Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren

De biologische stabilisatie van DNA-nanostructuren is essentieel voor toekomstige in-vivo toepassingen, zoals gerichte levering van geneesmiddelen. Echter, DNA wordt afgebroken in het lichaam door verschillende enzymen. Hier presenteren we een coatingtechniek die DNA-nanostructuren beschermt tegen enzymatische afbraak.

De belangrijkste voordelen zijn dat onze coating bestaat uit niet-toxische verbindingen die al worden gebruikt in levende organismen en dat de functionalisering van het oppervlak mogelijk blijft. Deze functionalisatie is belangrijk om moleculaire sensoren voor doelherkenning en schakelaars voor het vrijkomen van drugsladingen op te nemen. Polycatiecoatings verhogen de cellulaire opname van ingekapselde DNA-origamistructuren aanzienlijk, dus deze methode kan de deur openen voor toepassingen van DNA-origamis in diagnostiek en therapie.

De cellulaire opname is ook vereist voor mogelijke toepassingen voor genlevering van de DNA-nanotechnologie. Ik ben van mening dat de methode is vrij eenvoudig en kan gemakkelijk worden beheerst. Om te beginnen, meet de concentratie van gezuiverde DNA origami.

Gebruik twee microliters van TB buffer als de blanco te kalibreren ultravioletspectrofotometer. En meet dan de DNA-origamiconcentratie op 260 nanometer. Bereken vervolgens de hoeveelheden fosfaten in de gezuiverde DNA-origami-oplossing, met behulp van formule twee, zoals beschreven in het manuscript.

Bereid 15 microliter van de DNA-origami-structuur door het opnemen van een nanomol fosfaat, met behulp van TB buffer voor verdunning. Voeg 13,2 microliter toe aan tbc tot 1,8 microliter chitosan. En voeg 15 microliter van de chitosan-oplossing toe aan 15 microliters van de DNA-origami om een DNA-origami chitosan polyplex te ontwikkelen met een N/P-verhouding van acht.

Doorgaan met het voorbereiden van polyplexen van verschillende N /P ratio’s, met behulp van berekeningen zoals beschreven in het manuscript. Bereid 80 millimeter van een buis voor 2%agarose gel. Voeg 352 microliters van 2,5 molaire magnesiumchloride toe en bevlek het vervolgens met 10 microliter DNA-gelvlek.

Giet de geloplossing in een droge geldoos. Steek een gel elektroforese kam en laat het stollen bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten. Vul ondertussen de lopende buffer aan met 11 millimolar magnesiumchloride.

Meng 10 tot 20 microliter van elk monster met 20% van de 6X laadbuffer. Laad de monsters in de agarose gel putten, met inbegrip van een naakte DNA origami als controle. Voer de gel op 70 volt op kamertemperatuur gedurende twee en een half tot drie uur.

Gebruik vervolgens een UV-scanner om de gel te visualiseren. Om een DNase I beschermingstest uit te voeren, voeg je vier microliter van elke polyplex toe in vergelijking met verschillende N/P-verhoudingen, 1,5 microliter 10X DNase I-buffer, 8 microliter TB en 1,5 microliter DNase I tot een aparte PCR-buis van 2 milliliter. Dan incubeer hetzelfde bij 37 graden celsius in een thermocycler gedurende 24 uur.

Om DNase I te verteren, voeg twee microliter van 20 milligram per milliliter proteinase K en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een thermocycler. Dan, om de kern DNA nanostructuren te ontrafelen voeg 3,6 microliter van 50 milligram per milliliter 40 kilodaltons dextran sulfaat. Gebruik dan deze monsters en verse DNA-origami als controle om agarose gel elektroforese uit te voeren zoals eerder beschreven.

De band die overeenkomt met geladen monsters uit de gel wegstemmen. Om de DNA-origami te extraheren, gebruik een knijpvriesextractiekolom en volg de instructies van de fabrikant en ga verder met negatieve vlektransmissie elektronenmicroscopie beeldvorming zoals beschreven in het manuscript. Meng 6,5 microliter gezuiverde 36 nanomolar HRP-NR met 6,5 microliter polycaties van verschillende concentraties.

Om een polyplex voor te bereiden bij N/P-verhoudingen van één, twee, vier, 10 en 20, bereidt u een lege groep voor door 6,5 microliter gedestilleerd water te mengen met 6,5 microliter polycaties van verschillende concentraties die overeenkomen met de N/P-verhoudingen van één, twee, vier, 10 en 20. Voeg vervolgens 12,5 microliter van elk van deze voorbereide oplossingen toe aan een aparte put van een 96 putplaat. Voeg vervolgens 72,5 microliter HEPES-buffer toe aan elke put en meng.

Voeg 10 microliter van 15 millimolar ABTS en vervolgens 5 microliter van een 12 millimolar waterstofperoxide toe aan elke put en meng door pipetting op en neer. Ten slotte, gebruik maken van een multimode plaatlezer om absorptie op 421 nanometer te meten gedurende vier uur. Na het analyseren van polyplexen met behulp van een gel retardatie test, was er een verschuiving in de naakte nanostructuur naar de kathode, waarschijnlijk als gevolg van het tegenwicht van de negatieve lading van fosfaatgroepen op binding aan de polycaties, en de grootte toename van het complex.

Toen een extra hoeveelheid polyanionen, zoals dextranulfaat, werd toegevoegd, werd polyplexvorming omgekeerd. Dextran sulfaat van hoger moleculair gewicht bleek efficiënter te zijn in vergelijking met een lager moleculair gewicht. Na het analyseren van de polyplexen met behulp van negatieve vlektransmissie elektronenmicroscopie, micrografen toonde naakte DNA origami nanostructuren, lineaire polyethyleen polyplexen na decapsulatie, chitosan polyplexen, beelden van naakte en beschermde DNA origami onderworpen aan magnesium uitputting, enzymatische afbraak, en serum spijsvertering.

In aanwezigheid van DNase I, na twee uur, naakte nanostructuren werden volledig verteerd, terwijl de lineaire polyethyleen polyplexen van chitosan ingekapseld DNA origami intact bleef in de aanwezigheid van 10 eenheden per milliliter DNase I.Linear polyethyleen polyplexes beschermen de NANOstructuren efficiënter in vergelijking met chitosan. Wanneer de N/P-verhouding van de polyplex werd verhoogd, was de DNA-spijsvertering lager. Na coating enzym, of na meer gefunctionaliseerde DNA origami, met lineaire polyethyleen polyplexen en chitosan bij variant N / P verhoudingen, geen opmerkelijke interferentie met enzymatische activiteit werd waargenomen.

Aan de andere kant veranderde de kinetische van HRP-enzym drastisch na binding aan de DNA-origami. Het is belangrijk om te beginnen met goed gezuiverde, DNA origami structuren. Er bestaat een stabler streng die ook kan binden aan polycaties.

Ze zijn moeilijk te scheiden van de DNA-origami polyplexen. Onze coatingmoleculen worden ook gebruikt in gentherapietoepassingen. Dit betekent dat de DNA-nanostructuren in de toekomst kunnen worden gebruikt om het genoom van levende organismen te veranderen.

Voor agarose gel kleuring, meestal moleculen worden gebruikt die het DNA intercalate en zijn potentieel mutageen. Volg de veiligheidsinstructies van uw laboratorium bij het bevlekken van DNA.