Summary
Proteínas estructuralmente relacionadas con frecuencia ejercen distintas funciones biológicas. El intercambio de equivalentes regiones de estas proteínas para crear proteínas quiméricas constituye un enfoque innovador para identificar las regiones de la proteína crítica que son responsables de su divergencia funcional.
Abstract
El objetivo de este protocolo comprende el diseño de proteínas quiméricas en la que distintas regiones de una proteína son sustituidas por sus correspondientes secuencias de una proteína estructural similar, con el fin de determinar la importancia funcional de estas regiones. Tales quimeras se generan mediante un protocolo PCR anidado utilizando fragmentos de DNA traslapados y adecuadamente diseñado cartillas, seguidos de su expresión dentro de un sistema mamífero nativo estructura secundaria y modificaciones post-traduccionales.
El papel funcional de una región distinta entonces indica una pérdida de actividad de la quimera en un ensayo de lectura apropiado. En consecuencia, se identifican las regiones albergando un conjunto de aminoácidos esenciales, que pueden ser defendidos por técnicas complementarias (por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida) para aumentar la resolución molecular. Aunque limitada a los casos en que se encuentra una proteína estructuralmente relacionada con diferentes funciones, las proteínas quiméricas han sido empleadas con éxito para identificar las regiones de Unión críticos en proteínas como receptores de citoquinas y citoquinas. Este método está especialmente indicado en casos en que las regiones funcionales de la proteína no están bien definidas y constituye un valioso primer paso en enfoques de evolución dirigida a reducir las regiones de interés y reducir el esfuerzo de investigación involucrado.
Introduction
Varios tipos de proteínas, incluyendo citoquinas y factores de crecimiento, se agrupan en familias cuyos miembros comparten estructuras tridimensionales similares pero a menudo ejercen distintas funciones biológicas1,2. Esta diversidad funcional suele ser la consecuencia de pequeñas diferencias en la composición de aminoácidos dentro de sitios activos3 de la molécula. Identificación de dichos sitios y determinantes funcionales no sólo ofrece valiosa información evolutiva sino también para el diseño de los agonistas e inhibidores más específicos4. Sin embargo, el gran número de diferencias en la composición del residuo encontrado con frecuencia entre proteínas estructuralmente relacionadas complica esta tarea. A pesar de construir grandes bibliotecas que contienen cientos de mutantes hoy en día es factibles, evaluar cada variación de solo residuos y combinaciones de ellos sigue siendo un esfuerzo difícil y desperdiciador de tiempo5.
Técnicas de evaluación de la importancia funcional de las regiones de la proteína grande son así de valor para reducir el número de posibles residuos a un número manejable6. Proteínas truncadas han sido el enfoque más utilizado para abordar este asunto. En consecuencia, las regiones se consideran funcionalmente relevante si la función de la proteína bajo estudio es afectada por la eliminación de una región particular7,8,9. Sin embargo, una limitación importante de este método es que deleciones pueden afectar a la estructura secundaria de la proteína, llevando a mal plegamiento, la agregación y la imposibilidad de estudiar la región prevista. Un buen ejemplo es una versión truncada de la citoquina Oncostatina M (OSM), en el que una canceladura interna más grande de 7 residuos dio lugar a un mutante mal plegado que no podía ser más había estudiado10.
La generación de proteínas quiméricas constituye un enfoque alternativo e innovador que permite el análisis de regiones más grandes de proteína. El objetivo de este método es para el intercambio de regiones de interés en una proteína por secuencias estructuralmente relacionadas de otra proteína, con el fin de evaluar la contribución de las secciones sustituyó a funciones biológicas específicas. Ampliamente utilizado en el campo de la señalización de receptores para identificar dominios funcionales11,12, proteínas quiméricas son particularmente útiles para el estudio de familias de proteínas con poca identidad del aminoácido pero conservada estructura secundaria. Apropiado pueden encontrarse ejemplos en la clase de interleucina 6 (IL-6) tipo citoquinas, tales como interleukin-6 y ciliary neurotrophic factor (identidad de secuencia de 6%)13 o leucemia factor inhibitorio (LIF) y OSM (20% identidad)6, en la que el siguiendo el protocolo se basa.
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Protocol
1. diseño de proteínas quimérico
- Seleccione una proteína adecuada (donante) para el intercambio de regiones con la proteína de interés (destinatario) la proteína del donante debe ser estructuralmente similar, idealmente pertenecientes a la misma familia de proteínas, pero falta la actividad biológica para ser utilizado como lectura. Si no se conocen proteínas estructuralmente relacionadas, candidatos potenciales pueden ser identificados mediante una herramienta automatizada como la herramienta de búsqueda de alineación de Vector (VAST)14,15
- Acceder a la web Europea de banco de datos de la proteína (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introducir el nombre de la proteína de interés en el cuadro de búsqueda en la esquina superior derecha y haga clic en 'Buscar'. Siempre que hay una estructura cristalina, no por el identificador PDB (PDB ID; por ejemplo, 1evs de OSM).
