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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Identification d’une protéine fonctionnelle des régions par le biais de Construction des protéines chimériques

Published: January 8, 2019 doi: 10.3791/58786
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Protéines de structure apparentées exercent souvent des fonctions biologiques distinctes. L’échange des régions équivalentes de ces protéines afin de créer des protéines chimériques constitue une approche novatrice afin d’identifier les régions critiques de protéines qui sont responsables de leur divergence fonctionnelle.

Abstract

Le but du présent protocole englobe la conception des protéines chimériques dans lequel les régions distinctes d’une protéine sont remplacées par leurs séquences correspondants à une protéine de structure similaire, afin de déterminer l’importance fonctionnelle de ces régions. Ces chimères sont générés au moyen d’un protocole PCR imbriqué à l’aide de fragments d’ADN qui se chevauchent et adéquatement amorces, suivie de leur expression au sein d’un système mammifère indigène structure secondaire et modifications post-traductionnelles.

Le rôle fonctionnel d’une région distincte est alors indiqué par une perte d’activité de la chimère dans un test de lecture appropriée. En conséquence, les régions contenant un ensemble de critiques acides aminés sont identifiées, qui peuvent subir davantage de techniques complémentaires (mutagenèse dirigéepar exemple ) pour augmenter la résolution moléculaire. Bien que limité aux cas dans lesquels on trouvera une protéine structurellement apparentée avec différentes fonctions, protéines chimériques ont été employés avec succès pour identifier les régions de liaison critique en protéines tels que les récepteurs de cytokines et de cytokines. Cette méthode est particulièrement adaptée dans les cas où les régions fonctionnelles de la protéine ne sont pas bien définies et constitue une première étape utile dans les approches d’évolution dirigée à affiner les zones d’intérêt et de réduire l’effort de dépistage impliqué.

Introduction

Plusieurs types de protéines, y compris des cytokines et facteurs de croissance, sont regroupées en familles dont les membres partagent des structures tridimensionnelles similaires mais exercent souvent des fonctions biologiques distinctes1,2. Cette diversité fonctionnelle est généralement la conséquence de petites différences dans la composition en acides aminés au sein active sites3 de la molécule. Identification de ces sites et ces déterminants fonctionnels n’offrent pas de seulement précieux évolutive mais aussi de concevoir des agonistes et des inhibiteurs plus spécifiques4. Cependant, le grand nombre de différences dans la composition de résidus trouvés fréquemment entre les protéines de structure apparentées complique cette tâche. Même si la construction de grandes bibliothèques contenant des centaines de mutants sont de nos jours c’est possibles, évaluer chaque variation seul résidu et combinaisons de ceux-ci reste encore un effort difficile et fastidieux à5.

Techniques d’évaluer l’importance fonctionnelle des protéines grande régions sont donc de valeur afin de réduire le nombre de résidus éventuels à un nombre gérable6. Des protéines tronquées ont été l’approche plus utilisé pour s’attaquer à ce problème. En conséquence, les régions sont réputées être fonctionnellement pertinente si la fonction de la protéine étudiée est affectée par la suppression d’une région donnée7,8,9. Toutefois, une limitation majeure de cette méthode est que destructions peuvent affecter la structure secondaire de la protéine, conduisant à un mauvais repliement, agrégation et l’incapacité pour étudier la région prévue. Un bon exemple est une version tronquée de la cytokine oncostatine M (OSM), dans lequel une délétion interne plus grande que 7 résidus a donné lieu à un mutant mal repliée qui ne pourrait pas être davantage étudié10.

La génération des protéines chimériques constitue une approche alternative et novatrice qui permet l’analyse des plus grandes régions de la protéine. L’objectif de cette méthode consiste à échanger des régions d’intérêt dans une protéine de structure apparentées séquences dans une autre protéine, afin d’évaluer la contribution des sections remplacées à des fonctions biologiques spécifiques. Largement utilisé dans le domaine de la signalisation des récepteurs afin d’identifier les domaines fonctionnels11,12, protéines chimériques sont particulièrement utiles pour l’étude des familles de protéines avec peu acides aminés mais conservé structure secondaire. Des exemples appropriés se trouvent dans la classe des cytokines de type interleukine-6 (IL-6), telles que l’interleukine-6 et ciliaire neurotrophic factor (6 % d’identité)13 ou leucémie facteur inhibiteur (LIF) et (20 % d’identité) OSM6, sur lequel la suivant le protocole est basé.

