Summary
構造的に関連蛋白質はよく明確な生物学的機能を発揮します。キメラ蛋白質を作成するためにこれらの蛋白質の相当領域の交換は、彼らの機能の相違に責任がある重大な蛋白質の領域を識別するために革新的なアプローチを構成します。
Abstract
このプロトコルの目標には、タンパク質の異なる領域がこれらの領域の機能の重要度を決定するために構造が似ているタンパク質に対応するシーケンスに置き換えられてキメラ蛋白質の設計が含まれます。このようなキメラが重なり合う DNA のフラグメントを使用して入れ子になった PCR のプロトコルによって生成され、十分なネイティブの二次構造と翻訳後修飾ように哺乳類システム内でその式の前のプライマーを設計しました。
異なる領域の機能的な役割は、適切な読み出しアッセイにおけるキメラの活動の損失によって示されます。その結果、一連の重要なアミノ酸をかくまっている地域が特定される、相補的な技術 (例えばサイト指示された突然変異誘発) 分子の解像度を上げることができますさらに上映されました。異なる関数と構造的に関連蛋白質を見つけることができる場合に限られていますが、キメラ蛋白質を正常にサイトカインとサイトカイン受容体などの蛋白質の重要なバインド領域を識別するために採用されています。このメソッドは、タンパク質の機能領域が、完全に定義されない場合に特に適している、関心領域を絞り込むスクリーニング労力を削減し進化のアプローチの貴重な最初のステップを構成します。
Introduction
サイトカインや成長因子などのタンパク質のいくつかの種類は、家族メンバーが似たような三次元構造を共有ではしばしば明確な生物学的機能1,2でグループ化されます。この機能の多様性は、通常分子の活性部位3内のアミノ酸組成のわずかな違いの結果です。このようなサイトおよび機能の決定要因の同定のみを提供しない貴重な進化への洞察もアゴニスト阻害剤の詳細4を設計します。ただし、構造的に関連蛋白質の間に頻繁に見られる残基組成の相違の多数は、このタスクを複雑にします。何百もの突然変異体は可能、1 つの残基のすべての変化を評価する今日を含む大規模なライブラリを構築するにもかかわらず、それらの組み合わせは依然困難な時間のかかる努力5。
管理番号6に可能な残基の数を減らすために値の大きい蛋白質の領域の機能の重要性を評価する技術をします。切り捨てられたタンパク質は、この問題に取り組むために最もよく使われるアプローチをされています。したがって、地域の場合は調査の下でタンパク質の機能が特定の地域の7,8,9の削除によって影響を受ける機能に関連すると見なされます。ただし、このメソッドの主な制限は削除が折りたたみ、集計、目的の領域を研究することができないにつながるタンパク質の二次構造に影響を与えることができます。良い例は、サイトカイン オンコスタチン M (OSM)、内部の削除 7 残基がさらにできませんでした誤って折りたたまれた突然変異体の結果よりも大きいが10を勉強したの切り捨てられたバージョンです。
キメラ蛋白質の生成はより大きい蛋白質領域の解析を可能にする革新的な代替アプローチを構成します。このメソッドの目的は、特定の生物学的機能に置き換えられるセクションの貢献度を評価するために別のタンパク質に構造的に関連するシーケンスによって蛋白質の関心領域を交換することです。機能ドメイン11,12を識別する受容体シグナル伝達の分野で広く使用されているキメラ蛋白質が少しのアミノ酸のアイデンティティが保存された二次構造蛋白質家族の研究に特に有用。インターロイキン 6 (IL-6) 型サイトカインのクラスでインターロイキン-6 および毛様体神経栄養因子 (6% 順序のアイデンティティ)13または白血病抑制的な要因 (LIF) および OSM (20% のアイデンティティ)6のように、適切な例を見つけることができます、次のプロトコルに基づいています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. キメラ蛋白質の設計
- 適切な蛋白質興味 (受信者) 供与体蛋白質は構造が似ている、理想的には同じタンパク質ファミリーに属するが、読み出しとして使用される生物学的活性を欠いているはずの蛋白質を持つ領域を交換する (ドナー) を選択します。ベクトル配置検索ツール (VAST)14,15などの自動化されたツールを使用して潜在的な候補を識別できる場合は構造的に関連するタンパク質が知られていません。
- 蛋白質のデータ ・ バンク (PDB)16ヨーロッパのウェブサイト (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/)、右上隅にある検索ボックスに興味の蛋白質の名前を紹介する、'検索' をクリックします。結晶構造が pdb ファイル (PDB id; ダウンしない利用可能です例えば1evs OSM のため)。
注: 構造データを PDB に使用できない場合タンパク質のホモロジー モデルかもしれないツールによって生成される、スイス モデル17など代わりに、利用可能な手順を追ってプロトコル18を使用しています。 - 広大な web サイト (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml) にアクセスします。PDB ID が利用、場合に、' のような構造の表示 ' ボックスに PDB ID '事前に計算された結果を取得' セクションは、入力までスクロールし、「Go」をクリック。次の画面では、' 元広大な 'し' チェーン全体 ' 潜在的な構造的に類似した候補の PDB Id の一覧を表示するをクリックします。
