Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Oppdage Ligand-bindende domene Dimerization aktiviteten til østrogen reseptor alfa bruker pattedyr to-Hybrid analysen

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

Vi presenterer en metode for å analysere 4-hydroxy-tamoxifen-avhengige østrogen reseptor alfa ligand-bindende domene dimerization aktiviteten bruker pattedyr to-hybrid analysen.

Abstract

Østrogen reseptor alfa (ERα) er en estrogenic ligand-avhengige transkripsjon regulator. Sekvensen av ERα protein er svært bevart blant arter. Det har blitt antatt at funksjonen av menneskelige og mus ERαs er identiske. Vi demonstrere differensial 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) på mus og menneskelig ERα ligand-bindende domene (LBD) dimerization aktivitet ved hjelp av pattedyr to-hybrid (M2H) analysen. M2H analysen kan demonstrere effektiviteten av LBD homodimerization aktivitet i pattedyrceller, utnytte transfection av to protein uttrykk plasmider (GAL4 DNA-bindende domene [DBD] fusion LBD og VP16 transactivation [VP16AD]-domene fusjon LBD) og GAL4 svarer element (GAL4RE) smeltet luciferase reporter plasmider. Når GAL4DBD fusion LBD og den VP16AD fusion LBD gjør således en dimer i cellene, dette proteinet binder seg til GAL4RE og deretter aktiverer en luciferase genuttrykk gjennom VP16AD avhengige transkripsjon aktiviteten. 4OHT-mediert luciferase aktivisering er høyere i HepG2 cellene som var transfekterte med musen ERα LBD fusion protein uttrykk plasmider enn i de menneskelige ERα LBD fusion protein uttrykk plasmider transfekterte cellene. Dette resultatet antyder at effekten av 4OHT-avhengige musen ERα LBD homodimerization aktivitet er høyere enn menneskelig ERα LBD. Generelt, er utnyttelse av M2H analysen ikke ideelt for vurdering av kjernefysiske reseptoren LBD dimerization aktivitet, fordi agonistic ligander forbedrer basale nivået av LBD aktivitet, og som hindrer oppdagelsen av LBD dimerization aktivitet. Vi fant at 4OHT ikke styrkes ERα LBD basale aktiviteten. Det er en nøkkelfaktor for å bestemme og oppdage 4OHT-avhengige LBD dimerization aktivitet for å kunne bruke M2H analysen. ERα LBD-baserte M2H analyser kan brukes for å studere delvis Agonistiske aktiviteten til selektiv østrogen reseptor modulatorer (f.eks, 4OHT) i ulike pattedyr celletyper.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Østrogen reseptor alfa (ERα) er en estrogenic ligand-avhengige transkripsjon regulator. Aminosyren sequenceof ERα er svært bevart blant arter. På grunn av den høyere homologi mellom menneske og mus ERα funksjonen til disse reseptorene er tenkt som identiske og differensial aktiviteten til estrogenic stoffer (f.eks, tamoxifen) i disse arter er forårsaket av arten forskjeller i kjemisk metabolisms i stedet for de strukturelle forskjellene i ERα. ERα har svært bevart domene strukturer som er vanlig blant kjernefysiske reseptor (NR) gruppe, utpekt A til F domener. E-domenet eller ligand-bindende domene (LBD) inneholder ligand-bindende lommen og transcriptional aktiveringsforespørselen 2, kalt AF-2. F domenet er lokalisert umiddelbart tilstøtende E domenet og mest variabel domenet blant NRs. Selv mellom menneske og musa ERα, homologi F domenet er betydelig lavere enn i andre domener1. Det ligand binding LBD ERα forbedrer homodimerization av ERα protein binde det spesifikke østrogen-responsive DNA elementet direkte for å regulere ligand-avhengige genet transkripsjon (klassisk handling av ERα). Krystallografisk undersøkelser avdekket differensial plasseringen av Spiralen 12 (AF-2 kjernen domene) med østradiol (E2)- eller 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - bundet LBD dimers2,3. ERα F domenet (45 aminosyrer) koble helix 12 direkte. Men er det ingen informasjon om effekten av denne utvidelsen av 45 aminosyrer (F domene) fra helix 12 om ERα LBD dimerization. I denne studien viser vi bidrag av F domenet artsspesifikke 4OHT-avhengige ERα LBD homodimerization med en pattedyr to-hybrid (M2H) analysen.