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Protocol

1. protéine chimère Design

  1. Sélectionnez une protéine adaptée (donneur) pour échanger des régions avec la protéine d’intérêt (destinataire), que la protéine du donneur doit être structurellement similaire, idéalement appartenant à la même famille de protéine, mais dépourvu de l’activité biologique peut servir de lecture. Si aucune protéine structurellement apparentés n’est connus, les candidats potentiels peuvent être identifiés à l’aide d’un outil automatisé tels que l’outil de recherche alignement vectoriel (VAST)14,15
    1. Accéder au site européen de Protein Data Bank (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introduire le nom de la protéine d’intérêt dans la zone de recherche dans le coin supérieur droit et cliquez sur « Rechercher ». Condition qu’une structure cristalline est disponible, pas vers le bas de l’identificateur de l’APB (PDB ID ; par exemple 1evs pour OSM).
      Remarque : si les données structurales ne sont pas disponibles à l’APB, un modèle d’homologie de la protéine peut être généré par un outil tel que SWISS-modèle17 au lieu de cela, en utilisant les protocoles disponibles étape par étape18.
    2. Accéder au site vaste (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). Dans le cas où un PDB ID est disponible, faites défiler jusqu'à la section « Récupérer pré-calculée résultats », imput le PDB ID dans la case « Afficher des Structures similaires pour » et cliquez sur « Go ». Dans l’écran suivant, cliquez sur « Original grande », puis « Ensemble de la chaîne » pour voir une liste d’ID de l’APB pour les candidats éventuels de structure similaires.
      1. Si un PDB ID n’est pas disponible, mais un modèle d’homologie a été généré, faites défiler jusqu'à la section « Recherche avec une nouvelle structure » et cliquez sur le lien « Recherche large ». Télécharger le fichier PDB du modèle en cliquant sur « Parcourir » à côté de « Fichier PDB soumettre », en sélectionnant le fichier en cliquant sur « Soumettre ».
      2. Après l’APB fichier est téléchargé, cliquez sur le bouton « Start » pour démarrer le calcul vaste. Une fois que le calcul est exécuté, cliquez sur « Ensemble de la chaîne » sous domaines pour voir les ID de PDB des protéines de structure similaires.
    3. Évaluer les fonctions biologiques d’intérêt (par exemple l’activation des récepteurs, l’activité enzymatique, activité de facteur de transcription) des premiers candidats, soit expérimentalement dans le système de lecture de choix ou d’une recherche documentaire. Sélectionnez une protéine de donneur avec fonction divergente par rapport à la protéine d’intérêt.
  2. Obtenir les séquences d’acides aminés de protéine des protéines receveur et donneur de la base de données de séquence de référence (RefSeq)19 .
    1. Accédez à la section de gène dans la page Web de RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), tapez le nom de la protéine d’intérêt dans la zone Rechercher et cliquez sur « Rechercher ». Cliquez sur le nom de gène pour l’espèce désirée dans la liste qui en résulte.
    2. Faites défiler jusqu'à la section RefSeq voir documenté toutes les isoformes. Cliquez sur l’identificateur de séquence pour l’isoforme d’intérêt (en commençant par NM), faites défiler et cliquez sur « CD » pour mettre en évidence la région codant pour des protéines du gène. En bas à droite de l’écran, cliquez sur « FASTA » et copier la séquence du gène.
    3. Enregistrez la séquence d’ADN à l’aide d’un ADN approprié logiciel de retouche. Lorsque vous utilisez le singe disponible gratuitement20, ouvrez le programme, coller la séquence copiée dans la case vide, sélectionnez le nom de la séquence et cliquez sur « Enregistrer ».
      Remarque : Répétez les étapes 1.2.1. pour 1.2.3. pour les protéines de donneur un ou plusieurs sélectionnés.
  3. Choisir les régions de la protéine soit substitué dans les différentes constructions chimériques.
    1. Diviser la séquence de la protéine d’intérêt dans les régions structurales distinctes. Idéalement, les domaines différents pour la protéine en question seront ont été décrits dans la littérature. Si ce n’est pas le cas, l’existence de caractéristiques structurelles conservées distinctes (hélices, boucles) doit être évaluée en étapes 1.3.1.1. à 1.3.1.4.
