، أو استخدام IgG2a-PE ايستب، وفقا لإعداد الفريق. الدوامة بإيجاز واحتضان هذه العينات في الثلج لمدة 5-10 دقيقة في الظلام.
- أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني في كل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 400 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الكريات الخلية مع 200-300 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لتحليل التدفق الخلوي. قم بتشغيل كل أنبوبة والحصول على البيانات المتعلقة بالأحداث على الأقل 10,000 الخلايا F4/80+ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يستخدم ناقل الحيوانات الأليفة-سومو معدل مثل ubiquitin صغيرة للسماح للتعبير عن البروتينات الأصلية في كولاي. يمكن أن يعزز الانصهار سومو الذوبان اجفب، مما يتيح لها يمكن الكشف عنها بسهولة. إذا كان التعبير اجفب بنجاح فعل اللاكتوز، ويمكن ملاحظة مستعمرات خضراء في الظلام (الشكل 1A). ويمكن ملاحظة النقاط الخضراء، التي تمثل التعبير عن اجفب كولاي، تحت مجهر الأسفار باستخدام عدسة هدف 40 x (الشكل 1B).
ويبين التحليل المجهري fluorescence الصور (الشكل 1) من الضامة البريتوني من الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الفئات. الشكل 1 يبين ومضان أحمر من F-أكتين، الفلورية الخضراء للتعبير عن اجفب كولاي، والأسفار الأزرق لتلطيخ النووية DAPI، والصورة المدمجة لكافة القنوات الأسفار الثلاثة. الفئران 16 شهرا، التي كانت تعتبر الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين، كانت تعادل 60-65 سنة البشر. وتوحي هذه الصور أن قدم الضامة من الفئران الصغار قدرة البلعمه أقوى من تلك التي من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين.
واستخدمت لقياس ومقارنة بلعم البلعمه من مجموعة الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين التدفق الخلوي (الشكل 2). يظهر الشكل 2 ألف تحليل تدفق ممثل الخلوي للشباب، والمسنين، ومجموعات التحكم. جسم F4/80-PE استخدمت لتحديد والبوابة الضامة، وتشير إشارات إيجابية اجفب الضامة التي فاجوسيتوسيد كولاي. وتبين نسبة F4/80+ والخلايا اجفب+ قدرة متجولة الضامة. وكانت النتيجة (الشكل 2) فريق الشباب 62.7% ± 5، 1% (يعني ± ووزارة شؤون المرأة)، الذي كان أعلى بكثير من 35.2 ± 2.9% (يعني ± ووزارة شؤون المرأة) من المجموعة الذين تتراوح أعمارهم بين. هذه النتائج تتوافق مع الاتجاه إلى نتائج الفحص المجهري الأسفار.
الشكل 1 : التعبير عن اجفب كولاي وفي البلعمه التي الضامة. (أ) إذ تعرب عن اجفب كولاي المستعمرات. بلازميد الحيوانات الأليفة-سومو-اجفب وتحولت إلى خلايا BL21(DE)؛ تم تلقيح البكتيريا على صفيحة كاناميسين رطل (100 ميكروغرام/مل). طلاء من 0.5 مليمول/لتر اللاكتوز على سطح لوحة رطل كمحفز، تسفر عن التعبير اجفب. إذا كان يتم التعبير عن اجفب بنجاح، لوحظت المستعمرات أخضر مصفر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في الظلام. (ب) الأسفار الفحص المجهري للتعبير عن اجفب كولاي. يمثل إشارة خضراء معربا عن اجفب كولاي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ج) الأسفار الأقنية الصور من الضامة التي كانت فاجوسيتوسينج كولاي. كانت المحتضنة الخلايا مع الإعراب عن اجفب كولاي (الأخضر) ح 1، تليها يغسل مع برنامج تلفزيوني، التثبيت مع بارافورمالدهيد 4%، وتلطيخ أكتين و استخدام فالويدين 633 المتقارنة العامل الحل (أحمر) و DAPI (أزرق). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تدفق نتائج الخلوي- (أ) تحليل تدفق الممثل الخلوي للشباب، والمسنين، ومجموعات المراقبة. كانت ملطخة الضامة البريتوني F4/80-PE بعد كوينكوبيشن مع الإعراب عن اجفب كولاي. F4/80+ والخلايا اجفب+ كانت نادرة في السلبية السيطرة والتحكم (المجموعة 4: مجموعة الشباب على الجليد) مجموعات. قطع تدفق الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين سيتوميتريك تمثل المجموعات 5 و 6، على التوالي. (ب) نتائج تحليل التدفق الخلوي من الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين الفئات. واستخدم اختبار مان-ويتني لدراسة الفرق بين هاتين المجموعتين. وكانت نسبة F4/80+ والخلايا اجفب+ في مجموعة الشباب أعلى بكثير من التي في المجموعة الذين تتراوح أعمارهم بين (*P < 0.05). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المجموعة | الاسم | الخلايا | اجفب كولاي | وقت الحضانة المشتركة |
| 1 | الشباب | 2 × 105 | 2 × 107 | ح 1 |
| 2 | الذين تتراوح أعمارهم بين | 2 × 105 | 2 × 107 | ح 1 |
الجدول 1: إعداد للفحص المجهري fluorescence المجموعة. مجموعتين، المجموعة الذين تتراوح أعمارهم بين (16 شهرا C57BL/6، n = 3) وفريق الشباب (عمرها 8 الأسبوع C57BL/6، ن = 3)، كانت تستخدم لإعداد الضامة البريتوني. وأضيفت إلى فصل الآبار الضامة البريتوني من كل الماوس. تم إضافة حوالي 2 × 105 خلايا في حجم 100 ميليلتر لكل بئر؛ ثم أضيفت حوالي 2 × 107 الإعراب عن اجفب كولاي الخلايا في حجم 10 ميليلتر لكل منهما جيدا وكوينكوباتيد عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
| المجموعة | الاسم، والشرط | الخلايا | اجفب | F4/80-PE | ايستب PE |
| كولاي | |||||
| 1 | تحديد ايستب على 37 درجة مئوية | 2 × 106 | - | - | إضافة 5 ميكروليتر |
| 2 | مراقبة إيجابية PE على 37 درجة مئوية | 2 × 106 | - | إضافة 5 ميكروليتر | - |
| 3 | التحكم "اجفب الإيجابية" في 37 درجة مئوية | 2 × 106 | 1 × 108 | - | - |
| 4 | مجموعة الشباب على الجليد | 2 × 106 | 1 × 108 | إضافة 5 ميكروليتر | - |
| 5 | فريق الشباب في 37 درجة مئوية | 2 × 106 | 1 × 108 | إضافة 5 ميكروليتر | - |
| 6 | المجموعة العمرية في 37 درجة مئوية | 2 × 106 | 1 × 108 | إضافة 5 ميكروليتر | - |
الجدول 2: مجموعة الإعداد للتدفق الخلوي- تم تعيين الضامة البريتوني الأولية من الفئران الشباب والذين تتراوح أعمارهم بين ست مجموعات. مجموعة 1 كمراقبة ايستب؛ تم تعيين المجموعات 2 و 3 كمراقبة إيجابية واحدة للقناة PE أو اجفب، على التوالي. لضمان أن الأسفار المدخلة غير معينة البلعمه، وكان المحتضنة مجموعة 4 على الجليد. توقفت في البلعمه على الجليد بسبب درجة الحرارة المنخفضة. فترة حضانة المرض كان ح 1 لكافة المجموعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول بسيطة جداً وواضحة. إحدى الخطوات الحاسمة للحث على التعبير اجفب كولاي. عادة، عندما يخطط مورثة من حقيقيات النوى، مثل اجفب، للتعبير عن في بدائيات النوى مثل كولاي، هناك خطر أن البروتين سوف تشكل مجاميع غير نشطة (إدراج الهيئات)، مما يؤدي إلى تغيير البنية الأصلية للبروتين ونشاط. باستخدام ناقلات سومو الحيوانات الأليفة وتشييد بلازميد الحيوانات الأليفة-سومو-اجفب، أعرب عن البروتين الانصهار سومو اجفب بنجاح، وإشارة خفيفة كانت قوية بما فيه الكفاية للكشف عنها بواسطة مجهر الأسفار وسيتوميتير تدفق.
أن الخطوة الحاسمة الأخرى هو إخماد الأسفار البكتيريا التي كانت لا تستوعب التي الضامة. على الرغم من أن قد تبين تريبان الأزرق إخماد الأسفار من fluorescein isothiocyanate (فيتك)-المسمى، قتلت الحرارة البكتيريا، أنها لا تعمل للعيش كولاي. استخدام حل مياه الكريستال بنفسجي 0.8 في المائة يمكن أن يشفي معظم الأسفار من كولاي التي تربط على سطح الخلية. بعض الكتابات تشير إلى أن الغسيل مع المضادات الحيوية بدلاً من تريبان الأزرق قد يساعد في إخماد الأسفار، ولكن أن لم يكن فعالاً في هذه التجربة10.
كثافة الخلية قد تحد من هذا الأسلوب. لأن الخلايا تتكون من خليط من الخلايا الليمفاوية والضامة، الضامة عادة أقل من كثافة الخلايا المحسوبة من هيموسيتوميتير عند حصاد الخلايا من التجويف الصفاقى الماوس، مما قد يتسبب في عدم وجود عدد كاف خلايا لقياس التدفق والفحص المجهري الأسفار. وفي حالة عدم كفاية إعداد الضامة، قد خلط الخلايا من اثنين إلى ثلاثة من الفئران داخل نفس المجموعة للمقايسة البلعمه. عندما يتم تطبيق هذا الأسلوب على خطوط الخلايا بلعم، مثل RAW264.7، فقدان الخلية قد تكون مصدر قلق، لأن هذه الخلايا نوناديرينت نسبيا؛ وهكذا، قد تكون الخلايا المفقودة أثناء عملية الغسيل. تغسل بلطف أو استخدام ألواح الثقافة مع الأسطح المعالجة بالخلية، التي قد تزيد من التصاق الخلية.
وهناك الكثير من الطرق الأخرى لتقييم القدرة على البلعمه. كواحدة من الأساليب الكلاسيكية، والكريات الحمراء الدجاج أو الخلايا الميتة الملون استخدمت كعلامات البلعمه. حساسية هذه الطرق كان محدودا بالتنوع الكبير من النتائج. أسلوب بديل آخر لدراسة البلعمه لاستخدام الخلايا المصابة بالبكتيريا لعدة ساعات، ثم الخلايا مع X-100 تريتون ولوحة في أجار رطل طبق بيتري بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تتحدد قدرة متجولة بإحصاء العدد من الوحدات (كفوس) تشكيل مستعمرة6. هذا الأسلوب المطلوب ما دام يومين للحصول على بيانات زيمبابوي، والفارق عدد الأصوات التي تم فرزها كانت كبيرة نظراً لأن ليساتيس الخلية هي المخفف عدة مرات. وأدخلت ل فحوصات البلعمه8حبات آنذاك، المسمى فيتك7 أو كولاي . بسبب هذه الخرز المستضدات السطحية محددة، كان بريوبسونيزيشن إضافية مطلوبة من أجل امتصاص أفضل. أيضا، قد تعوق طريقة استخدام البكتيريا المسماة فيتك البلعمه سبب الشبهة فيتك الفوعة الجرثومية9.
أسلوب أدخلت حديثا آخر هو استخدام الأصباغ تجارياً، وهي درجة الحموضة الحساسة وفلوريس إلا مجرد وهم داخل يحلول الحمضية، وبالتالي القضاء على التبريد الخطوة10. ومع ذلك، قد يكون الطقم تجارياً التكلفة الباهظة. بمجرد التعبير عن اجفب كولاي السلالة هي التي شيدت، البكتيريا وترد بسهولة، والأسفار مستقرة لعدة أسابيع، مما يجعل هذا الأسلوب بسيطة واقتصادية. بسبب اجفب fluorescence قوية، يمكن أن يكون هذا الأسلوب قابل للتعديل لتقنية فلوروميتريك الفائق لتقييم بلعم البلعمه، التي يمكن أن يؤديها في كامد 96-جيدا لوحة11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 31800046) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة لياونينغ (رقم 20170540262) تؤيد هذا العمل. وأنجز هذا العمل في المختبرات التابعة لمركز البحوث العلمية في الجامعة "الثانية المستشفى من داليان الطبية". المؤلف يود أن يشكر سانغ شياو لين لمساعدتها مع قياس التدفق، وتشو بو ويانغ دونغ تشوان لمساعدتها في إنتاج الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E.
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