- PDB ID は使用可能な相同モデルが生成された場合、新しい構造を持つ検索] セクションまで下にスクロール、「広大な検索」リンクをクリックして。'送信 PDB ファイル' の横にある「参照」をクリック ファイルを選択、'送信' をクリックするモデルの PDB ファイルをアップロードします。
- PDB ファイルはアップロード、膨大な計算を開始する「スタート」ボタンをクリックします。計算を実行すると、構造的に同じような蛋白質の PDB Id を参照ドメインの下で 'チェーンの全体' をクリックします。
- トップ候補者は、いずれかの選択または文献検索を介して読み出しシステムで実験的の興味 (例えば受容体活性化、酵素活性、転写因子活性) の生物学的機能を評価します。供与体蛋白質興味の蛋白質と比較して発散機能を選択します。
- 蛋白質のデータ ・ バンク (PDB)16ヨーロッパのウェブサイト (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/)、右上隅にある検索ボックスに興味の蛋白質の名前を紹介する、'検索' をクリックします。結晶構造が pdb ファイル (PDB id; ダウンしない利用可能です例えば1evs OSM のため)。
- リファレンス ・ シーケンス (RefSeq) データベース19から受信者とドナーの蛋白質の蛋白質のアミノ酸配列を取得します。
- RefSeq の web ページ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) で遺伝子セクションにアクセス、検索ボックスに興味の蛋白質の名を入力し、「検索」をクリック。結果の一覧で目的の種の遺伝子の名前をクリックします。
- すべて文書化されたアイソ フォームを参照してくださいに RefSeq セクションまでスクロールします。興味 (NM で始まる) のアイソ フォームのシーケンス id 番号をクリックして、スクロール ダウンし、'CD' 遺伝子の蛋白質のコーディングの地域を強調するためにクリックします。画面の右下、「FASTA」をクリックして、遺伝子の塩基配列をコピーします。
- 編集ソフトウェア適切な DNA を用いた DNA シーケンスを保存します。自由に利用できるサル20を使用すると、プログラムを開くし、空白のボックスでシーケンスのコピーを貼り付ける、シーケンス名を選択、「保存」をクリック。
注: は、1.2.1 の手順を繰り返します。1.2.3。選択した 1 つまたは複数のドナー蛋白質。
- 異なるキメラ構成要素で置換する蛋白質領域を選択します。
- 異なる構造領域の興味の蛋白質シーケンスを分割します。理想的には、問題の蛋白質のための別のドメインは、文献に記載されています。そうでない場合、保存された個別の構造的特徴 (ヘリックス ・ ループ) の存在は 1.3.1.1 の手順で評価する必要があります。1.3.1.4 を。
- 興味の蛋白質の構造データを PDB のウェブサイトからダウンロード (ステップ 1.1.1 を参照)。蛋白質のための PDB のページにアクセスし、画面の右側にある「ダウンロード」をクリックして PDB ファイルをダウンロード。
- ソフトフェア (https://pymol.org/) のような分子可視化システムでは、PDB ファイルを開きます。ソフトフェア、塩基配列を表示 (表示をクリックして > シーケンス上) (PDB ID 横に H をクリックすると、'すべて' を選択して) 既定の構造データを非表示、蛋白質の構造を明確に可視化する '漫画' ビューを選択機能 (S は PDB ID の横にあるをクリックして '漫画' を選択する)。
- 塩基配列各構造特徴に対応するアミノ酸を書き留めて、分子のさまざまな部分を強調表示する画面の上部をクリックします。
- 猿の DNA シーケンスの異なる構造領域に注釈を付けます。この操作を行うには、DNA シーケンスを開いてステップ 1.2.3 から。、地域中のアミノ酸のためのコーディングのヌクレオチドを選択、選択範囲を右クリックし、名前とカラーを与えるための '新機能' を選択します。前の手順で識別される構造地域ごとにプロセスを繰り返します。
注: と、塩基配列選択は ORFs をクリックしてダブル チェックすることができます > 翻訳、彼らが正しいアミノ酸シーケンスのコードことを確認、[ok] をクリックします。 - 蛋白質アライメント ツール (例えばClustal オメガ21) を用いた 2 つの蛋白質の残余シーケンスを合わせます。
注: キメラ哺乳類発現系で生産されるので、これらのシーケンスは蛋白質の信号のペプチッドを含める必要があります。- ステップ 1.2.3 から DNA 配列を開くことによってサル、ドナーと受容体蛋白質の完全アミノ酸配列を取得します。 選択して [Orf をクリック、> 翻訳。
- Clustal オメガ web ページ (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) にアクセス入力と 2 つのタンパク質のアミノ酸配列が下にスクロールし、「送信」をクリックします。各シーケンスのテキスト行で一人歩きをする必要があります ' > ProteinName' を正しく識別する.