Nota: Si no hay datos estructurales en el PDB, un modelo de la homología de la proteína puede generar una herramienta como Suiza-modelo17 en cambio, usando protocolos disponibles paso a paso18. - Acceder a la extensa página web (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). En el caso de un PDB ID está disponible, desplácese hacia abajo hasta la sección 'Recuperar resultados previamente computados' imput el PDB ID en la casilla de 'Mostrar las estructuras similares para' y haga clic en 'Go'. En la siguiente pantalla, haga clic en 'Original gran' y luego 'Cadena' para ver una lista de identificadores de PDB para potenciales candidatos estructuralmente similares.
- Si un identificador PDB no está disponible, pero se generó un modelo de la homología, desplácese hacia abajo hasta la sección 'Búsqueda de una nueva estructura' y haga clic en el enlace 'Buscar gran'. Subir el archivo PDB del modelo haciendo clic en 'Examinar' junto a 'Archivo de PDB presentar', seleccionando el archivo y haga clic en 'Enviar'.
- Después el PDB archivo cargado, haga clic en el botón 'Start' para iniciar el gran cálculo. Una vez realizado el cálculo, haga clic en 'Cadena' bajo dominios para ver los identificadores de PDB de proteínas estructuralmente similares.
- Evaluar las funciones biológicas de interés (por ejemplo, la activación del receptor, actividad enzimática, actividad de factor de transcripción) de los principales candidatos, ya sea experimentalmente en el sistema de lectura de elección o a través de una búsqueda de literatura. Seleccione una proteína de donantes con función divergente con respecto a la proteína de interés.
- Acceder a la web Europea de banco de datos de la proteína (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introducir el nombre de la proteína de interés en el cuadro de búsqueda en la esquina superior derecha y haga clic en 'Buscar'. Siempre que hay una estructura cristalina, no por el identificador PDB (PDB ID; por ejemplo, 1evs de OSM).
- Obtener las secuencias de aminoácidos de proteínas de las proteínas de receptor y donante de la base de datos de secuencia de referencia (RefSeq)19 .
- La sección del gene en la Página Web de RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), escriba el nombre de la proteína de interés en el cuadro Buscar y haga clic en 'Buscar'. Haga clic en el nombre del gene de la especie deseada en la lista resultante.
- Desplácese hacia abajo hasta la sección RefSeq ver isoformas todo documentado. Haga clic en el identificador de secuencia para el isoform de interés (a partir de NM), desplácese hacia abajo y haga clic en 'CDs' para resaltar la región codificante de la proteína del gene. En la parte inferior derecha de la pantalla, haga clic en 'FASTA' y copia la secuencia del gene.
- Guardar la secuencia de ADN utilizando un software de edición de ADN adecuado. Cuando se utiliza el mono libremente disponible20, abrir el programa, pegar la secuencia de copiado en el cuadro en blanco, seleccione el nombre de secuencia y haga clic en 'Guardar'.
Nota: Repita los pasos 1.2.1. a 1.2.3. para el uno o más donantes proteínas seleccionadas.
- Elija las regiones de la proteína a ser sustituido en las diferentes construcciones quiméricas.
- Dividir la secuencia de la proteína de interés en distintas regiones estructurales. Idealmente, diferentes dominios de la proteína en cuestión habrá sido descritos en la literatura. Si este no es el caso, debe evaluarse la existencia de distintas características estructurales conservadas (espirales, bucles) en pasos 1.3.1.1. a 1.3.1.4.
- Descargar los datos estructurales de la proteína de interés desde la web PDB (vea el paso 1.1.1.). Acceder a la página PDB para la proteína y descargar el archivo PDB haciendo clic en 'descargar' en el lado derecho de la pantalla.
- Abra el archivo PDB en un sistema de visualización molecular como PyMOL (https://pymol.org/). En PyMOL, Mostrar la secuencia de nucleótidos (haciendo clic en Mostrar > en la secuencia), ocultar los datos estructurales de predeterminado (clic en H junto a la identificación de PDB y seleccionando 'todo') y seleccione la vista de 'dibujos animados' visualizar claramente estructural de la proteína características (clic en la S junto a la identificación de PDB y seleccionando 'dibujos animados').
- Haga clic en la secuencia de nucleótidos en la parte superior de la pantalla para resaltar diferentes partes de la molécula, anotando los aminoácidos correspondientes a cada característica estructural distintiva.
- Anotar las distintas regiones estructurales en la secuencia de ADN en mono. Para ello, abra la secuencia de ADN de paso 1.2.3., seleccione los nucleótidos codifican para los aminoácidos en una región, haga clic derecho sobre la selección y elija 'Novedad' para darle un nombre y un color. Repita el proceso para cada región estructural identificado en el paso anterior.
Nota: La selección del nucleótido puede ser verificados por duplicado pinchando ORFs > traducir, luego hacer clic en aceptar, para que el código para la secuencia del aminoácido correcto. - Alinear las secuencias de residuos de las dos proteínas empleando una herramienta de alineación de la proteína (e.g. Clustal Omega21).
Nota: Puesto que las quimeras que se producirá en un sistema de expresión mamífero, estas secuencias deben incluir péptidos de señal de las proteínas.- Obtener las secuencias de aminoácido completo de donante y receptor proteínas en mono, con la apertura de las secuencias de ADN de paso 1.2.3., seleccionándolos y haciendo clic en ORFs > traducir.
- Acceder a la Página Web de Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) y llave de entrada las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas, a continuación, desplácese hacia abajo y haga clic en 'Enviar'. Cada secuencia debe fortificar por una línea de texto con ' > ProteinName' a identificarse correctamente...
- Recuperar el archivo de alineación haciendo clic en la pestaña 'Descargar archivo de alineación' y guárdelo. Este archivo puede ser abierto por cualquier programa de edición de texto.
- Utilizando el archivo de alineación como una referencia, anotar las correspondientes regiones estructurales de la proteína del donante en su secuencia de ADN (ver paso 1.3.2.).
- Decidir qué regiones de la proteína de intercambio en las proteínas quiméricas y diseñar las secuencias de nucleótido apropiado para las quimeras.
Nota: En ausencia de información detallada con respecto a la importancia funcional de las diferentes regiones, se sugiere para seleccionar grandes sustituciones como todas bucles o espirales para evaluar cuál de ellas tienen un impacto en función de la proteína. Este primer experimento exploratorio luego seguida de una segunda ronda de diseño de la proteína quimérica, que se centró en sustituciones más pequeñas dentro de las regiones relevantes.- Crear una copia de la secuencia de ADN anotada de la proteína del receptor del paso 1.3.2. y como una proteína quimérica. Abra la secuencia de ADN retitulada en mono, seleccionar y eliminar la codificación de secuencia de nucleótidos de la región a intercambiar y sustituirlo por la región correspondiente en la proteína del donante (copiada de la secuencia anotada creada en el punto 1.3.3.), luego guardar los cambios.
Nota: Crear una copia nueva y repita este paso para cada diferente quimera diseñado.
- Crear una copia de la secuencia de ADN anotada de la proteína del receptor del paso 1.3.2. y como una proteína quimérica. Abra la secuencia de ADN retitulada en mono, seleccionar y eliminar la codificación de secuencia de nucleótidos de la región a intercambiar y sustituirlo por la región correspondiente en la proteína del donante (copiada de la secuencia anotada creada en el punto 1.3.3.), luego guardar los cambios.
- Dividir la secuencia de la proteína de interés en distintas regiones estructurales. Idealmente, diferentes dominios de la proteína en cuestión habrá sido descritos en la literatura. Si este no es el caso, debe evaluarse la existencia de distintas características estructurales conservadas (espirales, bucles) en pasos 1.3.1.1. a 1.3.1.4.
2. preparación para la clonación Molecular
- Seleccionar un vector plásmido adecuado para el sistema de expresión de la opción. Para la expresión mamífero, se recomienda un vector de expresión de alta como pCAGGS22 o la serie de vectores pcDNA.
- Para la enzima de la restricción clonación basada en este protocolo, garantizar que los sitios de restricción únicos presentes en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector son compatibles con la proteína de interés. Para ello, abra la secuencia de ADN de las construcciones quiméricas con mono, haga clic en ' enzimas > selector de enzima ' y comprobar que al menos dos de los sitios de restricción en los MCS están ausente en la secuencia (mostrando un cero al lado de su nombre).
- Diseño de los cebadores terminal usando un editor de ADN como mono.
- Crear un nuevo archivo de ADN (archivo > nuevo) e iniciar el primer N-terminal con una secuencia líder (3-9 extras pares de bases, por ejemplo, AAAGGGAAA), seguido por el primer sitio de restricción seleccionado en MCS del vector (6-8 pares de bases, por ejemplo, TTAATTAA para PacI), un espaciador opcional (por ejemplo GCTAGCGCATCGCCACC en el vector de pCAGGS utilizado en el ejemplo) y los inicial 18-27 pares de bases del gen de interés (e.g. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG de OSM).
