Summary
Lav intensitet pulserende ultralyd stimulering (LIPUS) er en modalitet for ikke-invasiv mekanisk stimulering av endogene eller utviklet celler med høy romlig og tidsmessige oppløsning. Denne artikkelen beskriver hvordan å implementere LIPUS til en epi-fluorescens mikroskop og minimere akustisk impedans mismatch langs stien ultralyd for å hindre uønsket mekaniske gjenstander.
Abstract
Ved å fokusere lav intensitet ultralyd pulser som trenge myke vev, representerer LIPUS en lovende biomedisinsk teknologi eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring, hormonelle sekret og genetisk omprogrammeres celler. Imidlertid er oversettelsen av denne teknologien for medisinske anvendelser er hemmet av mangel Biofysiske mekanismer som målrettet vev følelse og svare på LIPUS. En passende tilnærming til å identifisere disse mekanismene vil være å bruke optisk biosensors sammen med LIPUS til å angi underliggende signalveier. Men kan implementere LIPUS til fluorescens mikroskop introdusere uønsket mekaniske gjenstander av fysiske grensesnitt som gjenspeiler, absorbere og refract akustiske bølger. Denne artikkelen presenterer en fremgangsmåte for å bygge LIPUS til kommersielt tilgjengelig oppreist epi-fluorescens mikroskop samtidig minimere påvirkning av fysiske grensesnitt langs akustisk banen. En enkel prosedyre er beskrevet å operere en ett element ultralyd svinger og få fokus sonen svingeren i objektive fokuspunkt. Bruk av LIPUS er illustrert med et eksempel på LIPUS-indusert kalsium transienter i kultivert menneskelig glioblastom celler målt med kalsium imaging.
Introduction
Mange sykdommer krever noen form for invasiv medisinsk intervensjon. Disse prosedyrene er ofte dyre, risikabelt, krever utvinning perioder og dermed legge en byrde til helsevesen. Ikke-invasive terapeutiske modaliteter har potensial til å gi tryggere og billigere alternativer til konvensjonelle kirurgiske prosedyrer. Men er nåværende ikke-invasiv tilnærminger som farmakoterapi eller Transkraniell magnetisk stimulering ofte begrenset av avveininger mellom vev penetrasjon, spatiotemporal oppløsning og uønskede off-målet effekter. I denne sammenheng en fokusert ultralyd utgjør en lovende ikke-invasiv teknologi med potensial til å manipulere biologiske funksjoner dypt inne vev med høy spatiotemporal nøyaktighet og begrenset off-målet effekter.
Fokusert ultralyd stimulering består av levere akustisk energi på nøyaktige dypt inne levende organismer. Avhengig av akustisk puls parametere, kan denne energien har en rekke medisinske bruksområder. For eksempel, har Food and Drug Administration godkjent bruk av høy intensitet fokusert ultralyd (HiFU) for termisk ablasjon prostatakreft, tremor-forårsaker områder av hjernen, livmor fibroids og smerte-forårsaker nerveender i benmetastaser1 . HiFu-mediert microbubble kavitasjon brukes også transiently åpne blod - hjerne barrieren for målrettet levering av systemisk-administrert therapeutics2. Romlig-peak puls-gjennomsnittlig intensiteten (jegsppa) og romlig-peak timelige gjennomsnittet intensitet (jegspta) brukes for HiFU programmer er vanligvis over flere kW cm-2 og produsere pulstrykk på flere titalls MPa. Disse intensitetsverdiene er langt over FDA-godkjent jegsppa og jegfikk også spta grenser for diagnostiske ultralyd 190 W cm-2 og 720 mW cm-2, henholdsvis3. I kontrast, har nyere studier vist at ikke-destruktiv pulserende ultralyd stimulering som er i eller i nærheten av en rekke diagnostiske ultralyd intensitet grenser (LIPUS) kan være effektive eksternt og sikkert manipulere nevrale avfyring4, 5,6,7,8, hormonelle sekret9,10 og bioengineered celler11. Likevel, mobilnettet og molekylære mekanismer som cellene forstand og svare på ultralyd forblir uklart, utelukker klinisk oversettelse av LIPUS. Derfor i de siste årene, studier av kunstige membraner, kultivert celler og dyr stimulert med ultralyd har steget å avsløre Biofysiske og fysiologiske prosesser modulert av LIPUS12,13, 14,15.
Lyd består av en vibrasjon overføres via et fysisk medium. Ultralyd er en lyd med en frekvens over menneskelige hørbare området (dvs. over 20 kHz). I en laboratorium, er ultralyd bølger vanligvis produsert av Piezoelektriske transdusere som inneholder et materiale som vibrerer som svar på en elektrisk felt svingte i en bestemt høyfrekvente båndbredde. To typer transdusere finnes: elementet transdusere og transducer arrays. Enkeltelement Piezoelektriske transdusere har en buet overflate som fungerer som en fokus linse og dermed konsentrater akustiske energien i et definert område kalt fokus sonen. Enkeltelement transdusere er mye billigere og enklere å betjene enn transducer arrays. Denne artikkelen vil fokusere på ett element transdusere.
Størrelsen på fokus sonen for en fokusert enkeltelement svinger avhenger av geometriske egenskapene for akustisk linsen og dens akustisk frekvens. For å oppnå en millimeter størrelse fokal sone med et enkeltelement svinger, er ultralyd frekvenser i MHz-området generelt. Dessverre, akustiske bølger på slike frekvenser er svært raskt svekket når overføres i en spinkel medium som luft. Dermed må MHz ultralyd bølger genereres og overført til prøven i tettere materialer som vann. Dette utgjør den første utfordringen integrere LIPUS modalitet til et mikroskop.
En annen utfordring er å redusere fysisk grensesnitt mellom materialer med ulike akustisk impedances (som er et produkt av stofftetthet og akustisk hastigheten) langs akustisk banen. Disse grensesnittene kan gjenspeile, refract, scatter og absorbere akustiske bølger, gjør det vanskelig å kvantifisere mengden akustisk energi effektivt levert et utvalg. De kan også opprette uønsket mekaniske gjenstander. For eksempel skape refleksjoner produsert vinkelrett akustisk mismatch impedans grensesnitt backpropagating bølger som forstyrrer fremover-spre seg. Langs forstyrrelser banen avbryte bølgene hverandre fast regioner av områder kalt noder og oppsummere på vekslende regioner kalt anti-noder, opprette såkalte stående bølger (figur 1). Det er viktig for experimentalist å kontrollere eller eliminere disse eksperimentelle grensesnitt i vitro som de ikke kanskje eksisterer i vivo.
Fluorescens måling av optisk journalister er en velkjent metode å forhøre gjennomsiktig biologiske prøver i sanntid og med ingen fysisk forstyrrelser. Denne tilnærmingen er dermed ideelt for LIPUS studier som noen fysiske sonder i sonicated området vil introdusere mekaniske gjenstander. Denne protokollen beskriver implementering og drift av LIPUS til kommersielle epi-fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voksende celler på akustisk gjennomsiktig Polyester Film
- Bore en 12 mm hull størrelse på bunnen av en målestokk 35 mm kultur parabol med en loddrett trykk-drill. Flytt bore sakte og bære vernebriller. Fjerne biter av plast festet til bunnen av parabolen med et blad for å lage en glatt overflate på den eksterne siden (figur 2).
- Påfør et tynt lag av marine-grade epoxy eller lim på at eksterne undersiden av retten.
- Sett en film av polyester (2,5 µm tykkelse) mot at eksterne undersiden av retten og trykk fast sørge for epoxy/limet spres jevnt mellom filmen og tykk plast overflaten. Trekk forsiktig filmen på en sentrifugal måte med fingrene til å opprette en flat overflate (figur 2).
