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Biochemistry

Chimeric प्रोटीन निर्माण के माध्यम से कार्यात्मक प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान

Published: January 8, 2019 doi: 10.3791/58786
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन अक्सर अलग जैविक कार्यों डालती है । chimeric प्रोटीन बनाने के लिए इन प्रोटीन के समकक्ष क्षेत्रों के आदान-प्रदान के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन क्षेत्रों है कि उनके कार्यात्मक विचलन के लिए जिंमेदार है की पहचान करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण का गठन किया ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य chimeric प्रोटीन के डिजाइन जिसमें एक प्रोटीन के विभिंन क्षेत्रों में एक संरचनात्मक रूप से इसी तरह के प्रोटीन में उनके इसी क्रम से बदल रहे हैं, क्रम में इन क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व निर्धारित करने के लिए शामिल हैं । इस तरह के chimeras के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं एक नेस्टेड पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर अतिव्यापी डीएनए अंशों और पर्याप्त रूप से डिजाइन प्राइमरों, एक स्तनधारी प्रणाली के भीतर उनकी अभिव्यक्ति के बाद देशी माध्यमिक संरचना और पोस्ट-शोधों संशोधनों को सुनिश्चित करने के लिए.

एक विशिष्ट क्षेत्र की कार्यात्मक भूमिका तो एक उचित readout परख में कल्पना की गतिविधि के नुकसान से संकेत दिया है । परिणाम में, महत्वपूर्ण अमीनो एसिड का एक सेट बंदरगाह क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं, जो आगे पूरक तकनीक द्वारा जांच की जा सकती है (जैसे साइट-निर्देशित mutagenesis) आणविक संकल्प को बढ़ाने के लिए । हालांकि मामलों में जो भिंन कार्यों के साथ एक संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन पाया जा सकता है तक सीमित है, chimeric प्रोटीन सफलतापूर्वक ऐसे साइटोकिंस और cytokine रिसेप्टर्स के रूप में प्रोटीन में महत्वपूर्ण बाध्यकारी क्षेत्रों की पहचान के लिए कार्यरत किया गया है । इस विधि के मामलों में विशेष रूप से उपयुक्त है जिसमें है प्रोटीन कार्यात्मक क्षेत्रों को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं, और निर्देशित विकास के दृष्टिकोण में एक मूल्यवान पहले कदम के लिए नीचे ब्याज के क्षेत्रों संकीर्ण और स्क्रीनिंग शामिल प्रयास को कम करने का गठन ।

Introduction

प्रोटीन के कई प्रकार, साइटोकिंस और विकास कारकों सहित, परिवारों में समूहीकृत कर रहे है जिनके सदस्य समान तीन आयामी संरचनाओं का हिस्सा है लेकिन अक्सर अलग जैविक कार्य1,2डालती । इस कार्यात्मक विविधता आमतौर पर है अणु सक्रिय3साइटों के भीतर एमिनो एसिड संरचना में छोटे मतभेदों का परिणाम है । ऐसी साइटों और कार्यात्मक निर्धारकों की पहचान मूल्यवान विकासवादी अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं, लेकिन यह भी अधिक विशिष्ट एगोनिस्ट और अवरोधक4डिजाइन करने के लिए । हालांकि, अक्सर संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन के बीच पाया अवशेषों संरचना में अंतर की बड़ी संख्या इस कार्य पेचीदा । हालांकि म्यूटेंट के सैकड़ों युक्त बड़े पुस्तकालयों का निर्माण आजकल संभव है, हर एक अवशेष भिन्नता का आकलन और उनमें से संयोजन अभी भी एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला प्रयास5रहता है.

बड़े प्रोटीन क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व का आकलन तकनीक मूल्य के इस तरह के एक प्रबंधनीय संख्या6के लिए संभव अवशेषों की संख्या को कम कर रहे हैं । कटा हुआ प्रोटीन इस मुद्दे से निपटने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण किया गया है । तदनुसार, क्षेत्रों के लिए कार्यात्मक प्रासंगिक माना जाता है यदि अध्ययन के तहत प्रोटीन समारोह एक विशेष क्षेत्र7,8,9के विलोपन से प्रभावित है । हालांकि, इस विधि की एक प्रमुख सीमा है कि विलोपन प्रोटीन माध्यमिक संरचना को प्रभावित कर सकते हैं, खुलासा करने के लिए अग्रणी, एकत्रीकरण और इरादा क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए अक्षमता. एक अच्छा उदाहरण है cytokine oncostatin एम (OSM), जिसमें एक आंतरिक विलोपन से बड़ा 7 अवशेषों एक खुलासा उत्परिवर्ती है कि आगे10का अध्ययन नहीं किया जा सकता के परिणामस्वरूप के एक छोटा संस्करण है ।

chimeric प्रोटीन की पीढ़ी एक वैकल्पिक और अभिनव दृष्टिकोण है कि बड़े प्रोटीन क्षेत्रों के विश्लेषण परमिट का गठन किया । इस विधि का लक्ष्य एक प्रोटीन में एक और प्रोटीन में संरचनात्मक रूप से संबंधित अनुक्रम द्वारा ब्याज के क्षेत्रों का आदान प्रदान करने के लिए है, ताकि विशिष्ट जैविक कार्यों के लिए प्रतिस्थापित वर्गों के योगदान का आकलन करने के लिए । व्यापक रूप से संकेत रिसेप्टर्स कार्यात्मक डोमेन11,12की पहचान करने के क्षेत्र में इस्तेमाल किया, chimeric प्रोटीन विशेष रूप से थोड़ा एमिनो एसिड पहचान के साथ प्रोटीन परिवारों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन माध्यमिक संरचना संरक्षित । उपयुक्त उदाहरण interleukin-6 (IL-6) प्रकार साइटोकिंस के वर्ग में पाया जा सकता है, जैसे interleukin-6 और सिलिअरी neurotrophic फैक्टर (6% अनुक्रम पहचान)13 या ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) और OSM (20% पहचान)6, जिस पर निंन प्रोटोकॉल आधारित है ।

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Protocol

1. Chimeric प्रोटीन डिजाइन

  1. एक उपयुक्त प्रोटीन का चयन करें (दाता) ब्याज के प्रोटीन के साथ विनिमय क्षेत्रों के लिए (प्राप्तकर्ता) दाता प्रोटीन संरचनात्मक रूप से समान होना चाहिए, आदर्श एक ही प्रोटीन परिवार से संबंधित है, लेकिन जैविक गतिविधि की कमी के रूप में इस्तेमाल किया जा readout । यदि कोई संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन ज्ञात कर रहे हैं, संभावित उंमीदवारों ऐसे वेक्टर संरेखण खोज उपकरण के रूप में एक स्वचालित उपकरण का उपयोग कर पहचाना जा सकता है (विशाल)14,15
    1. प्रवेश प्रोटीन डेटा बैंक (PDB)16 यूरोपीय वेबसाइट (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), ऊपरी दाहिने कोने पर खोज बॉक्स में ब्याज की प्रोटीन का नाम परिचय, और ' खोज ' पर क्लिक करें । बशर्ते कि एक क्रिस्टल संरचना उपलब्ध है, नहीं नीचे PDB पहचानकर्ता (PDB आईडी; उदा 1evs for OSM).
      नोट: यदि संरचनात्मक डेटा PDB पर उपलब्ध नहीं है, प्रोटीन का एक समरूपता मॉडल जैसे स्विस मॉडल17 के बजाय एक उपकरण द्वारा उत्पंन किया जा सकता है, उपलब्ध कदम दर कदम प्रोटोकॉल18का उपयोग कर ।
    2. विशाल वेबसाइट (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml) तक पहुंचें । PDB आईडी उपलब्ध होने की स्थिति में, ' पूर्व-गणना परिणाम पुनर्प्राप्त करें ' अनुभाग तक नीचे स्क्रॉल करें, imput के लिए ' समान संरचनाएं दिखाएं ' बॉक्स में PDB ID को क्लिक करें, और ' गो ' पर जाएं । निंनलिखित स्क्रीन में, ' मूल विशाल ' और फिर ' पूरी श्रृंखला ' पर क्लिक करें संभावित संरचनात्मक रूप से समान उंमीदवारों के लिए PDB आईडी की एक सूची देखने के लिए ।
      1. यदि एक PDB आईडी उपलब्ध नहीं है, लेकिन एक समरूपता मॉडल तैयार किया गया था, ' एक नई संरचना के साथ खोज ' अनुभाग और ' विशाल खोज ' लिंक पर क्लिक करने के लिए नीचे स्क्रॉल करें । ' submit PDB फाइल ' के आगे ' ब्राउज ' पर क्लिक करके मॉडल की PDB फाइल अपलोड करें, फाइल का चयन और ' submit ' पर क्लिक करें ।
      2. PDB फाइल अपलोड होने के बाद विशाल गणना शुरू करने के लिए ' स्टार्ट ' बटन पर क्लिक करें । एक बार गणना किया जाता है, पर क्लिक करें ' पूरी श्रृंखला ' डोमेन के तहत संरचनात्मक समान प्रोटीन की PDB आईडी देखने के लिए ।
    3. शीर्ष उंमीदवारों की (जैसे रिसेप्टर सक्रियकरण, एंजाइमी गतिविधि, प्रतिलेखन कारक गतिविधि) ब्याज की जैविक कार्यों का आकलन, या तो प्रयोग चुनाव के readout प्रणाली में या एक साहित्य खोज के माध्यम से । ब्याज की प्रोटीन की तुलना में अलग समारोह के साथ एक दाता प्रोटीन का चयन करें ।
  2. प्राप्त प्रोटीन अमीनो एसिड अनुक्रम प्राप्तकर्ता और दाता प्रोटीन के संदर्भ अनुक्रम से (RefSeq) डाटाबेस19 ।
    1. RefSeq वेबपेज (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) में जीन सेक्शन एक्सेस करें, सर्च बॉक्स में इंटरेस्ट के प्रोटीन का नाम लिखें और ' सर्च ' पर क्लिक करे । परिणामी सूची में वांछित प्रजातियों के लिए जीन नाम पर क्लिक करें ।
    2. सभी प्रलेखित isoforms देखने के लिए RefSeq अनुभाग तक नीचे स्क्रॉल करें । ब्याज की isoform के लिए अनुक्रम पहचानकर्ता पर क्लिक करें (एनएम के साथ शुरू), नीचे स्क्रॉल करें और ' सीडी ' पर क्लिक करने के लिए जीन के प्रोटीन कोडिंग क्षेत्र पर प्रकाश डाला । स्क्रीन के नीचे दाईं ओर, ' फसता ' पर क्लिक करें और जीन अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाएँ.
    3. एक उपयुक्त डीएनए संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग डीएनए अनुक्रम बचाओ । आज़ादी से उपलब्ध बंदर20का उपयोग करते समय, प्रोग्राम खोलें, कॉपी किए गए अनुक्रम को रिक्त बॉक्स में चिपकाएँ, अनुक्रम नाम का चयन करें और ' सहेजें ' पर क्लिक करे.
      नोट: चरण 1.2.1 दोहराएँ । ते 1.2.3. एक या एक से अधिक दाता प्रोटीन के लिए चयनित ।
  3. प्रोटीन क्षेत्रों का चयन करने के लिए अलग chimeric निर्माण में प्रतिस्थापित किया जाएगा ।
    1. अलग संरचनात्मक क्षेत्रों में ब्याज की प्रोटीन अनुक्रम विभाजित । आदर्श रूप में, प्रश्न में प्रोटीन के लिए अलग डोमेन साहित्य में वर्णित किया गया होगा । यदि यह मामला नहीं है, अलग संरक्षित संरचनात्मक सुविधाओं के अस्तित्व (helices, छोरों) चरणों 1.3.1.1 में मूल्यांकन किया जाना चाहिए । ते 1.3.1.4.
      1. PDB वेबसाइट से ब्याज की प्रोटीन के संरचनात्मक डेटा डाउनलोड (1.1.1 कदम देखें.) । प्रोटीन के लिए PDB पृष्ठ का उपयोग, और स्क्रीन के दाईं ओर ' डाउनलोड ' पर क्लिक करके PDB फ़ाइल डाउनलोड करें ।
      2. पयमोल (https://pymol.org/) जैसे आणविक विज़ुअलाइज़ेशन सिस्टम में PDB फ़ाइल खोलें. पयमोल में, न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम प्रदर्शित करें (पर प्रदर्शन > अनुक्रम पर क्लिक करके), डिफ़ॉल्ट संरचनात्मक डेटा को छिपाने (PDB आईडी के बगल में एच क्लिक करके, और ' सब कुछ ' का चयन) और स्पष्ट रूप से प्रोटीन की संरचनात्मक कल्पना करने के लिए ' कार्टून ' दृश्य का चयन सुविधाओं (एस PDB आईडी के बगल में क्लिक करें, और ' कार्टून ' का चयन) ।
      3. स्क्रीन के शीर्ष पर न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पर क्लिक करें अणु के विभिंन भागों पर प्रकाश डाला, नीचे एमिनो प्रत्येक विशिष्ट संरचनात्मक सुविधा के लिए इसी एसिड टिप्पण ।
    2. बंदर में डीएनए अनुक्रम पर विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्रों व्याख्या । ऐसा करने के लिए, चरण 1.2.3 से डीएनए अनुक्रम खोलें., एक क्षेत्र में अमीनो एसिड के लिए न्यूक्लियोटाइड कोडिंग का चयन करें, चयन पर राइट-क्लिक करें और ' नई सुविधा ' का चयन करने के लिए इसे एक नाम और एक रंग दे । पिछले चरण में पहचाने गए प्रत्येक संरचनात्मक क्षेत्र के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ ।
      नोट: न्यूक्लियोटाइड चयन ORFs > पर क्लिक करके, तो ठीक है, कि वे सही एमिनो एसिड अनुक्रम के लिए कोड सुनिश्चित करने के लिए क्लिक करके डबल जांच की जा सकती है ।
    3. दो प्रोटीन एक प्रोटीन संरेखण उपकरण (उदा Clustal ओमेगा21) को रोजगार के अवशेषों अनुक्रम संरेखित करें ।
      नोट: के बाद से chimeras एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित किया जा करने के लिए कर रहे हैं, इन दृश्यों में प्रोटीन संकेत पेप्टाइड्स शामिल होना चाहिए.
      1. प्राप्त दाता और बंदर में रिसेप्टर प्रोटीन के पूर्ण एमिनो एसिड अनुक्रम, कदम 1.2.3 से डीएनए दृश्यों को खोलने के द्वारा, उंहें चुनने और ORFs > अनुवाद क्लिक करें ।
      2. Clustal ओमेगा वेबपेज (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) का उपयोग और दो प्रोटीन के एमिनो एसिड अनुक्रम imput, तो नीचे स्क्रॉल करें और ' Submit ' पर क्लिक करे । प्रत्येक अनुक्रम को ठीक से पहचाने जाने के लिए ' > ProteinName ' के साथ एक पाठ पंक्ति द्वारा proceded जाना चाहिए..
      3. संरेखण फ़ाइल को ' डाउनलोड संरेखण फ़ाइल ' टैब पर क्लिक करके पुनर्प्राप्त करें और इसे सहेजें । यह फ़ाइल किसी भी पाठ संपादन प्रोग्राम द्वारा खोली जा सकती है ।
      4. एक संदर्भ के रूप में संरेखण फ़ाइल का प्रयोग, उनके डीएनए अनुक्रम में दाता प्रोटीन के इसी संरचनात्मक क्षेत्रों व्याख्या (कदम 1.3.2 देखें.) ।
    4. जो प्रोटीन क्षेत्रों chimeric प्रोटीन में विनिमय और chimeras के लिए उपयुक्त न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम डिजाइन का फैसला ।
      नोट: विभिन्न क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व के बारे में विस्तृत जानकारी के अभाव में, यह उन में से जो प्रोटीन समारोह पर एक प्रभाव है मूल्यांकन करने के लिए पूरे छोरों या helices के रूप में बड़े प्रतिस्थापन का चयन करने के लिए सुझाव दिया है. यह पहला खोजपूर्ण प्रयोग तो chimeric प्रोटीन डिजाइन, प्रासंगिक क्षेत्रों के भीतर छोटे प्रतिस्थापन पर ध्यान केंद्रित के एक दूसरे दौर के बाद किया जा सकता है ।
      1. कदम 1.3.2 से रिसेप्टर प्रोटीन की व्याख्या की डीएनए अनुक्रम की एक प्रतिलिपि बनाएं । और यह एक chimeric प्रोटीन के रूप में नाम बदलें । बंदर में नाम बदला डीएनए अनुक्रम खोलें, का चयन करें और इस क्षेत्र के लिए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम कोडिंग को नष्ट करने के लिए, और यह दाता प्रोटीन में इसी क्षेत्र से बदलने की जगह (व्याख्या कदम 1.3.3 में बनाई गई अनुक्रम से नकल की.), तो परिवर्तन सहेजें ।
        नोट: एक नई प्रतिलिपि बनाएं और प्रत्येक भिंन कल्पना डिज़ाइन के लिए इस चरण को दोहराएं ।

2. आणविक क्लोनिंग के लिए तैयारी

  1. एक प्लाज्मिड वेक्टर पसंद की अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए उपयुक्त का चयन करें । स्तनधारी अभिव्यक्ति के लिए, एक उच्च अभिव्यक्ति वेक्टर की तरह pCAGGS22 या pcDNA वेक्टर श्रृंखला की सिफारिश कर रहे हैं ।
    1. प्रतिबंध एंजाइम आधारित क्लोनिंग इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के लिए, यह सुनिश्चित करें कि अद्वितीय प्रतिबंध साइटों के एकाधिक क्लोनिंग साइट (MCS) में मौजूद सदिश के हित के प्रोटीन के साथ संगत कर रहे हैं । ऐसा करने के लिए, बंदर के साथ chimeric constructs के डीएनए अनुक्रम खोलने के लिए, क्लिक करें ' एंजाइमों > एंजाइम चयनकर्ता ' और पुष्टि करते है कि कम से MCS में प्रतिबंध साइटों के दो अनुक्रम में अनुपस्थित रहे है (एक शूंय प्रदर्शित उनके नाम के आगे) ।
  2. डिजाइन टर्मिनल प्राइमरों ऐसे बंदर के रूप में एक डीएनए संपादक का उपयोग कर ।
    1. एक नया डीएनए फ़ाइल बनाएं (> नई फ़ाइल) और एक नेता अनुक्रम (3-9 अतिरिक्त आधार जोड़े, जैसे AAAGGGAAA) के साथ N-टर्मिनल प्राइमर शुरू, पहले प्रतिबंध साइट द्वारा पीछा किया है सदिश MCS (6-8 आधार जोड़े, जैसे TTAATTAA के लिए PacI), एक वैकल्पिक स्पेसर ( उदाहरण में प्रयुक्त pCAGGS वेक्टर में GCTAGCGCATCGCCACC) और ब्याज के जीन के प्रारंभिक 18-27 आधार जोड़े (जैसे ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG for OSM) ।
    2. एक नए डीएनए फ़ाइल में, c-टर्मिनल प्राइमर अनुक्रम ब्याज की जीन के अंतिम 18-27 आधार जोड़े के साथ शुरू होता है (एक 6xHistidine सी के साथ एक जीन के लिएउदाहरण के लिए CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA-टर्मिनल टैग), एक वैकल्पिक स्पेसर द्वारा पीछा किया (जैसे TAGCGGCCGC में pCAGGS वेक्टर), दूसरा प्रतिबंध साइट चुना (एएससीआई के लिएउदाहरण के लिए GGCGCGCC) और एक नेता अनुक्रम (जैसे AAAGGGAAA) । पूरे अनुक्रम पर प्रकाश डाला, राइट क्लिक करें और रिवर्स प्राइमर प्राप्त करने के लिए ' रिवर्स-पूरक ' का चयन करें.
  3. chimeric निर्माण में सीमा क्षेत्रों में से प्रत्येक के लिए डिजाइन प्राइमर ।
    1. कल्पना के डीएनए अनुक्रम खोलें (चरण 1.3.4.1 में बनाया.) और क्षेत्र में एक 30 आधार युग्म क्षेत्र जहां मूल और डाला अनुक्रम संपर्क में हैं, प्रत्येक अनुक्रम के 15 आधार जोड़े शामिल हाइलाइट । क्षेत्र की प्रतिलिपि बनाएँ (राइट-क्लिक करें और ' प्रतिलिपि ' का चयन करें) और इसे एक नया डीएनए फ़ाइल में चिपकाएँ; यह सीक्वेंस फॉरवर्ड प्राइमरी का होगा ।
    2. आगे प्राइमर के पिछले चरण में उत्पंन की एक प्रतिलिपि बनाओ और यह रिवर्स प्राइमर के रूप में नाम बदलें । प्राइमरी अनुक्रम पर प्रकाश डाला, राइट क्लिक करें और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए ' रिवर्स-पूरक ' का चयन करें.
    3. दोहराएँ चरण 2.3.1. और 2.3.2 । chimeric डीएनए अनुक्रम में प्रत्येक संपर्क क्षेत्र के लिए । आम तौर पर, आगे/रिवर्स प्राइमर के दो सेट एक कल्पना उत्पंन करने के लिए आवश्यक हैं, जब तक प्रतिस्थापन एन टर्मिनल या सी-टर्मिनल क्षेत्रों में होता है ।
  4. एक oligonucleotide संश्लेषण प्रदाता से टर्मिनल और आंतरिक प्राइमरों का आदेश ।
    नोट: अत्यधिक शुद्ध टर्मिनल प्राइमरों का प्रयोग (जैसे HPLC-शुद्ध) प्रोटोकॉल की सफलता की दर में एक सकारात्मक प्रभाव हो सकता है । नमकीन आंतरिक प्राइमरों आमतौर पर अच्छे परिणाम प्रदान करते हैं ।
  5. दाता और रिसेप्टर जीन के टेंपलेट अनुक्रम प्राप्त करें ।
    नोट: एक टेम्पलेट के रूप में इन दृश्यों के खुले पढ़ने के फ्रेम (ORFs) युक्त plasmids को रोजगार बहुत प्रक्रिया की सुविधा और सिफारिश की है. वैकल्पिक रूप से, पूरक डीएनए (सीडीएनए) इन जीनों व्यक्त करने के लिए जाना जाता एक सेल लाइन से उत्पन्न बाद के चरणों के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) व्यक्तिगत डीएनए कल्पना बनाने के टुकड़े के प्रवर्धन

  1. chimeric प्रोटीन की रचना टुकड़े में से प्रत्येक के लिए एक व्यक्ति पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें । एक ठेठ chimeric प्रोटीन तीन व्यक्तिगत टुकड़े की आवश्यकता होगी: एन टर्मिनल भाग, क्षेत्र डाला जा करने के लिए, और सी-टर्मिनल हिस्सा है ।
    नोट: अनुक्रम में उत्परिवर्तन शुरू करने से बचने के लिए एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ (उदाहरण के लिए Phusion उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़) का प्रयोग करें । पीसीआर रिएक्शन की वजह से शाम को और रात भर रन सेट किए जा सकते हैं ।
    1. बर्फ पर एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब सेट करें और प्लास्टिक तालिका 1में दिखाए गए क्रम में पीसीआर मिश्रण के विभिन्न रिएजेंट, सुनिश्चित करें कि सही प्राइमरों और टेम्पलेट्स प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए कार्यरत हैं ( 2 तालिकादेखें) ।
    2. लेबल दो पतली घिरी ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूबों प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, और प्रत्येक ट्यूब में इसी पीसीआर मिश्रण के 20 µ एल हस्तांतरण । एक पीसीआर thermocycler में पीसीआर ट्यूबों स्थानांतरण और तालिका 3में विस्तृत प्रोटोकॉल शुरू ।
      नोट: एनीलिंग तापमान डिजाइन प्राइमरों के पिघलने के तापमान की तुलना में कम 5 डिग्री कम होना चाहिए ।
  2. जबकि पीसीआर चल रही है, Tris-एसीटेट-EDTA (ताे) बफर में 1% agarose जेल की १०० एमएल तैयार करें । इस प्रयोजन के लिए, agarose के 1 ग्राम का वजन, एक गिलास कुप्पी और माइक्रोवेव में १०० मिलीलीटर के साथ मिश्रण, जब तक agarose पूरी तरह से भंग हो जाता है, कुप्पी हर 30-40 सेकंड घूमता है । लगभग ५० ° c करने के लिए ठंडा करने की अनुमति दें, ethidium ब्रोमाइड के 2-3 µ एल जोड़ने (या एक समकक्ष डीएनए डाई) और वांछित अच्छी तरह से कंघी के साथ एक जेल ट्रे में डालना.
    चेतावनी: ethidium ब्रोमाइड एक ज्ञात mutagen है, उचित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग सुनिश्चित करते हैं ।
  3. पीसीआर रिएक्शन पूरा होने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 6x डीएनए लोडिंग बफर के 4 µ एल जोड़ें । एक ट्रो इकाई में 1% agarose जेल डालें, ताे बफर के साथ कवर और ध्यान से एक आणविक वजन सीढ़ी के साथ साथ जेल में नमूनों लोड ।
    नोट: लोड करने के समय, यह बाद में डीएनए वसूली की सुविधा के लिए नमूनों के बीच खाली गलियों छोड़ने के लिए बेहतर है ।
  4. चलाने के लिए 80-120 V पर जेल 20-45 मिनट के लिए ।
    नोट: बैंड के तहत १,००० आधार जोड़े आमतौर पर १२० वी में लगभग 20 मिनट में electrophoresed जा सकता है, जबकि बड़े बैंड अब समय चलने की आवश्यकता होगी ।
  5. बंद ट्रो इकाई बारी, agarose जेल बाहर ले और यूवी प्रकाश के तहत प्रवर्धित डीएनए बैंड कल्पना । एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग, बाहर जेल से व्यक्तिगत डीएनए टुकड़े काट, और उंहें 2 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों लेबल के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: डीएनए क्षति से बचने के लिए यूवी प्रकाश के लिए जोखिम समय को कम करें ।
  6. विभिन्न डीएनए अंशों को शुद्ध करने के लिए एक पीसीआर क्लीन-अप किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें ।
    1. एक जेल टुकड़ा युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए किट द्वारा प्रदान की NTI बफर के ५०० µ एल जोड़ें । 50-55 डिग्री सेल्सियस पर एक thermomixer के लिए स्थानांतरण और जेल पूरी तरह से बफर में भंग है जब तक १००० rpm पर मिलाते हुए ।
    2. एक लेबल किट कॉलम के लिए प्रत्येक समाधान स्थानांतरण, एक microcentrifuge में स्पिन (30-60 के दशक, ११,००० x जी) और flowthrough त्यागें । किट के NT3 वॉश बफर के ७०० µ एल जोड़ें, एक ही सेटिंग के तहत फिर से केंद्रापसारक और flowthrough त्यागें । ११,००० x g पर 1-2mins के लिए कॉलम फिर से केंद्रापसारक स्तंभ के अंदर सिलिका झिल्ली सूखी ।
    3. कॉलम में एक लेबल १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब, प्लास्टिक 30 µ एल nuclease के स्तंभ में नि: शुल्क पानी के स्थानांतरण, 1 मिनट के लिए खड़े हो जाओ और 30 केंद्रापसारक ११,००० x जी में 60 elute डीएनए के लिए ।
  7. एक spectrophotometer में २६० एनएम और ३४० एनएम पर नमूना के अवशोषण को मापने के द्वारा बरामद डीएनए की मात्रा को बढ़ाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) । डीएनए एकाग्रता २६० एनएम आंकड़ा से ३४० एनएम पढ़ने घटाकर, तो डीएनए के विलुप्त होने गुणांक (५० µ g/एमएल)23से परिणाम गुणा द्वारा गणना की है ।
    नोट: २३० एनएम और २८० एनएम पर अतिरिक्त माप डीएनए शुद्धता के मूल्यांकन के लिए अनुमति: 260/280 और १.८ ऊपर 260/230 अनुपात आम तौर पर डीएनए के लिए शुद्ध माना जाता है । प्रोटोकॉल इस कदम के बाद रोका जा सकता है, 4 डिग्री सेल्सियस (अल्पकालिक) या-20 डिग्री सेल्सियस (लंबी अवधि) में eluted डीएनए भंडारण ।

4. पीसीआर प्रवर्धन Chimeric डीएनए अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए

  1. कल्पना के अलग घटकों को फ्यूज करने के लिए एक पीसीआर रिएक्शन की ५० µ एल सेट करें । एक ही ३.१ में विस्तृत कदम का पालन करें, एन टर्मिनल और सी-टर्मिनल प्राइमरों के साथ 10 डीएनए टुकड़ों में से प्रत्येक के एनजी के साथ रोजगार ३.७ चरण में प्राप्त की ।
    नोट: पीसीआर रिएक्शन शाम में सेट हो सकती है और रात भर चलती है ।
  2. दोहराएं ३.२ के लिए कदम ३.७ को ठीक करने और nuclease-मुक्त पानी की 30 µ एल में शुद्ध डीएनए टुकड़ा यों तो । इस अंश chimeric डीएनए अनुक्रम, प्रतिबंध साइटों द्वारा पार्श्व टर्मिनल प्राइमरों में शामिल हैं ।

5. एक अभिव्यक्ति वेक्टर में Chimeric डीएनए की प्रविष्टि

  1. लेबल दो १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूबों और प्लास्टिक तालिका 4में इंगित किया गया क्रम में विभिन्न रिएजेंट, एक ट्यूब में चयनित अभिव्यक्ति वेक्टर के 1 µ जी जोड़ने और अन्य में बरामद डीएनए टुकड़ा की 1 µ जी. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1-4 घंटे के लिए मशीन चुना प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पाचन प्रदर्शन करने के लिए ।
    नोट: सुनिश्चित करें कि दोनों प्रतिबंध एंजाइमों कार्यरत बफर के साथ संगत कर रहे हैं । मामले में वे पूरी तरह से अलग बफर की आवश्यकता होती है, एंजाइमों और दोहराने की केवल एक के साथ पहले इन चरणों का प्रदर्शन. समय पाचन के लिए आवश्यक प्रतिबंध एंजाइमों चयनित के आधार पर भिंन हो सकते हैं: विस्तृत जानकारी के लिए निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें ।
  2. चरणों को दोहराएँ ३.२ करने के लिए ३.७ को शुद्ध और पच डीएनए टुकड़ा और अभिव्यक्ति वेक्टर की वसूली 30 µ में nuclease-मुक्त पानी की एल. पहले की तरह ही बरामद डीएनए की मात्रा को बढ़ाता है ।
  3. डालें डीएनए की मात्रा की गणना एक 3:1 डालने के लिए आवश्यक है/वेक्टर दाढ़ अनुपात बंधाव प्रतिक्रिया में, निंनलिखित समीकरण का उपयोग कर ।

    संमिलित करें (एनजी) = दाढ़ अनुपात * वेक्टर (एनजी) * डालें आकार (बीपी)/ वेक्टर आकार (बीपी)

    नोट: विभिंन डालने/वेक्टर दाढ़ अनुपात का परीक्षण किया जा सकता है, हालांकि आम तौर पर एक 3:1 अनुपात पर्याप्त परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है ।
  4. एक बंधाव प्रतिक्रिया के 20 µ एल सेट के साथ एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में ४० एनजी की अभिव्यक्ति वेक्टर चरण ५.३, बफर में गणना की chimeric डीएनए की राशि, और टी-4 डीएनए ligase आदेश निम्नलिखित तालिका 5में इंगित किया गया, और 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी.
    नोट: बंधाव दक्षता आम तौर पर 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रतिक्रिया प्रदर्शन से वृद्धि हुई है, लेकिन वैकल्पिक रूप से प्रतिक्रिया कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए मशीन किया जा सकता है ।
  5. बंधाव मिश्रण के रासायनिक सक्षम ई कोलाई में 5-10 µ एल रूपांतरण (ई. कोलाई) मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित तैयार24 चयन प्लेटों में वृद्धि और विस्तार और प्लाज्मिड डीएनए के लिए एकल कालोनियों उठाओ विस्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार अलगाव25।
    नोट: ई. कोलाई XL1-नीले तनाव इस प्रोटोकॉल के लिए कार्यरत है, लेकिन अंय ई. कोलाई वेरिएंट भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. डाइजेस्ट 1 µ जी उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइमों के साथ अलग plasmids कदम ५.१ में दिए गए निर्देशों का पालन, और एक agarose जेल में ट्रो द्वारा chimeric अनुक्रम के लिए इसी आकार के एक डीएनए बैंड की उपस्थिति का आकलन (3.2-3.5 कदम देखें) ।
    नोट: यह अनुशंसित है कि संमिलित अनुक्रम एक डीएनए sequencing सेवा के माध्यम से सत्यापित है ।
  7. सफल अनुक्रम सत्यापन पर, plasmids बड़ी मात्रा में उत्पादित किया जा सकता है और अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल26,27का पालन करके एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में कार्यरत हैं ।

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Representative Results

निर्माण और एक chimeric प्रोटीन की पीढ़ी (चित्रा 1) interleukin-6 cytokine परिवार, OSM और लिफ, जो एक हाल ही में प्रकाशित अध्ययन का विषय थे के दो सदस्यों के साथ उदाहरण किया जाएगा6. चित्रा 2 इन प्रोटीन के तीन आयामी संरचना से पता चलता है । दोनों अणुओं कक्षा मैं साइटोकिंस की विशेषता माध्यमिक संरचना को अपनाने, चार helices के साथ (एक को घ) एक बंडल में पैक और28छोरों से जुड़े हुए । मानव प्रोटीन की संरेखित एमिनो एसिड संरचनाओं चित्रा 3एमें देखा जा सकता है । इस उदाहरण में OSM के ईसा पूर्व पाश क्षेत्र इसी लिफ अनुक्रम द्वारा विमर्श किया गया था के रूप में चित्र 3बीमें दिखाया एमिनो एसिड अनुक्रम के साथ एक OSM-लिफ कल्पना बनाने के लिए.

इस प्रयोजन के लिए, OSM और लिफ के डीएनए अनुक्रम प्राप्त किए गए थे और ईसा पूर्व पाश के लिए इसी एंकोडिंग एमिनो एसिड क्षेत्र दोनों साइटोकिंस के लिए पहचान की गई थी और (चित्रा 4) की जगह । एक 6-histidine टैग इसके अतिरिक्त सी में शामिल किया गया था, के लिए बहाव प्रोटीन शुद्धि की सुविधा टर्मिनस । अगले, स्तनधारी अभिव्यक्ति (pCAGGS) के लिए एक उपयुक्त सदिश चुना गया था, और अद्वितीय अपने एकाधिक क्लोनिंग साइट के भीतर प्रतिबंध साइटों (PacI और एएससीआई) यह सुनिश्चित करना है कि वे chimeric जीन अनुक्रम में मौजूद नहीं थे के बाद चुना गया (कदम देखें 2.1.1.).

प्राइमरों तालिका 4 में दिखाया गया के रूप में डिजाइन किए गए थे । एन टर्मिनल फॉरवर्ड OSM प्राइमर 9 आधार जोड़े, PacI प्रतिबंध साइट, एक प्लाज्मिड विशिष्ट स्पेसर, और OSM के प्रारंभिक 27 आधार जोड़े के बाद के एक अग्रणी अनुक्रम शामिल थे । सी-टर्मिनल रिवर्स प्राइमर एएससीआई प्रतिबंध साइट, एक स्पेसर के बाद अग्रणी अनुक्रम शामिल है, और 27 जीन है, जो इस विशेष मामले में सी-टर्मिनल histidine टैग से संबंधित के अंतिम आधार जोड़े । इसके अलावा बीसी लूप के जंक्शन अंक में फैले 30 बेस पेयर प्राइमरों को आगे और रिवर्स ओरिएंटेशन दोनों में जरूरी किया गया ।

पहली पीसीआर प्रवर्धन कदम तीन अलग प्रतिक्रियाओं के शामिल थे । एन टर्मिनल OSM टुकड़ा है, जो आवश्यक एन टर्मिनल OSM आगे और ईसा पूर्व शुरू रिवर्स प्राइमरों, टेंपलेट के रूप में OSM इस्तेमाल किया । लिफ बीसी लूप के माध्यम से प्राप्त किया गया था बीसी स्टार्ट फॉरवर्ड और बीसी एंड रिवर्स प्राइमर्स टेम्पलेट के रूप में लिफ का उपयोग करके. सी-टर्मिनल OSM टुकड़ा बीसी अंत आगे और सी टर्मिनल OSM रिवर्स प्राइमरों, साथ ही OSM के रूप में टेंपलेट का इस्तेमाल किया । इन तीन टुकड़ों, ३८५, ७५ और ३२१ आधार जोड़े क्रमशः की उंमीद आकार के साथ, चित्रा 5 में एक 1% agarose जेल में जुदाई के बाद देखा जा सकता है ।

ये शुद्ध टुकड़े तो दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया में एक टेंपलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया, साथ एन टर्मिनल OSM आगे और सी टर्मिनल OSM रिवर्स प्राइमरों । इस प्रवर्धन का परिणाम, OSM-लिफ बीसी लूप जीन अनुक्रम के अनुरूप है और चित्रा 5बीमें दिखाया गया है । यह कदम शुद्धि के बाद किया गया था, एक 4 जीन टुकड़ा के घंटे पाचन और चुना प्लाज्मिड, जेल ट्रो और शुद्धि, 16 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बंधाव, और ई. कोलाई XL1 में परिवर्तन-नीला । व्यक्तिगत plasmids अलग और डीएनए टुकड़ा (चित्रा 6) के उचित प्रविष्टि के लिए प्रतिबंध एंजाइम पाचन द्वारा जांच की गई । अंत में, सकारात्मक हिट करने के लिए अनुक्रमण के लिए भेजा गया था सत्यापित करने के लिए कि अनुक्रम से संबंधित इरादा OSM-लिफ BC लूप कल्पना करने के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रोटीन अभिव्यक्ति, शोधन और परीक्षण में कार्यात्मक परख6.

Figure 1
चित्रा 1 : chimeric प्रोटीन पीढ़ी के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (क) Chimeric डिजाइन प्रक्रिया: क्षेत्रों के चयन के बाद विमर्श किया जाना, वांछित कल्पना और आवश्यक प्राइमरों के अनुक्रम डीएनए संपादन सॉफ्टवेयर के माध्यम से निर्माण कर रहे हैं. (ख) chimeric प्रोटीन की उत्पादन में महत्वपूर्ण कदमों को दर्शाया गया है. पीसीआर प्रवर्धन के दो कदम एक chimeric जीन अनुक्रम है, जो तो उचित प्रतिबंध एंजाइमों और एक अभिव्यक्ति वेक्टर में ligated के साथ पच जाता है उपज । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : OSM और लिफ के बीच संरचनात्मक समानताएं । OSM29 के क्रिस्टल संरचनाओं का प्रतिनिधित्व (PDB: 1EVS) और लिफ30 (PDB: 2Q7N), डिजाइन कल्पना के एक अनुमानित प्रतिनिधित्व के साथ । इन साइटोकिंस एक चार पेचदार बंडल अनुरूप छोरों से जुड़े हुए अपनाने । यह शोध मूलतः जर्नल ऑफ जैविक रसायन में प्रकाशित हुआ था. एड्रियन-Segarra, जे. एम., शिंडलर्स, एन., Gajawada, पी., Lörchner, एच., रचाई, टी. & Pöling, जे. अटल बिहारी पाश और डी-मानव Oncostatin एम (OSM) के बंधन साइट III में कुंडल OSM रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक हैं. जे बियोल रसायन २०१८; 18:7017-7029. © द लेखक6. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : OSM और लिफ एमिनो एसिड अनुक्रम की तुलना । (क) मानव OSM और लिफ के पूर्ण लंबाई अमीनो एसिड अनुक्रम का संरेखण, बीसी पाश क्षेत्र के साथ प्रकाश डाला. तारक (*) पूरी तरह से संरक्षित अवशेषों, बृहदांत्र (:) दृढ़ता से इसी तरह के गुणों और पीरियड्स (.) के साथ अमीनो एसिड के अनुरूप कमजोर इसी तरह की सुविधाओं के साथ उन निरूपित संकेत मिलता है । (ख) OSM ईसा पूर्व पाश कल्पना के एमिनो एसिड अनुक्रम, OSM के बीसी पाश क्षेत्र के साथ इसके लिफ समकक्ष की जगह. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : OSM ईसा पूर्व पाश कल्पना के डीएनए अनुक्रम । chimeric OSM प्रोटीन का अनुक्रम । लिफ से डाला गया क्षेत्र नारंगी रंग में हाइलाइट किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : OSM ईसा पूर्व पाश कल्पना डीएनए टुकड़े के प्रवर्धन. (क) पहली पीसीआर प्रवर्धन से परिणाम, एन टर्मिनल क्षेत्र (लेन 2), बीसी लूप (लेन 3) और सी-टर्मिनल क्षेत्र (लेन 4) के लिए इसी बैंड के साथ । (ख) दूसरी पीसीआर प्रवर्धन से परिणाम, जिसमें तीन बैंड प्रथम प्रवर्धन में प्राप्त OSM कल्पना उत्पन्न करने के लिए संयुक्त हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : प्लाज्मिड वेक्टर में OSM BC लूप कल्पना का सम्मिलन । प्रतिबंध एंजाइम पाचन जनित plasmids की, एक कम बैंड पर मौजूद के साथ ~ ७०० आधार जोड़े OSM कल्पना जीन अनुक्रम की सही प्रविष्टि का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक शेयर एकाग्रता मात्रा (५० µ एल में)
बाँझ पानी को ५० µ l
पीसीआर बफर 10X 5 µ l
dNTPs 10 एमएम 1 µ l
DMSO १००% १.५ µ l
फॉरवर्ड प्राइमर १० µ मी 1 µ l
रिवर्स प्राइमर १० µ मी 1 µ l
टेंपलेट डीएनए चर के रूप में प्लाज्मिड डीएनए के 2.5-12.5 एनजी के लिए आवश्यक
Phusion उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 2 इकाइयां/µ l ०.५ µ l

तालिका 1: पीसीआर रिएक्शन मिश्रण के लिए आवश्यक एजेंट ।

N-टर्मिनल अंश Chimeric लन C-टर्मिनल अंश
फॉरवर्ड प्राइमर एन-टर्मिनल फॉरवर्ड पहले जंक्शन को आगे दूसरा जंक्शन आगे
रिवर्स प्राइमर पहले जंक्शन रिवर्स दूसरा जंक्शन रिवर्स C-टर्मिनल रिवर्स
टेंपलेट डीएनए प्राप्तकर्ता दाता प्राप्तकर्ता

तालिका 2: प्राइमर और टेंपलेट्स एक मानक chimeric प्रोटीन की पीढ़ी के लिए आवश्यक है ।

सायकल स्टेप तापमान समय चक्रों की संख्या
प्रारंभिक विकार ९८ º ग 30 1
विकार ९८ º ग 10s 23-25
एनीलिंग ६८ º ग * 25s 23-25
एक्सटेंशन ७२ º ग 30 प्रति kilobase 23-25
अंतिम विस्तार ७२ º ग 300s 1
पकड़ 4 º c ∞ 1
* सबसे कम 5 º सी कम तापमान पिघलने से प्राइमर

तालिका 3: पीसीआर प्रोटोकॉल chimeric टुकड़े और पूर्ण chimeric प्रोटीन बढ़ाना था ।

अभिकर्मक शेयर एकाग्रता मात्रा (५० µ एल में)
बाँझ पानी को ५० µ l
प्रतिबंध एंजाइम बफर * 10X 5 µ l
टेंपलेट डीएनए चर के रूप में डीएनए के 1 µ जी के लिए आवश्यक
एंजाइम #1 चर 1 µ l
एंजाइम #2 चर 1 µ l
* सुनिश्चित करें कि दोनों एंजाइमों चयनित बफर के साथ संगत कर रहे हैं

तालिका 4: प्रतिबंध एंजाइम पाचन प्रतिक्रिया के घटक ।

अभिकर्मक शेयर एकाग्रता मात्रा (20 µ एल में)
बाँझ पानी से 20 µ l
टी-4 डीएनए Ligase बफर 10X 2 µ l
वेक्टर डीएनए चर के रूप में डीएनए के ४० एनजी के लिए आवश्यक
डीएनए डालें चर के रूप में एक 3:1 दाढ़ अनुपात के लिए आवश्यक
टी-4 डीएनए Ligase चर 1-2 µ l

तालिका 5: रिएजेंट बंधाव प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है ।

नाम प्राइमरी सीक्वेंस
एन-टर्मिनल OSM फॉरवर्ड प्राइमरी (PacI) AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG
सी-टर्मिनल HisTag रिवर्स प्राइमर (एएससीआई) TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG
बीसी लूप आगे शुरू AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC
बीसी लूप शुरू रिवर्स GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT
बीसी लूप एंड फॉरवर्ड GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC
बीसी लूप एंड रिवर्स GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC

तालिका 6: OSM बीसी पाश कल्पना की पीढ़ी में इस्तेमाल किया प्राइमरों.

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Discussion

chimeric प्रोटीन की पीढ़ी एक बहुमुखी तकनीक है, जो काट दिया प्रोटीन की सीमा से परे जाने के लिए इस तरह के cytokine रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन13की मॉड्यूलरता के रूप में सवालों के पता करने में सक्षम है का गठन किया । chimeras के डिजाइन अध्ययन के इस प्रकार में एक महत्वपूर्ण कदम है, और सावधान विचार की आवश्यकता है । प्रारंभिक अध्ययन कार्यात्मक डोमेन की स्थापना के लिए आम तौर पर एक पहले चरण में व्यापक क्षेत्रों के प्रतिस्थापन की आवश्यकता होगी, जबकि चर लंबाई के छोटे प्रतिस्थापन और एक ही क्षेत्र के विस्तृत अध्ययन के लिए अनुकूल हैं । विशेष ध्यान इस कदम में एक प्रोटीन परिवार के भीतर छोटे संरक्षित रूपांकनों की उपस्थिति के लिए दिया जाना चाहिए, क्योंकि इन अक्सर कार्यात्मक31,३२साइटों का संकेत कर रहे हैं । व्यक्तिगत अनुभव इंगित करता है कि chimeric प्रोटीन डिजाइन के एक से अधिक दौर के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र के नीचे संकीर्ण आवश्यक हो सकता है, प्रत्येक दौर के साथ (महीने के लिए सप्ताह) कार्यात्मक परख परीक्षण के लिए प्रारंभिक डिजाइन से काफी समय की आवश्यकता है ।

जब तक वहां के हित के प्रोटीन के लिए एक संरचनात्मक समान प्रोटीन मौजूद है, लेकिन जैविक कार्यों को हटाना रखने, विधि ब्याज के किसी भी अनुक्रम के लिए लागू है, हालांकि यह है पीसीआर पर अपनी निर्भरता के कारण एक विशेष जीन के लिए अनुकूलित किया जाना है प्रवर्धन. विशेष रूप से, जीसी संपंन क्षेत्रों रखने जीन विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण लक्ष्य साबित हो सकता है, क्योंकि अनुक्रम के इन प्रकार के प्रवर्धन३३की क्षमता को कम करने के लिए जाना जाता है । इन मुद्दों आमतौर पर अलग अलग तरीकों से हल किया जा सकता है, जैसे विभिंन additives के अलावा (betaine) प्रतिक्रिया के लिए, विशेष डीएनए पोलीमरेज़ बफ़र्स, या एनीलिंग पैरामीटर३४के संशोधन का उपयोग करें । इसलिए, यह आम तौर पर ब्याज की जीन के लिए पर्याप्त परिस्थितियों से पहले कुछ परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होगी पाया जाता है ।

प्रदान की गई प्रोटोकॉल क्लासिक प्रतिबंध एंजाइम आधारित क्लोनिंग तरीकों पर आधारित है, जो आम तौर पर प्रयोगशाला के हर प्रकार के लिए सुलभ हैं, लेकिन यह आगे और अधिक उंनत क्लोनिंग तकनीक का लाभ लेने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए गेटवे क्लोनिंग, जो कई अलग वैक्टर में एक ही डालने क्लोनिंग की सुविधा का उपयोग कर (उदाहरण के लिए अगर विभिंन अभिव्यक्ति प्रणालियों के लिए समानांतर में परीक्षण किया जा रहे हैं), केवल जगह में विशेष attB पुनर्संयोजन साइटों की आवश्यकता होगी इस प्रोटोकॉल३५में विस्तृत प्रतिबंध साइटों की । अन्य नए क्लोनिंग के तरीके एक दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया (जैसे उपयोगकर्ता३६ या गिब्सन विधानसभा३७) और बंधाव (जैसे अनुक्रम और बंधाव-स्वतंत्र क्लोनिंग (SLIC)३८ या में फ्यूजन विधानसभा के लिए की जरूरत बाईपास कर सकते हैं ३९). जबकि विभिंन रिएजेंटों और प्राइमर डिजाइन रणनीतियों, इन तरीकों तक पहुंच के साथ पाठकों की आवश्यकता के लिए उंहें लागू करने के लिए महत्वपूर्ण बुनियादी डिजाइन सिद्धांतों का पालन करने के बाद chimeric निर्माण की पीढ़ी की गति को प्रोत्साहित किया जाता है इस प्रोटोकॉल के चरण 1 में विस्तृत ।

कुल मिलाकर, इस विधि के आवेदन बहुमूल्य तंत्र है जिसके द्वारा अंय प्रोटीन जैविक कार्यों जगह ले, विशेष रूप से प्रोटीन प्रोटीन या प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत को शामिल करने के बारे में अंतर्दृष्टि की आपूर्ति कर सकते हैं, और एक उपयोगी उपकरण का गठन पहचानें और एक प्रोटीन परिवार6के भीतर अद्वितीय संरचना-समारोह संबंधों को निर्दिष्ट करें ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम मैक्स प्लैंक सोसायटी और Schüchtermann-क्लिनिक (Bad Rothenfelde, जर्मनी) द्वारा समर्थित किया गया था । इस शोध का हिस्सा मूलतः जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था । एड्रियन-Segarra, जे. एम., शिंडलर्स, एन., Gajawada, पी., Lörchner, एच., रचाई, टी. & Pöling, जे. अटल बिहारी पाश और डी-मानव Oncostatin एम (OSM) के बंधन साइट III में कुंडल OSM रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक हैं. J. बियोल. २०१८; 18:7017-7029. © द लेखक.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labcycler thermocycler Sensoquest 011-103 Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000C  DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladder ThermoFisher Scientific SM0241
GeneRuler DNA Ladder Mix ThermoFisher Scientific SM0331
AscI restriction enzyme New England Biolabs R0558
PacI restriction enzyme New England Biolabs R0547
Phusion Hot Start II DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F-549S
dNTP set (100 mM) Invitrogen 10297018
T4 DNA ligase Promega M1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit Macherey-Nagel 740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock ThermoFisher Scientific MHS6278-202857165
LE agarose Biozym 840004
Primers Sigma-Aldrich Custom order
Human Oncostatin M cDNA Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

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References

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