- En un nuevo archivo de ADN, la secuencia de primer terminal C comienza con el final de 18-27 pares de bases del gen de interés (e.g. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA para un gen con una etiqueta de C-terminal de 6xHistidine), seguidos por un espaciador opcional (por ejemplo, TAGCGGCCGC en el vector de pCAGGS), la segunda restricción del sitio escogido (por ejemplo GGCGCGCC ASCI) y una secuencia de líder (p. ej. AAAGGGAAA). Destacar toda la secuencia, haga clic derecho y seleccionar 'Reverse-complemento' para obtener la cartilla reversa.
- Diseño de cebadores para cada una de las regiones de frontera en las construcciones quiméricas.
- Abra la secuencia de ADN de la quimera (creada en el paso 1.3.4.1.) y resaltar una región de 30 pares en la zona donde las secuencias insertadas y originales están en contacto, que comprende 15 pares de bases de cada secuencia. Copia la región (clic derecho y seleccione 'Copiar') y pégalo en un nuevo archivo de ADN; Esta secuencia será el primer avance.
- Hacer una copia de la cartilla avance generada en el anterior paso y renombrarlo como cartilla reversa. Resalte la secuencia de la cartilla, haga clic derecho y seleccionar 'Reverse-complemento' para generar la secuencia de cebador reverso.
- Repita los pasos 2.3.1. y 2.3.2. para cada zona de contacto en la secuencia de ADN quimérica. Por lo general, dos juegos de cartillas de avance/retroceso deben generar una quimera, a menos que la sustitución se produce en la N-terminal o c-terminal regiones.
- Ordenar los cebadores internos y terminales de un proveedor de síntesis de oligonucleótidos.
Notas: Uso altamente purificada cartillas terminal (por ejemplo, purificadas por HPLC) puede tener un impacto positivo en la tasa de éxito del protocolo. Iniciadores internos desaladas generalmente proporcionan buenos resultados. - Obtención de secuencias de la plantilla de los genes del donante y del receptor.
Nota: Empleando plásmidos que contienen los marcos de lectura abierta (ORFs) de estas secuencias como una plantilla considerablemente facilita el procedimiento y se recomienda. Alternativamente, DNA complementaria (cDNA) generado a partir de una línea celular conocida para expresar estos genes puede utilizarse como una plantilla para realizar los siguientes pasos.
3. polimerasa reacción en cadena (PCR) amplificación de los fragmentos de ADN individuales formando la quimera
- Preparar una mezcla de reacción PCR individual para cada uno de los fragmentos que componen la proteína quimérica. Una proteína quimérica típico requerirá tres fragmentos individuales: la parte N-terminal y la región a insertarse la parte C-terminal.
Notas: Utilice una polimerasa de la DNA (por ejemplo polimerasa de la DNA de Phusion alta fidelidad) de alta fidelidad para evitar la introducción de mutaciones en la secuencia. La reacción de PCR se puede configurar en la noche y correr durante la noche.- Conjunto una microcentrífuga de 1.5 mL tubo con hielo y pipetear los reactivos diferentes de las mezclas PCR en el orden indicado en la tabla 1, asegurar correcta cartillas y se utilizan plantillas para cada reacción de PCR (ver cuadro 2).
- Etiqueta dos tubos PCR de 0,2 mL de pared delgada para cada reacción y transferencia 20 μl de la mezcla correspondiente de PCR en cada tubo. Transferir los tubos PCR en un termociclador PCR e iniciar el protocolo detallado en la tabla 3.
Nota: temperatura de recocido debe ser por lo menos 5 grados más bajo que la temperatura de fusión de los cebadores diseñados.
- Mientras que la PCR está en ejecución, preparar 100 mL de un gel de agarosa al 1% en tampón acetato-Tris-EDTA (TAE). Para ello, pesar 1 g de agarosa, mezclar con 100 mL de buffer TAE en un frasco de vidrio y microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente, girando el frasco cada 30-40 segundos. Permitir una refrigeración a aproximadamente 50 ° C, agregar 2-3 μl de bromuro de etidio (o un tinte de ADN equivalente) y vierta en una bandeja de gel con los peines bien deseados.
PRECAUCIÓN: bromuro de etidio es un mutágeno conocido, asegúrese de que el uso de equipo de protección adecuado. - Una vez finalizada la reacción de PCR, añadir 4 μL de buffer de carga 6 x ADN en cada tubo. Inserte el gel de agarosa al 1% en una unidad de electroforesis, cubrir con el almacenador intermediario TAE y cuidadosamente cargar las muestras en el gel junto con una escalera de peso molecular.
Nota: en el momento de la carga, es preferible dejar carriles vacíos entre las muestras para facilitar la recuperación de ADN luego. - Correr el gel a 80-120 V durante 20-45 minutos.
Nota: bandas bajo 1.000 pares de bases generalmente ser electrophoresed en alrededor de 20 minutos a 120 V, mientras bandas más grandes requieren tiempos más largos. - Apagar el aparato de electroforesis, sacar el gel de agarosa y visualizar las bandas amplificadas de ADN bajo luz UV. Usando una cuchilla de afeitar, cortar los fragmentos de ADN individuales del gel y transferirlas a tubos de microcentrífuga de etiquetado 2 mL.
Nota: Reducir al mínimo el tiempo de exposición a los rayos UV para evitar daños en el ADN. - Utilice un limpiar el PCR kit (véase Tabla de materiales) para purificar los diferentes fragmentos de ADN.
- Añadir 500 μl del buffer NTI proporcionado por el kit a cada tubo que contiene un fragmento de gel. Transferir a un Termomezcladores a 50-55 ° C y agitación a 1000 rpm hasta que el gel se disuelve completamente en el búfer.
- Cada solución de transferencia a una columna de etiquetado kit, girar en una microcentrífuga (30-60, 11.000 x g) y deseche el flujo. Añadir 700 μl de tampón de lavado del kit NT3, centrifugar nuevamente bajo la misma configuración y desechar el flujo. Centrifugue las columnas nuevamente por 1-2 minutos a 11.000 x g para secar la membrana de silicona dentro de la columna.
- Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado, pipeta 30 μl de agua libre de nucleasas en la columna, dejar reposar durante 1 minuto y centrifugar 30-60s a 11.000 x g a fin de eluir el ADN.
- Cuantificar la cantidad de ADN recuperado mediante la medición de la absorbancia de la muestra a 260 nm y 340 nm en un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales). La concentración de ADN se calcula restando la lectura 340 nm la figura nm 260, luego multiplicando el resultado por extinción coeficiente (50 μg/mL)23 de ADN.
Notas: Mediciones adicionales a 230 nm y 280 nm permite para la evaluación de la pureza de la DNA: 260/280 y 260/230 ratios por encima de 1.8 se miran generalmente como puro ADN. El protocolo puede hacer una pausa después de este paso, almacenar el ADN eluído a 4 ° C (corto plazo) o -20 ° C (largo plazo).
4. PCR amplificación para generar la secuencia de ADN quimérico
- Establecer 50 μl de reacción de PCR a los componentes separados de la quimera. Siga los mismos pasos detallados en el punto 3.1, empleando los cebadores N-terminal y c-terminal junto con 10 ng de cada uno de lo ADN de fragmentos obtenidos en paso 3.7.
Nota: La reacción de PCR se puede establecer en la noche y correr durante la noche. - Repita los pasos del 3.2 a 3.7 para recuperar y cuantificar el fragmento de DNA purificado en 30 μl de agua libre de nucleasa. Este fragmento contiene la secuencia de ADN quimérica, flanqueada por los sitios de restricción en los iniciadores de la terminal.
5. inserción de la DNA quimérica en un Vector de expresión
- Etiqueta dos tubos del microfuge de 1,5 mL y pipetear los reactivos diferentes en el orden indicados en la tabla 4, añadiendo 1 μg de la expresión seleccionada vector en un tubo y 1 μg del fragmento de ADN recuperado en el otro. Incubar durante 1-4 h a 37 ° C para realizar la digestión con las enzimas de restricción solicitadas.
Notas: Asegúrese de que ambas enzimas de restricción son compatibles con el tampón empleado. En caso de necesitan completamente diferentes buffers, realice estos pasos primero con una sola de las enzimas y repita. El tiempo necesario para la digestión puede variar dependiendo de las enzimas de restricción seleccionadas: Consulte las instrucciones del fabricante para obtener información detallada. - Repita los pasos 3.2 a 3.7 para purificar y recuperar la digerida ADN fragmento y expresión el vector en 30 μl de agua libre de nucleasa. Cuantificar la cantidad de ADN recuperado como antes.
- Calcular la cantidad de ADN de insertar para una relación molar 3:1 inserto vector en la reacción de la ligadura, utilizando la siguiente ecuación.
Insertar (ng) = fracción Molar * Vector (ng) * Insertar tamaño (bp) / tamaño de Vector (bp)
Nota: Relaciones molares diferentes inserto vector pueden probarse, aunque generalmente una proporción de 3:1 es suficiente para obtener resultados adecuados. - Establecer 20 μl de una reacción de la ligadura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 40 ng de la expresión vector la cantidad de ADN quimérico calculado en el paso 5.3, buffer y T4 ADN ligasa siguiendo el orden indicado en la tabla 5e incubar toda la noche a 16 ° C.
Nota: Ligadura eficiencia generalmente se incrementa mediante la realización de la reacción durante la noche a 16 ° C, pero también la reacción puede ser incubada durante 2 h a temperatura ambiente. - Transformación de 5-10 μl de la mezcla de ligadura en químicamente competentes de Escherichia coli (e. coli) preparado siguiendo protocolos estándar24 crece en placas de selección y escoja colonias solo para expansión y plásmido ADN aislamiento según protocolos establecidos25.
Nota: Para este protocolo se empleó la cepa de e. coli XL1-Blue, pero también pueden utilizarse otras variantes de e. coli . - 1 μg plásmidos aislada con las enzimas de restricción apropiadas siguiendo las instrucciones en el paso 5.1 y evaluar la presencia de una banda de ADN de un tamaño correspondiente a la secuencia quimérica por electroforesis en un gel de agarosa (ver pasos 3.2-3.5).
Nota: Se recomienda que la secuencia insertada es verificada por medio de un servicio de secuenciación de ADN. - Previa verificación de la secuencia exitosa, la plásmidos pueden ser producida en grandes cantidades y empleada en un sistema de expresión mamífero por siguientes protocolos bien establecidos26,27.
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Representative Results
Construcción y la generación de una proteína quimérica (figura 1) se ejemplifica con dos miembros de la familia del cytokine interleukin-6, OSM y LIF, que fueron objeto de un estudio publicado recientemente6. La figura 2 muestra la estructura tridimensional de estas proteínas. Ambas moléculas adoptan la estructura secundaria característica de clase que citoquinas, con cuatro hélices (llamados A D) embalado en un paquete y Unidos por lazos28. Las estructuras alineadas del aminoácido de las proteínas humanas pueden verse en la figura 3A. En este ejemplo la región del loop de BC de OSM fue intercambiado por la secuencia correspondiente de la LIF para crear una quimera de la OSM-LIF con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la figura 3B.
Para este propósito, la secuencia de ADN de OSM y LIF se obtuvieron y la codificación región del aminoácido correspondiente al lazo de BC se identificó para ambas citoquinas y sustituido (figura 4). Además se incorporó una etiqueta histidina 6 en la terminal C para facilitar la purificación de proteínas aguas abajo. A continuación, fue elegido un vector adecuado para la expresión mamífera (pCAGGS) y sitios de restricción únicos dentro de su sitio de clonación múltiple fueron seleccionados (PacI y AscI) después de asegurarse de que no estaban presentes en la secuencia del gene quimérico (vea el paso 2.1.1.).
Primers fueron diseñados como se indica en cuadro 4. El primer N-terminal de la OSM adelante incluyeron una secuencia líder de 9 pares de bases, seguidos por el sitio de la restricción de PacI , un espaciador de plásmidos específicos y los pares de bases 27 iniciales de OSM. El primer revés C-terminal incorporado la secuencia líder, seguida por el sitio de la restricción de AscI , un espaciador y los 27 últimos pares de bases del gen, que en este caso particular corresponde a la etiqueta de histidina c-terminal. Además, cartillas de par 30-base que abarca los puntos de unión del lazo BC fueron requeridos en orientaciones de avance y retroceso.
El primer paso de amplificación de PCR consistió en tres reacciones separadas. El N-terminal OSM fragmento, que OSM N-terminal hacia delante y BC Inicio cartillas inversas, OSM utilizado como plantilla. El bucle LIF BC se obtuvo mediante BC Inicio adelante y cartillas inversas del final de BC con LIF como plantilla. El fragmento terminal C OSM había utilizado BC end adelante y cartillas inversas C-terminal OSM, así como OSM como plantilla. Estos tres fragmentos con tamaños esperados de 385 y 321 y 75 pares de bases respectivamente, pueden verse en la figura 5A después de la separación en un gel de agarosa al 1%.
Estos purificada fragmentos fueron utilizados como una plantilla en la segunda reacción de PCR, junto con OSM N-terminal hacia delante y la terminal C OSM inversa cartillas. El resultado de esta amplificación, correspondiente a la OSM-LIF secuencia de genética de lazo BC y se muestra en la figura 5B. Este paso fue seguido por la purificación, una digestión de 4 horas del fragmento de gen y el plásmido solicitada, electroforesis en gel y purificación, la ligadura durante la noche a 16 ° C y transformación en e. coli XL1-Blue. Los plásmidos fueron aislados y defendidos por la digestión de la enzima de la restricción para la adecuada inserción del fragmento de ADN (figura 6). Finalmente, hits positivos fueron enviados para que la secuencia verificar que la secuencia correspondió a la quimera de bucle de OSM-LIF BC prevista antes de proceder a la expresión de proteína, depuración y pruebas en ensayos funcionales6.
Figura 1 : Representación esquemática de la generación de proteína quimérica. (A) proceso de diseño quimérica: después de la selección de las regiones para cambiarse, la secuencia de la quimera deseada y los cebadores necesarios se construyen mediante ADN software de edición. (B) se representan los pasos clave en la generación de proteínas quiméricas. Dos pasos de amplificación de PCR producen una secuencia del gen quimérico, que es digerida con las enzimas de restricción apropiadas y ligarse en un vector de expresión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Similitudes estructurales entre OSM y LIF. Representación de las estructuras cristalinas de OSM29 (PDB: 1EVS) y30 de la LIF (PDB: 2Q7N), junto con una representación aproximada de la quimera diseñada. Estas citoquinas adoptan una conformación helicoidal de cuatro paquete unida por los lazos. Esta investigación se publicó originalmente en el Journal of Biological Chemistry. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. El lazo del AB y D-hélice en sitio obligatorio III de humano Oncostatina M (OSM) se requieren para la activación del receptor OSM. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © los autores6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Comparación de secuencias de aminoácidos OSM y LIF. (A) alineación de las secuencias de aminoácidos completos de OSM y LIF, con la región del loop de BC destacados. Los asteriscos (*) indican residuos totalmente conservados, dos puntos (:) corresponden a los aminoácidos con propiedades muy similares y puntos (.) denotan aquellos con características similares débil. (B) secuencia de aminoácidos de la quimera de bucle OSM BC, con la región del loop de BC de OSM sustituida por su equivalente LIF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Secuencia de la DNA de la quimera de bucle OSM BC. Secuencia de la proteína quimérica de OSM. La región desde LIF se resalta en naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Fragmentos de amplificación de la DNA de quimera OSM BC lazo. (A) resultado de la primera amplificación de PCR, con bandas correspondientes a la región N-terminal (carril 2), bucle de BC (carril 3) y la región c-terminal (carril 4). (B) el resultado de la segunda amplificación por PCR, en el que las tres bandas en la primera amplificación se combinan para generar la quimera de la OSM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Inserción de la quimera OSM BC lazo en vector plásmido. Digestión de la enzima de la restricción de la plásmidos generada, con una banda inferior en ~ 700 pares de bases que indica la correcta inserción de la secuencia del gen OSM quimera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | Concentración stock | Volumen (50 μL) |
| Agua estéril | a 50 μl | |
| Tampón PCR | 10 X | 5 ΜL |
| dNTPs | 10 mM | 1 ΜL |
| DMSO | 100% | 1.5 ΜL |
| Primer avance | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Primer revés | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Plantilla de ADN | Variable | Como sea necesario para 2.5-12.5 ng de ADN plásmido |
| Polimerasa de la DNA de Phusion alta fidelidad | 2 unidades/μl | 0.5 ΜL |
Tabla 1: Reactivos necesarios para la mezcla de reacción de PCR.
| Fragmento N-terminal | Inserción quimérica | Fragmento C terminal | |
| Primer avance | Avance del N-terminal | Primer cruce hacia adelante | Segundo cruce hacia adelante |
| Primer revés | Primera intersección inversa | Segundo cruce inverso | C-terminal inversa |
| Plantilla de ADN | Destinatario | Donantes | Destinatario |
Tabla 2: Cartilla y plantillas necesarias para la generación de una proteína quimérica estándar.
| Paso de ciclo | Temperatura | hora | Número de ciclos de |
| Desnaturalización inicial | 98 º C | 101 | 1 |
| Desnaturalización | 98 º C | 301 | 23-25 |
| De recocido | 68 º C * | de 25 años | 23-25 |
| Extensión | 72 º C | 30s por kilobase | 23-25 |
| Extensión final | 72 º C | 300S | 1 |
| Mantenga | 4 º C | ∞ | 1 |
| * Al menos 5 º c más baja que la temperatura de fusión de la cartilla | |||
Tabla 3: Protocolo PCR utilizado para amplificar los fragmentos quiméricos y la proteína quimérica completo.
| Reactivo de | Concentración stock | Volumen (50 μL) |
| Agua estéril | a 50 μl | |
| Buffer de enzima de restricción * | 10 X | 5 ΜL |
| Plantilla de ADN | Variable | Como sea necesario para 1 μg de ADN |
| Enzima #1 | Variable | 1 ΜL |
| Enzima #2 | Variable | 1 ΜL |
| * Asegurarse de que ambas enzimas son compatibles con el búfer seleccionado | ||
Tabla 4: Componentes de la reacción de digestión de la enzima de la restricción.
| Reactivo de | Concentración stock | Volumen (en μL 20) |
| Agua estéril | a 20 μl | |
| T4 Buffer ADN ligasa | 10 X | 2 ΜL |
| Vector de ADN | Variable | Como sea necesario para 40 ng de ADN |
| Insertar ADN | Variable | Como sea necesario para una relación molar 3:1 |
| T4 ADN ligasa | Variable | 1-2 ΜL |
Tabla 5: Reactivos necesarios para la reacción de ligadura.
| Nombre | Secuencia de primer |
| Primer avance de OSM de N-terminal (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-terminal HisTag inversa primer (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| Inicio de bucle de BC hacia adelante | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| Lazo de BC Inicio atrás | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| Final de BC lazo hacia adelante | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| Final de lazo BC inversa | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Tabla 6: Iniciadores utilizan en la generación de la quimera de bucle OSM BC.
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Discussion
La generación de proteínas quiméricas constituye una técnica versátil, que puede ir más allá de los límites de proteínas truncadas a abordar cuestiones tales como la modularidad del receptor del cytokine enlace dominios13. El diseño de quimeras es un paso clave en este tipo de estudios y requiere una cuidadosa consideración. Estudios preliminares para establecer dominios funcionales generalmente requiere sustitución de amplias regiones en una primera fase, mientras que los reemplazos más pequeños de longitud variable son más adecuados para estudios detallados de una sola región. Debe prestarse especial atención a la presencia de pequeños motivos conservados dentro de una familia de proteínas en este paso, ya que a menudo son indicativas de sitios funcionales31,32. Experiencia personal indica que más de una ronda de diseño de la proteína quimérica puede ser necesaria para reducir una región funcional clave, con cada uno redondo que requieren gran tiempo (semanas a meses) desde el diseño inicial a las pruebas de análisis funcional.
Como existe una proteína estructural similar a la proteína de interés, pero que poseen funciones biológicas divergentes, el método es aplicable a cualquier secuencia de interés, aunque tiene que ser optimizado para cada gen en particular debido a su dependencia de PCR amplificación. Particularmente, genes poseen regiones ricas en GC pueden resultar particularmente desafiantes objetivos, ya que este tipo de secuencias es conocido por reducir la eficacia de la amplificación33. Estas cuestiones pueden resolverse generalmente por diferentes medios, tales como la incorporación de diferentes aditivos (por ejemplo betaína) a la reacción, el uso de buffers especializado polimerasa de la DNA o la modificación de los parámetros recocido34. Por lo tanto, generalmente requerirá algún ensayo y error antes de que se encuentran condiciones adecuadas para el gen de interés.
El protocolo siempre se basa en basada en la enzima de la restricción clonación métodos clásicos, que son generalmente accesibles a todo tipo de laboratorio, pero puede ser aún más adaptado para aprovechar las ventajas de la más avanzadas técnicas de clonación. Por ejemplo mediante clonación de gateway, que facilita el mismo inserto en varios vectores diferentes (por ejemplo, si son sistemas de expresión diferentes en paralelo), la clonación sólo requeriría sitios de recombinación particular attB en lugar de los sitios de restricción en este protocolo35. Otras metodologías más recientes de clonación pueden pasar por alto la necesidad de una segunda reacción de PCR (por ejemplo usuario36 o Gibson Asamblea37) y la ligadura (por ejemplo, secuencia y ligadura-independiente clonación (SLIC)38 o Asamblea en fusión 39). mientras que requieren reactivos diferentes y estrategias de diseño de la cartilla, los lectores con acceso a estos métodos se les animados a aplicarlos para acelerar significativamente la generación de construcciones quiméricas después de seguir los principios básicos del diseño detallada en el paso 1 del presente Protocolo.
En general, la aplicación de este método puede proporcionar información valiosa sobre los mecanismos que otras proteínas funciones biológicas tienen lugar, que en particular involucran interacciones ácidas nucleicos proteínas, o proteínas y constituyen una herramienta útil para identificar y especificar las relaciones estructura-función única dentro de una familia de proteínas6.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la sociedad Max Planck y la clínica Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemania). Parte de esta investigación fue publicado originalmente en el Journal of Biological Chemistry. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. El lazo del AB y D-hélice en sitio obligatorio III de humano Oncostatina M (OSM) se requieren para la activación del receptor OSM. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © los autores.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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