M2H analysen er en metode for å demonstrere protein-protein interaksjoner i pattedyrceller introdusere de tre forskjellige plasmider DNAs: to protein uttrykk plasmider, som uttrykker GAL4 DNA-bindende domene (DBD) fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD, og GAL4RE-smeltet luciferase uttrykk reporter plasmider. Når GAL4DBD fusion ERα LBD og VP16AD fusion ERα LBD samhandler (gjør således en dimer) i cellene, dette proteinet binder seg til GAL4RE, og deretter aktiverer luciferase genuttrykk gjennom funksjonen VP16AD-avhengige transactivation. Nivået på LBD homodimerization kan evalueres av den luciferase aktiviteten.

Gjær to-hybrid (Y2H) analysen er en alternativ metode basert på samme prinsipp som bruker gjær som vertsmiljøet. Tidligere rapporter ved hjelp av Y2H systemet vist at F-domene-avkuttet menneskelig ERα LBD øker E2-avhengige coactivator rekruttering, konkluderte med at F domenet hindrer E2-mediert transkripsjon4. Dette resultatet er inkonsekvent med andre rapporter som har vist dempes transcriptional aktiviteten til F-domene-avkuttet menneskelige ERα i pattedyrceller5,6. Nylig vist vår studie, bruker M2H systemet, at E2-avhengige coactivator rekruttering aktiviteten til menneskelig ERα LBD er redusert med F domene trunkering i pattedyrceller og samsvarer med transkripsjon aktivitet1. Disse observasjonene foreslår at rollen fysiologiske protein-protein interaksjon er forskjellig i en celle type-spesifikk måte og sammenheng. M2H analysen kan vise protein-protein samhandling aktivitet i samme mobilnettet kontekst som brukes for å bestemme transcriptional aktiviteten. Dette gir en fordel til M2H analysen sammenlignet Y2H eller andre i vitro protein-protein samhandling-analyser.

Det gjenstår spørsmål om molekylære mekanismer for delvis Agonistiske aktiviteten til selektiv østrogen reseptor modulatorer (SERM) (f.eks, 4OHT) å regulere ERα-mediert transkripsjon. ERα LBD-baserte M2H analyser kan brukes for å studere mekanismen for delvis Agonistiske aktiviteten SERM i ulike pattedyr celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. utarbeidelse av plasmider for pattedyr to-hybrid analysen

