Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

Hier, wordt een protocol inzake de bescherming van DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media met behulp van natuurlijke kationische polysaccharide chitosan en synthetische lineaire polyethyleneimine (LPEI) coatings gepresenteerd.

Abstract

DNA origami nanostructuren bezit een enorm potentieel om te worden gebruikt voor biologische en medische toepassingen. Echter induceren laag-zout voorwaarden en nucleasen in fysiologische vloeistoffen denaturatie- en afbraak van zelf geassembleerde DNA nanostructuren. In niet-virale gen levering, wordt enzymatische afbraak van DNA overwonnen door de inkapseling van het negatief-geladen DNA in een kationische shell. Hierin, geïnspireerd door gene levering vooruitgang, een eenvoudige, one-step en robuuste methodologie wordt gepresenteerd voor de stabilisatie van DNA origami nanostructuren door coaten ze met chitosan en lineaire polyethyleneimine. De polycation-coating beschermt efficiënt DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media. Deze methode wordt ook behouden de volledige serverprocessor van enzym - en aptamer-gebaseerde functionalization van DNA nanostructuren.

Introduction

DNA is een veelzijdige bouwsteen voor de programmeerbare zelf-assemblage van nanoschaal structuren1. De meest populaire methode voor het maken van DNA nanostructuren is de DNA origami techniek, die is gebaseerd op de zelf-assemblage van een lang circulaire, één gestrande DNA strengen steiger met de hulp van honderden korter vorm-bepalen synthetische nietje2. Vandaag, is de oprichting van DNA nanostructuren in bijna elke geometrie en morfologie gemakkelijk haalbaar. DNA nanostructuren kunt site-specifically met hoge precisie3,4 worden matiemaatschappij en kunnen worden geprogrammeerd om65,allosteric conformationele wijzigingen ondergaan. Vandaar, met behulp van DNA als een bouwmateriaal biedt de unieke kans maken van programmeerbare en responsief op maat ontworpen nanostructuren voor toepassingen in de biosensing, diagnostiek en drug delivery. DNA nanostructuren zijn echter gevoelig voor de spijsvertering door exo- en endo-nucleasen en lattice gebaseerde 3D DNA origami nanostructuren vereist over het algemeen hoge zoutgehalte buffers (bv., 5-20 mM Mg+ 2) om hun integriteit7,8.

De snelle afbraak van DNA door nucleasen aanwezig in het bloed en het extracellulaire matrix is een groot obstakel voor de efficiënte in-vivo levering van genetische producten in cellen9. Om te overwinnen deze beperking, bij de levering van niet-virale gen, wordt DNA gemengd met een kationische polymeer op een gedefinieerde N/P gratis ratio (de verhouding van aminen in polycation aan de fosfaten in DNA)10. Het complex van DNA met een kationische polymeer, bekend als polyplex, DNA beschermt tegen aantasting van de nuclease-gemedieerde en verbetert de cellulaire opname11. Geïnspireerd door gene levering vooruitgang, oligolysine12, oligolysine-polyethyleen glycol (PEG) copolymeren13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-op basis van polymeren14, en virus Eiwitmantel eiwitten15 zijn gebruikt voor het stabiliseren van DNA origami nanostructuren.

Onlangs berichtten we een methode voor de bescherming van DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media met behulp van de natuurlijke kationische polysaccharide chitosan en de synthetische lineaire polyethyleneimine (LPEI) gemeld16was. Dit artikel is een aanpassing van onze eerdere werk en beschrijft het gedetailleerd protocol voor de bereiding van polyplexes, hun karakterisering, testen van de stabiliteit van naakt en beschermde nanostructuren in lage-zout en nuclease-rijke media en behandeling van de serverprocessor van enzym - en aptamer-matiemaatschappij DNA origami nanostructuren op polycation coating.

