Summary
구조적으로 관련된 단백질 자주 가지 생물 학적 기능을 발휘 한다. 공상 단백질을 만들기 위해이 단백질의 동등한 지역 교환 그들의 기능 차이 대 한 책임은 중요 한 단백질 영역을 식별 하는 혁신적인 접근 방식을 구성 합니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 단백질의 고유 영역이이 지역의 기능적 중요성을 결정 하기 위하여 구조적으로 유사한 단백질에서의 해당 시퀀스에 의해 대체 됩니다 공상 단백질의 디자인을 포함. 그런 키메라 겹치는 DNA 파편을 사용 하 여 중첩 된 PCR 프로토콜에 의하여 생성 하 고 적절 하 게 설계 된 뇌관, 뒤에 기본 보조 구조와 포스트 번역 상 수정 되도록 포유류 시스템 내에서 그들의 식.
고유 영역의 기능 역할 다음 적절 한 판독 분석 결과에 키메라의 활동의 손실에 의해 표시 됩니다. 결과 중요 한 아미노산의 집합을 품고 지역 식별 됩니다는 분자 해상도 높이기 위해 보완 기술 (예: 사이트 감독 mutagenesis)에 의해 추가 상영 될 수 있습니다. 제한 경우에는 서로 다른 기능을 가진 구조적으로 관련된 단백질을 찾을 수 있습니다, 비록 공상 단백질 cytokines, 사이토카인 수용 체 등 단백질에 중요 한 바인딩 영역을 식별 하 성공적으로 고용 되어 있다. 이 메서드는 단백질의 기능 지역 잘 정의 되지 않은 경우에 특히 적합 하며 감독된 진화 접근 관심 영역을 좁혀 하 고 관련된 심사 노력을 줄이기 위해 중요 한 첫 번째 단계를 구성.
Introduction
여러 종류의 단백질, cytokines 그리고 성장 인자를 포함 하 여 가족 구성원 유사한 3 차원 구조를 공유 하지만 고유한 생물학적 기능1,2를 자주 발휘에 그룹화 됩니다. 이 기능의 다양성 일반적으로 아미노산 구성 분자의 활성 사이트3내에 있는 작은 다름의 결과 이다. 이러한 사이트와 기능적인 결정 요인의 식별 제공 하지 않습니다만 중요 한 진화 통찰력 뿐만 아니라 좀 더 구체적인 촉진제와 억제제4디자인. 그러나, 구조상으로 관련된 단백질 사이 자주 발견 잔류물 구성에 있는 다름의 많은이 작업을 복잡. 포함 된 대규모 라이브러리를 구축 돌연변이의 수백은 현재 가능 하 고, 모든 단일 잔류물 변화를 평가 하 고 그들의 조합을 도전적이 고 시간이 걸리는 노력5에 아직도 남아 있다.
큰 단백질 영역의 기능적 중요성 평가 기법 관리 번호6에 가능한 잔류물의 수를 줄이기 위해 값의 따라서 이다. 잘린된 단백질이이 문제를 해결 하기 위해 가장 많이 사용 된 접근 되었습니다. 따라서 지역 연구에서 단백질 기능 특정 지역7,,89의 삭제에 의해 영향을 받는 경우 기능적으로 관련 된 것으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법의 주요 한계는 삭제 misfolding, 집계 및 대상된 지역 연구를 선도 하는 단백질의 이차 구조, 영향을 미칠 수 있습니다. 좋은 예는 cytokine oncostatin M (OSM), 있는 내부 삭제 7 잔류물 귀착되 었 다 더 수 없습니다 misfolded 돌연변이 보다 더 큰 공부10의 잘린된 버전입니다.
공상 단백질의 생성 더 큰 단백질 영역의 분석을 허용 하는 대체 하 고 혁신적인 접근 방식을 구성 합니다. 이 방법의 목표는 특정 생물 학적 기능을 대체 섹션의 기여를 평가 다른 단백질에서 구조적으로 관련된 시퀀스에 의해 단백질에 관심 영역을 교환. 식별 기능 도메인11,12수용 체 신호의 분야에서 널리 이용 된다, 공상 단백질은 특히 유용 단백질 가족 작은 아미노산 정체성만 보존된 이차 구조를 공부. 인터 루 킨-6 및 속눈썹 neurotrophic 요인 (6% 순서 신원)13 또는 백혈병 금지 요인 (LIF) 및 OSM (20% 신원)6에 같은 인터 루 킨-6 (일리노이-6) 유형 cytokines의 클래스에 적절 한 예를 찾을 수 있습니다는 다음 프로토콜은 근거한 다.
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Protocol
1. 공상 단백질 디자인
- 적당 한 단백질 (기증자) 교환 기증자 단백질 구조적으로 유사 하 고, 이상적으로 동일한 단백질 가족에 속하는 하지만 판독으로 사용 될 생물 학적 활동 부족 해야 관심 (받는 사람)의 단백질 영역을 선택 합니다. 없는 구조적으로 관련된 단백질, 알려 지는 경우 잠재적인 후보자 확인 될 수 있다 벡터 맞춤 검색 도구 (광대 한)14,15 와 같은 자동화 된 도구를 사용 하 여
- Access 단백질 데이터 은행 (PDB)16 유럽 웹사이트 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), 오른쪽 상단 모서리에 있는 검색 상자에 관심사의 단백질의 이름을 소개 하 고 '검색'을 클릭 합니다. 결정 구조는 PDB (PDB ID; 식별자 아래로 하지 사용할 수 제공 예를 들어 1evs OSM에 대 한)입니다.
참고: 데이터 구조는 PDB에서 사용할 수 없는 경우 단백질의 homology 모델 수 생성 될 스위스-모델17 같은 도구 대신, 사용 가능한 단계별 프로토콜18를 사용 하 여. - 광대 한 웹사이트 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)를 액세스할. PDB ID를 사용할 수 있는 경우 ' 쇼 유사한 구조에 대 한 ' 상자에 PDB ID imput '사전 계산된 결과 검색' 섹션까지 아래로 스크롤하여 고 '이동'을 클릭 합니다. 다음 화면에서 ' 원래 광대 한 ' 그리고 ' 전체 체인 ' 잠재적인 구조적으로 유사한 후보자에 대 한 PDB Id의 목록을 보려면 클릭 합니다.
- PDB ID는 사용할 수 없습니다 하지만 homology 모델 생성, '새로운 구조와 검색' 섹션까지 아래로 스크롤하여 고 '광대 한 검색' 링크에 클릭 하십시오. '제출 PDB 파일' 옆에 있는 '찾아보기'를 클릭 하면, 파일을 선택 하 고 '제출'을 클릭 하 여 모델의 PDB 파일을 업로드.
- 후에 PDB 파일 업로드, 광대 한 계산을 시작 하려면 '시작' 버튼을 클릭 합니다. 계산을 수행 하는 ' 전체 체인 ' 구조적으로 유사한 단백질의 PDB Id를 보러 도메인 아래에 클릭 합니다.
- 최고 후보자, 또는 문학 검색을 통해 선택의 판독 시스템에서 실험적으로의 관심 (예: 수용 체 활성화, 효소 활동, 녹음 방송 요인 활동)의 생물 학적 기능을 평가 합니다. 기증자 단백질 관심사의 단백질에 비해 다양 한 기능을 선택 합니다.
- Access 단백질 데이터 은행 (PDB)16 유럽 웹사이트 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), 오른쪽 상단 모서리에 있는 검색 상자에 관심사의 단백질의 이름을 소개 하 고 '검색'을 클릭 합니다. 결정 구조는 PDB (PDB ID; 식별자 아래로 하지 사용할 수 제공 예를 들어 1evs OSM에 대 한)입니다.
- 참조 시퀀스 (RefSeq) 데이터베이스19 에서 기증자와 받는 사람 단백질의 단백질 아미노산 시퀀스를 가져옵니다.
- RefSeq 웹 페이지 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)에서 유전자 섹션을 액세스, 검색 상자에 관심사의 단백질의 이름을 입력 하 고 '검색'을 클릭 합니다. 결과 목록에서 원하는 종에 대 한 유전자 이름을 클릭 하십시오.
- 모든 문서화 isoforms를 보러 RefSeq 섹션으로 스크롤하십시오. 관심 (NM로 시작)의 isoform에 대 한 시퀀스 식별자를 클릭 하십시오 아래로 스크롤한 'CD' 유전자의 단백질 코딩 영역을 강조 표시를 클릭 합니다. 화면 오른쪽 하단에 'FASTA'에 클릭 하 고 유전자 시퀀스를 복사 합니다.
- 적당 한 DNA 편집 소프트웨어를 사용 하 여 DNA 시퀀스를 저장 합니다. 자유롭게 사용할 수 있는 원숭이20를 사용할 때 프로그램을 열고, 빈 상자에 복사한 순서를 붙여, 선택 시퀀스 이름 하 고 '저장'을 클릭 합니다.
참고: 반복 단계 1.2.1. 1.2.3을. 에 하나 이상의 기증자 단백질 선택.
- 다른 공상 구문에서 대용 단백질 영역을 선택 합니다.
- 고유한 구조 지역에 관심사의 단백질 순서를 나눕니다. 이상적으로, 단백질에 대 한 도메인을 다른 문학에 설명 된 합니다. 이 경우가 아니라, 뚜렷한 보존된 구조 기능 (나선, 루프)의 존재 단계 1.3.1.1에서에서 평가 되어야 한다. 1.3.1.4 하.
- PDB 웹사이트에서 관심사의 단백질의 구조적 데이터를 다운로드 (단계 1.1.1 참조.). 단백질에 대 한 PDB 페이지에 액세스 하 고 화면 오른쪽에 '다운로드'를 클릭 하 여 PDB 파일을 다운로드.
- PyMOL (https://pymol.org/) 같은 분자 시각화 시스템에서 PDB 파일을 엽니다. PyMOL, 뉴클레오티드 순서 표시 (표시를 클릭 하 여 > 시퀀스에), (PDB ID 옆 H를 클릭 하 고 선택 하 여 '모든 것') 기본 구조 데이터를 숨길 하 고 명확 하 게 단백질의 구조를 시각화 하기 위해 '만화' 보기를 선택 기능 (PDB ID 다음 S를 클릭 하 고 '만화' 선택).
- 각각 독특한 구조 기능에 해당 하는 아미노산을 지적 하는 분자의 다른 부분을 강조 하기 위해 화면의 상단에서 뉴클레오티드 순서를 클릭 하십시오.
- 주석을 원숭이 DNA 순서에 별개의 구조상 영역. 1.2.3 단계에서 DNA 시퀀스를 엽니다., 코딩 영역에 아미노산 뉴클레오티드를 선택, 선택 영역을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 고 그것에 게 이름을 색상 ' 새로운 기능 '을 선택. 이전 단계에서 식별 된 각 구조 지역에 대 한 프로세스를 반복 합니다.
참고: ORFs를 클릭 하 여 두 수 있다 뉴클레오티드 선택 > 번역, 다음 확인을 클릭 하 여 그들이 올바른 아미노산 시퀀스에 대 한 코드를 보장 하기 위해. - 단백질 정렬 도구 (예: Clustal 오메가21)를 채용 하는 두 단백질의 잔류물 시퀀스를 정렬 합니다.
참고:는 키메라 포유류 식 시스템에서 생산 되 고 있기 때문에,이 순서 단백질의 신호 펩 티 드 포함 되어야 합니다.- 1.2.3 단계에서 DNA 시퀀스를 열어 원숭이, 기증자 및 수용 체 단백질의 전체 아미노산 시퀀스를 구하십시오. 그들을 선택 하 고 클릭 ORFs > 번역.
- Clustal 오메가 웹 페이지 (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 액세스 및 imput 두 단백질의 아미노산 시퀀스 다음 아래로 스크롤하여 고 '제출'을 클릭 합니다. 각 시퀀스와 텍스트 줄에 의해 진행 되어야 ' > ProteinName'를 제대로 식별할 수...
- '맞춤 파일 다운로드' 탭을 클릭 하 여 정렬 파일을 검색 하 고 그것을 저장 합니다. 이 파일은 모든 텍스트 편집 프로그램에서 열 수 있습니다.
- 그들의 DNA 순서에 기증자 단백질의 해당 구조 지역 주석을 참조로 정렬 파일을 사용 하 여 (단계 1.3.2를 참조.).
- 공상 단백질에 교환 하 고는 키메라에 대 한 적절 한 뉴클레오티드 순서를 디자인 하는 단백질 영역을 결정 합니다.
참고: 다른 지역의 기능적 중요성에 대 한 자세한 내용은의 부재, 그것은 제안 전체 루프 같은 큰 대체 선택 하 또는 그들의 평가에 나선 단백질 기능에 영향을 미칠. 이 첫 번째 탐구 실험 관련 영역 내 작은 대체에 초점을 맞춘 공상 단백질 디자인의 두 번째 라운드에 의해 다음 다음 수 있습니다.- 1.3.2 단계에서 수용 체 단백질의 주석된 DNA 시퀀스의 복사본을 만듭니다. 그리고 공상 단백질으로 이름을 바꿉니다. 원숭이에서 이름이 바꾼된 DNA 시퀀스를 열고, 선택 하 고 교환 및 기증자 단백질 (복사 단계 1.3.3에서에서 만든 주석된 시퀀스에서.), 해당 지역 대체 다음 변경 사항을 저장 영역에 대 한 코딩 뉴클레오티드 순서 삭제.
참고: 새 복사본을 만들고 각 다른 키메라 설계에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 1.3.2 단계에서 수용 체 단백질의 주석된 DNA 시퀀스의 복사본을 만듭니다. 그리고 공상 단백질으로 이름을 바꿉니다. 원숭이에서 이름이 바꾼된 DNA 시퀀스를 열고, 선택 하 고 교환 및 기증자 단백질 (복사 단계 1.3.3에서에서 만든 주석된 시퀀스에서.), 해당 지역 대체 다음 변경 사항을 저장 영역에 대 한 코딩 뉴클레오티드 순서 삭제.
- 고유한 구조 지역에 관심사의 단백질 순서를 나눕니다. 이상적으로, 단백질에 대 한 도메인을 다른 문학에 설명 된 합니다. 이 경우가 아니라, 뚜렷한 보존된 구조 기능 (나선, 루프)의 존재 단계 1.3.1.1에서에서 평가 되어야 한다. 1.3.1.4 하.
2입니다. 분자 클로닝을 위한 준비
- 플라스 미드 벡터의 선택 식 시스템에 대 한 적합 한 선택 합니다. 포유류 식, pCAGGS22 같은 높은 식 벡터 또는 pcDNA 벡터 시리즈는 것이 좋습니다.
- 제한 효소 기반 복제이 프로토콜에서 시연, 벡터의 다중 복제 사이트 (MCS)에 독특한 제한 사이트 관심의 단백질와 호환 되는지 확인 합니다. 이렇게 하려면, 원숭이와 공상 구조의 DNA 순서를 열고, 클릭 ' 효소 > 효소 선택기 ' MCS에 제한 사이트의 적어도 2 결 석 확인 순서 (그들의 이름 옆에 있는 0 표시).
- 원숭이 등 DNA 편집기를 사용 하 여 터미널 뇌관 디자인.
- 새로운 DNA 파일 만들기 (파일 > 새) 벡터의 MCS (6-8의 기본적인 쌍, 예: PacI에 대 한 TTAATTAA)에서 선택한 첫 번째 제한 사이트 다음 지도자 시퀀스 (3-9 추가 자료 쌍, 예: AAAGGGAAA), N 맨끝 뇌관을 시작 하 고는 선택적 공백 (예: pCAGGS 벡터에 GCTAGCGCATCGCCACC 예제에서 사용 되는)와 초기 18-27의 기본적인 쌍 (예: OSM에 대 한 ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG) 관심사의 유전자의.
- 새로운 DNA 파일에 C 터미널 뇌관 순서 쌍을 시작 마지막으로 18-27 자료 (예: CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 6xHistidine C 터미널 태그와 유전자에 대 한), 관심사의 유전자의 뒤 선택적 공백 (예: TAGCGGCCGC에서 pCAGGS 벡터), 두 번째 제한 사이트 선택 (예: AscI 위한 GGCGCGCC)와 지도자 시퀀스 (예: AAAGGGAAA). 시퀀스 전체를 강조 표시 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 역방향 입문서를 ' 리버스 보수 '를 선택 합니다.
- 각 공상 구문에서 국경 지역에 대 한 프라이 머를 설계 합니다.
- 키메라 (단계 1.3.4.1에서에서 만든)의 DNA 순서를 열고 원본 및 삽입 된 시퀀스 위치 연락처, 각 시퀀스의 구성 15 기본적인 쌍에에서 영역에서 30 자료 쌍 영역을 강조 표시 합니다. 지역 (마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 '복사'를 선택)를 복사 하 고 붙여 새로운 DNA 파일; 이 시퀀스는 앞으로 뇌관을 될 것입니다.
- 단계 및 역방향 뇌관으로 이름을 이전에 생성 된 앞으로 뇌관의 복사본을 만듭니다. 뇌관 순서를 강조, 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 ' 리버스-보완 ' 반전 뇌관 시퀀스를 생성을 선택 합니다.
- 2.3.1 단계를 반복 합니다. 2.3.2 하 고입니다. 대 한 공상 DNA 순서에 있는 각 연락처 영역. 교체는 N 맨끝 또는 C 터미널 영역에서 발생 하지 않는 한 일반적으로, 앞으로 또는 반전 뇌관의 2 세트는 한 키메라 생성 해야 합니다.
- 터미널 및 내부 뇌관 oligonucleotide 종합 공급자 로부터 주문.
노트: 터미널 뇌관 정화 높은 사용 하 여 (예: HPLC 정화) 프로토콜의 성공률에 긍정적인 영향을 미칠 수 있습니다. Desalted 내부 뇌관은 일반적으로 좋은 결과 제공합니다. - 기증자와 수용 체 유전자의 서식 파일 시퀀스를 가져옵니다.
참고: 크게 템플릿으로 이러한 시퀀스의 열려있는 독서 프레임 (ORFs)을 포함 하는 플라스 미드를 채용 절차를 용이 하 게 하 고는 것이 좋습니다. 또는, 후속 단계에 대 한 보완 DNA (cDNA)이이 유전자를 표현 하기 위해 알려진 셀 라인에서 생성 된 서식 파일로 사용할 수 있습니다.
3. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭 키메라를 형성 하는 개별 DNA 파편의
- 공상 단백질을 구성 하는 조각의 각각에 대 한 개별 PCR 반응 혼합물을 준비 합니다. 전형적인 공상 단백질 3 개인적인 파편을 요구할 것 이다: N 맨끝 부분, 삽입, 지역 그리고 C 터미널 부분.
노트: 고 충실도 DNA 중 합 효소 (예: Phusion 고 충실도 DNA 중 합 효소)를 사용 하 여 시퀀스에서 돌연변이 소개 하지 마십시오. PCR 반응 저녁에 고 하룻밤 사이 실행 될 수 있습니다.- 표 1에 표시 된 순서에 PCR 혼합물의 다른 시 약에 얼음에 피펫으로 1.5 mL microfuge 관 설정 올바른 뇌관 및 서식 파일은 각 PCR 반응에 대 한 고용 ( 표 2참조).
- 각 반응에 대 한 두 개의 얇은 벽 0.2 mL PCR 튜브 라벨 하 고 각 관에서 해당 PCR 혼합물의 20 µ L를 전송. PCR thermocycler에 PCR 튜브를 전송 하 고 표 3에 대 한 자세한 프로토콜을 시작.
참고: 적어도 5도 녹는 온도 보다 낮은 설계 뇌관의 이어야 한다 어 닐 링 온도.
- PCR를 실행 하는 동안 트리-아세테이트-EDTA (태) 버퍼에 1 %agarose 젤 100ml 준비 합니다. 이 위해 agarose의 1 g, 100 mL 유리 플라스 크에 태 버퍼의 혼합 및 무게는 agarose는 완전히 해산, 소용돌이 플라스 크 30-40 초 마다 때까지 전자 레인지. 약 50 ° C에 냉각 허용, ethidium 평범한 사람의 2-3 µ L (또는 동일한 DNA 염료)을 추가 하 고 원하는 잘 빗으로 젤 트레이에 부 어.
주의: ethidium 평범한 사람 알려진된 등재, 적절 한 보호 장비 사용. - PCR 반응 완료 되 면, 각 관에서 6 x DNA 로딩 버퍼 4 µ L를 추가 합니다. 1 %agarose 젤 전기 이동 법 장치에 삽입 하 고 커버 태 버퍼와 신중 하 게 분자량 사다리와 함께 젤으로 샘플을 로드.
참고: 로드 시이 좋습니다 나중에 DNA 복구를 촉진 하기 위하여 샘플 사이 빈 레인을 떠나입니다. - 20-45 분 동안 80-120 V에서 젤을 실행 합니다.
참고: 1, 000의 기본적인 쌍 아래 밴드 수 일반적으로 수 electrophoresed 120 V에서 약 20 분에서 동안 큰 밴드 더 긴 상영 시간을 필요 합니다. - 전기 영동 장치, agarose 젤을 꺼내 끄고 UV 빛에서 증폭 된 DNA 밴드를 시각화. 면도날을 사용 하 여, 젤에서 개별 DNA 조각을 잘라 고 레이블이 2 mL microfuge 관에 그들을 전송.
참고: DNA 손상을 방지 하기 위해 자외선에 노출 시간을 최소화 합니다. - 사용 하는 PCR 정리 키트 ( 재료의 표참조) 다른 DNA 파편을 정화.
- NTI 버퍼 젤 조각에 포함 된 각 튜브를 키트에 의해 제공 500 µ L를 추가 합니다. 50-55 ° C에서 thermomixer 및 젤 버퍼에 완전히 용 해 될 때까지 1000 rpm에서 떨고 전송.
- 레이블된 키트 열에 각 솔루션을 전송, microcentrifuge (30-60, 11000 x g)에 회전 하 고는 flowthrough를 삭제. 키트의 NT3 워시 버퍼의 700 µ L을 추가 하 고 동일한 설정에서 다시 원심은 flowthrough를 삭제. 다시 1-2mins 11000 x g 열 안에 실리 카 막 건조에 대 한 열 원심
- 1 분 동안 서 서 하 고 30-60 elute DNA를 11000 x g에서 원심 열에 열 레이블된 1.5 mL microfuge 관을, nuclease 무료 물 피펫으로 30 µ L를 전송.
- 260에 샘플의 흡 광도 측정 하 여 복구 하는 DNA의 양을 계량 및 340 nm는 분 광 광도 계에 ( 재료의 표참조). DNA 농도 다음 DNA의 소멸 계수 (50 µ g/mL)23를 곱한 결과 260 nm 그림에서 340 nm 읽기를 빼서 계산 됩니다.
노트: 230에서 추가 측정 nm 및 280 nm DNA 순수성의 평가 대 한 허용: 260/280와 260/230 비율 1.8 이상 일반적으로 주시 된다 순수한 DNA에 대 한. 프로토콜 (단기) 4 ° C 또는-20 ° C (장기)에 eluted DNA 저장이 단계 후에 일시 중지 될 수 있습니다.
4. PCR 증폭 공상 DNA 시퀀스를 생성 하
- 키메라의 별도 성분 융합 PCR 반응의 50 µ L을 설정 합니다. 3.1, 고용 10 함께 N 단자와 C 단자 뇌관에 동일한 단계에 따라 각 DNA의 ng에서 얻은 단계 3.7 조각.
참고: PCR 반응 저녁에 고 하룻밤 사이 실행 될 수 있습니다. - 3.2 3.7을 복구 하 고 계량 nuclease 무료 물 30 µ L에서 순화 된 DNA 조각 단계를 반복 합니다. 이 조각 공상 DNA 순서, 터미널 뇌관에 포함 된 제한 사이트에 의해 형벌을 포함 합니다.
5. 식 벡터에 공상 DNA의 삽입
- 레이블 2 1.5 mL microfuge 관 및 표 4, 선택한 식의 1 µ g 추가에 표시 된 순서 대로 다른 시 약 피펫으로 한 튜브 및 다른에서 복구 된 DNA 파편의 1 µ g에 벡터. 선택한 금지 효소로 소화를 수행 하기 위해 37 ° C에서 1-4 h에 품 어.
노트: 두 제한 효소는 고용 버퍼와 호환 확인 하십시오. 완전히 다른 버퍼, 필요한 경우에 효소 중 하나에 이러한 단계를 먼저 수행 하 고 반복 합니다. 소화 선정 제한 효소에 따라 다를 수 있습니다 필요한 시간: 자세한 내용은 제조업체의 설명서를 참조 하십시오. - 3.2 3.7 정화 및 복구 nuclease 무료 물 30 µ L에서 소화 DNA 단편 및 식 벡터 단계 반복 합니다. 이전 처럼 복구 하는 DNA의 양을 계량.
- 다음 수식을 사용 하 여 삽입 DNA 결 찰 반응에서 3:1 삽입/벡터 어 금 니 비율에 필요한 금액을 계산 합니다.
삽입 (ng) 어 금 니 비율 = * 벡터 (ng) * (혈압)을 삽입 크기 / 벡터 크기 (bp)
참고: 다른 삽입/벡터 어 금 니 비율 테스트할 수 있습니다, 있지만 일반적으로 3:1 비율로 적절 한 결과를 얻을. - 40 1.5 mL microfuge 관에서 결 찰 반응의 20 µ L를 설정 식의 ng 단계 5.3, 버퍼, 그리고 T4 DNA 리가 표 5에 표시 된 순서에 따라 계산 하는 공상 DNA의 양을 벡터와 16 ° c.에서 밤새 품 어
참고: 결 찰 효율은 일반적으로 수행 하룻밤 16 ° C에서 반응 하 여 증가 하지만 반응 실내 온도에서 2 h incubated 하는 수 또는. - 화학적으로 유능한 대장균 (대장균)으로 결 찰 혼합물의 5-10 µ L 표준 프로토콜24 성장 선택 격판덮개에 따라 준비 하 고 단일 식민지 확장 및 플라스 미드 DNA에 대 한 선택 변환 설립된 프로토콜25에 따라 격리입니다.
참고: 대장균 XL1-블루 스트레인이이 프로토콜에 대 한 고용 되었다 그러나 다른 대장균 변종 사용할 수 있습니다. - 5.1, 단계에서 지침에 따라 적절 한 제한 효소 1 µ g 격리 된 플라스 미드를 소화 하 고 평가에 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 공상 시퀀스에 해당 하는 크기의 DNA 밴드의 존재 (참조 단계 3.2-3.5).
참고: 삽입 된 시퀀스 DNA 시퀀싱 서비스를 통해 확인 하는 것이 좋습니다. - 성공적인 시퀀스 확인 시는 플라스 미드 다량 생산 고 다음 확고 프로토콜26,27포유류 식 시스템에서 고용 될 수 있습니다.
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Representative Results
건설 및 공상 단백질 (그림 1) 최근에 출판 된 연구6의 주제 이었다 OSM 및 LIF, 인터 루 킨-6 cytokine 가족의 두 멤버와 궁 행 것입니다. 그림 2 는이 단백질의 3 차원 구조를 보여 줍니다. 두 분자 나 cytokines, 4 개의 나선 (나 d A)와 번들에서 포장 하 고 루프28합류 클래스의 특성 이차 구조를 채택 한다. 인간 단백질의 정렬 된 아미노산 구조는 그림 3에서 볼 수 있습니다. 이 예에서 기원전 루프 지역 OSM의 아미노산 시퀀스 그림 3B와 같이 OSM LIF 키메라를 만들 해당 LIF 시퀀스에 의해 교환 했다.
이 대 한 목적, OSM 및 LIF의 DNA 시퀀스 가져온 고 기원전 루프에 해당 하는 인코딩 아미노산 지역 두 cytokines에 대 한 확인 되었다 (그림 4)를 대체. 6 히스티딘 태그 또한 다운스트림 단백질 정화를 촉진 하기 위하여 C-말단에 통합 되었다. 다음, 포유류 식 (pCAGGS)에 대 한 적합 한 벡터 선택 되었다, 그리고 그것의 다중 복제 사이트 내에서 고유한 제한 사이트 선택 (PacI 과 AscI) 그들은 공상 유전자 시퀀스에서 존재 했다 확인 한 후 (단계를 참조 하십시오 2.1.1입니다.)입니다.
프라이 머와 같이 설계 되었습니다 표 4. N-터미널 앞으로 OSM 뇌관 PacI 제한 사이트, 플라스 미드 전용 스페이서 및 OSM의 초기 27 기본적인 쌍 9 기본적인 쌍의 주요 시퀀스를 포함. C-터미널 역 뇌관 AscI 제한 사이트, 스페이서, 그리고 27 마지막 기본적인 쌍이 특정 한 경우에는 C 맨끝 히스티딘 태그에 대응 유전자의 다음 주요 시퀀스를 통합. 또한, BC 루프의 연결 지점에 걸친 30-기본적인 쌍 뇌관을 앞으로 역 방향에서 요구 되었다.
3 별도 반응을 첫 번째 PCR 증폭 단계에 의하여 이루어져 있다. N 맨끝 OSM 조각, 필요한 앞으로 N 맨끝 OSM 및 BC 시작 역 뇌관, 템플릿으로 사용된 OSM입니다. LIF 기원전 루프 기원전 앞으로 시작과 기원전 끝 역 뇌관 LIF 템플릿으로 사용 하 여 통해 얻은 것입니다. C-터미널 OSM 조각 기원전 끝 앞으로 C 터미널 OSM 역방향 뇌관, 뿐만 아니라 OSM 템플릿으로 사용. 385, 75, 321의 기본적인 쌍의 예상된 크기와이 세 조각은 각각 1 %agarose 젤에서 분리 후 그림 5A 에서 볼 수 있습니다.
이러한 정화 조각 N 맨끝 OSM 앞으로 함께 두 번째 PCR 반응에 있는 서식 파일 및 C 터미널 OSM 반전 뇌관으로 사용 했다. 해당 OSM LIF 하이 증폭의 결과 기원전 루프 유전자 시퀀스 그림 5B에 표시 됩니다. 이 단계는 정화, 유전자 조각 및 선택한 플라스 미드, 젤 전기 이동 법 그리고 정화, 16 ° C, 및 대장균 XL1-파랑으로 하룻밤 결 찰의 4 시간 소화에 선행 되었다. 개별 플라스 미드 분리 되었고 DNA 조각 (그림 6)의 적절 한 삽입에 대 한 금지 효소 소화에 의해 상영. 마지막으로, 긍정적인 안타 확인 순서 단백질 표정, 정화를 진행 하 고 기능적인 분석 실험6에서 테스트 하기 전에 의도 OSM LIF 기원전 루프 키메라에 대응 하는 시퀀싱을 위해 보내졌다.
그림 1 : 공상 단백질 생성의 도식 대표. (A) 공상 디자인 프로세스: 교환 지역 선택 후 원하는 키메라와 필요한 뇌관 순서 DNA 편집 소프트웨어를 사용 하 여 구성 됩니다. (B) 공상 단백질의 생성에 중요 한 단계는 묘사 된다. PCR 확대의 두 단계 다음 적절 한 제한 효소로 소화 하 고 식 벡터에 출혈 공상 유전자 시퀀스를 생성 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : OSM LIF 간의 구조 유사성. OSM29 의 크리스탈 구조의 표현 (PDB: 1EVS) LIF30 (PDB: 2Q7N), 설계 된 키메라의 대략적으로 표시 된 함께. 이러한 cytokines 루프 합류 번들 4 나선형 구조를 채택 한다. 이 연구 생물학 화학의 저널에 출판 되었다. 아드리안 Segarra, J. M., 쉰들러, 북 아 일, Gajawada, P., Lörchner, H., 브라운, 토니 & Pöling, 제이 AB 루프 및 D-나선형 바인딩 사이트 III 인간 Oncostatin M (OSM)의에서는 OSM 수용 체 활성화 필요 합니다. J. Biol 켐 2018; 18:7017-7029. © 저자6. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : OSM 및 LIF 아미노산 시퀀스의 비교. (A) 강조 하는 기원전 루프 영역 OSM 인간과 LIF의 전체 길이 아미노산 시퀀스의 정렬. 별표 (*) 표시 완벽 하 게 보존된 잔류물, 강력 하 게 유사한 속성을 가진 아미노산에 해당 하는 콜론 (:)과 마침표 (.) 나타내는 그 약하게 비슷한 기능. OSM LIF 상응 하 여 대체의 BC 루프 지역 OSM 기원전 루프 키메라의 (B) 아미노산 시퀀스입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : OSM 기원전 루프 키메라의 DNA 시퀀스. 공상 OSM 단백질의 시퀀스입니다. LIF에서 삽입 지역 오렌지 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : OSM 기원전 루프 키메라 DNA의 확대 조각. (A) BC 루프 (3 차선)와 C-터미널 지역 (4 차선) N 맨끝 영역 (2 차선)에 해당 하는 밴드와 함께 첫 번째 PCR 증폭에서 발생. ((B)는) 세 밴드 첫 번째 확대에서 얻은 두 번째 PCR 증폭 결과 OSM 키메라를 생성 하기 위해 결합 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : OSM 기원전 루프 키메라 플라스 미드 벡터에 삽입. OSM 키메라 유전자 시퀀스의 올바른 삽입을 나타내는 ~ 700 기본적인 쌍에 낮은 밴드와 함께 생성 된 플라스 미드의의 금지 효소 소화 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 사진 농도 | 볼륨 (50 µ L)에서 |
| 멸 균 물 | 50 µ L를 | |
| PCR 버퍼 | 10 X | 5 Μ L |
| dNTPs | 10 m m | 1 Μ L |
| DMSO | 100% | 1.5 Μ L |
| 앞으로 뇌관 | 10 Μ M | 1 Μ L |
| 반전 뇌관 | 10 Μ M | 1 Μ L |
| 템플릿 DNA | 변수 | 플라스 미드 DNA의 2.5-12.5 ng에 대 한 필요에 따라 |
| Phusion 고 충실도 DNA 중 합 효소 | 2 단위 / µ l | 0.5 Μ L |
표 1: 시 약은 PCR 반응 혼합물에 필요한.
| N 맨끝 파편 | 공상 삽입 | C-터미널 조각 | |
| 앞으로 뇌관 | N-터미널 앞 | 첫 번째 분기점 앞으로 | 앞으로 두 번째 접합 |
| 반전 뇌관 | 첫 번째 교차점 역 | 두 번째 교차점 역 | C-터미널 역 |
| 템플릿 DNA | 받는 사람 | 기증자 | 받는 사람 |
표 2: 뇌관 및 표준 공상 단백질의 생성에 필요한 서식 파일
| 사이클 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 수 |
| 초기 변성 | 98 º C | 30 대 | 1 |
| 변성 | 98 º C | 10 초 | 23-25 |
| 어 닐 링 | 68 º C * | 25s | 23-25 |
| 확장 | 72 ° C | kilobase 당 30 | 23-25 |
| 마지막 확장 | 72 ° C | 300s | 1 |
| 보류 | 4 º C | ∞ | 1 |
| * 적어도 5 º C 낮은 녹는 온도 뇌관 보다 | |||
표 3: PCR 프로토콜 공상 조각과 전체 공상 단백질을 증폭 하는 데 사용.
| 시 약 | 사진 농도 | 볼륨 (50 µ L)에서 |
| 멸 균 물 | 50 µ L를 | |
| 버퍼 제한 효소 * | 10 X | 5 Μ L |
| 템플릿 DNA | 변수 | 1 µ g의 DNA에 대 한 필요에 따라 |
| 효소 #1 | 변수 | 1 Μ L |
| 효소 #2 | 변수 | 1 Μ L |
| * 두 효소는 선택 버퍼와 호환 보장 | ||
표 4: 제한 효소 소화 반응의 구성 요소.
| 시 약 | 사진 농도 | 볼륨 (20 µ L)에서 |
| 멸 균 물 | 20 µ L를 | |
| T4 DNA 리가 버퍼 | 10 X | 2 Μ L |
| 벡터 DNA | 변수 | 40에 필요한 DNA의 ng |
| DNA를 삽입 | 변수 | 3:1 어 금 니 비율에 대 한 필요에 따라 |
| T4 DNA 리가 | 변수 | 1-2 Μ L |
표 5: 결 찰 반응에 필요한 시 약.
| 이름 | 뇌관 순서 |
| N 맨끝 OSM 앞으로 뇌관 (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-터미널 HisTag 역 뇌관 (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| 앞으로 기원전 루프 시작 | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| 기원전 루프 역 시작 | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| 앞으로 기원전 루프 끝 | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| 기원전 루프 끝 역 | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
표 6: 뇌관 OSM 기원전 루프 키메라의 생성에 사용 됩니다.
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Discussion
공상 단백질의 생성 cytokine 수용 체 바인딩 도메인13의 모듈화 등 주소 질문에 잘린된 단백질의 한계를 넘어 이동 할 수 있는 다양 한 기술을 구성 합니다. 키메라의 디자인 연구의이 종류에 있는 중요 한 단계 이며, 신중한 검토를 요구 한다. 일반적으로 예비 연구 기능 도메인을 설정 하는 가변 길이의 작은 교체는 단일 영역의 상세한 연구에 더 적합 하는 동안 첫 번째 단계에서 광범위 한 영역의 대체를 요구할 것 이다. 특별 한 관심 때문에 이들은 종종 표시 기능 사이트31,32의이 단계에서 단백질 가족 내 작은 보존된 모티프의 존재에 주어져야 한다. 개인적인 경험 공상 단백질 디자인의 하나 이상의 라운드 필요한 수 나타냅니다을 핵심 기능 영역, 각 중요 한 요구 라운드 시간 (달 주) 초기 디자인에서 기능 시험 테스트.
관심사의 단백질을 구조적으로 유사한 단백질 존재 하지만 분기 생물학 기능 보유, 방법은 관심의 모든 시퀀스에 적용 비록 그것이 각 특정 유전자 PCR에 그것의 신뢰 때문에 대 한 최적화가 증폭입니다. 특히, GC 풍부한 영역을 보유 하는 유전자 증폭33의 효율성을 줄이기 위해 이러한 유형의 시퀀스 알려져 있습니다 이후 특히 도전적인 목표, 증명 수도 있습니다. 이러한 문제는 일반적으로 반응, 전문된 DNA 중 합 효소 버퍼의 사용 또는 어 닐 링 매개 변수34의 수정에 다른 첨가제 (예: betaine)의 추가 등의 다른 방법으로 해결할 수 있습니다. 관심사의 유전자에 대 한 적절 한 조건을 발견 하기 전에 따라서, 그것은 일반적으로 몇 가지 시행 착오를 요구할 것 이다.
제공 하는 프로토콜은 고전적인 제한 효소 기반 복제 방법에, 일반적으로 실험실의 모든 종류에 액세스할 수 있는 기반으로 하지만 그것은 더욱 더 고급 복제 기술을 활용 하 적응 시킬 수 있다. 예를 들어 게이트웨이 복제 사용 하 여, 복제 (예: 다른 식 시스템은 동시에 테스트를 하는 경우), 몇 가지 다른 벡터에 동일한 삽입 용이 하 게 단지 필요 장소에 특정 attB 재결합 사이트 이에 대 한 자세한 제한 사이트의35를프로토콜 합니다. 다른 새로운 복제 방법론 두 번째 PCR 반응 (예: 사용자36 또는 깁슨 어셈블리37) 및 결 찰 (예: 시퀀스 및 결 찰-독립 (SLIC) 복제38 또는 퓨전에서 어셈블리에 대 한 필요성을 무시할 수 있습니다. 39). 다른 시 약 및 뇌관 디자인 전략을 요구 하는 동안 이러한 방법에 대 한 액세스와 함께 독자는 크게 속도 공상 구문 기본 설계 원칙에 따라 후 세대를 적용 하는 것이 좋습니다 이 프로토콜의 1 단계에서 자세한.
전반적으로,이 방법의 응용 프로그램 어떤 다른 단백질에 의해 생물 학적 기능, 단백질-단백질 또는 단백질 핵 산 상호 작용, 특히 관련 고 유용한 도구를 구성 하는 메커니즘에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 식별 하 고 단백질 가족6내에서 독특한 구조-기능 관계를 지정 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 맥스 플랑크 사회와 Schüchtermann-클리닉 (바트, 독일)에 의해 지원 되었다. 이 연구의 일부 생물 화학의 저널에 출판 되었다. 아드리안 Segarra, J. M., 쉰들러, 북 아 일, Gajawada, P., Lörchner, H., 브라운, 토니 & Pöling, 제이 AB 루프 및 D-나선형 바인딩 사이트 III 인간 Oncostatin M (OSM)의에서는 OSM 수용 체 활성화 필요 합니다. J. Biol. 화학 2018; 18:7017-7029. © 저자.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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