  1. Bruk følgende plasmider: pG5-Luc pBIND-ERαEF og pakt-ERαEF.
    Merk: Plasmider er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel og sendes filter papir. pG5-Luc er reporter plasmider som inneholder fem ganger i GAL4 forståelsesfull elementer smeltet sammen med luciferase uttrykk enheten (figur 1A). pBIND-ERαEF er protein uttrykk plasmider for GAL4DBD-smeltet ERα LBD proteiner. pBIND-ERαEF inneholder en Renilla luciferase uttrykk enhet for normalisering transfection effektiviteten (figur 1B). Pakten-ERαEF er protein uttrykk plasmider for VP16AD-smeltet ERα LBD proteiner (figur 1C). Diagrammet av uttrykt protein fra plasmider er vist i figur 2.
  2. Forberede plasmider DNAs.
    1. Kuttet ut området plasmider lastet fra papiret med ren saks og legg den i en 1,5 mL tube. Bruk hansker og bruke rene pinsetter for å plukke opp plasmider lastet papiret. Legg 100 µL Tris-EDTA (TE) bufferen (pH 8.0) og vortex godt.
    2. Legge 1 µL av plasmider DNA løsningen fra trinn 1.2.1 å kompetent Escherichia coli celler (se Tabell for materiale) og holde røret på isen i 15 min.
    3. Varme-shock plasmider-lagt kompetent celler. Inkuber lysrør i 42 ° C vannbad for 30 s og, deretter holde dem på isen i 2 minutter.
    4. Legg til 250 µL av super optimal buljong med catabolite undertrykkelse (SOC) medium (romtemperatur) lysrør og kultur med skjelvende på 37 ° C i 30 min.
    5. Plate 100 µL av kultivert E. coli på en prewarmed Luria kjøttkraft (LB) tallerken med 100 µg/mL ampicillin (10 cm diameter parabolen) og kultur på 37 ° C over natten.
    6. Plukke en koloni fra platen og legg den i en 14 mL tube med 2 mL kjempefint kjøttkraft (TB) med 100 µg/mL ampicillin. Kultur med skjelvende på 37 ° C før mediet er svakt tåkete.
    7. Legge til 1 mL av kultivert mediet fra trinn 1.2.6 en autoklaveres 250 mL glass kolbe som inneholder 50 mL av TB med 100 µg/mL ampicillin. Kultur med skjelvende ved 37 ° C i 20-24 h.
    8. Overføre den kultiverte E. coli til en 50 mL konisk rør og sentrifuge 3,450 x g ved romtemperatur for 30 min med swing-bøtte rotoren. Kast medium. Lagre E. coli pellet på-80 ° C.
    9. Legge 3 mL celle rørets løsning (se Tabell of Materials) til E. coli pellets og stoppe den helt. Legge 3 mL celle lysis løsning (se Tabell for materiale), blanding røret forsiktig ved å snu det 10 x, og holde det på is 5 min (holde tiden punktvis). Legge til 6 mL av nøytralisering løsning (se Tabell for materiale), bland røret stadig med å trykke, og deretter holde den på is 10 min.
    10. Sentrifuge røret 3,450 x g på 4 grader i 30 min med swing-bøtte rotoren. Overføre DNA inneholder løsningen å en ny 50 mL konisk tube og legge 10 mL av DNA rensing harpiks (se Tabell for materiale). Suspendere harpiks forsiktig.
    11. Sentrifuge røret 625 x g for 1 min bruker swing-bøtte rotoren. Forkaste løsningen og holde harpiks nederst.
    12. Legge til 15 mL kolonnen vaskeløsning (80 mM kalium acetate, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA, og 55% etanol) 50 mL konisk rør og rist den forsiktig å suspendere harpiks. Gjenta trinn 1.2.11.
      Merk: Vaskeløsning kolonnen må være forberedt med diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vann eller nuclease uten vann.
    13. Legg til 5 mL av kolonnen vaskeløsning til 50 mL konisk røret og suspendere harpiks med en 5 mL pipetter. Harpiks gjelder kolonnen (se Tabell for materiale) som ligger på vakuum manifold. Vakuum kolonnen til harpiks tørr. Legg til 6 mL av kolonnen vaskeløsning kolonne og vakuum.
    14. Når harpiks tørker visuelt koble reservoaret fra kolonnen. Overføre nederst i kolonnen (harpiks) til en 1,5 mL tube. Sentrifuge kolonnen med maksimal hastighet i 2 minutter bruke et microcentrifuge til å tørke harpiks.
    15. Overføre nederst i kolonnen (harpiks) til en ny 1,5 mL tube. Legger 300 µL av nuclease-fritt vann til kolonnen og vente til hele harpiksen er gjennomvåt.
    16. Sentrifuge kolonnen med maksimal hastighet for 1 min samle plasmider DNA inneholder løsning (200-250 µL).
    17. Behandle DNA inneholder løsningen med fenol-kloroform (1:1), deretter med kloroform som følger.
      1. Legge til samme volum av fenol-kloroform (1:1) i DNA inneholder løsningen (200-250 µL), rist godt og sentrifuge med maksimal hastighet i 2 minutter ved hjelp av en microcentrifuge. Samle det øvre laget (DNA inneholder løsning) og legge den til en ny 1,5 mL tube. Gjenta dette trinnet 1 x.
      2. Legge til den samme mengden kloroform DNA inneholder løsningen (200-250 µL), rist godt og sentrifuge med maksimal hastighet i 1 samle det øvre laget (DNA inneholder løsning) og legge den til en 1,5 mL tube.
        Merk: Endotoxin (lipopolysakkarid) induserer mobilnettet signalering i noen celler. For å unngå slik uforutsett effekt, anbefales 1.2.17, noe som kan redusere endotoxin forurensning.
    18. Utløse plasmider DNA ved hjelp av etanol nedbør teknikk som følger.
      1. Legg 1/9 av DNA blanding av 3 M natrium acetate (pH 5.5) og 20 x 3M natrium acetate volum av 100% etanol DNA inneholder løsningen. For eksempel legge til 27,8 µL av 3 M natrium acetate og 278 µL av 100% etanol i 250 µL av DNA løsningen (det siste bindet er 555.8 µL).
      2. Hold løsningen på-80 ° C for 20 min minst. Sentrifuge med maksimal hastighet for 20 min på 4 grader. Forkaste løsningen og holde pellet. Legge til 200 µL av 75% etanol og skyll innsiden av røret. Sentrifuge for 20 min på 4 ° C, forkaste løsningen og holde pellet. Tørr DNA pellet bruker en vakuum konsentrator.
      3. Legge til 100-250 µL av TE buffer (pH 8.0) til røret. Oppløse DNA-pellets og sjekke DNA konsentrasjonen med et spektrofotometer på en bølgelengde på 260 nm. Holde DNA konsentrasjonen rundt 0,5 mg/mL.