Protocol

1. voorbereiding Polycation Stock oplossing

  1. LPEI-stockoplossing
    1. Voeg 10 mg LPEI in een glas bekerglas met < 10 mL H2O.
    2. Toevoegen als u wilt volledig los LPEI, HCl (32%) tot het bereiken van de pH 2.0.
    3. Breng de pH op 7.0 door toevoeging van NaOH (10 M).
    4. Stel het volume aan de uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL.
    5. Het filtraat van de stockoplossing van de LPEI door een 0,22 µm-membraan.
  2. Chitosan-stockoplossing
    1. Los 16.6 mg chitosan oligosaccharide lactaat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccharide compositie, deacetylated uit chitine met 90%) in 1 mL azijnzuur (10%) waterige media ter voorbereiding van een stamoplossing waarvan de concentratie van 10 mg/mL.

2. de zuivering van DNA Origami nanostructuren

  1. Mix 100 µL van het DNA origami monster (in 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffer (aangeduid als TB) met inbegrip van 18 mM MgCl2) met de gelijkwaardige hoeveelheid 22 mM MgCl aangevuld2 TB (100 µL) in een 1,5 mL-buis.
  2. Voeg 200 µL van zuivering buffer (15% (m/v) PEG 8000, van 5 mM Tris, 1 mM EDTA en 505 mM NaCl). Meng zachtjes door inversie van de buis.
  3. Draai het monster bij 16.000 × g bij kamertemperatuur (Toby) gedurende 25 minuten.
  4. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in 16 mM MgCl2 aangevuld TB buffer. De bovendrijvende vloeistof en de pellet bevatten overtollige nietje strengen en geprecipiteerde DNA origami, respectievelijk.
  5. Incubeer het monster gedurende één dag op Toby op 650 rpm in een thermomixer. Deze stap is voor volledige resuspensie van DNA origami.

3. Agarose Gel elektroforese (leeftijd)

  1. Voeg 1,6 g agarose en 80 mL 0,5 x TAE buffer (20 mM Tris, 0.5 mM EDTA, 10 mM azijnzuur, pH 8) in een bekerglas van glas ter voorbereiding van een 2% agarose gel. Magnetron voor 5 min. Swirl de inhoud van het bekerglas voor 1 min in een waterbad. Voeg 352 µL van MgCl2 (2,5 M) ter voorbereiding van het gel met 11 mM MgCl2. Vooraf vlek de gel met 10 µL van DNA gel vlek.
  2. Giet de gel-oplossing in een droge gel-doos en invoegen van een kam van de Elektroforese van het gel. Laat de oplossing stollen bij Toby voor 15-30 min.
  3. Een aanvulling op de lopende buffer (0.5 x TAE-buffer) met 11 mM MgCl2.
  4. Meng 10-20 µL van het monster met 20% van 6 x laden buffer (0,25% (m/v) bromophenol blauw, 30% (v/v) glycerol, 0,25% (m/v) xyleen cyanol FF) en laadt u deze in de agarose gel putten.
  5. Stel de gel bij 70 V op Toby voor 2,5 - 3 h.
  6. Visualiseer de gel met een UV-scanner.

4. negatieve vlek transmissie-elektronenmicroscopie (nsTEM)

  1. Breng 5 µL van de verdunde nanostructuur of de polyplex op een gloed-geloosd koolstof beklede Cu400 TEM grid. Laat het adsorberen voor ca. 1 min.
  2. Afvoer overtollige vocht vanaf de rand van het raster door een stuk filtreerpapier.
  3. Breng 5 µL van een waterige oplossing van 2% uranyl acetaat en 1 min wachten.
  4. Hiermee kunt u dat de rand filtreerpapier volledig afvoer overtollige vocht vanaf de rand van het raster.
  5. Laat het volledig drogen voor het injecteren in de TEM raster.

5. Polyplex vorming

Opmerking: Illustratieve voorbeeld voor het voorbereiden van een polyplex bestaande uit DNA origami en chitosan op 0,01-8 N/P ratio's.

  1. Bereken het aantal aminen per polycation met behulp van de Formule-1 (tabel 1).
  2. Meten van de concentratie van gezuiverde DNA origami met behulp van een ultra violet spectrofotometer op 260 nm. Gebruik 2 µL van TB buffer als de blanco kalibreren van de machine. De "nmol van fosfaat" berekenen met behulp van Formule-2.
  3. Bereiden 15 µL van de DNA-structuur origami inclusief 1 nmol van fosfaat.
  4. Formule-3 gebruiken voor het berekenen van het volume van de chitosan, die nodig is voor de voorbereiding van de polyplex bij N/P 0.01-8. Bijvoorbeeld, ter voorbereiding van de polyplex op N/P 8, 1.8 µL van chitosan (0,8 mg/mL) nodig is (N/P is 8, nmol van fosfaat is 1, molecuulgewicht van chitosan is 5000 g/mol, concentratie van de stockoplossing van chitosan is 0,8 mg/mL en het aantal aminen per chitosan is 28). 13.2 µL van TB aan 1.8 µL van chitosan (0,8 mg/mL) toevoegen. 15 µL van chitosan oplossing (0,8 mg/mL) tot 15 µL van de DNA-origami uit stap 5.3 te krijgen een DNA origami-chitosan polyplex met NP 8 toevoegen. De polyplex wordt spontaan gevormd.
  5. Herhaal stap 5.4 ter voorbereiding van de polyplexes op verschillende N/P ratio's.
  6. Voert een leeftijd, zoals beschreven in stap 3 (figuur 1A). Omvatten de naakte DNA origami als controle.
  7. Het imago van de polyplex zoals beschreven in stap 4 (Figuur 2).

    Formule-1) aantal amine groepen per polycation
    Equation 1

    Formule-2) mol van fosfaat
    =Equation 2

    Formule-3) Hoeveelheid (µL) polycations
    =Equation 3

6. uitpakken met Dextran (II) sulfaat

  1. Bereken het aantal sulfaat groepen per dextran (II) sulfaat met behulp van formule-4 (tabel 2).
  2. Berekenen van het volume van dextran sulfaat die nodig zijn voor de decomplexation van de polyplex op een vooraf gedefinieerde A / P-verhouding met behulp van formule-5. De A / P charge ratio is de verhouding tussen het sulfaat-groepen van de polyanion (A) tot de groepen van de fosfaat (P) van de DNA-origami. Een overtollige hoeveelheid dextran (II) sulfaat is nodig voor een efficiënte decomplexation van de polyplexes (bijvoorbeeld 500-1000). Bijvoorbeeld, decomplex de polyplex bereid in sectie 5 (polyplex bevat 1 nmol van fosfaat) bij A / P 1000, 3.6 µL van dextran sulfaat 40 kDa (50 mg/mL) nodig is (A / P is 1.000 nmol van fosfaat is 1, het molecuulgewicht van dextran (II) sulfaat is 40.000 g/mol de concentratie van de stockoplossing van dextran (II) sulfaat 50 mg/mL en aantal sulfaat is 220). 3.6 µL dextran-sulfaat (50 mg/mL) toevoegen aan de polyplex uit stap 5.4 en meng goed.
  3. Als u werkt met een chitosan polyplex, toevoegen NaOH om het decomplexation-proces te vergemakkelijken. NaOH toevoegen voor een eindconcentratie van 10 mM. Sla deze stap voor LPEI polyplexes.
  4. Voert een leeftijd, zoals beschreven in stap 3 (figuur 1B). Omvatten een naakte DNA origami en polyplex als controle.

    Formule-4) aantal sulfaat groepen per polyanion =
    Equation 4

    Formule-5) Hoeveelheid (µL) dextran (II) sulfaat
    =Equation 5

7. stabiliteit naar Mg uitputting

  1. Wassen van 20 µL van een DNA-origami of de bijbehorende polyplex (inclusief 2 nmol fosfaat) met 4 x 600 µL van Mg-nul buffer (5 mM Tris, 1 mM EDTA en 30 mM NaCl) met behulp van de ultrafiltratie kolom (MWCO ~ 3 kDa). Draai elke wassen bij 14.000 × g bij Toby voor 3-5 min.
  2. Verzamelen van de resterende oplossing (80 µL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende één dag op 650 rpm in een thermomixer.
  3. Als testen LPEI polyplex, 2.5 µL van MgCl2 (500 mM) voor een eindconcentratie van 16 mM MgCl2toevoegen. Voeg vervolgens 7 µL van dextran (II) sulfaat-40 kDa (50 mg/mL) (gelijk aan A / P 1000) te ontrafelen van de kern DNA nanostructuren (uitpakken, zie stap 6).
    Opmerking: Deze stap overslaan als werken met chitosan polyplex of naakte DNA origami.
  4. Volg nsTEM imaging zoals beschreven in stap 3 (Figuur 2).

8. DNase ik titratie Assay van naakte DNA Origami nanostructuren

  1. Mix 3 µL van naakte DNA origami inclusief 1 nmol fosfaat met 2 µL van 10 x DNase ik buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6), 1 µL van MgCl2 (250 mM), 12 µL van het water in 0,2 mL PCR buizen. Voeg 2 µL van DNase ik (10 x). Pas de voorraad van de DNase ik (10 x) om de laatste DNase ik concentraties van 0,25-2 U/mL.
  2. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur in een thermocycler monsters.
  3. Onderdompelen van de monsters in ijs en deactiveren van de nucleolytic-activiteit door toevoeging van 2 µL van 500 mM dithiothreitol (DTT) en 2,5 µL van EGTA (33 mM).
  4. Analyseer de monsters met een leeftijd, zoals beschreven in stap 3.

9. stabiliteit van Polyplexes naar DNase ik

  1. Mix 4 µL van een polyplex (inclusief 1 nmol van fosfaten, bereid op verschillende N/P ratio's) met 1.5 µL van een DNase ik buffer (10 x), 8 µL van TB en 1,5 µL van DNase ik (100 U/mL) in een 0,2 mL PCR buis.
  2. Incubeer het monster gedurende 24 uur bij 37 ° C in een thermocycler.
  3. Voeg 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) te verteren de DNase I. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een thermocycler.
    Opmerking: in plaats van enzymatische spijsvertering, chemische deactivering van DNase ik door toe te voegen 1.5 µL van DTT (500 mM) en 2 µL van EGTA (33 mM) kunnen worden uitgevoerd.
  4. Voeg 3.6 µL van dextran (II) sulfaat-40 kDa (50 mg/mL) (gelijk aan A / P 1000) te ontrafelen van de kern DNA nanostructuren.
  5. Voert leeftijd, zoals beschreven in stap 3 (figuur 3A, Figuur 3 c). Verse DNA origami als controle voor het meten en vergelijken van de intensiteiten van de band op de gel bevatten.
  6. Accijnzen de band op de leeftijd en het uittreksel van de DNA-origami door een squeeze bevriezen extractie kolom op basis van het protocol door de leverancier verstrekt.
  7. Volg nsTEM imaging zoals beschreven in stap 4 (Figuur 2).

10. stabiliteit naar foetale runderserum (FBS)

  1. Mix 4 µL van naakte DNA origami of haar overeenkomstige polyplex (inclusief 1 nmol van fosfaat) met 17 µL van TB + 10% FBS in 0,2 mL PCR buizen. Gebruik vers ontdooid FBS.
  2. Incubeer het monster bij 37 ˚C in een thermische cycler gedurende 24 uur.
  3. Dompel het monster in een ijsbad.
  4. Als testen de polyplex, voert u het proces van het uitpakken van gegevenspakketten verstaan door 3.6 µL van dextran (II) sulfaat-40 kDa (50 mg/mL) toe te voegen. Bovendien, het toevoegen van NaOH als werken met polyplexes van de chitosan (zie stap 6.3)
  5. Voert een leeftijd, zoals beschreven in stap 3. Omvatten de nieuwe DNA-origami als controle voor het meten en vergelijken van de intensiteiten van de band op de gel.
  6. Accijnzen van de band op de leeftijd en de DNA-origami extract door een squeeze bevriezen extractie kolom.
  7. Voeg 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) toe aan de geëxtraheerde DNA origami oplossing (20 µL) in een tube van 0,2 mL PCR. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in een thermocycler te verteren serum eiwitten gebonden aan de nanostructuren.
  8. Wassen van het monster met 5 x 500 µL van TB met inbegrip van 16 mM MgCl2 met behulp van de kolom ultracentrifugatie (MWCO ~ 100 kDa) te wassen proteïnase K (MW ~ 28.9 kDa) weg. Draai elke wassen bij 14.000 × g bij Toby voor 3-5 min.
  9. Uitvoeren van nsTEM imaging zoals beschreven in stap 4 (Figuur 3).
    Opmerking: De gel uitgepakte monster uit stap 10.6 kan direct gebruikt worden voor nsTEM imaging. De beeldvorming kan echter zeer uitdagend vanwege de gehechtheid van serum eiwitten aan het DNA origami nanostructuren. Proteïnase K behandeling (stappen 10,7-10.9) wordt daarom aanbevolen om de beeldvorming proces te vergemakkelijken.

11. het testen van de serverprocessor van Horseradish Peroxidase enzym (HRP)-matiemaatschappij DNA Origami op Coating met Polycations

  1. Zuiveren de zelf samengestelde biotinyleerd-NR (Biotine-NR) zoals beschreven in stap 2.
  2. Incubeer 200 µL van gezuiverde Biotine-NR (36 nM, in 16 mM aangevuld TB buffer) met 200 µL van HRP-geconjugeerde streptavidine (540 nM, in TB buffer). 4.8 µL van MgCl2 (500 mM) toevoegen om een eindconcentratie van 14 mM. Incubeer bij Toby voor 12u op 650 rpm in een thermomixer
  3. HRP-matiemaatschappij NR (HRP-NR) door een PEG zuivering methode zuiveren (zoals beschreven in stap 2) als u wilt verwijderen van de niet-afhankelijke HRP-enzymen. Resuspendeer de geprecipiteerde HRP-NR in TB met inbegrip van 16 mM MgCl2.
  4. Mix-6.5 µL van gezuiverde HRP-NR (36 nM) met 6.5 µL van polycations van variant concentraties te bereiden de polyplex op N/P ratio's van 1, 2, 4, 10 en 20 (gebruik Formule 3).
  5. Herhaal stap 11.2-11,4 voor niet-biotinyleerd NR. Zoals het enzym HRP kan binden niet-specifiek aan de DNA-origami, de niet-biotinyleerd DNA origami, die wordt behandeld met HRP enzymen en PEG gezuiverd (vergelijkbaar met biotine-NR), zal dienen als het besturingselement in de test.
  6. Mix-6.5 µL van gedistilleerd-water met 6.5 µL van polycations van variant concentratie overeenstemt met de gedefinieerde N/P ratio's van 1, 2, 4, 10 en 20. Scripties monsters dienen als de lege groep.
  7. De bereide oplossing in stappen 11.4-11,6 (12,5 µL) toevoegen aan een 96-wells-plaat met inbegrip van 72,5 µL van HEPES-buffer (25 mM HEPES, 20 mM 200 mM NaCl, KCl, 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7.4) en meng goed.
  8. Voeg 10 µL van 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Voeg 5 µL van H2O2 (12 mM) en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag. H2O2 initieert de reactie.
  10. Meet de extinctie op 421 nm meer dan 4 uur met een multimode-afleesapparaat (figuur 4A).

12. het testen van de serverprocessor van Hemine-bindende Aptamers (HBA)-matiemaatschappij DNA Origami op Coating met Polycations

  1. Zuiveren de HBA matiemaatschappij-NR (HBA-NR) zoals beschreven in stap 2. Resuspendeer de geprecipiteerde HBA-NR in TB aangevuld met 6 mM MgCl2 (hogere zoute concentratie leidt tot de samentelling van HBA-NR).
  2. Mix 10 µL van HBA-NR (40 nM) met 10 µL van polycations met verschillende concentratie te bereiden polyplex van gedefinieerde N/P ratio's van 1, 2, 10 en 20.
  3. Mix 10 µL van naakte-NR (40 nM) of gedistilleerd water met 10 µL van polycations in uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar overeenkomt met N/P ratio's van 1, 2, 10 en 20.
  4. De oplossing van 20 µL bereid uit stappen 12.2 en 12.3 toevoegen aan de 96-wells-plaat met inbegrip van 60 µL van HEPES-buffer (25 mM HEPES, 20 mM 200 mM NaCl, KCl, 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, pH 7.4) en meng goed. Omvatten ten minste één blancomonster ter vervanging van de 20 µL polyplex of polycation oplossing (van stappen 12.2 en 12.3) met water.
  5. Voeg 5 µL van Hemine (0,04 mM) gevolgd door 10 µL van ATBS (15 mM). Plaats de plaat op een roteerschudapparaat gedurende 5 minuten.
  6. Voeg 5 µL van H2O2 (12 mM) en meng goed door pipetteren omhoog en omlaag.
  7. Meet de extinctie op 421 nmover 30 min met de multimode-afleesapparaat (figuur 4B).

Representative Results

Drie DNA origami nanostructuren van verschillende configuraties zijn ontworpen, met inbegrip van een nanostaafjes (NR), een nanobottle (NB) en een draadframe nanostructuur (WN) (de 3D-modellen van de nanostructuren worden geïllustreerd in Figuur 2). Het NR en het NB werden ontworpen op basis van een plein en honingraat rooster, respectievelijk, met behulp van caDNAno17 en de WN is gemaakt met behulp van de Daedalus software18. Een uitgebreide protocol voor het ontwerp, en zelf-assemblage van DNA nanostructuren heeft zijn gepubliceerd reeds19,20,21,22. Het hoofdbestanddeel van de vorm-specifieke onderdelen werden besteld, zelf geassembleerd en verder gezuiverd op basis van een protocol beschreven door Stahl et al. 23 (stap 2).

Polyplexes werden gekenmerkt door de gel retardatie assay en nsTEM imaging. Op de DNA-origami mengen met de polycations, werd een verschuiving in de naakte nanostructuur band naar de kathode waargenomen(Figuur 1). Dit kan worden toegeschreven aan het tegenwicht van de negatieve lading van fosfaat groepen op binding aan polycations en de totale grootte van het complex toenemen. Het toevoegen van een extra bedrag van polyanions zoals dextran (II) sulfaat kunt omkeren de polyplex vorming. In dit verband, dextran sulfaat met hoger molecuulgewicht (MW ~ 40 kDa) toonde aan het meer efficiënt zijn voor de decomplexation in vergelijking met een lager molecuulgewicht dextran (II) sulfaat (MW ~ 4 kDa) (Figuur 1B).

Terwijl het imaging LPEI polyplexes door uranyl acetaat negatieve vlek TEM, was het moeilijk om het imago van alle deeltjes. Het was veronderstelde dat LPEI uranyl acetaat van binding met de backbone van fosfaat door strakke shielding van DNA origami zouden kunnen belemmeren. Daarom voorafgaand aan nsTEM imaging, is een overtollige hoeveelheid dextran (II) sulfaat toegevoegd LEPI polyplexes. De ontrafeld DNA origami nanostructuren toonde geen teken van defect noch ontleding. In tegenstelling, werden met succes chitosan polyplexes beeld met geen behoefte aan polyanion behandeling (Figuur 2).

Alle naakte DNA nanostructuren (ongeacht hun verschillende configuraties) waren gedenatureerde volledig na een dag van incubatie bij 37 ° C in de Mg-nul buffer, zoals bevestigd door nsTEM imaging. In tegenstelling, nanostructuren bekleed met LPEI of chitosan op N/P≥1 intact gebleven. Evenzo DNase ik titratie testen bleek de gevoeligheid van onbeschermde nanostructuren naar enzymatische spijsvertering. Terwijl naakte nanostructuren werden volledig verteerd in aanwezigheid van 1 U/mL DNase ik na 2 h, de LEPI of chitosan ingekapseld DNA origami bleef intact in Mg-nul buffer aangevuld met 10 U/mL DNase ik voor een minimum van één dag (Figuur 2). Hogere stabiliteit naar nucleolytic spijsvertering werd bereikt door verhoging van de N/P-verhouding van de polyplexes. Bovendien beschermt LPEI het DNA nanostructuren meer efficiënt in vergelijking met chitosan (Figuur 3A, Figuur 3C), waarschijnlijk als gevolg van de hogere heffing dichtheid van LEPI, en dus hogere bindende affiniteit tot het DNA24 . Geen verschil werd waargenomen tijdens het gebruik van LPEI van verschillende moleculair gewicht (figuur3B).

De serverprocessor van functionele groepen in DNA nanostructuren na inkapseling in een polymeer-shell is een belangrijk kenmerk. Bovendien, de compatibiliteit van polycation coating met de horseradish peroxidase enzym (HRP) en Hemine-bindende aptamers (HBA) matiemaatschappij DNA origami werd onderzocht. Drie biotinyleerd nietje strengen waren staken van het oppervlak van de NR en vervolgens matiemaatschappij met HRP-geconjugeerde streptavidine (drie enzymen per DNA origami). De catalytically zeer actieve (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') werd gekozen voor deze experimenten25. Tot 24 nietje strengen waren staken van het NR-oppervlak met een 5-nm lengte linker (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') gevolgd door de PS2. M reeks (24 aptamers per DNA origami). Geen opmerkelijke belemmering van enzymatische of aptamer activiteit werd waargenomen op coating HRP - of HBA-matiemaatschappij DNA origami met LPEI en chitosan op variant N/P ratio's (Figuur 4A-B)16. Echter de kinetische van enzym HRP dramatisch veranderd na binding met de DNA-origami (Figuur 4C).

Figure 1
Figuur 1 : Representatief leeftijd beelden van polyplex vorming en uitpakken van gegevenspakketten verstaan. (A) de elektroforetische mobiliteit shift assay voor NB gemengd met chitosan op N/P ratio's voor 0.01-8. Elke rijstrook bevat 1 nmol NB. De eerste rijstrook is de verwijzing NB. (B) uitpakken van gegevenspakketten verstaan van polyplexes door polyan dextran (II) sulfaat (DS). Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur16. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Negatieve vlek TEM microfoto van DNA origami en polyplexes. 3D-model en nsTEM microfoto van naakte DNA origami nanostructuren (kolommen 1 en 2). nsTEM microfoto van LPEI polyplexes (na uitpakken van gegevenspakketten verstaan) en chitosan polyplexes (kolommen 3 en 4). nsTEM beelden van naakt en beschermde DNA origami (polyplex) onderworpen aan Mg uitputting (kolommen 5, 6 en 7), enzymatische afbraak (kolommen 8 en 9), serum spijsvertering (kolommen 10 en 11) voor één dag bij 37 ° C. LPEI-5 kDa werd gebruikt in deze test. Naakte DNA nanostructuren waren gedegradeerd na detectie van een leeftijd in de aanwezigheid van 1 U/mL DNase ik of in TB + 10% FBS na 2 uur incubatie bij 37 ° C. Schaal bars: 100 nm. Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur16. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Representatieve resultaten van DNase ik bescherming testen. (A) de DNase ik bescherming assay voor polyplexes voor WN met LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa en LPEI-25 kDa voorbereid op N/P-verhouding van 2, 4, 8 en 10. De monsters werden blootgesteld aan 10 U/mL DNase ik gedurende 24 uur bij 37 ° C. De laatste baan is het besturingselement WN. De polyplexes waren gepelde vóór het laden in de gel. (B) de intensiteit van de genormaliseerde gemiddelde band voor de polyplexes van DNA origamis met verschillende LPEI geëxtraheerd vanaf leeftijd beeld-A. Y-as vertegenwoordigt genormaliseerd gemiddelde band intensiteit. (C) de DNase ik bescherming assay van chitosan-WN polyplexes voorbereid op een N/P ratio's van 1, 2, 4, 10 en 20. De monsters werden blootgesteld aan 10 U/mL DNase ik gedurende 24 uur bij 37 ° C. Lane 6 is de controle polyplex (N/P 20). De laatste baan is het besturingselement WN. Alle chitosan polyplexes waren gepelde vooraf laden in de gel. Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur16. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: resultaten van de vertegenwoordiger van colorimetrische enzym - en aptamer-matiemaatschappij DNA origami tests. (A) de colorimetrische bepaling van de enzym-matiemaatschappij nanostructuren (HRP-NR) bekleed met chitosan 3.7 h na de start van de reactie. (B) colorimetrische bepaling van de aptamer-matiemaatschappij nanostructuren (HBA-NR) bekleed met chitosan, 6 min na de reactie inleiding. Y-as vertegenwoordigt de genormaliseerde extinctie. (C) controle van de colorimetrische bepaling van HRP en HRP-NR na verloop van tijd. Dit cijfer is gewijzigd van een eerder gepubliceerde figuur16. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Kationogene polymeren Chitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa
Moleculair gewicht polymeer (kDa) 5 5 10 25
Molecualr gewicht van monomeer (g/mol) 161 43 43 43
Aantal amine per monomeer 1 1 1 1
Aantal amine per polymeer 28 116 232 581

Tabel 1. Berekening van het aantal amine groepen per polycation.

Moleculair gewicht dextran sulfaat (kDa) 4 40
Molecuulgewicht van monomeer (g/mol) 366 366
Aantal sulfaat per monomeer 2 2
Aantal sulfaat per polymeer 22 220

Tabel 2. Berekening van het aantal van sulfaat groepen per polyanion.

Discussion

In de zelf-assemblage van DNA origami, de nietje strengen worden meestal toegevoegd in 5-10 overtollige verhouding aan de steiger. Deze overtollige nietje strengen binden ook aan de polycation en het formulier polyplexes in de monometer bereik die verder moeilijk worden gescheiden van DNA origami polyplexes. Vandaar, is een cruciale stap in polyplex vorming te verwijderen van de overtollige nietje strengen en goed gezuiverd DNA origami nanostructuren te gebruiken.

Andere methoden zijn ontwikkeld voor het stabiliseren van DNA nanostructuren zoals de cyclisatie van DNA-strengen via een klik op reactie26. Zoals alkyn - en azide-gemodificeerde nietje strengen vereist voor de vorming van interlocked single-stranded ringen zijn, deze techniek is beperkt voor de stabilisatie van kleine nanostructuren dergelijke een DNA-catenane, en het is niet gemakkelijk schaalbare voor grotere DNA origami de structuur zoals die in dit protocol worden gebruikt. Onlangs, Gerling et eenl.27 gemeld een methode voor het maken van covalente cyclobutene pyrimidine dimeer (CPD) banden tussen naburige thymidines binnen DNA nanostructuren met ultraviolette bestraling. Hoewel deze methode site-selectieve en schaalbare is, is haar efficiëntie bij de bescherming van DNA origami veel lager dan polycation coating. Bijvoorbeeld, verduren CPD-gestabiliseerde DNA origami objecten alleen 0.4 U/mL DNase ik voor 1 uur, terwijl polyplexes waren stabiel in aanwezigheid van 10 U/mL DNase ik voor ten minste één dag.

Kortom, gentherapie geïnspireerd chitosan en LPEI coating is een goedkope, one-step en efficiënte manier inspelen op de lange termijn stabiliteit van DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media. De omkeerbaarheid van de formatie polyplex vergemakkelijkt de toepassing ervan in scriptingregel diagnostische tests waar de bescherming van DNA origami tegen de aantasting van de nucleolytic of zout-uitputting is cruciaal in één stap maar kan problemen veroorzaken in andere stappen zoals DNA versterking. Daarnaast is polycation coating een mogelijke aanpak voor het verbeteren van de cellulaire opname van DNA origami nanostructuren voor drug-levering toepassingen28.

Disclosures

De auteurs verklaren geen conflicten van belang in verband met dit verslag.

Acknowledgments

Dit project heeft financiering ontvangen van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder grant overeenkomst nr. 686647. TEM afbeeldingen werden opgenomen op een Morgagni, gevoed met 80 kV op de EM-faciliteit van de Wenen Biocenter Core voorzieningen GmbH (VBCF). We bedank Tadija Kekic voor hulp bij het grafische ontwerp en Elisa De LIano voor het ontwerpen van de wireframe nanostructuur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Tags

Chemie kwestie 143 DNA origami polyplex op lange termijn stabilisatie aantasting van de nucleolytic gen-therapie functionalization
Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter