Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma mus peritoneal makrofag fagocytos med förbättrad grön fluorescens protein-uttryckande Escherichia coli.
Abstract
Detta manuskript beskriver en enkel och reproducerbar metod för att utföra en fagocytos assay. Den första delen av denna metod innebär att bygga en pET-SUMO-andra vektor (SUMO = små ubiquitin-liknande modifierare) och uttrycker förbättrad grön fluorescens protein (andra) i Escherichia coli (BL21DE). ANDRA-uttryckande E. coli är coincubated med makrofager för 1 h vid 37 ° C; den negativa kontrollgruppen inkuberas på is för samma belopp av tid. Makrofager är sedan redo för bedömning. Fördelarna med denna teknik är dess enkel och okomplicerad steg och fagocytos kan mätas genom både flöde cytometer och fluorescens Mikroskop. Den andra-uttryckande E. coli är stabila och visa en stark fluorescens signal även efter makrofager korrigeras med PARAFORMALDEHYD. Denna metod är inte bara lämplig för bedömningen av makrofag cellinjer eller primära makrofager i vitro men även lämplig för utvärdering av granulocyt och monocyt fagocytos i perifera mononukleära blodceller. Resultaten visar att fagocytos kapacitet av peritoneal makrofager från unga (åtta veckor gamla) möss är högre än för makrofager från åldern (16 månader gamla) möss. Sammanfattningsvis, metoden mäter makrofag fagocytos och är lämplig för att studera funktionen medfödda immunsystemet.
Introduction
Makrofag fagocytos analyser används ofta för att studera det medfödda immunförsvaret. Medfödda immunsvaret kan tyda infektionskänslighet. Makrofag cellinjer används allmänt i immunologi studier. Dock utökade passagen kan orsaka genen och äventyras immun funktioner i dessa cellinjer. Primär peritoneal makrofager är således perfekt objektet som att studera cell funktion1.
Även om medfödda immunsvaret ansågs vara intakt i år kroppen, kan fagocytos förmågan minska jämfört med att i den yngre kropp2,3. Här kommer vi att visa en metod för att bedöma fagocytos av peritoneal makrofager från ung (åtta veckor gamla) och äldre (16 månader gamla) musen använder andra-uttryckande E. coli, vilket är bekvämt, snabbt och ekonomiskt genomförbart.
Användning av en andra-uttryckande E. coli -stam är en av fördelarna med denna analys eftersom dessa bakterier är stabila och visa en stark fluorescens signal, även efter det att makrofager korrigeras av 4% (w/v) PARAFORMALDEHYD. Dessutom, genom att använda den andra-uttryckande E. coli, forskare behöver inte ytterligare färgning efter fagocytos, vilket sparar tid. Makrofager är dessutom immunoresponsive för E. coli ytantigen, att göra E. coli mer lämpade för fagocytos analysen än med andra-uttryckande svampar eller fluorescein-märkt pärlor.
Med andra-uttryckande E. coli, kan en fagocytos assay lätt fulländat i 2 h och mätt med både flöde flödescytometri och fluorescence mikroskopi, beroende på forskarens syfte. Eftersom denna metod mäter direkt fagocytos förmågan, är resultaten mer reproducerbar än andra indirekta metoder.
Denna metod har också verifierats i en RAW264.7 cell fodrar och människans perifera mononukleära celler4. Texten nedan finns detaljerade stegvisa instruktioner för att utföra denna analys och belyser de kritiska steg som forskarna kan modifiera för att möta behoven hos sina experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes enligt nationella institut för hälsa riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur och protokoll godkändes av djur vård och användning kommittén av Dalian medicinska universitet. Sexton-månad-gammal (med en kroppsvikt på 30-35 g) och åtta veckor gamla (20-25 g) SPF (specifika-patogenfria) manliga C57BL/6 möss erhölls från SPF djurens center Dalian Medical University. Alla möss förvarades i djurstallar med tillgång till mat och vatten ad libitum. Temperaturen hölls vid 20-24 ° C, luftfuktighet var 40-70%, och belysning var 12 h ljus/12 h mörk. Djuren fick anpassa sig till miljön minst 7 dagar innan experimentet.
1. konstruktion av pET-SUMO-andra plasmid och induktion av det andra uttrycket
- Syntetisera den andra gen fragmenten (en 717 bp-sekvens som syntetiseras av en anpassad gen syntes tjänst, se Tabell för material - och kompletterande fil 1 för sekvensen) och förstärka fragmentet med forward primer ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') och reverse primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), med HiFi-Taq-DNA polymeras.
- För att säkerställa att polymeras-kedjereaktion (PCR) produkterna har enda 3' adenin överhäng för TA kloning i nästa steg, Använd en 30 min förlängning vid 72 ° C efter sist cykel (se kompletterande fil 1 för PCR-villkor). Kontrollera PCR-produkten av agaros gelelektrofores.
- Klona PCR-produkten i den pET-SUMO vektorn (se Tabell för material) med hjälp av den TA kloning metod5 med T4 DNA-ligase. Inkubera reaktionen vid rumstemperatur (20-25 ° C) i 30 min. Vektorn är linearized mellan nukleotider 653 och 654 med en 1 bp 5′ T-överhäng på varje hårstrå.
- Förvandla den kemiskt behöriga BL21(DE) E. coli -stammen ligering produkten enligt följande: Tillsätt 5 µL (100 ng) av PCR-produkt till 100 µL av BL21(DE) behöriga celler via värme chock vid 42 ° C i 90 s; hålla blandningen på is för 3 min, och sedan lägger 400 µL av lysogeny buljong (LB) medium förvärmd vid 37 ° C, skaka den för 1 h vid 37 ° C och 120 rpm.
- Inokulera 100 µL av bakterier på ytan av en LB-kanamycin (100 µg/mL) platta med inducerare laktos (0,5 mmol/L), ger den andra uttrycket stammen. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
Obs: Om andra uttrycks framgångsrikt, några kolonier kan observeras som glödande grönt ljus i mörkret.- Du kan också välja kolonier att verifiera den infoga andra fragmenten av DNA-sekvensering. Primers för DNA-sekvensering är: framåt, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; omvänd, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
- Inokulera en positiv koloni i 5 mL LB medium med 100 µg/mL kanamycin. Inkubera i en 37 ° C skakas inkubator vid 120 rpm för 2 h, och sedan lägga till inducerare laktos till en slutlig koncentration av 0,5 mmol/L och fortsätter att skaka i 6 h, förmå andra uttryck. Empiriskt, när skakar för 6 h, optisk densitet vid 600 nm (OD600) kan nå 0,7 eller högre.
- Tillsätt 10 µL av bakteriell odlingssubstratet på ett objektglas, täck med ett täckglas och undersöka ett uttryck för andra under en inverterad fluorescens Mikroskop. De andra-uttryckande bakterierna kan lagras i mediet vid 2-8 ° C i flera veckor.
2. mus peritoneal makrofag isolering och primära kultur
- Tillsätt 3,5 g thioglycolate till 100 mL destillerat vatten och autoklav blandningen till sterilitet innan användning. Pumpa thioglycolate mediet i en 1 mL steril spruta i huven för mus peritoneal injektion. Använda en mus per spruta för att undvika infektion. Användning av thioglycolate kan öka antalet makrofager. Bosatt peritoneal makrofager kan isoleras utan thioglycolate men med lägre makrofag avkastning.
- Söva musen med hjälp av en metod som godkänts av den lokala djurens vård och användning kommittén. Injicera 1 mL 3,5% thioglycolate medium i musens bukhålan med 1 mL sprutan, använda en 23-G nål.
Obs: Genom att inducera anestesi, peritoneal injektionen kan utföras enkelt och minskar risken för skador på de inre organen som orsakas av injektion. - Hålla musen med vatten och mat ad libitum i 3 dagar. Övervaka kropp vikt och mat intag av djuret varje dag. Om viktminskning i kroppen är större än 10% inom 3 dagar, utesluta djuret från experimentet.
- Efter 3 dagar, avliva musen av cervikal dislokation efter snabbt inducera anestesi av sevofluran i en sluten låda. Alternativt använda en metod som har godkänts av den lokala djurens skötsel och användning kommittén till eutanasi musen.
- Placera musen i en skål (med en 10 cm i diameter) med 75% etanol att sterilisera och överföra det snabbt till huven. Placera musen på en tallrik och pin front tass till styrelsen att bestämma musens position.
- Med en 5 mL spruta bifogas en 20 G injicera nål, placera nålen avfasningen upp i 30 – 40° vinkel, 5 mL kall (4-10 ° C) fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på nedre delen av magen i musens bukhålan, undvika punktering tarmen. Om tarmen (eller något annat organ) är punkterad, musen och dess celler kan inte längre användas för experiment, som detta kan aktivera celler som inte är lämplig för primär cellkultur.
- Utföra en mild massage på de två sidorna av musens buken. Sug sedan ut vätskan försiktigt och långsamt. Dosera peritonealvätska i en 50 mL centrifugrör. Upprepa dessa steg 2 x eller 3 x.
- Centrifugera de suspenderade cellerna för 10 min vid 400 x g i en kyld centrifug (4-8 ° C). Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i RPMI 1640 medium med 10% fetalt bovint serum (FBS). Räkna cellerna. Empiriskt, är cell densiteten ungefär lika med 5 x 106 celler/mL när cellerna är resuspended i 10 mL av medium.
- Lägga till 5 x 106 celler i varje brunn 6-well platta för flöde flödescytometri assay och 5 x 105 celler per brunn till en 24-well platta för fluorescens Mikroskop. Odla cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator över natten. Odlingsmediet kan uppdateras efter 3 h att ta bort nonadherent celler eftersom de flesta av dessa är lymfocyter. Vidhäftande cellerna är främst makrofager, och de kan följa väl vävnad-kultur-behandlade plast.
3. makrofag fagocytos assay använda mikroskopet fluorescens
- Iaktta cellerna i ljusa fält Mikroskop för att bedöma cellernas viabilitet och cell densiteten.
- Ta bort odlingssubstratet från 24-väl plattan. Tillsätt 100 µL av färskt odlingssubstrat och 10 µL av bakteriesuspensionen (cirka 2 x 107 celler) i varje brunn som beskrivs i tabell 1. Inkubera i 1 h i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Försiktigt tvätta 3 x-5 x med 500 µL kallt PBS per brunn att tvätta ur noninternalized bakterier.
- Inkubera cellerna med 4% formaldehyd i PBS i rumstemperatur i 30 min.
- Tvätta fast cellerna 3 x med PBS (500 µL per brunn).
- Tillsätt 200 µL phalloidin 633 fluorescens färga konjugerade arbetslösning (se Tabell för material) för att färga de F-aktin. Butik i en mörk, fuktig plats (60% - 80%) i rumstemperatur i 60 min. Skölj cellerna 3 x med PBS (500 µL per brunn) att ta bort någon överflödig phalloidin. Genom färgning F-actin, cytoplasman kan beskrivas och bidra till att skilja de internaliserade bakterierna.
- Tillsätt 200 µL DAPI (4', 6-diamidin-2-fenylindol) arbetslösning (1 µg/mL) till fläcken cellkärnan och inkubera i 5 min i en mörk, fuktig plats i rumstemperatur. Skölj 1 x med PBS (500 µL per brunn) och 1 x med samma volym av destillerat vatten. Cellerna kommer sedan vara redo för observation under en inverterad fluorescens Mikroskop.
4. makrofag fagocytos analys med flödescytometri
- Att minimera de experimentella fel och göra en korrekt tolkning av resultaten, ange grupperna och kontrollera rören för experimentet som förtecknas i tabell 2.
- För kontrollgruppen, som kommer att placeras på is (grupp 4 i tabell 2), ta bort mediet från 6-väl plattan och tvätta det 1 x med PBS. Lägg sedan till 1 mL 70 mM kall EDTA i brunnen att lossa cellerna och överföra dem till flöde flödescytometri röret. Tillsätt 50 µL av bakteriesuspensionen i röret och placera den på is för 1 h.
- För de andra grupperna, ta bort odlingssubstratet. Tillsätt 1 mL färsk medium i varje brunn. Tillsätt 50 µL av bakteriesuspensionen i brunnar enligt inställningen för gruppen, som beskrivs i tabell 2. Sedan placera 6-väl plattan i 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 1 h.
- För att släcka fluorescensen av noninternalized E. coli, tillsätt 200 µL av lösning 0,8% kristallviolett (CV) vatten i brunnen och gunga inom kort, så att man undviker ett falskt positivt resultat av andra-uttryckande E. coli bindningen till ytan av den makrofager men inte internaliserat. Tvätta cellerna 3 x med PBS ta bort eventuella kvarvarande CV.
- Lägg sedan till 1 mL 70 mM kall EDTA i brunnen att lossa cellerna och överföra dem till flöde flödescytometri röret.
- Centrifugera rören vid 400 x g i 5 min och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 100 µL av PBS att resuspendera cellerna. Tillsätt 5 µL F4/80-PE-konjugerad antikropp (en ytantigen som uttrycks på mus makrofager) in i rören, eller Använd IgG2a-PE-isotyp, enligt inställningen för gruppen. Vortex kort och inkubera proverna på is för 5-10 min i mörker.
- Tillsätt 1 mL PBS i varje rör och centrifugera vid 400 x g i 5 min. Tag bort supernatanten. Återsuspendera cell pellets med 200-300 µL av PBS för flödescytometri Flödesanalys. Kör varje rör och förvärva data för minst 10 000 händelser av F4/80+ celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PET-SUMO vektorn använder tredjeparts en liten ubiquitin-liknande modifierare som gör att uttrycket av infödda proteiner i den E. coli. SUMO fusion kan avsevärt förbättra andra löslighet, så att den kan upptäckas lätt. Om det andra uttrycket framgångsrikt framkallas av laktos, kan gröna kolonier observeras i mörkret (figur 1A). Gröna prickar, som representerar den andra-uttryckande E. coli, kan observeras i fluorescens Mikroskop använder ett 40 x-objektiv (figur 1B).
Mikroskopi analys visar fluorescens bilder (figur 1 c) av peritoneal makrofager från grupperna unga och äldre. Figur 1 c visar den röd fluorescensen av F-aktin, den gröna fluorescensen av andra-uttryckande E. coli, den blå fluorescensen av DAPI nukleär färgning och sammanslagna bilden av alla tre fluorescens kanaler. 16 månader gamla möss, som betraktades som de åldern möss, var motsvarande 60 - till 65-åriga människor. Dessa bilder föreslår att makrofager från unga möss fram en starkare fagocytos förmåga än de från de åldern möss.
Flödescytometri (figur 2) användes för att kvantifiera och jämföra makrofag fagocytos från gruppen unga och äldre. Figur 2A visar en representativ Flödesanalys flödescytometri av unga, äldre och kontrollgrupper. F4/80-PE antikroppen användes för att identifiera och gate makrofager och andra positiva signaler indikerar makrofager som fagocyteras E. coli. Andelen F4/80+ och andra+ celler indikerar att fagocytiska makrofager. Resultatet (figur 2B) av den unga gruppen var 62,7% ± 5,1% (medelvärde ± SEM), vilket var betydligt högre än den 35,2% ± 2,9% (medelvärde ± SEM) av gruppen äldre. Dessa resultat är förenliga med utvecklingen av fluorescence mikroskopi resultat.
Figur 1 : Andra-uttryckande E. coli och dess fagocytos av makrofager. (A) andra-uttryckande E. coli kolonier. PET-SUMO-andra plasmiden förvandlades till BL21(DE) celler; bakterier var inokuleras på en LB-kanamycin (100 µg/mL) plattan. En beläggning av 0,5 mmol/L laktos på LB platta ytan användes som den induceraren, ger det andra uttrycket. Om andra uttrycks framgångsrikt, observeras gulaktig grön kolonier med hjälp av UV-ljus i mörkret. (B) fluorescensmikroskopi av andra-uttryckande E. coli. Grön signal representerar andra-uttryckande E. coli. Skalstapeln = 50 µm. (C) flerkanaliga fluorescens bilder av makrofager som phagocytosing E. coli. Cellerna inkuberades med andra-uttryckande E. coli (grön) för 1 h, följt av en tvätt med PBS och fixering med 4% paraformaldehyd, och färgning för F-aktin använder phalloidin 633 konjugat arbetslösning (röd) och DAPI (blå). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Flow flödescytometri resultat. (A) representativa flödescytometri Flödesanalys av unga, äldre och kontrollgrupper. Peritoneal makrofager var fläckad med F4/80-PE efter coincubation med andra-uttryckande E. coli. F4/80+ och andra+ celler var sällsynta i negationen kontroll och kontroll (grupp 4: unga gruppen på is) grupper. Unga och äldre flöde flödescytometrisk tomterna representerar grupper 5 och 6, respektive. (B) resultaten från flödet flödescytometri analysen av grupperna unga och äldre. Ett Mann-Whitney test användes för att undersöka skillnaden mellan dessa två grupper. Andelen av F4/80+ och andra+ celler i den unga gruppen var betydligt högre än i den äldre gruppen (*P < 0,05). Felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Grupp | Namn | Celler | EGFP E. coli | Samtidig inkubationstid |
| 1 | Ung | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 h |
| 2 | I åldern | 2 x 105 | 2 x 107 | 1 h |
Tabell 1: grupp inställningen för fluorescensmikroskopi. Två grupper, den äldre gruppen (16 månader gamla C57BL/6, n = 3) och den unga gruppen (8 veckor gamla C57BL/6, n = 3), användes för att förbereda peritoneal makrofager. Peritoneal makrofager i varje mus har lagts till separat brunnar. Ungefär 2 x 105 celler i en volym av 100 µL lades till varje brunn; sedan, ungefär 2 x 107 andra-uttryckande E. coli celler i en volym av 10 µL lades till varje brunn och coincubated för 1 h vid 37 ° C.
| Grupp | Namn och villkor | Celler | ANDRA | F4/80-PE | PE-ISOTYP |
| E. coli | |||||
| 1 | Isotypen kontroll vid 37° C | 2 x 106 | — | — | Tillsätt 5 μl |
| 2 | PE positiv kontroll vid 37° C | 2 x 106 | — | Tillsätt 5 μl | — |
| 3 | ANDRA positiva kontrollen vid 37° C | 2 x 106 | 1 x 108 | — | — |
| 4 | Ung grupp på is | 2 x 106 | 1 x 108 | Tillsätt 5 μl | — |
| 5 | Ung grupp vid 37° C | 2 x 106 | 1 x 108 | Tillsätt 5 μl | — |
| 6 | Åldersgrupp vid 37° C | 2 x 106 | 1 x 108 | Tillsätt 5 μl | — |
Tabell 2: gruppera inställningen för flödescytometri. Primär peritoneal makrofager från unga och äldre mössen sattes som sex grupper. Grupp 1 var satt som isotypen kontroll; grupperna 2 och 3 sattes som enda positiv kontroll för PE eller andra kanal, respektive. För att säkerställa att den internaliserade fluorescensen är specifik för fagocytos, var grupp 4 ruvade på is. Fagocytos stoppas på is på grund av den låga temperaturen. Inkubationstiden var 1 h för alla grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stegen i detta protokoll är ganska enkel och okomplicerad. En av de kritiska steg är att framkalla andra uttryck på E. coli. Vanligtvis, när en gen från Eukaryoter, liksom andra, planeras att uttrycka i prokaryoter som E. coli, finns det en risk att proteinet kommer att bilda inaktiva aggregat (inkludering organ), som ändrar proteinets infödda struktur och verksamhet. Med hjälp av pET-SUMO vektorn och konstruera pET-SUMO-andra plasmiden, den andra-SUMO fusionsprotein uttryckt framgångsrikt, och ljus signalen var stark nog att upptäckas av både fluorescens Mikroskop och en flödescytometer.
Den andra kritiska steget är att släcka fluorescensen av bakterier som inte var internaliserat av makrofager. Trots Trypan blå har visats att släcka fluorescensen av fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)-märkt, värmeavdödade bakterier, det fungerade inte för den levande E. coli. Använda en 0,8% lösning kristallviolett vatten kan släcka de flesta av fluorescensen av den E. coli som binder på cellytan. Vissa litteraturen tyder på att tvätt med antibiotika i stället för med Trypan blå kan hjälpa till att släcka fluorescensen, men som inte var effektivt i detta experiment10.
Cell densiteten kan begränsa denna teknik. Eftersom cellerna består av en blandning av lymfocyter och makrofager, är makrofager oftast lägre än cell densiteten beräknas från hemocytometer när skörden cellerna från de mus bukhålan, vilket kan resultera i ett otillräckligt antal av celler för flödescytometri och fluorescensmikroskopi. Vid otillräcklig numrerar av makrofager, kan celler från två till tre möss inom samma grupp blanda för fagocytos analysen. När denna teknik används i makrofag cellinjer, såsom RAW264.7, kan cellförlust vara ett problem, eftersom dessa celler är relativt nonadherent; Således kan celler förloras under förfarandet för tvätt. Tvätta försiktigt eller kultur plattor med cell-behandlade ytor, vilket kan öka celladhesion.
Det finns många andra metoder för att bedöma fagocytos förmåga. Som en av de klassiska metoderna användes kyckling erytrocyter eller betsad döda celler som markörer för fagocytos. Känsligheten för dessa metoder var begränsad av den stora variationen av resultaten. En annan alternativ metod för att undersöka fagocytos är att använda celler infekterade med bakterier i flera timmar, då lyse cellerna med Triton x-100 och plattan på en LB agar petriskål över natten vid 37 ° C. Fagocytos kapacitet bestäms genom att räkna antalet kolonibildande enheter (CFUs)6. Denna metod krävs så länge som 2 dagar för att erhålla CFU data och variansen för räknade siffrorna var stort eftersom de cell lysates späds ut flera gånger. Sedan, FITC-märkt pärlor7 eller E. coli infördes för fagocytos analyser8. Eftersom dessa pärlor saknade specifika ytantigener, krävdes ytterligare preopsonization för optimalt upptag. Också, metoden att använda FITC-märkt bakterierna kan hindra fagocytos eftersom FITC äventyras bakteriella virulens9.
En annan nyligen införda metoden är att använda kommersialiserade färgämnen, som är pH känsligt och endast fluorescerar när de är inne sura lysosomen, vilket eliminerar de släcka steg10. Den kommersialiserade kit kan dock vara kostnadseffektivt oöverkomliga. När den andra-uttryckande E. coli -stammen är konstruerad, bakterierna återges enkelt och fluorescensen är stabil i flera veckor, vilket gör denna metod enkel och ekonomisk. Eftersom andra har en stark fluorescens, kan denna metod också vara modifierbara till en hög genomströmning fluorometric teknik att bedöma makrofag fagocytos, som kan utföras i en ogenomskinlig plattan med 96 brunnar11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr. 31800046) och naturvetenskap Foundation i Liaoning-provinsen (nr 20170540262) stött detta arbete. Detta arbete var fulländat i laboratorier av vetenskapliga forskningscentrum vid andra sjukhus i Dalian medicinska universitet. Författarna vill tacka Xiao-Lin Sang för hennes hjälp med flödescytometri, och Bo Qu och Dong-Chuan Yang för deras hjälp producera video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | - | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | - | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E.
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