2. pattedyr to-hybrid analysen

  1. Opprettholde cellene.
    1. Kultur menneskelige hepatocellulært karsinom HepG2 celler i en 750 mL, 175 cm2 vev kultur kolbe med fenol red uten minimum viktig media (MEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS; inaktivert), 2 mM L-glutamin, og 1% penicillin-streptomycin løsning (antibiotika) for å opprettholde cellene.
    2. Kultur cellene i en 5% CO2-supplert, 37 ° C inkubator til cellene er ca 90% confluent.
      Merk: For å redusere estrogenic bakgrunn aktivitet, fenol red-fri medium skal brukes for alle M2H eksperimenter. Dette trinnet skal utføres innenfor en ren benk/biologisk sikkerhet regjering. Cellene skal beholdes etter den generelle pattedyr celle kultur protokoll7.
  2. Forberede cellene transfection.
    Merk: Følgende fremgangsmåter for trinn skal utføres i ren benk/biologisk sikkerhet regjering. Cellene er kultivert/ruges i en 5% CO2-supplert, 37 ° C inkubator i dette trinnet hver gang.
    1. Replate 90% confluent cellene til 24-vel platene; Skyll cellene 1 x med fosfat-bufret saltvann (PBS).
    2. Legge til 7 mL av 0,05% trypsin-EDTA løsning kultur flasken og suge celler for 1-2 min samtidig kultur flasken i en ren benk ved romtemperatur. Fjerne en del av trypsin-EDTA løsningen og la 1-2 mL løsningen i kultur kolbe. Inkuber kultur kolbe i inkubator for 1-2 min.
    3. Smellkyss bunnen av flasken å koble cellene og sjekk celler under microscope.
      Merk: Hvis cellene er fortsatt knyttet til kolbe, ruge for en annen 1-2 min, og deretter gjenta trinn 2.2.3.
    4. Suspendere cellene i fenol red-free MEM supplert med 10% kull-strippet FBS (inaktivert), 2 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin løsning.
      Merk: Kull-strippet FBS må brukes til å redusere effekten av serum-avledet endogene østrogen.
    5. Telle celle nummer og seed celler i en 24-vel plate på en tetthet på 1.2 x 105 celler/godt. Tilordne tre brønner for hvert datapunkt (tre eksemplarer).
    6. Kultur cellene over natten. Fortsett å gå 2.4.1.
  3. Forberede en DNA blanding transfection.
    Merk: De følgende plasmider DNAs er transfekterte i en brønn: 100 ng av pG5-Luc reporter plasmider, 50 ng av uttrykket plasmider for GAL4DBD fusion proteiner (pBIND), og 50 ng av uttrykket plasmider for VP16AD fusion proteiner (pakt).
    1. Hvis du vil analysere ligand-avhengige ERα LBD dimerization aktiviteten, forberede følgende kombinasjoner (Figur 3). Kombinasjon (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pakten, og pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten. Kombinasjon (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pakt-hERαEF, og pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakt-mERαEF. Kombinasjon (iii): pG5-Luc + pBIND + pakt-hERαEF, og pG5-Luc + pBIND + pakt-mERαEF.
      Merk: Kombinasjon (i) representerer basale eksperimentelt av menneskelig ERα LBD og mus ERα LBD, henholdsvis. Hvis resultatet viser bemerkelsesverdig høy med ligand alene, er denne metoden unfeasible for bruk med det ligand (f.eksdiethylstilbestrol [DES]). Kombinasjon (ii) representerer nivåene av dimerized menneskelig ERα LBD og dimerized musen ERα LBD, henholdsvis. Kombinasjon (iii) representerer negative kontroller; Bruk dette settet bare når eksperimentet utføres for første gang å evaluere bakgrunnen av systemet.
    2. Før blande, beregne totalen DNA beløpet kreves basert på antall brønner for hva. Eksperimenter utført i triplicates og fem datapunkt, blande den følgende plasmider DNAs i to 1,5 µL rør for kombinasjoner (i) og (ii): pG5-Luc, 5 (datapunkt) x 3 (wells) x 100 ng = 1500 ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (datapunkt) x 3 (wells) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL); Pakten (kombinasjon i) eller pakt-mERαEF (for kombinasjon ii), 5 (datapunkt) x 3 (wells) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL).
      Merk: Konsentrasjonen av hver plasmider DNA løsning er 0,1 µg/µL.
    3. Utløse DNA blandingen ved hjelp av etanol nedbør teknikk. Legg 1/9 av DNA blanding av 3 M natrium acetate (pH 5.5) og 20 x 3M natrium acetate volum av 100% etanol til DNA blanding. Deretter vortex tube.
      Merk: For eksempel legge til 3,4 µL av 3 M natrium acetate og 34 µL av 100% etanol 30 µL av plasmider DNA blanding eksemplifisert i trinn 2.3.2. Dette trinnet bidrar til å holde en ufravikelig transfection tilstand, og det er ikke nødvendig å utføre dette trinnet i en biologisk sikkerhet regjering.
    4. Holde blandingen over natten på 20 ° C. Sentrifuge den maksimale hastigheten for 20 min på 4 ° C. Kast løsningen (pellet er usynlig). Legge til 120 µL av 75% etanol røret; Skyll innsiden av røret. Sentrifuge for 20 min på 4 ° C. Forkaste løsningen og tørr DNA blandingen med en vakuum konsentrator for 30 min.
  4. Utføre transfection.
    Merk: Følgende trinn skal utføres i en ren benk eller en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
    1. Neste morgen, skyll cellene seeded i en 24-vel plate (fra trinn 2.2.6) 2 x med 0,5 mL PBS (romtemperatur).
    2. Legge til varm (37 ° C) frisk fenol red-free MEM supplert med 10% kull-strippet FBS (inaktivert) og 2 mM L-glutamin uten antibiotika hver brønn (0,5 mL medium/vel). Holde cellene i en 5% CO2-supplert, 37 ° C inkubator.
    3. Avbryte tørket plasmider DNA blandingen (fra trinn 2.3.4) Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) (ingen serum, fenol red-fri, ikke glutamin, 13 µL/vel). Beregne beløpene av DMEM fra antall brønner for hva.
      Merk: 15 brønner for kombinasjon (i) x 13 µL = 195 µL og 15 brønner for kombinasjon (ii) x 13 µL = 195 µL.
    4. Suspendere transfection reagensen (se Tabell for materiale; 1,5 µL/vel) i DMEM (12.5 µL/vel) i en annen 1,5 mL tube. Beregne mengden transfection reagens- og DMEM fra antall brønner for hva.
      Merk: 30 [15 brønner for kombinasjon] (i) og 15 wells for kombinasjon (ii) x 1,5 µL av transfection reagensen + 30 x 12,5 µL av DMEM = 420 µL.
    5. Legge til en lik mengde transfection reagens mediet (fra trinn 2.4.4) til hver tube (fra trinn 2.4.3). Inkuber rør i 5-10 min ved romtemperatur.
      Merk: 200 µL av transfection reagens medium + 195 µL av kombinasjon (i) DNA blanding = 395 µL og 200 µL av transfection reagens medium + 195 µL av kombinasjon (ii) DNA blanding = 395 µL. Det er viktig å legge til en lik mengde transfection reagens medium rørene av kombinasjon (i) og (ii). Det er ikke nødvendig å bruke opp mediet i dette trinnet.
    6. Legg kombinert blandingen (fra trinn 2.4.5) hver brønn (25 µL/vel) av 24-vel plate (fra trinn 2.4.2) og Inkuber celler for 6 h i 5% CO2-supplert, 37 ° C inkubator.
    7. Fjerne hva mediet fra 24-vel plate. Legge til varm (37 ° C) frisk fenol red-free MEM supplert med 10% kull-strippet FBS (inaktivert), 2 mM L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin løsning og ligand (suspendert i etanol) (0,5 mL medium/vel). Kultur celler for 16-18 h i 5% CO2-supplert, 37 ° C inkubator.
  5. Høste prøvene.
    1. Skyll cellene med 1 mL av PBS, og deretter legge til 100 µL av 1 x passiv lyseringsbuffer (se Tabell for materiale).
    2. Kraftig riste 24-vel platene med en vortex blandebatteri å koble cellene.
    3. Fryse plater (celle lysates) 1 x av flytende nitrogen eller lagre dem på-80 ° C før analysen. Umiddelbart før analysen, kraftig rist platene på en shaker til de er ved romtemperatur.
      Merk: Denne prosessen forhindrer uregelmessig vises avvikende verdier for luciferase aktivitet.
  6. Utføre en dual-luciferase analysen.
    1. Forberede reagensene dual-luciferase analysen systemet (se Tabellen for materiale).
      1. For å gjøre luciferase analysebuffer substrat (LAS), legger du til alle luciferase analysebuffer i luciferase analysen underlaget i brun glassflaske. Lagre LAS bufferen på 20 ° C.
        Merk: LAS bufferen skal være oppvarmet til romtemperatur før bruk.
      2. For å gjøre Renilla luciferase Substratbufferen (RLS), bland Renilla luciferase substrat og Renilla luciferase buffer i forholdet 1:50. Gjør frisk RLS buffer for hver analysen og bruke en sort tube eller en tube av tinfoil. Beregne mengden RLS buffer gjør en frisk buffer.
        Merk: RLS bufferen skal være oppvarmet til romtemperatur før bruk.
    2. Angi reagenser i microplate leseren.
      1. Vask injeksjon linjer 2 x med 70% etanol; deretter vaske linjene 2 x med vann.
        Merk: Dette er viktig å unngå forstyrre analyseresultatene.
      2. LAS buffer til P-injektoren linje (første injeksjon) og angi RLS bufferen til M-injektor linje (andre injeksjon). Ikke bland disse buffere. RLS buffer hemmer luciferase aktivitet.
    3. Bruke 10 µL av høstet prøver (fra trinn 2.5.3) til 96-brønns hvit plast plate.
    4. Bruk følgende innstillinger til microplate leseren. P-injektor, bruker et volum på 50 µL, av 2 s, og en hastighet på 50 µL/s. M-injektor, bruker et volum på 50 µL, av 2 s, og en hastighet på 50 µL/s. satt en integrasjon tid av 15 s. temperaturen til 25 ° C.
    5. Kjør microplate leseren.
    6. Verdiene for luciferase aktivitet (IPValue) og verdiene i Renilla luciferase aktiviteten (IMValue) bruker data oppkjøpet program (se Tabell for materiale).
    7. Vask injeksjon linjene etter datainnsamling (se trinn 2.6.2.1).
  7. Analysere data.
    1. Bruke normaliserte verdier (IPValue/IMValue) for dataanalyse.
    2. Sette den normaliserte verdien av kombinasjon (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pakten] med kjøretøy (0 nM ligand) idet 1 for beregning av basale nivået og homodimerized ERα LBD nivå. Nivåer vises som "Relativ aktivitet".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 3 viser ordningen av mulige svar i kombinasjon (i) og kombinasjon (ii) plasmider-transfekterte celler. Eksperimentelle resultater er vist i Figur 4. Aktiviteten i kombinasjon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten) viser stimulering av 10 nM E2 (Figur 4A), fordi det ERα LBD inneholder ligand-avhengige transactivation funksjonelle domenet, AF-2. Agonistiske (f.eksE2) som binder seg til den ERα LBD rekrutter transkripsjon coactivator(s) AF-2 domenet. Denne hendelsen fører til transcriptional aktivisering uten interaksjon med VP16AD fusion LBD og gjør det vanskelig å vurdere aktiviteten din LBD homodimerization på grunn av uspesifikke bakgrunnen (Figur 3C). Aktiviteten i kombinasjon (ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakt-mERαEF) ble observert med 1 nM og 10 nM E2 behandling (Figur 4A). Det ville være mulig å fastslå agonist-avhengige ERα LBD homodimerization aktiviteten Hvis riktig ligand konsentrasjonen for å oppdage aktiviteten til kombinasjon (ii) uten aktivering av kombinasjon (i) finnes (f.eksden betingelse 1 nM E2 i Figur 4A). Dermed er det vanskelig å oppdage agonist-mediert ERα LBD homodimerization aktiviteten bruker M2H analysen. På den annen side, aktiviteten til kombinasjon (i) med 4OHT var den samme som kontrollen kjøretøy (0 nM) nivå (Figur 4B). Disse resultatene tyder på at funksjonen AF-2 i ERα ikke er aktivert av 4OHT. Dermed M2H analysen er et mulig alternativ for å analysere homodimerization aktiviteten til ERα LBD med 4OHT (Figur 3B, 3E).