- 'ダウンロード配置ファイル' タブをクリックして配置ファイルを取得し、保存します。このファイルは、任意のテキスト編集プログラムで開くことができます。
- 供与体蛋白質の DNA シーケンス内の対応する構造領域に注釈を付ける基準としての配置ファイルを使用して (手順 1.3.2 を参照)。
- キメラ蛋白質を交換し、キメラの適切な塩基配列を設計蛋白質領域を決定します。
注: さまざまな地域の機能的重要性に関する詳細な情報がない場合は、それをお勧め全体ループなど大規模な置換を選択するまたはそれらのどれを評価する螺旋形蛋白質の機能に影響があります。この最初の探索実験にはキメラ蛋白質の設計、関連する領域内で小さい置換に焦点を当てた第二ラウンドすることができます後。- 1.3.2 のステップから受容体タンパク質の注釈付きの DNA シーケンスのコピーを作成します。キメラ蛋白質としてそれの名前を変更します。猿の名前が変更された DNA シーケンスを開くを選択し、交換して (1.3.3 の手順で作成した注釈付きのシーケンスからコピー) 供与体蛋白質、対応する地域によって置き換えるし、変更を保存する領域のためのヌクレオチド シーケンス コーディングを削除します。
注: は、新しいコピーを作成し、設計されているそれぞれの異なるキメラについてこの手順を繰り返します。
- 1.3.2 のステップから受容体タンパク質の注釈付きの DNA シーケンスのコピーを作成します。キメラ蛋白質としてそれの名前を変更します。猿の名前が変更された DNA シーケンスを開くを選択し、交換して (1.3.3 の手順で作成した注釈付きのシーケンスからコピー) 供与体蛋白質、対応する地域によって置き換えるし、変更を保存する領域のためのヌクレオチド シーケンス コーディングを削除します。
- 異なる構造領域の興味の蛋白質シーケンスを分割します。理想的には、問題の蛋白質のための別のドメインは、文献に記載されています。そうでない場合、保存された個別の構造的特徴 (ヘリックス ・ ループ) の存在は 1.3.1.1 の手順で評価する必要があります。1.3.1.4 を。
2. 分子クローニングのための準備
- プラスミッドのベクトルの選択式システムに適したを選択します。哺乳類式 pCAGGS22のような高発現ベクターまたは pcDNA ベクター シリーズが推奨されます。
- 制限の酵素に基づくこのプロトコルで、クローニング ベクトルの多重クローニング サイト (MCS) で現在のユニークな制限サイトが興味の蛋白質と互換性があるようにしてください。これを行うには、サルとキメラ構造の DNA シーケンスを開いてをクリックして '酵素 > 酵素セレクター' MCS の制限のサイトの少なくとも 2 つが不在であることを確認 (自分の名前の横にある 0 を表示する) の順序で。
- サルなど DNA エディターを使用してターミナルのプライマーを設計します。
- 新しい DNA ファイルを作成 (ファイル > 新しい) ベクトルの MCS (6-8 塩基対、例えばパーチの TTAATTAA) で選択した最初の制限サイトに続いて (3-9 余分な塩基対、例えばAAAGGGAAA) のリーダー配列を N 末端プライマーを開始し、オプションのスペーサー (例えば例で使用 pCAGGS ベクトルで GCTAGCGCATCGCCACC) と (例えばOSM の ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG) の興味の遺伝子の初期 18-27 塩基対。
- 新しい DNA ファイル C 末端のプライマー シーケンス開始、最終の 18-27 塩基対 (例えばCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 6xHistidine C 末端タグが付いている遺伝子の)、興味の遺伝子の省略可能なスペーサーが続く (例えばTAGCGGCCGC でpCAGGS ベクトル)、2 番目の制限サイトの選択 (例えばアスキーの GGCGCGCC) とリーダーのシーケンス (例えばAAAGGGAAA)。シーケンス全体を強調表示し、右クリックして '逆の補数' 逆プライマーを取得するを選択します。
- 各キメラ構造で国境地帯のプライマーを設計します。
- (ステップ 1.3.4.1 で作成) キメラの DNA シーケンスを開き、元と挿入されたシーケンスに接触、各シーケンスの 15 塩基対を構成するゾーン 30 塩基対の領域を強調表示します。(右クリックし「コピー」を選択) 領域をコピーし、、新しい DNA ファイルに貼り付けるこのシーケンスは、前方のプライマーになります。
- ステップし、逆プライマーとして名前を変更前に生成された前方のプライマーのコピーを作成します。プライマー シーケンスを強調表示し、右クリックして '逆の補数' 逆プライマー シーケンスを生成するを選択します。
- 2.3.1 手順を繰り返します。2.3.2。キメラ DNA シーケンスの各コンタクト ゾーン。一般的に、フォワード/リバースのプライマーの 2 つのセットは、N 末端または C 末端領域で置換が発生しない限り、1 つのキメラを生成する必要が。
- オリゴヌクレオチド合成プロバイダーからターミナル、内部のプライマーを注文します。
ノート:ターミナルのプライマーを精製高度を使用して (例えばHPLC 精製) プロトコルの成功率の肯定的な影響を持つことができます。脱塩内部プライマーは通常、良好な結果を提供します。 - テンプレート ドナーおよび受容体遺伝子のシーケンスを取得します。
注: テンプレートとして大きく開いたリーディング ・ フレーム (ORFs) これらのシーケンスを含んでいるプラスミッドを用いた手順を容易にお勧め。また、相補的 DNA (cDNA) これらの遺伝子を表現するため知られている細胞から生成されるは、以降の手順のテンプレートとして使用できます。
3. キメラを形成する個々 の DNA のフラグメントのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の拡大
- キメラ蛋白質を構成するフラグメントのそれぞれの個々 の PCR 反応液を準備します。典型的なキメラ蛋白質は 3 つの個々 のフラグメントを必要とする: N 末端部分、挿入される領域と C 末端部分。
ノート:シーケンス内の突然変異を導入することを避けるために高忠実度 DNA ポリメラーゼ (例えばPhusion 高忠実度 DNA ポリメラーゼ) を使用します。PCR の反作用を夕方に設定し、一晩を実行できます。- 1.5 mL および microfuge チューブ ピペットで移しなさい氷のテーブル 1に示す順序で PCR 混合物の異なった試薬セット確認正しいプライマーとテンプレートが各 PCR の反作用に採用されている (表 2参照)。
- 各反作用のための 2 つの薄肉 0.2 mL PCR チューブにラベルを付けるし、各チューブに対応する pcr の 20 μ L を転送します。PCR チューブ PCR たちに転送し、表 3に詳細なプロトコルを開始します。
注: 焼鈍温度は少なくとも 5 度溶融温度よりも低く設計されたプライマーをする必要があります。
- PCR の実行中は、トリス酢酸 EDTA (TAE) バッファーに 1% の agarose のゲルの 100 mL を準備します。この目的のため寒天 1 g の重量を量る、100 mL のガラス フラスコで TAE バッファーを混ぜて、フラスコを 30-40 秒ごと旋回 agarose が完全に溶けるまで電子レンジします。約 50 ° C に冷却できるように臭化エチジウムの 2-3 μ L (または同等の DNA 色素) を追加して、目的も櫛が付いているゲル皿に注ぐ。
注意:臭化エチジウムは既知変異原物質、適切な保護具の使用を確認します。 - PCR の反作用が完了した後は、各チューブに 6 x DNA 読み込みバッファーの 4 μ L を追加します。挿入 1% アガロースゲル電気泳動装置、TAE バッファー カバーし、分子量の梯子と一緒にゲルにサンプルをロードし慎重に。
注: 読み込みの時に、それはその後 DNA の回復を容易にするサンプル間空の車線を残すことが望ましいです。 - 20-45 分 80-120 V でゲルを実行します。
注: 1,000 塩基対の下のバンドは、大きいバンドは長い実行時間を必要としながら、120 V、約 20 分で electrophoresed 通常ことができます。 - 電気泳動ユニット電源を切ります、agarose のゲルを取り出し、UV 光の下で増幅された DNA バンドを可視化します。かみそりの刃を使用して、ゲルから個々 の DNA のフラグメントをカットし、それらをラベル付きの 2 mL の microfuge の管に転送します。
注: は、DNA の損傷を避けるために紫外線に露光時間を最小限に抑えます。 - 使用する PCR クリーン アップ キットの異なる DNA 断片を浄化する (材料の表を参照してください)。
- 500 μ L のゲルのフラグメントを含む各管にキットで提供される NTI バッファーを追加します。50-55 ° C で thermomixer とゲルをバッファーに完全に溶解するまで 1000 rpm で揺れに転送します。
- ラベル キット列に各ソリューションを転送、(30-60、11,000 x g) 遠心機でスピンし、吸収を破棄します。キットの NT3 洗浄バッファーの 700 μ L を追加、再び同じ設定下で遠心し、吸収を破棄します。列内のシリカ膜を乾燥する 11,000 x g で 1-2 mins のために再度列を遠心します。
- 1 分立つと遠心分離機の DNA を溶出する 11,000 x g で 30-60 列にラベル付き 1.5 mL および microfuge の管柱、ヌクレアーゼ フリー水のピペット 30 μ L を転送します。
- 260 でサンプルの吸光度を測定することによって回復 DNA の量を定量化する nm、340 nm の分光光度計 (材料の表を参照してください)。DNA 濃度は、DNA の消光係数 (50 μ g/mL)23を乗じて、260 nm 図から 340 nm 読書を差し引いて計算されます。
ノート:追加測定 230 nm と 280 nm DNA 純度の評価を可能にする: 260/280 と 260/230 比率以上の 1.8 が DNA のために純粋な一般にみなされます。プロトコルは、この手順の (短期) 4 ° C または-20 ° C (長期) で溶離された DNA を保存する後休止できます。
4. キメラ DNA シーケンスを生成する Pcr
- キメラの別成分の融合を 50 μ L の PCR 反応を設定します。同じ手順 3.1、10、N 末端と C 末端のプライマーを用いた詳細な ng の DNA の各断片で得られたステップ 3.7。
注: PCR の反作用はする、夜に設定し、一晩実行します。 - 3.2 から 3.7 回復し、ヌクレアーゼ フリー水の 30 μ L で浄化された DNA フラグメントを定量化する手順を繰り返します。このフラグメントには、ターミナルのプライマーに含まれている制限のサイトが並ぶキメラの DNA シーケンスが含まれています。
5. キメラ DNA の発現ベクターへの挿入
- ラベル 2 1.5 mL の microfuge の管とピペットテーブル 4、追加選択式の 1 μ g に示されている順序で別の試薬の 1 つの管と他の回復された DNA のフラグメントの 1 μ g ベクトルします。選択した制限の酵素と消化を実行する 37 ° C で 1-4 時間インキュベートします。
ノート:両方制限酵素バッファー採用と互換性のあるを確認します。場合に彼らは完全に別のバッファーを必要とする、酵素の 1 つだけと最初にこれらの手順を実行しを繰り返します。選択制限の酵素によって異なります、消化のために必要な時間: 詳細については、製造元の指示を参照してください。 - 浄化し、ヌクレアーゼ フリー水の 30 μ L で消化 DNA フラグメントと発現ベクターを回復 3.2 から 3.7 手順を繰り返します。以前のように回復 DNA の量を定量化します。
- 挿入 DNA の ligation の反作用の 3:1 挿入/ベクトルのモル比に必要な次の方程式を使用して量を計算します。
挿入(ng) =モル比*ベクトル(ng) *サイズを挿入(bp)/ベクトルの大きさ(bp)
注: 異なる挿入/ベクトルのモル比をテストする通常 3:1 の比率は適切な結果を得るのに十分です。 - 40 1.5 mL および microfuge の管の ligation の反作用の 20 μ L を設定式の ng のキメラ DNA ステップ 5.3、バッファー、および表 5に示されている順序に従って T4 DNA リガーゼで計算量をベクトルおよび 16 ° C で一晩インキュベート
注: ライゲーション効率向上 16 ° C で一晩反応を実行する一般的に、室温で 2 時間の反応の培養または。 - 変換の化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) に結紮混合物の 5-10 μ L 標準プロトコル24選択の版成長に従って調製した拡張およびプラスミド DNA のシングル コロニーをピックアップ確立したプロトコル25によると分離。
メモ: このプロトコルの採用されたエシェリヒア属大腸菌XL1 青いひずみが他の大腸菌の亜種も使用できます。 - 5.1 では、ステップの指示に従って適切な制限の酵素と隔離されたプラスミド 1 μ g を消化し、agarose のゲルの電気泳動によるキメラのシーケンスに対応するサイズの DNA バンドの存在の査定 (3.2 3.5 手順を参照)。
注: 挿入されたシーケンスが DNA シーケンス サービスを使って確認することをお勧めします。 - 成功したシーケンスの検証時に、プラスミド大量生産でき次確立プロトコル26,27で哺乳類発現系において採用されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
建設とキメラタンパク質 (図 1) の生成は、最近出版された調査6の主題ではなかった OSM と LIF、インターロイキン 6 サイトカイン家族の 2 つのメンバーと例示が。これらのタンパク質の立体構造を図 2に示します。両方の分子は、私 (A ~ D と呼ばれる) 4 つのヘリックスとサイトカインはバンドル パック、ループ28参加クラスの特徴的な二次構造を採用します。人間蛋白質の一直線に並べられたアミノ酸の構造は、図 3Aで見ることができます。この例で BC ループ領域は OSM のアミノ酸シーケンス図 3Bに示すように OSM LIF キメラを作成する対応する LIF シーケンスによって交換されました。
これの目的は、OSM と LIF の DNA 配列が得られたし、BC ループに対応するエンコードのアミノ酸領域両方のサイトカインで確認されました (図 4)。下流蛋白質の浄化を促進する C 末端に 6 ヒスチジンの札をさらに設立。次に、哺乳類式 (pCAGGS) の適切なベクトルが選ばれたとその多重クローニング サイト内のユニークな制限のサイト選択された (パーチアスキー) 彼らがキメラ遺伝子シーケンスに存在しなかったことを確認した後 (手順を参照してください。2.1.1。)。
プライマーに示すように設計されていた表 4.N ターミナル前方 OSM プライマーには、パーチに制限のサイト、特定のプラスミド スペーサーと OSM の初期 27 塩基対に続いて 9 塩基の主要なシーケンスが含まれています。C 末端逆プライマーには、アスキー制限サイト、スペーサー、この特定のケースでは C 末端ヒスチジンの札に相当する遺伝子の 27 の最後の塩基対が続く主要なシーケンスが組み込まれています。さらに、紀元前ループの接合点にまたがる 30 塩基プライマー前方および逆方向の必要があります。
最初の PCR の拡大のステップは 3 つの別の反応に成って。OSM N 末端フラグメント、N 末端 OSM 前方および BC スタート逆プライマーを必要とするテンプレートとして使用される OSM。LIF BC ループは BC スタート楽しみにして、BC 終了逆プライマー LIF をテンプレートとして使用してから得た。OSM の C 末端フラグメントは、テンプレートとして OSM と同様に BC の端および C ターミナル OSM 逆プライマーを使用します。それぞれ、385、75、321 の塩基対のサイズが予想されるこれらの 3 つの断片 1% アガロースゲルで分離した後、図 5Aで見ることが。
これら精製フラグメントされた N 末端 OSM 楽しみと共に、第 2 PCR の反作用のテンプレートおよび C ターミナル OSM 逆プライマーとして使用されます。OSM LIF に対応する、この増幅の結果 BC ループ遺伝子シーケンス、図 5Bに示します。この手順は、精製、遺伝子のフラグメントと選ばれたプラスミッド、ゲル電気泳動法と浄化、16 ° C および大腸菌XL1 ブルーに変換で一晩結紮の 4 時間消化が続いた。個々 のプラスミドが分離・ DNA のフラグメント (図 6) の適切な挿入の制限の酵素の消化力によって選別します。最後に、肯定的なヒットは、シーケンス シーケンスがタンパク質発現、精製に進むと機能アッセイ6でテストする前に目的の OSM LIF BC ループ キメラに対応したことを確認するために送られました。
図 1: キメラ蛋白質生成の概略図。(A)キメラ デザイン プロセス: 交換される領域を選択した後一連の目的のキメラと必要なプライマー DNA 編集ソフトウェアによって構築されています。(B)キメラ蛋白質の生成の重要な手順が描かれています。PCR の拡大の 2 つの手順は、し適切な制限の酵素と消化され、発現ベクターにはキメラの遺伝子シーケンスを生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: OSM と LIF の構造類似性。OSM29の結晶構造の表現 (PDB: 1EVS) と LIF30 (PDB: 2Q7N)、設計されたキメラのおおよその表示と共に。これらのサイトカインは、ループによって参加 4 ヘリカル バンドル構造を採用します。この研究はもともと生物化学のジャーナルで出版されました。エイドリアン ・ Segarra、j. m.、シンドラー、(名)、Gajawada、p.、Lörchner、h.、ブラウン、t. & Pöling、j.AB ループと結合部位 III の人間オンコスタチン M (OSM) の D ヘリックス OSM 受容体活性化のために必要です。J. 生物化学 2018 年。18:7017-7029。 © 著者6。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: OSM と LIF のアミノ酸配列の比較。(A) BC ループの領域が強調表示されますでの人間の OSM と LIF、フルレングスのアミノ酸配列のアライメント。アスタリスク (*) が完全に保存されている残基を示す強くに似てプロパティを持つアミノ酸に対応するコロン (:) とピリオド (.) は弱同様の機能とのそれらを示します。等価の LIF に置き換え OSM の BC ループ領域の OSM BC ループ キメラの(B)アミノ酸のシーケンス。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: OSM BC ループ キメラの DNA シーケンス。キメラの OSM タンパク質のシーケンス。LIF から挿入された地域は、オレンジ色で強調表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: OSM BC ループ キメラ DNA の増幅断片します。(A) BC ループ (3 車線) と C 末端領域 (4 車線) (2 レーン)、N 末端領域に対応するバンドの最初の PCR の拡大の結果です。((B)) 3 つのバンドが最初の増幅で取得した 2 つ目の PCR の拡大の結果は、OSM のキメラを生成する結合されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: OSM BC ループ キメラのプラスミッドのベクトルに挿入します。OSM キメラ遺伝子の塩基配列の正しい挿入を示す 〜 700 塩基対で存在下のバンドで、生成されたプラスミドの制限の酵素の消化力。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬 | ストック濃度 | (50 μ L) でボリューム |
| 滅菌水 | 50 μ L に | |
| PCR のバッファー | 10 X | 5 Μ L |
| dNTPs | 10 mM | 1 Μ L |
| DMSO | 100% | 1.5 Μ L |
| 前方のプライマー | 10 Μ M | 1 Μ L |
| 逆プライマー | 10 Μ M | 1 Μ L |
| テンプレート DNA | 変数 | プラスミド DNA の 2.5 12.5 ng の必要に応じて |
| Phusion 高忠実度 DNA ポリメラーゼ | 2 単位/μ l | 0.5 Μ L |
表 1: 試薬の pcr 反応に必要な。
| N 末端フラグメント | キメラの挿入 | C 末端フラグメント | |
| 前方のプライマー | N ターミナル前方 | 楽しみにして最初の接合部 | 第二接合部前方 |
| 逆プライマー | 逆に最初の接合部 | 第二接合部逆 | C 末端逆 |
| テンプレート DNA | 受信者 | ドナー | 受信者 |
表 2: プライマーと標準的なキメラ蛋白質の生成に必要なテンプレート。
| サイクルのステップ | 温度 | 時間 | サイクル数 |
| 初期変性 | 98 ° C | 30 代 | 1 |
| 変性 | 98 ° C | 10 秒 | 23-25 |
| アニール | 68 ° C * | 25 秒 | 23-25 |
| 拡張機能 | 72 ° C | プラスミドあたり 30 代 | 23-25 |
| 最終的な拡張 | 72 ° C | 300s | 1 |
| ホールド | 4 ° C | ∞ | 1 |
| * 少なくとも 5 ° C の融点プライマーより低い | |||
表 3: PCR のプロトコルはキメラのフラグメントとの完全キメラタンパク質を増幅するために使用します。
| 試薬 | ストック濃度 | (50 μ L) でボリューム |
| 滅菌水 | 50 μ L に | |
| 制限酵素バッファー * | 10 X | 5 Μ L |
| テンプレート DNA | 変数 | DNA の 1 μ g の必要に応じて |
| 酵素 #1 | 変数 | 1 Μ L |
| 酵素 #2 | 変数 | 1 Μ L |
| * 両方の酵素が選択バッファーと互換性があることを確認します。 | ||
制限酵素消化反応表 4: コンポーネント。
| 試薬 | ストック濃度 | (20 μ L) でボリューム |
| 滅菌水 | 20 μ L に | |
| T4 DNA リガーゼ バッファー | 10 X | 2 Μ L |
| ベクトル DNA | 変数 | 40 の必要に応じて DNA の ng |
| DNA を挿入します。 | 変数 | 3:1 のモル比の必要に応じて |
| T4 DNA リガーゼ | 変数 | 1-2 Μ L |
表 5: 試薬の ligation の反作用に必要な。
| 名 | プライマー シーケンス |
| N 末端 OSM 前方プライマー (パーチ) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C 末端 HisTag 逆プライマー (アスキー) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| 紀元前ループの開始を楽しみにして | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| BC ループ開始逆 | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| BC ループ端 | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| 逆に BC ループ終了 | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
表 6: プライマーは OSM BC ループ キメラの生成で使用されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
キメラ蛋白質の生成は、サイトカイン受容体結合ドメイン13のモジュール性など質問に対処に切り捨てられた蛋白質の限界を超えて移動することができる汎用性の高い技術を構成します。キメラの設計学では、この種の重要なステップであり注意が必要です。機能ドメインを確立する予備研究一般に間必要になります最初の段階で幅広い領域の置換変数の長さより小さい置換は 1 つの地域の詳細な研究に適しています。機能サイト31,32を示すことが多いので、このステップでタンパク質ファミリー内で小さな節約されたモチーフの存在に特別な注意を与えべき。個人的な経験は、キメラ蛋白質の設計よりも 1 つのラウンドが必要なできることを示しますキー機能領域を絞り込むには、各ラウンドは、重要な必要とする時間 (週か月) 初期設計から機能試金テストします。
限り、興味の蛋白質に構造が似ているタンパク質が存在するが分岐の生物学的機能を有する、メソッド、関心の任意のシーケンスに適用される各特定遺伝子 PCR への依存のために適しています。増幅。特に、GC の豊富な地域を有する遺伝子はシーケンスのこれらのタイプは、増幅33の効率を減らすために知られているので、特に挑戦的な目標を証明するかもしれない。これらの問題は、反応、特殊な DNA ポリメラーゼのバッファーの使用や熱処理パラメーター34の変更に異なる添加物 (例えばベタイン) の追加など、さまざまな手段によって通常解決できます。したがって、いくつかの試行錯誤は、興味の遺伝子に十分な条件を発見する前にそれ一般に必要があります。
提供されるプロトコルは古典的な制限酵素ベース クローニング方法に基づいて、研究室のすべてのタイプに一般にアクセス可能であるが、さらに適応できるを利用するクローン技術をより高度な。たとえば使用ゲートウェイのクローニング、クローニング (例えば異なる式システムが並列でテストする場合)、いくつかの異なるベクトルで同じ挿入を容易にする単する必要がある場所特定attBリコンビネーション サイトこの詳細な制限のサイトの35 をプロトコルします。他の新しいクローンの方法論が第 2 PCR の反作用 (例えばユーザー36または37ギブソン アセンブリ) と結紮 (例えばシーケンスと結紮に依存しない (SLIC) をクローニング38または融合のアセンブリの必要性を回避できます。39). これらのメソッドへのアクセスを持つ読者が基本的な設計原則に従った後キメラ構成要素の生成処理速度が向上するそれらを適用することをお勧め別の試薬とプライマー デザイン戦略を立て、このプロトコルの手順 1 で詳しく説明します。
全体的にみて、このメソッドのアプリケーションは、他の蛋白質が生体機能とくにタンパク質間、またはタンパク質-核酸相互作用を含む、場所を取るし、する便利なツールを構成するメカニズムに関する貴重な洞察を提供できます。識別し、蛋白質家族6内のユニークな構造と機能の関係を指定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、マックス ・ プランク協会と Schüchtermann クリニック (悪い Rothenfelde、ドイツ) によって支持されました。本研究の一部は、元生物化学のジャーナルで出版されました。エイドリアン ・ Segarra、j. m.、シンドラー、(名)、Gajawada、p.、Lörchner、h.、ブラウン、t. & Pöling、j.AB ループと結合部位 III の人間オンコスタチン M (OSM) の D ヘリックス OSM 受容体活性化のために必要です。J. Biol. chem. 2018;18:7017-7029。 © 著者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