- Når epoxy/limet har tørket, kort skyll tørr polyester-bunnen rett med 95% etanol og sterilisere ved å plassere fatet og innsiden overflaten av dens lokket under en sterk 254 nm UV excitation kilde. Justere varighet og intensitet å levere en UV dose ca 330 mJ cm-2 for fullstendig ødeleggelse av de fleste typer mikro-organismer. Denne energien tilsvarer omtrent en varighet på 5 min med en 1000 µW cm-2 UV lys.
- Aliquot kommersielt tilgjengelig ekstracellulær matrix proteiner blandinger (EMPM) i små rør (50-100 µL) og lagre dem på 20 ° C eller mindre i sterile forhold.
- I et sterilt miljø (f.eks inne en biosafety cabinet), kan du fortynne en frossen lager av EMPM med en ønsket kultur medium til 1: 100. Arbeid på is for å hindre EMPM polymerisasjon ved romtemperatur. Raskt bruke 100 µL av middels blandingen på polyester filmen. Plass lokket tilbake på rett å opprettholde sterilitet.
- Inkuber EMPM-belagt polyester bunnen retter i en celle kultur CO2 inkubator på 37 ° C for 6-12 h.
- Etter inkubasjon Sug opp overflødig mediet og direkte frø overflaten med cellene på den ønskede tettheten. Arbeid under sterilt tilstand å opprettholde sterilitet.
2. LIPUS gjennomføring
- Plass en vanntank under målet med en oppreist mikroskop med stor volum og uten belysning maskinvare i overføringsbane.
- Bruke kommersielt tilgjengelig optomechanical komponenter, plass en prøve holder under målsettingen og svinger innehaver under eksempel abonnenten. For påfølgende prøven søk og ultralyd justering, montere disse to holdere på oversettelse dagsetapper.
- Plass bevegelige deler og aktuatorer av oversettelse dagsetapper utenfor tank eller over vann å unngå vannskader. Bare bruke rustfrie materialer som anodisert aluminium eller stål midt optomechanical komponenter.
- Fyll tanken med deionisert og degassed vann før utnytte nedsenking svingeren. Vann må stemme overens med horisontalplanet av prøven holderen (Figur 3).
Merk: Deionisert vann forhindrer elektriske koplingen i nærvær av høy elektrisk felt. Avgassing vil også hindre spredning og endringer av akustiske bølger. Avløp vann etter hvert eksperiment med en pumpe eller ventilen slik at vann faller under posisjon svingeren. Også erstatte eller filtrere vann ofte og rydde opp vanntanken for å unngå vekst av mikroorganismer.
3. skrå akustisk eksitasjon
- Bruke kommersielt tilgjengelige optomechanical komponenter, orientere svingeren i skrå stilling med hensyn til den optiske banen. Dette sikrer at alle reflekterte bølger føres fra prøven (Figur 3 og Figur 4).
4. kjører svingeren
Merk: Ultralyd transdusere konvertere oscillerende elektrisk energi til mekanisk utvidelse/sammentrekning av et piezoelektrisk materiale. Denne konverteringen produserer energitap i form av varmeenergi. Derfor, mens transdusere har en topp inngangsspenning grense, de har en elektrisk kraft grense for å unngå termisk skade piezoelectric elementet:
med plikt syklus forhold brøkdel av tiden av elektriske simulering, P den elektriske strømforsyningen (i watt), Vrms root-betyr-torget spenningen (i volt) alternativ spenningskilde og Z det elektriske impedans (i Ohms).
med Vpp topp-til-topp spenningen på svingeren.
- Opprette en sinusbølge skjemaet inneholder ønsket antall sykluser per puls, og pulsen repetisjon frekvens ved hjelp av en kommersiell funksjonsgenerator. Men krever relativt høy VPPs måtte effektivt kjøre standard ultralyd transdusere ofte tillegg av en effektforsterker å forsterke utdataene (dvs. øke amplituden til Vpp) for funksjonsgenerator.
Merk: angir For eksempel en transducer produsenten makt grensen for en gitt svinger er 35 W. Vil en sinusformet topp-til-topp Inngangsspenning (Vi) 500 mV ved en syklus på 50% og forsterket gjennom en 50 dB/100 W forsterker være innenfor den makt dette svinger?- For å besvare dette spørsmålet, kan du beregne spenning etter forsterkning. En radiofrekvens (RF) effektforsterker, er forsterkning faktoren (dB) definert av:
Dermed forsterket spenningen har en amplituden utgang Vpp (Vpp = Vut) til:
Bruke formler 1 og 2, og bruker 50 Ω som elektrisk impedans, er tilsvarende kraften generert av denne spenningen:
Denne Stimuleringen er derfor innenfor den makt svingeren. - Bruker eksemplet ovenfor, beregne bølgeform parametrene (Vpp, frekvens, puls varighet og puls repetisjon frekvens) som tilsvarer strøm og spenning grensene levert av svingerens produsent. Pass på å respektere disse grensene for å unngå skade svingeren og andre tilkoblede instrumenter.
- For å besvare dette spørsmålet, kan du beregne spenning etter forsterkning. En radiofrekvens (RF) effektforsterker, er forsterkning faktoren (dB) definert av:
- Velg en funksjonsgenerator som opererer innenfor et frekvensområde kompatibel med ultralyd svingeren. Juster frekvensen av funksjonsgenerator nominell peak frekvens svingeren.
- Opprette en sinusformet spenning puls ønsket varighet og repetisjon frekvens med burst-modus av funksjonen generatoren. Justere topp-til-topp spenning til en ønsket verdi. Kontroller at hele puls er kortere enn tidsintervallet mellom to påfølgende pulser.
- Kontroller at bølgeform tilsvarer ønsket signalet ved å koble utdataene for funksjonen generatoren til inngangen på et oscilloskop.
- Koble til produksjon av funksjonen generatoren til inngangen på en RF effektforsterker (Figur 4). Kontroller at stimulasjonsparameteret er innenfor grensene for svingerens produsent.
5. strålen justering
- Velg en hydrophone som opererer med en frekvens rekkevidde og akustisk intensitet kompatibel med frekvensen og intensitet ultralyd svingeren.
- Forsiktig bringe spissen av en hydrophone sonde i fokus i objektive synsfelt på stedet som tilsvarer plasseringen av prøven (Figur 4).
- Kontroller at både sonde og svinger er nedsenket i deionisert og degassed vann. Ikke kul spissen av hydrophone med et fysisk objekt enn vann som dette vil endre sin belegg og påvirker måling.
- Utføre en brutto før justering svingeren visuelt posisjonering den akustiske aksen mot hydrophone sonden. Sørger for at avstanden mellom svingerens overflate og hydrophone spissen omtrent tilsvarer svingerens brennvidde.
- Koble hydrophone til en av oscilloskops Signalinngang. Koble synkronisering utløseren fra funksjonsgenerator til en annen oscilloskop inndata. Visualisere både signaler samtidig på oscilloskop.
- Kjøre svingeren med noen ultralyd sykluser lav driftssyklus og lav amplituden å unngå å skade sonden. Sjekk med hydrophone's produsent sikker drift betingelser for å unngå skade hydrophone spissen.
- Justere s/divisjon knotten ifølge reisetiden av ultralyd fra svingerens overflaten til hydrophone. Se etter et hydrophone signal på oscilloskop etter synkronisering utløseren.
- Sakte betjene svingeren bruker et motorisert eller manuell XYZ stadium. La svingeren i posisjon som samsvarer med maksimal hydrophone signalet (Figur 4).
Merk: Hvis ikke finner noe signal er det mulig intensiteten av på akustisk pulser er for lav eller strålen er mis-justert spredt av et objekt. Sjekk regelmessig at hydrophone og svinger er visuelt pre justert og at ingen bobler eller fysisk objekt er i riktig vei unntatt polyester filmen. Hvis fortsatt ikke finner noe signal, øke spenningen av litt øke amplituden til hydrophone signal.
6. fastsettelse av ultralyd pulstrykk og intensitet
- Strålen justert, mål topp-til-topp amplituden til hydrophone output på oscilloskop for forskjellige spenninger kjører svingeren. Sørg for ikke å overskride trykkgrensen anbefalt av hydrophone's produsent.
- Konvertere disse målingene til press og/eller akustisk intensitetsverdiene med metoden kalibrering levert av den hydrophone produsent.
Merk: Akustisk intensiteten kan bestemmes fra press og vice versa med formelen:
med jeg akustisk trykket (i W m-2), P akustisk trykket (i Pa), ρ tettheten av spre materiale (1000 kg m-3 for vann) og c hastighet i spre medium (for vann, c = 1500 m s-1). - Opprette kalibrering kurver ved hjelp av disse målingene.
Merk: Trykk vs spenningen og intensiteten vs spenning kurvene har en lineær og parabolske figur, henholdsvis. - Bestemme press og/eller intensitet for en ønsket kjøring spenning ved hjelp av tilsvarende kalibreringskurven.
7. kalsium-Sensitive/LIPUS Live-celle fluorescens Imaging
- Erstatte cellens kultur medium med ønsket tenkelig bufferen som inneholder 5 µM en celle-permeant kalsium-sensitive fargestoff (f.eks Fluo-4 er). Inkuber kultur parabol på en CO2 inkubator på 37 ° C 1t.
- Nøye vask celler med samme bufferen gratis fargestoff.
- Plass rett i prøven holderen. Opphisse cellene med blå lys belysning (490 nm) og justere eksitasjon intensitet og kameraet eksponering for å unngå overdreven bleking eller pixel metning.
- Utføre tidsinnstilt bildebehandling med ønsket bilde oppkjøpet innstillinger. Bruke en nedsenkning målsetting for bedre bildekvalitet og med lenge arbeidsavstand for å redusere uønskede refleksjoner (se Figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 er et eksempel på LIPUS eksperiment multiplekset med kalsium imaging. Glioblastom celler (A-172) ble dyrket på EMPM belagt polyester film i standard kultur medium (supplert med 10% serum og 1% antibiotika), og inkubert med kalsium-sensitive fluorescerende reporter Fluo-4 AM. Cellene ble fotografert med en 10 X nedsenking linsen og opplyst med en hvit LED-lyskilde og fluorescens lys ble samlet inn med en standard GFP filter. LIPUS ble brukt av manuelt ved å kjøre en 4 MHz svinger med en puls bølgeform 158 V topp-til-peak amplitude, 0.1 ms puls varighet og 10 ms puls repetisjon frekvensen (dvs. arbeidssyklus med 1%). Disse parameterne tilsvarer jegsppa = 88 M cm-2 (godt under diagnostiske grensen på 190 W cm-2)og jegfikk også spta = 877 mW cm-2 (litt over diagnostiske grensen på 720 mW cm-2), henholdsvis. Resultatene viser denne Stimuleringen produsert robust kalsium elevations (figur 5B, 5 C, 5 D).
For kort puls er varigheter (dvs. med ingen signifikant varmespredning under pulsen) og antar varmekapasitet av prøven (dvs. celler dyrket på polyester film og midt i vannoppløsning) lik som vann, endring av temperatur (∆Tmax) produsert under hver puls kan estimeres ved16
med en puls varighet på 0,1 ms og puls intensiteten av 88 M cm-2
∆TMaks = 0,12 x 0,0001 x 88 ≈ 1 m ° C
med 1% driftssyklus er den lille mengden varme deponert på sonen fokal under hver 0,1 ms puls sannsynlig fjernet av varmeledning under 9.9 ms spredt mellom to påfølgende pulser. Derfor robust kalsium signaler i figur 5B, 5 C, 5 D er mest sannsynlig forårsaket av ikke-termisk mechanism(s).
Figur 1: stående bølge formasjon på et reflekterende grensesnitt. Tilstedeværelsen av et grensesnitt mellom materialer med forskjellige akustisk impedans gjenspeiler en innkommende press bølge (blå) med en bølgelengde λ. Siden begge bølger reiser i motsatt retning, opprettes en oscillerende faseskift. Toppen: på denne tiden, faseskift er 180°, produsere destruktiv interferens av stående bølge (grønne bølge). Midten: Når bølgene har flyttet avstand tilsvarer λ/4 forhold til toppanelet, faseskift er null og begge bølger forsterke via konstruktiv interferens, produsere en stående bølge av høyere amplitude. Bunnen: Når bølgene har flyttet en ekstra avstand av λ/2 (derav totalt λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ fra topp referansen), fase Skift blir null igjen, produsere en stående bølge av høy amplitude men med omvendt polaritet. Merk at noen posisjoner i banen har en konstant null Press (node, svart sirkler) mens andre stillinger stadig pendle mellom minimums- og press (antinodes, grønne sirkler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: voksende celler på akustisk gjennomsiktig polyester film. Figuren viser nederst i en 35 mm parabolen med store 12 mm hull i midten. Hullet er deretter dekket med en tynn polyester film. Filmen er godt festet til eksterne bunnen av parabolen med marine grade epoxy. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: implementering av en ultralyd opp til en oppreist fluorescens mikroskopet. En skreddersydd vanntank plasseres under en oppreist fluorescens mikroskop uten overført belysning maskinvare. En motorisert eksempel holder plassert under målet er knyttet til optomechanical komponenter fast til tabellen vibrasjon utenfor tank. Svingeren er plassert under prøven og festet til en oversettelse scene festet til optomechanical komponentene i tanken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: skjematisk diagram i hele organisasjonen. Opplegget inkluderer en epi-fluorescens oppreist fluorescens mikroskop for å aktivere fluorescens imaging kulturperler celler. Svingeren vises med en skrå retning med hensyn til den optiske banen. Denne konfigurasjonen unngår bakover refleksjon av akustiske bølger langs akustisk banen, dermed hindre stående bølge dannelse og/eller repeterende stimulering av prøven med flere ultralyd ekko. En ønsket bølgeform er produsert av en funksjonsgenerator som kan manuelt slått på eller elektronisk utløst av en datamaskin-grensesnitt (Transistor-Transistor-logikk eller Universal Serial Bus). Amplituden og forsinkelse av signalet målt ved hydrophone nålen (rød) kan analyseres ved hjelp av et oscilloskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: eksempel på LIPUS-indusert kalsium signaler i menneskelig glioblastom celler A-172. (A) rå fluorescens bilde av A-172 celler dyrket på en polyester bunn 35 mm kultur parabol og lastet med en celle-permeant versjon av kalsium-indikator Fluo-4. Rød spor representerer cellekantlinjene automatisk identifisert av et dataprogram og merket som regioner av interesse (ROI). (B) tid selvfølgelig relative fluorescens endring (Ft-F0f0eller ΔF/F0) for hver avkastning under en LIPUS-eksperiment. Bilder ble kjøpt med en hastighet på 1 rammen per sekund av en standard CCD kamera og LIPUS ble brukt for 10 s mellom 20 og 30. LIPUS bølgeform består av 100 µsec pulser som inneholder 400 sykluser på 4 MHz og gjentas hvert 10 ms 10 s. (C) handlingen viser tid selvfølgelig betyr ΔF/F0 beregnet for alle ROIs (feilfelt ikke vist). (D) Plot viser persentil av Avkastningen viser ΔF/F0 over en brukerdefinert aktivisering terskel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedfordelen av fokusert ultralyd er dens evne til å levere ikke-invasively mekanisk og/eller termisk energi til biologiske prøver med høy spatio-temporale presisjon. Andre teknikker skal mekanisk stimulere cellene vanligvis ansette invasiv fysiske sonder (f.eks celle-poking) eller krever samspillet av høy energi laserstråler med uvedkommende gjenstander (f.eks optisk pinsett). Magnetisk oppvarming kan varme bestemte romlige steder inne biologiske prøver men tilstedeværelsen av utenlandske magnetiske nanopartikler. På den annen side, presis ikke-invasiv oppvarming av lite utvalg (f.eks cellekulturer) i vandige media er mulig å bruke infrarød eller mikrobølgeovn eksitasjon17,18,19.
Siden kommersielle systemer kan utføre ultralyd eksitasjon i forbindelse med fluorescens mikroskopi ikke er tilgjengelig, har mange biophysicists opprettet tilpassede systemer skreddersydd til deres spesifikke applikasjoner8,12 ,13,20. Gjennomføringen av slike systemer kan imidlertid være vanskelig for ikke-eksperter. Denne artikkelen beskrives grunnleggende operasjonen for å kjøre en fokusert ultralyd bjelke mot fokalplanet av en oppreist epi-fluorescens mikroskop mål samtidig akustisk refleksjoner og stående bølger gjenstander som produseres på feil akustisk impedans grensesnitt. Disse akustisk gjenstander tas ikke i betraktning i publiserte litteratur vanligvis eksplisitt.
Hvis bruker en akustisk stråle vinkelrett optiske banen bjelke vil til slutt får væske-solid grensesnittet dannet av linsen av en nedsenket mål eller, hvis en luft målsetting brukes, vann-luften grensesnitt over utvalget. Disse grensesnittene gjenspeiler de akustiske bølgene tilbake til prøven, produsere stående bølger (se figur 1). Å begrense eller unngå disse refleksjoner, anbefales det å plassere svingeren med en skrå vinkel med hensyn til den optiske banen.
Bruk av polyester bunn kultur retter ikke bare minimere akustisk refleksjoner produsert av tykk plastikk kultur retter bunnen, de også aktivere experimentalist å stimulere prøven fra under med en oppreist mikroskop. Dette er en best konfigurasjon i forhold til en invertert mikroskop for å plassere en nedsenket svinger med en skrå retning med hensyn til den optiske banen.
Denne protokollen er utformet for bruk med fokusert ultralyd transduktorer, men experimentalist kan også bruke ikke-fokusert (plan) ultralyd transdusere også. Merk at siden LIPUS er ment for presis stimulering av ønskede områder i vev, fokusert ultralyd transdusere er generelt foretrukket for både i vitro og vivo programmer. Akustisk bjelker produsert av Plane transdusere er også bredere, gjør det vanskeligere å redusere refleksjoner og andre mekaniske gjenstander.
Fokus sonen for et enkeltelement fokusert ultralyd svinger avhenger av mange parametere som elementet diameter, akustisk frekvensen og lyd hastigheten av spre materiale. For en standard MHz svinger, er fokal området vanligvis begrenset i et millimetric eller sub millimetric område. En avveining eksisterer mellom størrelsen på sonen fokus og evne til akustisk strålen å trenge inn vev uten mye tap på grunn av demping: Jo høyere frekvensen, mindre fokus sonen men jo svakere penetrasjon.
For å effektivt stimulere celler visualisert under et mikroskop, må akustisk fokus sonen svingeren overlappe med optisk fokalplanet for målsettingen. Til dette målet er det nødvendig å nøyaktig justering av akustisk strålen bruker et kommersielt tilgjengelig hydrophone. Det er to hovedtyper av hydrophones: hydrophone nåler og fiber optisk systemer. Begge typer kan brukes. Under justering er det viktig å sørge for at akustisk intensiteten ligger innen press grensene for hydrophone og at frekvensen av svingeren i frekvensområdet på hydrophone følsomhet.
Bruk kalibreringen levert av produsenten (hvis tilgjengelig) konvertere spenning amplitude utdata fra hydrophone til faktiske akustisk trykk (hydrophones kalibreres vanligvis med et tall i V Pa-1 eller lignende enheter). Hydrophones har også vanligvis en fortrinnsrett orientering (retningen) med hensyn til akustisk strålen, derfor er foretrukket posisjon på hydrophone i samme retning av akustisk aksen. Hvis ikke mulig, hydrophones kan ha et diagram for demping vs retningsbestemt vinkel, slik at retningsbestemt etter korreksjon etter målingene er tatt.
Strålen justering kan være en frustrerende oppgave, spesielt når en transducer med en smal fokal sone. Hydrophone signalet skal vises med en forsinkelse med hensyn til pulsen kjøring svingeren. Denne forsinkelsen tilsvarer tiden ultralyd å reise fra svingerens overflaten til hydrophone sonden (i vann, lydbølger reise med en hastighet på ca 1500 m s-1) (se Figur 4). Merk at forsinkelsen av RF signaler gjennom elektriske kabler er liten, bare om 3 ns m-1, som i den foreliggende sak, kan ignoreres. En måte å teste om bjelken er godt justert er å beregne avstanden mellom svinger og hydrophone bruker forsinkelsen målt oscilloskop og kjente lyd hastigheten i vann. For eksempel er en forsinkelse på ca 17 µs forventet for en transducer med en brennvidde på 25 mm.
Hvis bruk av kommersielle hydrophone ikke er mulig (f.eks uvanlig svinger frekvens med ikke samsvarende hydrophones eller begrenset plass til å plassere hydrophone), akustisk strålen kan justeres med puls-echo metoden20. Dette gjøres vanligvis ved først å skyve et lite reflekterende objekt størrelse lik eller mindre enn diameteren beam svingeren i fokus i mikroskopet synsfelt. Svingeren brukes deretter både som akustisk emitter (for å sende ultralyd pulser) og mottaker (for å oppdage ekko fra reflekterende objektet). Merk at i denne konfigurasjonen en dedikert forsterker er nødvendig å forsterke ganske liten ekko signalet kommer ut av svingeren.
For betjening av RF instrumenter er det viktig at alle kabler og tilkoblinger til instrumenter har samsvarende elektrisk impedans, ellers uønskede elektrisk refleksjoner vil oppstå og endre elektrisk bølgeform. Dette er vanligvis de fleste bajonett Neill-Concelman (BNC) kabler og RF utstyr å ha 50 Ω impedans. Noen oscilloskop, men har en høy inngangsimpedans av 1 MΩ, og dermed vil gjenspeile en RF signal matet via en 50 Ω BNC kabel. I dette tilfellet skal en enkel 50 Ω feed gjennom terminator settes mellom slutten av BNC-kabelen og oscilloskops innspill til riktig avslutte signalet uten tap.
Denne metoden er teknisk begrenset av instrumentering for å levere ultralyd pulser og utføre fluorescens bildebehandling. For eksempel ville et standard enkelt-fotonet fluorescens mikroskop bare aktivere bildebehandling av todimensjonal prøver. Det kan imidlertid utføre mer komplekse LIPUS imaging av tredimensjonale prøver som hjernen skiver eller liten organer med flere Foton eksitasjon.
En annen utfordring med LIPUS eksperimenter er å skille mekanisk vs termiske effekten formidles av akustisk bjelker. En mekanisk utskiftning skrå til den optiske banen kan oppdages hvis det fortrenger bildet i flyet aksen (x, y) eller defocuses prøven i z-aksen. Disse forskyvninger, avhenger av den kombinerte optiske oppløsningen av mikroskopet kamera og mål. Dessuten, disse bevegelser ville bare oppstår under sonication, må en bruker en bildefrekvens som er høy nok til å synkronisere timelige overlappingen mellom kamera eksponering og puls varighet.
Undersøke ultralyd-indusert termiske effekten, bruk konvensjonelle fysiske sonder til å måle temperaturen anbefales ikke på grunn av uunngåelig vibrasjoner av sonden. Teknikken er beskrevet her er imidlertid godt egnet til å måle temperaturendringer genetisk kodet thermosensitive fluorescens journalister eller thermosensitive fargestoffer21,22. I fremtiden, som flere biokompatible fluorescerende journalister blir tilgjengelige, kan denne teknikken studiet av ultralyd effekter på mange andre Biofysiske parametere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Mikhail Shapiro og Nikita Reznik for fruktbart diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra Western University of Health Sciences og NIH gi R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , World Neurosurgery. (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O'Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