Aktiviteten av kombinasjonen av musen ERα LBD uttrykk plasmider (pBIND-mERαEF + pakt-mERαEF) med 4OHT var betydelig høyere enn kombinasjonen av menneskelig ERα LBD uttrykk plasmider (pBIND-hERαEF + pakt-hERαEF) (figur 5A, 5B). Resultatet indikerer at 4OHT-avhengige homodimerization aktiviteten til musen ERα LBD mer potent enn menneskelig ERα LBD. Videre har analysert vi 4OHT-avhengige LBD homodimerization aktivitet ved hjelp av menneske-mus F-domene-byttet ERα LBD uttrykk plasmider, mERαEhF (mus ERα E domene med menneskelige F domene) og hERαEmF (menneskelig ERα E domene med musen F domene). Homodimerization aktiviteten til mERαEhF var betydelig lavere enn mERαEF. Derimot var homodimerization aktiviteten til hERαEmF betydelig høyere enn hERαEF (figur 5C). Således, det virker som det F-domenet har en innflytelse på artsspesifikke 4OHT-avhengige ERα LBD homodimerization aktivitet.

Disse resultatene tyder på at ERα LBD dimerization aktiviteten til 4OHT-lignende ligander, som SERM, kan oppdages av M2H analysen. Deretter viser vi en mulig måte å analysere ERα LBD homodimerization aktiviteten agonistic kjemikalier. ERα LBD dimerization aktiviteter E2 og diethylstilbestrol (DES) kan oppdages av M2H analysen når du bruker en enkelt-amino-acid-mutert ERα LBD (mus ERα-I362D). Denne mutasjonen forstyrrer E2-avhengige coactivator rekruttering aktiviteten til ERα LBD8. Kombinasjon (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + pakten) ble ikke aktivert av E2 eller DES på noen konsentrasjon vi analyserte (figur 6B), som var forskjellig fra WT ERα LBD (figur 6en). ERα-I362D LBD dimerization aktiviteten til DES var mer potent enn E2 (figur 6B). Denne mutant kan brukes for en sammenlignende studie av agonist-avhengige ERα LBD dimerization aktivitet. men krever det ytterligere analyse og karakterisering av biologiske funksjonaliteten til denne muterte ERα.

Figure 1
Figur 1 : Diagram av plasmider brukes for M2H analysen. (A) dette panelet viser pG5-Luc, reporter plasmider som inneholder et GAL4 svarer element (GAL4 RE) smeltet sammen med en luciferase koding genet. (B) dette panelet viser pBIND-mERαEF, den protein uttrykk plasmider for GAL4DBD fusion mERαEF; Renilla luciferase fungerer for normalisering transfection effektiviteten. (C) dette panelet viser pakt-mERαEF, den protein uttrykk plasmider for kjernefysisk lokalisering signalet (NLS)-smeltet VP16AD fusion mERαEF. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Diagram over ERα LBD uttrykk plasmider brukes i dette eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Av M2H analysen. Denne illustrasjonen viser representant transfekterte tilstand i cellene med kombinasjon (i) plasmider (venstre) og cellene transfekterte med kombinasjon (ii) plasmider (høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Ligand-avhengige dimerization aktivitet av musen ERα LBD. (A) dette panelet viser luciferase aktivitet i cellene transfekterte kombinasjon (i) plasmider (pG5-Luc + pakten + pBIND-mERαEF) eller kombinasjonen (ii) plasmider (pG5-Luc + pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) med eller uten E2. (B) dette panelet viser luciferase aktivitet i cellene transfekterte kombinasjon (i) plasmider eller kombinasjon (ii) plasmider med eller uten 4OHT. Aktiviteten er representert som gjennomsnittet ± standardavviket (SD). Grafen til Kontrollpanel A har blitt gjenskapt fra tidligere publiserte data11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Differensiell dimerization aktivitet av musen og menneskelig ERα LBD med 4OHT. (A) dette panelet viser transfekterte luciferase aktiviteten til cellene med kombinasjonen av musen ERα LBD uttrykk plasmider (pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) eller en kombinasjon av menneskelig ERα LBD uttrykk plasmider (pakt-hERαEF + pBIND-hERαEF) med eller uten 4OHT. (B) lav aktivitet rekke panelet A forstørres for å vise dimerization aktiviteten til menneskelig ERα LBD og eksperimentelle basale nivåer (pakt + pBIND-mERαEF, pakten + pBIND-hERαEF). (C) dette panelet viser luciferase aktivitet i cellene transfekterte med mus-menneskelige F-domene-byttet LBD uttrykk plasmider. mERαEhF angir musen ERα E domene smeltet sammen med menneskelige F domene. hERαEmF angir menneskelige ERα E domene smeltet sammen med musen F domene. Aktiviteten er representert som den gjennomsnittlig ± SD. Grafer har blitt gjenskapt fra tidligere publiserte data1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Påvisning av agonist-mediert ERα LBD dimerization aktivitet med en AF-2 muterte ERα LBD. (A) dette panelet viser luciferase aktivitet i cellene transfekterte kombinasjon (i) plasmider (pG5-Luc + pakten + pBIND-mERαEF) eller kombinasjonen (ii) plasmider (pG5-Luc + pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) med eller uten ligander; E2 (rød), DES (lilla). (B) dette panelet viser luciferase aktivitet i cellene transfekterte kombinasjon (i) plasmider (pG5-Luc + pakten + pBIND-mERα-I362D) eller kombinasjonen (ii) plasmider (pG5-Luc + pakt-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) med eller uten ligander; E2 (rød), DES (lilla). Aktiviteten er representert som den gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her, beskrev vi protokollen for M2H analysen, med fokus på analysen betingelsene for å oppdage homodimerization aktiviteten til ERα LBD som et eksempel. Generelt er M2H analysen ikke populær for vurdering av ligand-avhengige ERα LBD dimerization aktivitet. Dette skyldes ERα LBD har en transcriptional aktivering funksjon; aktiviteten som forstyrrer, i noen tilfeller resultatene av M2H analysen. Som vi viser her, kan imidlertid M2H analysen brukes for å analysere LBD dimerization aktiviteten visse stoffer som ikke aktiverer funksjonen AF-2 transactivation i LBD (f.eks, 4OHT, SERM). For å redusere indre aktiviteten til LBD (bakgrunn aktivitet), vi valgte den laveste E2 inneholder kull-strippet FBS fra produksjon mye og brukt inaktivert kull-strippet FBS. Disse faktorene er viktig for suksessen til M2H analysen bruker WT ERα LBD og oppdage svak kjernekraft aktivitet. I tillegg viste vi ERα LBD dimerization aktivitet av agonister (E2 og DES) med mERα-I362D-mutant, som forstyrrer agonist-avhengige coactivator rekruttering aktiviteten til AF-2. Disse resultatene tyder på at M2H analysen kan være mer nyttig for vurdering av ligand-avhengige ERα LBD dimerization aktivitet.

I feltet NR forskning er M2H analysen brukt for vurdering av ligand-avhengige coactivator eller corepressor rekruttering aktivitet av NR LBDs9,10. Plasmider av pBIND smeltet sammen med regionen NR samspill i kofaktor brukes for denne typen eksperiment i stedet for pBIND-ERαEF. Dette eksperimentet bruker kort protein elementet som inneholder feltet NR samspill motiv (LxxLL) i stedet for en større strukturelle domenet til coactivator. En mulighet er at større coactivator elementet kan aktivere transkripsjon uten rekrutteringen av VP16AD fusion LBD; som kan forstyrre resultatene fra M2H analysen. Denne protokollen kan også brukes for å analysere bindende aktiviteten til en rekke stoffer til ERα. For eksempel var cellene transfekterte med pG5-Luc pBIND-smeltet NR samspill motiv og pakt-ERαEF plasmider og deretter behandlet med ulike kjemikalier, som endokrine-forstyrre kjemikalier eller potensielle hormonelle therapeutics. Hvis luciferase aktiviteten økes med en kjemisk i denne analysen, er deretter det spådd at kjemiske skal være i samspill med ERα LBD å rekruttere NR samspill motiv8.

M2H analysen viser protein-protein interaksjoner i pattedyrceller. Som vi nevnte i innledningen, kan fysiologiske rollen protein-protein interaksjoner være forskjellig i cellen spesifikk sammenheng. M2H analyser kan gi resultatene av protein-protein samhandling aktivitet i samme mobilnettet kontekst som brukes for andre eksperimenter, som analyse av transcriptional aktivitet. I tillegg kan det analysere effekten av celle-signalisering modulatorer (f.eks, hemmere eller aktivator av kinaser) involvert med protein-protein interaksjoner i cellene. Dette er en fordel med M2H analysen sammenlignet med andre i vitro protein-protein samhandling-studier.

Imidlertid må det vurderes at protein-protein interaksjoner oppdaget via M2H analysen ikke kan representere en direkte samspill mellom to proteiner. Med andre ord, er det muligheten for at mobilnettet factor(s) eksisterer som tillater en kobling mellom to proteiner. Hvis en slik vurdering oppstår, bør så evalueringen av i vitro protein-protein samhandling studier være nødvendig, for eksempel GST-fusion protein pulldown analysen. Dessuten, er det bedre å kontrollere uttrykket nivået av pBIND - og pakt-plasmider-avledet proteiner i cellene å evaluere resultatene av analysen. Spesielt når samhandling aktiviteten ikke kan oppdages, bidrar informasjonen protein uttrykk nivåer til å finne årsaken til resultatet. Anti-Gal4DBD antistoffer og anti-VP16AD antistoff kan brukes for en western blot analyse.

Hvis laboratoriet har eksperimentell opplegget for luciferase reporter analyser, som kan brukes for å analysere transkripsjon aktiviteten til regulatoriske elementer eller regulere faktorer, det er ganske enkelt å utføre M2H analysen. M2H analysen er en fordelaktig additiv metode for transcriptional regulering studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å fortolle.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Sueyoshi og Wang på National Institute of Environmental helse Sciences (NIEHS) for deres kritisk lesing av manuskriptet og Tanner Jefferson til å utføre prosedyrer på videoen. Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale institutter for helse Grant 1ZIAES070065 (til K.S.K.) fra delingen av Intramural forskning av NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293, (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389, (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95, (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295, (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9, (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21, (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. Humana Press. (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290, (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16, (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19, (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288, (29), 21105-21116 (2013).
Oppdage Ligand-bindende domene Dimerization aktiviteten til østrogen reseptor alfa bruker pattedyr to-Hybrid analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter