Summary
Proteínas estruturalmente relacionadas frequentemente exercem funções biológicas distintas. A troca das regiões equivalentes destas proteínas a fim de criar proteínas quiméricas constitui uma abordagem inovadora para identificar regiões críticas da proteína que são responsáveis pela sua divergência funcional.
Abstract
O objetivo do presente protocolo abrange o design das proteínas quiméricas em que regiões distintas de uma proteína são substituídas por suas sequências correspondentes em uma proteína estruturalmente semelhante, a fim de determinar a importância funcional destas regiões. Tais quimeras são geradas através de um protocolo PCR aninhado usando a sobreposição de fragmentos de DNA e adequadamente projetado cartilhas, seguidas por sua expressão dentro de um sistema de mamíferos para garantir estrutura secundária nativa e modificações borne-translational.
O papel funcional de uma região distinta é então indicado por uma perda de atividade da Quimera, em um ensaio de leitura apropriado. Em consequência, são identificadas regiões abrigando um conjunto de aminoácidos essenciais, que pode ser ainda mais selecionados por técnicas complementares (por exemplo, mutagenesis local-dirigido) para aumentar a resolução molecular. Embora limitada a casos em que uma proteína estruturalmente relacionada com funções diferentes pode ser encontrada, proteínas quiméricas têm sido empregadas com sucesso para identificar as regiões críticas de ligação em proteínas tais como receptores de citocinas e citocinas. Este método é particularmente apropriado em casos em que as regiões funcionais da proteína não estão bem definidas e constitui um valioso primeiro passo na evolução dirigida abordagens para diminuir as regiões de interesse e reduzir o esforço de rastreio envolvido.
Introduction
Vários tipos de proteínas, incluindo citocinas e fatores de crescimento, são agrupados em famílias cujos membros compartilham semelhantes estruturas tridimensionais, mas muitas vezes exercem funções biológicas distintas1,2. Esta diversidade funcional costuma ser a consequência de pequenas diferenças na composição de aminoácidos dentro sites ativos3 da molécula. Identificação de tais sites e determinantes funcionais não só oferecem insights valiosos evolutivos mas também projetar mais específico agonistas e inibidores da4. No entanto, o grande número de diferenças na composição do resíduo frequentemente encontrado entre proteínas estruturalmente relacionadas complica essa tarefa. Mesmo que a construção de grandes bibliotecas contendo centenas de mutantes hoje em dia é viáveis, avaliando cada variação único resíduo e combinações deles continua a ser um esforço desafiante e demorado5.
Técnicas para avaliar a importância funcional das regiões grandes proteínas são, portanto, de valor para reduzir o número de resíduos possíveis para um número gerenciável6. Proteínas truncadas tem sido a abordagem mais utilizada para resolver este problema. Nesse sentido, as regiões são consideradas funcionalmente relevantes se a função da proteína em estudo é afectada pela exclusão de uma determinada região7,8,9. No entanto, uma grande limitação deste método é que as exclusões podem afetar a estrutura secundária da proteína, levando a enrolamento, agregação e a incapacidade para estudar a região pretendida. Um bom exemplo é uma versão truncada da citocina oncostatin M (OSM), no qual uma exclusão interna maior do que 7 resíduos resultaram em um mutante misfolded que não poderia ser mais estudou10.
A geração de proteínas quiméricas constitui uma abordagem alternativa e inovadora que permite a análise de regiões maiores da proteína. O objetivo desse método é a troca de regiões de interesse em uma proteína por sequências estruturalmente relacionadas em uma outra proteína, a fim de avaliar a contribuição das seções substituiu a funções biológicas específicas. Amplamente utilizado no campo da sinalização de receptores para identificar domínios funcionais11,12, proteínas quiméricas são particularmente úteis para estudar famílias da proteína com pouco aminoácido identidade mas conservada estrutura secundária. Adequadas exemplos podem ser encontrados na classe de interleucina-6 (IL-6) tipo citocinas, como interleucina-6 e ciliar neurotrophic factor (6% identidade de sequência)13 ou leucemia inibitório fator (LIF) e (20% de identidade) OSM6, em que o seguindo o protocolo é baseado.
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Protocol
1. proteína quimérico Design
- Selecione uma proteína adequada (doador) a troca de regiões com a proteína de interesse (destinatário), que a proteína do doador deve ser estruturalmente semelhante, idealmente pertencentes à mesma família da proteína, mas falta a atividade biológica a ser usada como leitura. Se sem proteínas estruturalmente relacionadas são conhecidas, os potenciais candidatos podem ser identificados usando uma ferramenta automatizada como o Vector alinhamento ferramenta de pesquisa (vasto)14,15
- Acesse o site europeu de16 proteína banco de dados (PDB) (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introduzir o nome da proteína de interesse na caixa de pesquisa no canto superior direito e clique em 'Pesquisar'. Desde que uma estrutura cristalina está disponível, não para baixo o identificador do PDB (PDB ID; por exemplo, 1evs para OSM).
Nota: se os dados estruturais não estão disponíveis no PDB, um modelo de homologia da proteína pode ser gerado por uma ferramenta como o suíço-modelo17 em vez disso, usando protocolos passo a passo disponível18. - Acesse o site vasto (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). No caso de um PDB ID está disponível, role para baixo até a seção 'Recuperar resultados pré-calculada', imput o PDB ID na caixa 'Mostrar estruturas semelhantes para' e clique em 'OK'. Na tela seguinte, clique em 'vasto Original' e depois 'Toda a cadeia' para ver uma lista de IDs de PDB para potenciais candidatos estruturalmente semelhantes.
- Se um PDB ID estiver indisponível, mas foi gerado um modelo de homologia, role para baixo até a seção 'Busca com uma nova estrutura' e clique no link 'Vasta pesquisa'. Upload de arquivo PDB do modelo clicando em 'Browse' ao lado 'Arquivo PDB submeter', selecionando o arquivo e clique em 'Submeter'.
- Após o PDB arquivo é carregado, clique no botão 'Start' para iniciar o cálculo vasto. Uma vez que o cálculo é executado, clique em 'Toda a cadeia' sob domínios para ver as identificações de PDB de proteínas estruturalmente similares.
- Avalie as funções biológicas de interesse (por exemplo, da ativação do receptor, atividade enzimática, atividade do fator de transcrição) dos candidatos top, ou experimentalmente no sistema de leitura de escolha ou através de uma pesquisa bibliográfica. Selecione uma proteína de doador com função divergente em comparação com a proteína de interesse.
- Acesse o site europeu de16 proteína banco de dados (PDB) (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introduzir o nome da proteína de interesse na caixa de pesquisa no canto superior direito e clique em 'Pesquisar'. Desde que uma estrutura cristalina está disponível, não para baixo o identificador do PDB (PDB ID; por exemplo, 1evs para OSM).
- Obter as sequências de aminoácidos da proteína das proteínas do receptor e do doador do banco de dados a sequência de referência (RefSeq)19 .
- Acesse a seção de gene na RefSeq página Web (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), digite o nome da proteína de interesse na caixa Pesquisar e clique em 'Pesquisar'. Clique no nome do gene para a espécie desejada na lista resultante.
- Role para baixo até a seção RefSeq ver isoformas tudo documentadas. Clique sobre o identificador de sequência para a isoforma de interesse (começando com NM), role para baixo e clique em 'CDS' para destacar a região de codificação da proteína do gene. No canto inferior direito da tela, clique em 'FASTA' e copie a sequência do gene.
- Salve a sequência de DNA usando um software de edição de DNA adequado. Ao usar o macaco livremente disponível20, abra o programa, colar a sequência copiada na caixa em branco, selecione o nome de sequência e clique em 'Salvar'.
Nota: Repita os passos 1.2.1. a 1.2.3. para as proteínas um ou mais doadores selecionadas.
- Escolha as regiões da proteína a ser substituído nas diferentes construções quiméricas.
- Divida a sequência da proteína de interesse em distintas regiões estruturais. Idealmente, diferentes domínios da proteína em questão serão têm sido descritos na literatura. Se isso não for o caso, a existência de distintas características estruturais conservadas (hélices, loops) deve ser avaliada em etapas 1.3.1.1. para 1.3.1.4.
- Baixar os dados estruturais da proteína de interesse no site da PDB (consulte a etapa 1.1.1.). Acessar a página do PDB para a proteína e baixar o arquivo PDB, clicando em 'download' no lado direito da tela.
- Abra o arquivo PDB em um sistema de visualização molecular como PyMOL (https://pymol.org/). Em PyMOL, exibir a sequência de nucleotídeos (clicando em Exibir > em sequência), ocultar os dados estruturais padrão (clicando o H ao lado do PDB ID e selecionando 'tudo') e selecione a visualização de 'desenho animado' Visualizar claramente estrutural da proteína características (clicando o S ao lado o PDB ID e selecionando 'desenhos animados').
- Clique sobre a sequência de nucleotídeos na parte superior da tela para destacar diferentes partes da molécula, anotando os aminoácidos correspondentes a cada particularidade estrutural.
- Anote as regiões estruturais distintas na sequência do DNA em macaco. Para fazer isso, abra a sequência do DNA da etapa 1.2.3., selecione os nucleotídeos de codificação para os aminoácidos em uma região, botão direito do mouse na seleção e selecione 'Novidade' para dar-lhe um nome e uma cor. Repita o processo para cada região estrutural identificada na etapa anterior.
Nota: A seleção de nucleotídeo pode ser revista clicando ORFs > traduza, em seguida, clicando em Okey, para garantir que eles codificam para a sequência correta de aminoácidos. - Alinhe as sequências de resíduo das duas proteínas empregando uma ferramenta de alinhamento de proteína (por exemplo, Clustal Omega21).
Nota: Desde as quimeras são a ser produzido em um sistema de expressão de mamíferos, essas sequências devem incluir peptídeos de sinal a proteínas.- Obter as sequências de aminoácido completa de proteínas do doador e do receptor em macaco, abrindo-se as sequências de DNA da etapa 1.2.3., selecionando-os e clicando em ORFs > Translate.
- Acessar a página da Web Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) e imput as sequências de aminoácidos das proteínas de dois, em seguida, role para baixo e clique em 'Enviar'. Cada sequência deve ser começou por uma linha de texto com ' > ProteinName' para ser corretamente identificado...
- Recuperar o arquivo de alinhamento clicando na guia 'Alinhamento de Download arquivo' e salve-o. Este arquivo pode ser aberto por qualquer programa de edição de texto.
- Usando o arquivo de alinhamento como referência, anotar as correspondentes regiões estruturais da proteína em sua sequência de DNA do doador (consulte a etapa 1.3.2.).
- Decida quais regiões da proteína para trocar nas proteínas quiméricas e projetar as sequências de nucleotídeos apropriado para as quimeras.
Nota: Na ausência de informações detalhadas sobre a importância funcional das diferentes regiões, sugere-se para selecionar grandes substituições como toda loops ou hélices para avaliar quais deles têm um impacto sobre a função da proteína. Esta primeira experiência exploratória então pode ser seguida por uma segunda rodada de design de proteínas quiméricas, focada em substituições menores nas regiões relevantes.- Crie uma cópia da sequência de DNA anotada da proteína do receptor da etapa 1.3.2. e renomeá-lo como proteínas quiméricas. Abrir a sequência de DNA renomeada em macaco, selecionar e excluir a sequência de nucleotídeos codificação para a região a ser trocadas e substituí-la pela região correspondente na proteína doador (copiada da sequência anotada criada na etapa 1.3.3.) e, em seguida, salvar as alterações.
Nota: Criar uma nova cópia e repita esta etapa para cada diferente Quimera projetada.
- Crie uma cópia da sequência de DNA anotada da proteína do receptor da etapa 1.3.2. e renomeá-lo como proteínas quiméricas. Abrir a sequência de DNA renomeada em macaco, selecionar e excluir a sequência de nucleotídeos codificação para a região a ser trocadas e substituí-la pela região correspondente na proteína doador (copiada da sequência anotada criada na etapa 1.3.3.) e, em seguida, salvar as alterações.
- Divida a sequência da proteína de interesse em distintas regiões estruturais. Idealmente, diferentes domínios da proteína em questão serão têm sido descritos na literatura. Se isso não for o caso, a existência de distintas características estruturais conservadas (hélices, loops) deve ser avaliada em etapas 1.3.1.1. para 1.3.1.4.
2. preparação para clonagem Molecular
- Selecione um vetor do plasmídeo adequado para o sistema de expressão de escolha. Para a expressão dos mamíferos, um vetor de alta expressão como pCAGGS22 ou a série de vetor de pcDNA é recomendada.
- Para a enzima de restrição clonagem baseada demonstrada neste protocolo, certifique-se de que os sites de restrição único presentes no site clonagem múltipla (MCS) do vetor são compatíveis com a proteína de interesse. Para fazer isso, abra a sequência de DNA das construções quiméricoes com macaco, clique em ' enzimas > seletor de enzima ' e verifique se pelo menos dois dos sites restrição em MCS estão ausente na sequência (exibindo um zero ao lado de seu nome).
- Desenha os primers de terminais usando um editor de DNA como macaco.
- Criar um novo arquivo de DNA (arquivo > novo) e iniciar o primer do N-terminal com uma sequência de líder (3-9 extras pares de bases, por exemplo, AAAGGGAAA), seguido pelo primeiro site restrição selecionado no MCS do vetor (6-8 pares de bases, por exemplo, TTAATTAA para PacI), um espaçador de opcional (por exemplo, GCTAGCGCATCGCCACC do vetor de pCAGGS usado no exemplo) e os pares de base inicial de 18-27 do gene de interesse (por exemplo, ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG para OSM).
- Em um novo arquivo de DNA, a sequência da primeira demão do C-terminal começa com a final 18-27 pares de bases do gene de interesse (por exemplo, CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA para um gene com um tag do C-terminal de 6xHistidine), seguidos por um espaçador opcional (por exemplo, TAGCGGCCGC em o vetor de pCAGGS), a segunda restrição site escolhido (por exemplo, GGCGCGCC para ascos) e uma sequência de líder (por exemplo, AAAGGGAAA). Destacar a sequência inteira, botão direito do mouse e selecione 'Reverse-complemento' para obter o primer reverso.
- Desenho de primers para cada uma das regiões fronteiriças nas construções quiméricas.
- Abra a sequência do DNA da Quimera (criada na etapa 1.3.4.1.) e destaque uma região de 30 pares de base na zona onde as sequências originais e inseridas estão em contato, composto por 15 pares de base de cada sequência. A região (botão direito do mouse e selecione 'Copiar') de copiar e colá-lo em um novo arquivo de DNA; Essa sequência será o primer para a frente.
- Faça uma cópia do primer frente gerado na anterior etapa e renomeá-lo como primer reverso. Destacar a sequência da primeira demão, botão direito do mouse e selecione 'Reverse-complemento' para gerar a sequência inversa da primeira demão.
- Repita as etapas 2.3.1. e 2.3.2. para cada zona de contato na sequência de DNA quimérico. Geralmente, dois pares de primers de avanço/retrocesso são necessários para gerar uma quimera, a menos que a substituição ocorre no N-terminal ou regiões C-terminal.
- Encomendar os primers internos e terminais de um provedor de síntese do oligonucleotide.
Notas: Usando altamente purificado cartilhas terminais (por exemplo, HPLC-purificado) pode ter um impacto positivo na taxa de sucesso do protocolo. Demolhado iniciadores internos geralmente fornecem bons resultados. - Obter modelo as sequências de genes do doador e do receptor.
Nota: Empregando plasmídeos contendo os frames de leitura abertos (ORFs) destas sequências como um modelo extremamente facilita o procedimento e é recomendado. Alternativamente, DNA complementar (cDNA) gerado a partir de uma linha de celular conhecida de expressar estes genes pode ser usado como um modelo para as etapas subsequentes.
3. polymerase reação em cadeia (PCR) amplificação dos fragmentos do DNA Individual, formando a Quimera
- Prepare uma mistura de reação de PCR individual para cada um dos fragmentos compondo as proteínas quiméricas. Uma típica proteínas quiméricas exigirá três fragmentos individuais: a parte do N-terminal, a região a ser inserido e a parte C-terminal.
Notas: Use uma alta fidelidade DNA polimerase (por exemplo, Phusion alta fidelidade DNA polimerase) para evitar a introdução de mutações na sequência. A reação de PCR pode ser constituída à noite e correr durante a noite.- Conjunto uma microcentrífuga de 1,5 mL tubo no gelo e pipetar os reagentes diferentes das misturas PCR na ordem mostrada na tabela 1, certifique-se de cartilhas corretas e modelos são empregados para cada reação de PCR (ver quadro 2).
- Rotular a dois tubos PCR de paredes finas-0,2 mL para cada reação e transferir 20 µ l da mistura de PCR correspondente em cada tubo. Transferir os tubos PCR para um thermocycler PCR e iniciar o protocolo detalhado na tabela 3.
Nota: temperatura do recozimento deve ser pelo menos 5 graus inferior à temperatura de fusão dos primers projetados.
- Enquanto a PCR está executando, prepare 100 mL de um gel de agarose 1% em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE). Para este efeito, pesar 1 g de agarose, misture com 100 mL de tampão TAE num balão de vidro e até a agarose é completamente dissolvido, agitando o balão a cada 30-40 segundos no microondas. Permitir o arrefecimento a aproximadamente 50 ° C, adicionar 2-3 µ l de brometo de etídio (ou um equivalente corante de DNA) e despeje em uma bandeja de gel com os pentes bem desejados.
Atenção: brometo de etídio é um conhecido agente mutagénico, garantir o uso adequado de equipamentos de proteção. - Após a reação de PCR é concluída, adicione 4 µ l de tampão de carregamento 6 x DNA em cada tubo. Inserir o gel de agarose 1% em uma unidade de electroforese, cobrir com tampão TAE e carregar cuidadosamente as amostras no gel juntamente com um peso molecular de escada.
Nota: no momento do carregamento, é preferível deixar pistas vazias entre as amostras para facilitar a recuperação do DNA depois. - Funcione o gel em 80-120 V para 20-45 minutos.
Nota: bandas sob 1.000 pares de bases geralmente podem ser electrophoresed em cerca de 20 minutos a 120 V, enquanto bandas maiores exigirão tempos mais longos de execução. - Desligue o aparelho de eletroforese, retire o gel de agarose e visualizar as bandas de DNA amplificadas sob luz UV. Usando uma lâmina de barbear, cortar os fragmentos de DNA individuais do gel e transferi-los para tubos de microcentrífuga 2ml rotulada.
Nota: Minimize o tempo de exposição à luz UV para evitar danos ao DNA. - Use um PCR limpar kit (veja a Tabela de materiais) para purificar os diferentes fragmentos de DNA.
- Adicione 500 µ l de buffer NTI fornecido pelo kit a cada tubo contendo um fragmento de gel. Transferir para um thermomixer a 50-55 ° C e agitando a 1000 rpm, até que o gel é completamente dissolvido em buffer.
- Cada solução de transferência para uma coluna rotulada kit, girar numa microcentrifuga (30-60, 11.000 x g) e descartar o flowthrough. Adicione 700 µ l de tampão de lavagem do kit NT3, centrifugue novamente sob as mesmas configurações e descartar o flowthrough. Centrifugar as colunas novamente por 1-2mins a 11.000 x g para secar a membrana de silicone dentro da coluna.
- Transferi a coluna para um tubo de microcentrífuga rotulado 1,5 mL, pipetar 30 µ l de água livre de nuclease à coluna, deixe repousar durante 1 minuto e centrifugar a 11.000 x g para Eluir o DNA de 30-60.
- Quantificar a quantidade de DNA recuperado por medir a absorvância da amostra em 260 nm e 340 nm num espectrofotómetro (ver Tabela de materiais). A concentração de DNA é calculada subtraindo-se a leitura de 340 nm da figura 260 nm, em seguida, multiplicar o resultado por coeficiente de extinção (50 µ g/mL)23 do DNA.
Notas: Medições adicionais em 230 nm e 280 nm permitir uma avaliação da pureza do DNA: 260/280 e 260/230 rácios acima 1.8 são geralmente considerados como puro para DNA. O protocolo pode ser pausado após esta etapa, armazenando o DNA eluted a 4 ° C (curto prazo) ou a-20 ° C (longo prazo).
4. PCR amplificação para gerar a sequência de DNA quimérico
- Configure-se 50 µ l de uma reação de PCR para fundir os componentes separados da Quimera. Siga as mesmas etapas detalhadas no 3.1, empregando os primers N-terminal e C-terminal, juntamente com 10 ng de cada do DNA fragmentos obtidos no passo 3.7.
Nota: A reação de PCR pode ser definida à noite e correr durante a noite. - Repita as etapas de 3,2 a 3,7 para recuperar e quantificar o fragmento de DNA purificado em 30 µ l de água livre de nuclease. Este fragmento contém a sequência de DNA quimérico, ladeada pelos sites restrição constantes os primers terminais.
5. a inserção do DNA quimérico em um vetor de expressão
- Rótulo de dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e pipeta os reagentes diferentes na ordem indicados na tabela 4, adicionando 1 µ g da expressão selecionada de vetor em um tubo e 1 µ g do fragmento de DNA recuperado no outro. Encube por 1-4 h a 37 ° C, para realizar a digestão com enzimas de restrição as escolhido.
Notas: Certifique-se de ambas as enzimas de restrição são compatíveis com o buffer de empregado. No caso eles exigem amortecedores completamente diferentes, execute estas etapas primeiro com apenas uma das enzimas e repita. O tempo necessário para a digestão pode variar dependendo das enzimas de restrição selecionadas: consulte as instruções do fabricante para obter informações detalhadas. - Repita as etapas de 3,2 a 3,7 para purificar e recuperar o vetor digerido do fragmento e expressão DNA em 30 µ l de água livre de nuclease. Quantificar a quantidade de DNA recuperado como antes.
- Calcule a quantidade de DNA de inserção necessária para uma relação molar de 3:1 inserção/vetor na reação da ligadura, utilizando a seguinte equação.
Inserir (ng) = razão Molar * vetor (ng) * Inserir tamanho (bp) / tamanho do vetor (bp)
Nota: Rácios molar de inserção/vetor diferentes podem ser testados, embora geralmente uma proporção de 3:1 é suficiente para obter resultados adequados. - Configurar a 20 µ l de uma reação de ligadura em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 40 ng da expressão vetor a quantidade de DNA quimérico calculado no passo 5.3, tampão e T4 DNA ligase, seguindo a ordem indicada na tabela 5e incubar durante uma noite a 16 ° C.
Nota: Eficiência de ligadura é geralmente maior, realizando a reação durante a noite a 16 ° C, mas como alternativa a reação pode ser incubada durante 2 h à temperatura ambiente. - Transformação de 5-10 µ l da mistura de ligadura em quimicamente competentes de Escherichia coli (e. coli) preparado seguindo protocolos padrão24 crescem em placas de seleção e escolha colônias única para expansão e plasmídeo de DNA isolamento de acordo com protocolos estabelecidos25.
Nota: A cepa de Escherichia coli XL1-Blue foi empregada para este protocolo, mas outras variantes de e. coli também podem ser usados. - Digerir os plasmídeos isolados de 1 µ g com as enzimas de restrição apropriadas, seguindo as instruções na etapa 5.1 e avaliar a presença de uma banda de DNA de um tamanho correspondente à sequência de quimérico por eletroforese em um gel de agarose (ver etapas 3.2-3.5).
Nota: É recomendável que a sequência inserida é verificada por meio de um serviço de sequenciamento de DNA. - Após verificação de sequência bem sucedida, o plasmídeo pode ser produzido em quantidades maiores e empregado em um sistema de expressão mamíferos pelos seguintes protocolos bem estabelecidos26,27.
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Representative Results
Construção e geração de uma proteína Quimérico (Figura 1) pode ser exemplificados com dois membros da família de citocinas interleucina-6, OSM e LIF, que foram objecto de um estudo recentemente publicado6. A Figura 2 mostra a estrutura tridimensional destas proteínas. Ambas as moléculas adotam a estrutura secundária característica de classe I, citocinas, com quatro hélices (denominados de À D) embalado em um pacote e unidas por laços28. As estruturas de aminoácidos alinhados das proteínas humanas podem ser vistas na Figura 3. Neste exemplo, a região de laço BC de OSM foi trocado pela correspondente sequência LIF para criar uma quimera de OSM-LIF com a sequência de aminoácidos, como mostrado na Figura 3B.
Para este propósito, a sequência de DNA de OSM e LIF foram obtidos e a região de aminoácido codificação correspondente ao lacete BC foi identificada por ambas as citocinas e substituído (Figura 4). Uma marca 6-histidina Adicionalmente foi incorporada no C-terminal para facilitar a purificação da proteína a jusante. Em seguida, foi escolhido um vetor apropriado para a expressão de mamíferos (pCAGGS), e sites de restrição exclusiva dentro de seu sítio de clonagem múltipla foram selecionados (PacI e ascos) depois de se assegurar que eles não estavam presentes na sequência do gene Quimérico (consulte a etapa 2.1.1.).
Primers foram desenhados conforme mostrado no tabela 4. O primer OSM frente N-terminal incluído uma sequência principal de 9 pares de bases, seguido do site de restrição do PacI , um espaçador de plasmídeo específicas e os iniciais 27 pares de base de OSM. O primer reverso do C-terminal incorporado a sequência principal, seguida do site de restrição de ascos , um espaçador e os 27 últimos pares de bases do gene, correspondendo neste caso em particular para a marca de histidina C-terminal. Além disso, as primeiras demão 30 pares de base, abrangendo os pontos de junção do loop BC foram exigidas em orientações para diante e reversos.
A primeira etapa de amplificação do PCR consistia de três reações distintas. O N-terminal OSM fragmento, que exigia BC início reversos primers e OSM N-terminal para a frente, OSM usado como modelo. O loop LIF BC foi obtido por meio de iniciar BC para a frente e BC final reversos primers usando LIF como modelo. O fragmento OSM C-terminal utilizado final do BC para a frente e reversos cartilhas OSM C-terminal, bem como OSM como modelo. Estes três fragmentos, com tamanhos esperados de pares de base 385, 75 e 321 respectivamente, podem ser vistos na Figura 5A após separação em um gel de agarose 1%.
Estas purificado fragmentos foram então usados como um modelo a segunda reação de PCR, juntamente com OSM N-terminal para a frente e C-terminal OSM reverter primeiras demão. O resultado desta amplificação, correspondente a OSM-LIF de sequência do gene laço BC e é mostrada na Figura 5B. Esta etapa foi seguida por purificação, uma digestão de 4 horas do fragmento do gene e escolhido do plasmídeo, electroforese do gel e purificação, ligadura durante a noite a 16 ° C e transformação em Escherichia coli XL1-Blue. Plasmídeos individuais foram isolados e examinados por digestão enzimática de restrição para a adequada inserção do fragmento de DNA (Figura 6). Finalmente, sucessos positivos foram enviados para sequenciamento verificar que a sequência correspondia à Quimera de laço de OSM-LIF BC pretendida antes de proceder a expressão da proteína, purificação e testes em ensaios funcionais6.
Figura 1 : Representação esquemática da geração de proteínas quiméricas. (A) processo de projeto quimérico: após a seleção das regiões a ser trocada, a sequência da Quimera desejada e os primers necessários são construídos por meio de software de edição de DNA. (B) as principais etapas na geração de proteínas quiméricas são retratadas. Duas etapas de amplificação por PCR produzem uma sequência do gene quimérico, que é então digerida com as enzimas de restrição apropriadas e ligada em um vetor de expressão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Similaridades estruturais entre OSM e LIF. Representação das estruturas de cristal de OSM29 (PDB: 1EVS) e LIF30 (PDB: 2Q7N), juntamente com uma representação aproximada da Quimera projetada. Estas citocinas adotam uma conformação helicoidal-4 bundle unida por laços. Esta pesquisa foi originalmente publicada no jornal de química biológica. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, s., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. O laço do AB e D-hélice no sítio de ligação III de humano Oncostatin M (OSM) são necessários para a ativação do receptor OSM. J. Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © os autores6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Comparação de sequências de aminoácidos OSM e LIF. (A) alinhamento de sequências de humanos OSM e LIF, aminoácido completos com a região de laço BC destacada. Asteriscos (*) indicam resíduos totalmente conservados, dois-pontos (:) correspondem aos aminoácidos com propriedades fortemente semelhantes e pontos (.) denotam aqueles com características semelhantes fracamente. (B) sequência de aminoácidos a Quimera de laço OSM BC, com a região de laço BC de OSM, substituído pelo seu equivalente LIF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Sequência de DNA da Quimera de laço OSM BC. Sequência da proteína OSM quimérico. A região inserida de LIF é destacada em laranja. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Fragmentos de amplificação do DNA Quimera OSM BC laço. (A) resultam de amplificação por PCR do primeira, com bandas, correspondente à região N-terminal (pista 2), loop de BC (faixa 3) e a região C-terminal (faixa 4). (B) resultam da segunda amplificação por PCR, em que as três bandas obtidas na primeira ampliação são combinadas para gerar a Quimera OSM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Inserção de Quimera de laço o OSM BC em vetor do plasmídeo. Digestão de enzima de restrição dos Plasmideos gerados, com uma banda inferior presente no ~ 700 pares de bases indicando a inserção correta da sequência do gene de Quimera de OSM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | Concentração das ações | Volume (em 50 µ l) |
| Água estéril | a 50 µ l | |
| Tampão PCR | 10 X | 5 Μ l |
| dNTPs | 10 mM | 1 Μ l |
| DMSO | 100% | 1,5 Μ l |
| Primer para a frente | 10 ΜM | 1 Μ l |
| Primer reverso | 10 ΜM | 1 Μ l |
| Modelo de DNA | Variável | Conforme necessário para 2.5-12,5 ng de DNA de plasmídeo |
| Alta fidelidade Phusion DNA polimerase | 2 unidades / µ l | 0,5 Μ l |
Tabela 1: Reagentes necessários para a mistura de reação de PCR.
| Fragmento N-terminal | Inserção quimérico | Fragmento do C-terminal | |
| Primer para a frente | N-terminal para a frente | Primeiro cruzamento para a frente | Segunda junção para a frente |
| Primer reverso | Primeiro cruzamento reverso | Segunda junção reversa | C-terminal reverso |
| Modelo de DNA | Destinatário | Dador | Destinatário |
Tabela 2: Primer e modelos necessários para a geração de uma padrão proteínas quiméricas.
| Etapa do ciclo | Temperatura | Tempo | Número de ciclos |
| Desnaturação inicial | 98 ° C | 505 | 1 |
| Desnaturação | 98 ° C | 10s | 23-25 |
| Recozimento | 68 ° C * | 051 | 23-25 |
| Extensão | 72 ° C | 30 anos por mil | 23-25 |
| Extensão final | 72 ° C | 300s | 1 |
| Segure | 4 ° C | ∞ | 1 |
| * Pelo menos 5 ° c mais baixa do que a primeira demão a temperatura de fusão | |||
Tabela 3: Protocolo PCR usado para amplificar os fragmentos quiméricoes e a proteína completa quimérico.
| Reagente | Concentração das ações | Volume (em 50 µ l) |
| Água estéril | a 50 µ l | |
| Enzima de restrição Buffer * | 10 X | 5 Μ l |
| Modelo de DNA | Variável | Conforme necessário para 1 µ g de DNA |
| Enzima #1 | Variável | 1 Μ l |
| Enzima #2 | Variável | 1 Μ l |
| * Certifique-se de ambas as enzimas são compatíveis com o buffer selecionado | ||
Tabela 4: Componentes da reação de digestão da enzima de restrição.
| Reagente | Concentração das ações | Volume (em 20 µ l) |
| Água estéril | a 20 µ l | |
| T4 DNA Ligase Buffer | 10 X | 2 Μ l |
| Vector DNA | Variável | Conforme necessário para 40 ng de DNA |
| Inserir DNA | Variável | Conforme necessário para uma relação molar de 3:1 |
| T4 DNA Ligase | Variável | 1-2 Μ l |
Tabela 5: Os reagentes necessários para a reação da ligadura.
| Nome | Sequência da primeira demão |
| N-terminal OSM encaminhar cartilha (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-terminal HisTag reversa primeira demão (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| Início de loop do BC para a frente | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| Loop de BC começar a inversa | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| Final de ciclo do BC para a frente | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| Fim do laço BC inverter | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Tabela 6: Primers usados na geração de Quimera de laço o OSM BC.
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Discussion
A geração de proteínas quiméricas constitui uma técnica versátil, que é capaz de ir além dos limites das proteínas truncadas para abordar questões como a modularidade do receptor de citocina-ligação domínios13. O projeto de quimeras é um passo fundamental neste tipo de estudos e requer cuidadosa consideração. Estudos preliminares para estabelecer domínios funcionais geralmente exigirá a substituição das grandes regiões, numa primeira fase, enquanto menores substituições de comprimentos variáveis são mais adequadas para estudos detalhados de uma única região. Deve prestar atenção especial à presença de pequenos motivos conservados dentro de uma família de proteínas nesta etapa, já que estes muitas vezes são indicativos de sites funcionais31,32. Experiência pessoal indica que mais de uma rodada de design de proteínas quiméricas pode ser necessária para diminuir uma região chave funcional, com cada rodada exigindo significativo tempo (semanas ou meses) desde a concepção inicial para testes de ensaio funcional.
Enquanto existe uma proteína estruturalmente semelhante à proteína de interesse, mas possuindo funções biológicas divergentes, o método é aplicável a qualquer sequência de interesse, embora tem que ser otimizado para cada gene particular devido a sua dependência de PCR amplificação. Particularmente, genes possuindo regiões ricas GC podem provar alvos particularmente desafiadoras, já que estes tipos de sequências são conhecidos por reduzir a eficiência do amplificação33. Esses problemas geralmente podem ser resolvidos por diferentes meios, tais como a adição de aditivos diferentes (por exemplo, betaína) para a reação, o uso de buffers especializada DNA polimerase ou a modificação do recozimento parâmetros34. Portanto, geralmente exigirá algumas tentativas antes de encontram-se as condições adequadas para o gene de interesse.
O protocolo fornecido é baseado no clássicos enzima de restrição com base em métodos de clonagem, que são geralmente acessíveis a todo o tipo de laboratório, mas pode ser ainda mais adaptado para aproveitar-se das mais avançadas técnicas de clonagem. Por exemplo, utilizando-se de passagem de clonagem, que facilita a clonagem a mesma inserção em vários vetores diferentes (por exemplo, se os sistemas diferentes de expressão devem ser testados em paralelo), meramente exigiria sites de recombinação particular attB no lugar os sites de restrição detalhadas no presente protocolo35. Outras metodologias mais recentes de clonagem podem ignorar a necessidade de uma segunda reação de PCR (por exemplo, o usuário36 ou Gibson Assembleia37) e ligadura (por exemplo, a sequência e ligadura independente de clonagem (SLIC)38 ou montagem em fusão 39). exigindo diferentes reagentes e estratégias de design da primeira demão, leitores com acesso a esses métodos são encorajados a aplicá-las para acelerar significativamente a geração de construções quiméricas depois de seguir os princípios de projeto básico detalhada na etapa 1 do presente protocolo.
Em geral, a aplicação deste método pode fornecer informações valiosas sobre os mecanismos pelos quais outras proteínas funções biológicas ocorrem, em particular envolvendo da proteína-proteína ou interações ácidas nucleico da proteína e constituem uma ferramenta útil para identificar e especificar relações estrutura-função exclusiva dentro de uma família de proteínas6.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela sociedade Max Planck e a clínica-Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemanha). Parte desta pesquisa foi publicado originalmente na revista de química biológica. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, s., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. O laço do AB e D-hélice no sítio de ligação III de humano Oncostatin M (OSM) são necessários para a ativação do receptor OSM. J. Biol Chem. 2018; 18:7017-7029. © os autores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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