      1. Télécharger les données structurales de la protéine d’intérêt sur le site de l’APB (voir étape 1.1.1.). Accéder à la page de l’APB pour la protéine et téléchargez le fichier PDB en cliquant sur « télécharger » à droite de l’écran.
      2. Ouvrir le fichier PDB dans un système de visualisation moléculaire comme PyMOL (https://pymol.org/). Dans PyMOL, afficher la séquence nucléotidique (en cliquant sur Affichage > séquence sur), masquer les données structurales par défaut (en cliquant le H à côté de l’ID de l’APB et en sélectionnant « tout ») et sélectionnez la vue de « dessin animé » visualiser clairement structurels de la protéine caractéristiques (en cliquant sur le S à côté de l’ID de l’APB et en sélectionnant « cartoon »).
      3. Cliquez sur la séquence de nucléotides dans le haut de l’écran pour mettre en évidence les différentes parties de la molécule, notant les acides aminés correspondant à chaque particularité structurelle.
    2. Annoter les régions structurales distinctes sur la séquence d’ADN dans les ApE. Pour ce faire, ouvrez la séquence d’ADN à l’étape 1.2.3., sélectionnez les nucléotides codant pour les acides aminés dans une région, faites un clic droit sur la sélection et sélectionnez « Nouveauté » pour lui donner un nom et une couleur. Répétez le processus pour chaque région structurelle identifiée à l’étape précédente.
      Remarque : La sélection de nucléotide peut être vérifiée en cliquant sur ORF > traduire, puis en cliquant sur OK, pour s’assurer qu’ils code pour la séquence correcte des acides aminés.
    3. Aligner les séquences de résidus des deux protéines utilisant un outil d’alignement de protéines (p. ex. Clustal Omega21).
      Remarque : Étant donné que les chimères qui doivent être produites dans un système d’expression chez les mammifères, ces séquences devraient inclure des peptides signaux des protéines.
      1. Obtenir les séquences pleine d’acides aminés des protéines de donneur et receveur dans les ApE, en ouvrant les séquences d’ADN à l’étape 1.2.3., en les sélectionnant et en cliquant sur ORF > Translate.
      2. Accéder à la page Web de Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) et imput les séquences d’acides aminés de deux protéines, puis faites défiler vers le bas et cliquez sur « Soumettre ». Chaque séquence doit être précédée par une ligne de texte avec ' > ProteinName' identifier correctement...
      3. Récupérer le fichier de l’alignement en cliquant sur l’onglet « Fichier de téléchargement alignement » et enregistrez-le. Ce fichier peut être ouvert par n’importe quel programme d’édition de texte.
      4. Le fichier de l’alignement en utilisant comme référence, annoter les régions correspondantes de structurales de la protéine de donateurs dans leur séquence d’ADN (voir étape 1.3.2.).
    4. Décider quelles régions de la protéine d’échanger au niveau des protéines chimériques et concevoir les séquences de nucléotides appropriés pour les chimères.
      Remarque : En l’absence d’informations détaillées au sujet de l’importance fonctionnelle des différentes régions, il est suggéré pour sélectionner les substitutions de grandes telles que des boucles entières ou hélices d’évaluer lequel d'entre eux ont un impact sur la fonction des protéines. Cette première expérience exploratoire peut être suivie par un second tour de la conception de protéines chimériques, axé sur des substitutions plus petites dans les régions concernées.
      1. Créer une copie de la séquence d’ADN annotée de la protéine réceptrice de l’étape 1.3.2. et renommez-le comme une protéine chimérique. Ouvrez la séquence d’ADN renommée dans les ApE, sélectionnez et supprimez le codage de séquence de nucléotides de la région à être échangées et remplacez-la par la région correspondante à la protéine de donateurs (copiée à partir de la séquence annotée, créée à l’étape 1.3.3.), puis enregistrez les modifications.
        Remarque : Créer une nouvelle copie et répétez cette étape pour chaque chimère différent conçu.

2. préparation pour le clonage moléculaire

  1. Sélectionnez un vecteur plasmidique approprié pour le système d’expression de choix. Pour l’expression chez les mammifères, un vecteur de haute expression comme pCAGGS22 ou la série vector pcDNA est recommandée.
    1. Pour l’enzyme de restriction clonage a démontré dans ce protocole, s’assurer que les sites de restriction uniques présentes dans le site multiple de clonage (MCS) du vecteur sont compatibles avec la protéine d’intérêt. Pour ce faire, ouvrez la séquence d’ADN des constructions chimériques avec ApE, cliquez sur ' Enzymes > sélecteur d’Enzyme ' et vérifiez qu’au moins deux des sites de restriction dans les MC sont absent dans la séquence (qui affiche un zéro à côté de leur nom).
  2. Concevoir les amorces terminales en utilisant un éditeur d’ADN comme le singe.
    1. Créez un nouveau fichier ADN (File > New) et lancer l’amorce de la N-terminale avec une séquence de tête (3-9 extra paires de bases, par exemple AAAGGGAAA), suivi par le premier site de restriction sélectionné dans MCS du vecteur (6-8 paires de bases, par exemple TTAATTAA pour PacI), un entretoise en option (par exemple GCTAGCGCATCGCCACC dans le vecteur pCAGGS utilisée dans l’exemple) et les paires de base initial de 18-27 du gène d’intérêt (par exemple ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG pour OSM).
    2. Dans un nouveau fichier ADN, la séquence d’amorce de C-terminale commence avec la finale 18-27 paires de bases du gène d’intérêt (par exemple CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA pour un gène avec une étiquette C-terminal de 6xHistidine), suivies par une entretoise en option (par exemple TAGCGGCCGC dans le vecteur de pCAGGS), la deuxième restriction du site choisi (par exemple GGCGCGCC pour les asques) et une séquence de tête (par exemple AAAGGGAAA). Mettre en évidence la séquence entière, faites un clic droit et sélectionnez « Reverse-complément » pour obtenir l’amorce de marche arrière.
  3. Conception des amorces pour chacune des régions frontalières dans les constructions chimériques.
    1. Ouvrez la séquence d’ADN de la chimère (créée à l’étape 1.3.4.1.) et mettre en valeur une région de 30 paires de bases dans la zone où les séquences originales et insérées sont en contact, comprenant 15 paires de base de chaque séquence. Copiez la région (clic droit et sélectionnez « Copier ») et collez-le dans un nouveau fichier ADN ; cette séquence sera l’amorce vers l’avant.
    2. Faites une copie de l’apprêt avant générée lors de la précédente étape et renommez-le comme amorce de marche arrière. Mettre en évidence la séquence d’amorçage, cliquez et sélectionnez « Reverse-complément » pour générer la séquence inverse de l’apprêt.
    3. Répétez les étapes 2.3.1. et 2.3.2. pour chaque zone de contact dans la séquence d’ADN chimère. En général, les deux ensembles d’amorces de marche avant/marche arrière sont requis pour générer une chimère, sauf si le remplacement se produit à la N-terminal ou les régions C-terminal.
  4. Commander les amorces internes et terminales d’un fournisseur de synthèse d’oligonucléotide.
    NOTES : En utilisant hautement purifié amorces terminales (par ex. purifié par HPLC) peut avoir un impact positif dans les taux de réussite du protocole. Morue dessalées amorces internes fournissent généralement de bons résultats.
  5. Obtenir les séquences du modèle des gènes donneur et receveur.
    NOTE : Employant des plasmides contenant les cadres ouverts de lecture (ORF) de ces séquences en tant que modèle grandement facilite la procédure et est recommandé. Alternativement, l’ADN complémentaire (ADNc) généré à partir d’une lignée de cellules qui expriment ces gènes peut servir comme modèle pour les étapes suivantes.

3. polymerase Chain Reaction (PCR) Amplification de Fragments d’ADN individuels formant la chimère

  1. Préparer un mélange de réaction PCR individuel pour chacun des fragments composant la protéine chimérique. Une protéine chimérique typique, il faudra trois fragments individuels : la partie N-terminale, la région doit être inséré et la partie C-terminale.
    NOTES : Une haute fidélité ADN polymérase (p. ex. Phusion High Fidelity ADN polymérase) permet d’éviter l’introduction de mutations dans la séquence. La réaction de PCR peut être mises en place dans la soirée et exécutée pendant la nuit.
    1. Ensemble un microtubes de 1,5 mL de tube sur la glace et la pipette les différents réactifs des mélanges PCR dans l’ordre indiqué dans le tableau 1, s’assurer que les amorces correctes et modèles sont employés pour chaque réaction de PCR (voir tableau 2).
    2. Identifier deux tubes PCR de minces 0,2 mL de chaque réaction et le transfert de 20 µL du mélange dans chaque tube PCR correspondant. Transférer les tubes PCR dans un thermocycleur PCR et initier le protocole détaillé dans le tableau 3.
      Remarque : la température de recuit doit être au moins 5 degrés inférieur à la température de fusion des amorces conçues.
  2. Alors que la PCR est en cours d’exécution, préparation de 100 mL d’un gel d’agarose de 1 % dans un tampon Tris-acétate-EDTA (TAE). À cet effet, peser 1 g d’agarose, mélanger avec 100 mL de tampon TAE dans un flacon en verre et four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose est complètement dissoute, en agitant le flacon toutes les 30-40 secondes. Laisser refroidir jusqu'à environ 50 ° C, ajouter 2-3 µL du bromure d’éthidium (ou un équivalent colorant ADN) et verser dans un bac de gel avec les peignes de bien désirés.
    Attention : bromure d’éthidium est un agent mutagène connu, s’assurer de l’utilisation d’équipement de protection adéquat.
  3. Après que la réaction PCR est terminée, ajoutez 4 µL de tampon de charge 6 x ADN dans chaque tube. Insérez le gel d’agarose à 1 % dans une unité d’électrophorèse, couvrir avec un tampon TAE et soigneusement charger les échantillons dans le gel avec une échelle de poids moléculaire.
    NOTE : au moment du chargement, il est préférable de laisser les voies vides entre les échantillons afin de faciliter la récupération de l’ADN par la suite.
  4. Exécutez le gel à 80-120 V de 20 à 45 minutes.
    NOTE : bandes en vertu de 1 000 paires de bases peuvent généralement être grande en 20 minutes environ à 120 V, tandis que les bandes plus larges, il faudra plus longs en cours d’exécution.
  5. Éteignez l’appareil d’électrophorèse, retirez le gel d’agarose et visualiser les bandes d’ADN amplifiés sous la lumière ultraviolette. À l’aide d’une lame de rasoir, découper les fragments d’ADN individuels du gel et transférez-les dans des microtubes marqué 2 mL.
    Remarque : Réduire au minimum le temps d’exposition aux rayons ultraviolets afin d’éviter des dommages à l’ADN.
  6. Utiliser un PCR nettoyage nécessaire (voir la Table des matières) pour purifier les différents fragments d’ADN.
    1. Ajouter 500 µL de tampon NTI fourni par le kit à chaque éprouvette contenant un fragment de gel. Transfert à un thermomixer à 50-55 ° C et secouant à 1000 tr/min, jusqu'à ce que le gel soit complètement dissout dans la mémoire tampon.
    2. Transférer chaque solution dans une colonne marquée kit, tourner dans une micro-centrifugeuse (30-60 s, 11 000 x g) et jeter la redistribution. Ajouter 700 µL de tampon de lavage du kit NT3, centrifuger à nouveau sous les mêmes paramètres et éliminer la redistribution. Centrifuger les colonnes encore pour 1-2 min à 11 000 x g à sec de la membrane de la silice à l’intérieur de la colonne.
    3. Transférer la colonne à un tube à centrifuger étiquetées 1,5 mL, ajouter 30 µL d’eau exempte de nucléase dans la colonne, laisse reposer pendant 1 minute et centrifuger 30-60 s à 11 000 x g pour éluer l’ADN.
  7. Quantifier la quantité d’ADN récupéré en mesurant l’absorbance de l’échantillon à 260 nm et 340 nm dans un spectrophotomètre (voir Table des matières). La concentration d’ADN est calculée en soustrayant la lecture de 340 nm du chiffre 260 nm, puis en multipliant le résultat par extinction coefficient (50 µg/mL)23 de l’ADN.
    NOTES : Des mesures additionnelles à 230 nm et 280 nm permettant l’évaluation de la pureté de l’ADN : 260/280 et 260/230 ratios / plus de 1.8 est généralement considérées comme pure pour l’ADN. Le protocole peut être suspendu après cette étape, stocker l’ADN éluée à 4 ° C (courte durée) ou -20 ° C (long terme).

4. PCR Amplification pour générer la séquence d’ADN chimère

  1. Mettre en place 50 µL d’une réaction de PCR à fusionner les constituants séparés de la chimère. Suivez les mêmes étapes détaillées au point 3.1, utilisant les amorces N-terminal et C-terminal ainsi que de 10 ng de chacun de l’ADN des fragments obtenus en étape 3,7.
    Remarque : La réaction de PCR peut être définie dans la soirée et exécuter toute la nuit.
  2. Répétez les étapes de 3,2 à 3,7 pour récupérer et quantifier le fragment d’ADN purifié dans 30 µL d’eau exempte de nucléase. Ce fragment contenait la séquence d’ADN chimère, flanquée par les sites de restriction inclus dans les amorces de terminales.

5. insertion de l’ADN chimère dans un vecteur d’Expression

  1. Étiquette deux des microtubes 1,5 mL et ajouter les réactifs différents dans l’ordre indiqués dans le tableau 4, ajoutant 1 µg de l’expression sélectionnée vector dans un tube et 1 µg du fragment d’ADN récupéré dans l’autre. Incuber pendant 1-4 h à 37 ° C, pour effectuer la digestion avec les enzymes de restriction choisies.
    NOTES : S’assurer que les deux enzymes de restriction sont compatibles avec le tampon utilisé. Dans le cas où il faut complètement différents tampons, effectuez ces étapes tout d’abord avec un seul de ces enzymes et répéter. Le temps nécessaire à la digestion peut varier selon les enzymes de restriction sélectionnés : se référer aux instructions du fabricant pour plus d’informations.
  2. Répétez les étapes 3,2 à 3,7 pour purifier et récupérer le vecteur ADN digéré en fragment et expression dans 30 µL d’eau exempte de nucléase. Quantifier la quantité d’ADN récupéré comme avant.
  3. Calculer la quantité d’ADN d’insertion requis pour un rapport molaire de 3:1 insert/vecteur dans la réaction de ligature, selon l’équation suivante.

    Insérer (ng) = rapport molaire * vecteur (ng) * taille d’insertion (bp) / taille du vecteur (bp)

    NOTE : Les rapports molaires différentes insert/vecteur peuvent être testées, bien que généralement un ratio de 3:1 est suffisant pour obtenir des résultats suffisants.
  4. Mettre en place 20 µL d’une réaction de ligature dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec 40 ng de l’expression vectorielle de la quantité d’ADN chimère calculé à l’étape 5.3, tampon et T4 DNA ligase suivant l’ordre indiqué dans le tableau 5et incuber une nuit à 16 ° C.
    Remarque : L’efficacité de la ligature est généralement augmentée en effectuant la réaction du jour au lendemain à 16 ° C, mais sinon la réaction peut être incubée pendant 2 h à température ambiante.
  5. Transformation de 5 à 10 µL du mélange ligature en chimiquement compétentes d' Escherichia coli (e.coli) établi à la suite de protocoles standard24 Grow en plaques de sélection et prélever des colonies unique pour l’expansion et le plasmide d’ADN isolation selon les protocoles établis,25.
    Remarque : La souche e. coli XL1-Blue a été employée pour ce protocole, mais d’autres variantes d’e. coli peuvent également être utilisés.
  6. Digérer 1 µg les plasmides isolés avec les enzymes de restriction appropriées suivant les instructions à l’étape 5.1 et d’évaluer la présence d’une bande d’ADN d’une taille correspondant à la séquence chimérique par électrophorèse en gel d’agarose (voir étapes 3.2-3.5).
    Remarque : Il est recommandé que la séquence insérée est vérifiée au moyen d’un service de séquençage de l’ADN.
  7. Suite à la vérification de séquence avec succès, les plasmides peuvent être produites en grandes quantités et employés dans un système d’expression chez les mammifères en suivant des protocoles bien établis,26,27.

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Representative Results

Construction et production d’une protéine chimérique (Figure 1) vont être illustrées avec deux membres de la famille des cytokines interleukine-6, OSM et FRV, qui ont fait l’objet d’une étude récemment publiée6. La figure 2 montre la structure tridimensionnelle de ces protéines. Les deux molécules adoptent la structure secondaire caractéristique de classe j’ai cytokines, avec quatre hélices (appelés A à D) emballés dans un paquet et rejoint par boucles28. Les structures alignées des acides aminés des protéines humaines peuvent être vu dans la Figure 3A. Dans cet exemple la région BC de la boucle de l’OSM a été échangé par la séquence correspondante de FRV pour créer une chimère OSM-LIF avec la séquence d’acides aminés comme illustré à la Figure 3B.

Pour ce but, la séquence d’ADN de l’OSM et FRV ont été obtenues et la codage région d’acides aminés correspondant à la boucle de la BC a été identifiée pour les deux cytokines et remplacé (Figure 4). Une balise 6-histidine ne figurait plus dans la partie C-terminale pour faciliter la purification de la protéine en aval. Ensuite, un vecteur approprié pour l’expression chez les mammifères (pCAGGS) a été choisi, et des sites de restriction unique au sein de son site multiple de clonage ont été sélectionnés (PacI et AscI) après s’être assuré qu’ils n’étaient pas présents dans la séquence du gène chimère (voir l’étape 2.1.1.).

Amorces ont été conçues comme indiqué dans tableau 4. L’amorce de l’OSM avant N-terminal comprenait une séquence principale de 9 paires de bases, suivi par le site de restriction de PacI , une entretoise de plasmide spécifiques et les initiales 27 paires de bases d’OSM. L’apprêt inverse C-terminal constituée de la séquence principale suivie par le site de restriction des asques , une entretoise et les 27 dernières paires de bases du gène, qui, dans ce cas particulier, correspond à la balise d’histidine C-terminal. En outre, des amorces de 30-nucléotide s’étendant sur les points de jonction de la boucle de la BC devaient dans les orientations avance et arrière.

La première étape d’amplification PCR se composait de trois réactions distinctes. Le N-terminal OSM fragment, qui exigeait N-terminal OSM vers l’avant et des amorces inverses de début de BC, OSM utilisé comme modèle. La boucle FRV BC a été obtenue par le biais de début de BC avec impatience et BC fin amorces inverses à l’aide de FRV en tant que modèle. Le fragment C-terminal OSM utilisé fin BC avant et amorces inverses C-terminal OSM, ainsi que OSM en tant que modèle. Ces trois fragments, accompagnées des grandeurs attendues de paires de base 385, 75 / 321 respectivement, peuvent être vu dans la Figure 5A après la séparation dans un gel d’agarose à 1 %.

Ces purifié des fragments ont ensuite été utilisés comme un modèle dans la deuxième réaction de PCR, ainsi que de N-terminal OSM vers l’avant et le C-terminal OSM reverse amorces. Le résultat de cette amplification, correspondant à l’OSM-LIF séquence du gène BC boucle et est illustré à la Figure 5B. Cette étape a été suivie d’une purification, une digestion de 4 heures du fragment de gène et le plasmide choisie, l’électrophorèse sur gel et purification, ligature nuitée à 16 ° C et la transformation en e. coli XL1-Blue. Plasmides individuels ont été isolées et examinées par enzyme de restriction digestion pour une insertion correcte du fragment d’ADN (Figure 6). Enfin, hits positifs ont été envoyés pour le séquençage vérifier que la séquence correspond à la chimère de boucle OSM-LIF BC prévue avant de procéder à l’expression de la protéine, purification et test tests fonctionnels6.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la génération de protéine chimérique. (A) le processus de conception chimérique : après la sélection des régions doivent être échangées, la séquence de la chimère désirée et les apprêts nécessaires sont construits au moyen de l’ADN, logiciel de retouche. (B) les étapes principales de la génération des protéines chimériques sont représentés. Deux étapes d’amplification PCR génère une séquence de gène chimère, qui est ensuite digérée par les enzymes de restriction appropriées et liguée dans un vecteur d’expression. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Similarités structurales entre l’OSM et FRV. Représentation des structures cristallines de l’OSM29 (APB : 1EVS) et FRV30 (PDB : 2Q7N), ainsi qu’une représentation approximative de la chimère conçue. Ces cytokines adoptent une conformation de quatre hélices bundle accompagnée de boucles. Cette recherche a été publiée dans le Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Antonino Giuseppe, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Les lignes AB et du D-helix en site de liaison III d’humain Oncostatine M (MSO) sont nécessaires pour l’activation des récepteurs OSM. J Biol Chem 2018 ; 18:7017-7029. © les auteurs6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison des séquences d’acides aminés OSM et FRV. (A) l’alignement des séquences d’acides aminés pleine longueur de humaines OSM et FRV, avec la région de la boucle BC a mis en évidence. Astérisques (*) indiquent les résidus entièrement conservées, deux-points ( :)) correspondent aux acides aminés ayant des propriétés fortement semblables et de points (.) désignent ceux qui ont des caractéristiques semblables faiblement. Séquence d’acides aminés (B) de la chimère de boucle OSM BC, avec la région de la boucle BC de l’OSM, remplacé par son équivalent de FRV. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Séquence d’ADN de la chimère de boucle OSM BC. Séquence de la protéine chimérique de l’OSM. La région insérée d’un FRV est surlignée en orange. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Fragments d’amplification de l’ADN de chimère OSM BC boucle. (A) résultent de l’amplification par PCR de la première, avec des bandes correspondant à la région N-terminale (piste 2), boucle de BC (piste 3) et région C-terminale (piste 4). (B) résultent de l’amplification par PCR deuxième, dont les trois bandes obtenues dans la première amplification sont combinés pour générer la chimère de l’OSM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Insertion de la chimère de boucle OSM BC dans le vecteur plasmidique. Enzyme de restriction digestion des plasmides générés, avec une bande inférieure présente à ~ 700 paires de base indiquant l’insertion correcte de la séquence du gène chimère OSM. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Réactif Concentration de stock Volume (en 50 µL)
Eau stérile à 50 µL
Mémoire tampon d’ACP 10 X 5 ΜL
dNTPs 10 mM 1 ΜL
DMSO 100 % 1,5 ΜL
Primer avant 10 ΜM 1 ΜL
Inverser l’apprêt 10 ΜM 1 ΜL
Modèle de l’ADN Variable Comme l’exige pour les 2,5 à 12,5 ng d’ADN plasmidique
Phusion haute-fidélité ADN polymérase 2 unités/µL 0,5 ΜL

Tableau 1 : Réactifs nécessaires pour le mélange de réaction PCR.

Fragment N-terminal Insertion de chimérique Fragment C-terminal
Primer avant N-terminal avant Première jonction avec impatience Second carrefour vers l’avant
Inverser l’apprêt Premier croisement inverse Second carrefour inverse C-terminal inverse
Modèle de l’ADN Destinataire Bailleurs de fonds Destinataire

Tableau 2 : Primer et les modèles nécessaires à la production d’une protéine chimérique standard.

Étape du cycle Température Temps Nombre de cycles
Dénaturation initiale 98 ° C 101 1
Dénaturation 98 ° C 10 s 23-25
Recuit 68 ° C * 455 23-25
Extension 72 ° C 30 s par kilobases 23-25
Extension finale 72 ° C 300 s 1
Maintenez 4 ° C ∞ 1
* Au moins 5 ° c inférieure à la température de fusion de l’apprêt

Tableau 3 : Protocole PCR utilisé pour amplifier les fragments chimériques et la protéine pleine chimérique.

Réactif Concentration de stock Volume (en 50 µL)
Eau stérile à 50 µL
Enzyme de restriction tampon * 10 X 5 ΜL
Modèle de l’ADN Variable Comme nécessaires à 1 µg d’ADN
Enzyme #1 Variable 1 ΜL
Enzyme #2 Variable 1 ΜL
* S’assurer que les deux enzymes sont compatibles avec le tampon sélectionné

Tableau 4 : Éléments de la réaction de digestion d’enzymes de restriction.

Réactif Concentration de stock Volume (en 20 µL)
Eau stérile à 20 µL
T4 DNA Ligase tampon 10 X 2 ΜL
Vecteur ADN Variable Comme l’exige pour 40 ng d’ADN
Insérer l’ADN Variable Au besoin, pour un rapport molaire de 3:1
T4 DNA Ligase Variable 1-2 ΜL

Tableau 5 : Les réactifs nécessaires à la réaction de ligature.

Nom Séquence d’amorce
Apprêt avant OSM N-terminal (PacI) AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG
C-terminal HisTag reverse primer (AscI) TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG
Début de boucle BC avec impatience AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC
Boucle de BC commencer inverse GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT
Fin de boucle BC avec impatience GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC
Fin de boucle BC inverser GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC

Tableau 6 : Les amorces utilisées dans la production de la chimère de boucle OSM BC.

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Discussion

La génération des protéines chimériques constitue une technique polyvalente, qui est en mesure d’aller au-delà des limites des protéines tronquées pour répondre aux questions telles que la modularité de cytokine-récepteur liaison domaines13. Le design des chimères est une étape clé dans ce genre d’études et nécessite un examen attentif. Des études préliminaires pour établir des domaines fonctionnels nécessitera généralement substitution de vastes régions dans une première phase, tandis que les plus petits remplacements de longueurs variables conviennent mieux à des études détaillées d’une région unique. Une attention particulière il faut de la présence de petits motifs conservés au sein d’une famille de protéines dans cette étape, car ce sont souvent des sites fonctionnels31,32. Expérience personnelle indique que plus d’un tour de conception de protéines chimériques peut être nécessaire d’affiner une région clé fonctionnelle, avec chaque tour nécessitant une importante temps (semaines ou mois) de la conception initiale à l’essai de test fonctionnel.

Tant qu’il existe une protéine structurellement similaire à la protéine d’intérêt, mais possédant des fonctions biologiques divergentes, la méthode est applicable à n’importe quelle séquence d’intérêt, bien qu’il doit être optimisé pour chaque gène particulier en raison de sa dépendance sur PCR amplification. En particulier, gènes possédant des régions riches en GC pourraient s’avérer des cibles particulièrement difficiles, car ces types de séquences sont connus pour réduire l’efficacité de l' amplification33. Ces questions peuvent généralement être résolues par différents moyens, tels que l’ajout de différents additifs (par exemple la bétaïne) pour la réaction, l’utilisation de tampons spécialisés ADN polymérase ou la modification des paramètres recuit34. Par conséquent, il faudra généralement quelques essais et erreurs avant que les conditions adéquates pour le gène d’intérêt sont trouvent.

Le protocole fourni est basé sur le classiques axée sur l’enzyme de restriction méthodes de clonage, qui sont généralement accessibles à tous les types de laboratoire, mais il peut être plus adapté pour profiter de plus avancé des techniques de clonage. Par exemple l’utilisation de clonage gateway, qui facilite l’insertion même dans plusieurs différents vecteurs (p. ex. si les systèmes d’expression différents doivent être testés en parallèle), le clonage simplement nécessite notamment attB sites de recombinaison en place les sites de restriction détaillées dans ce protocole35. Autres méthodes de clonage plus récents peuvent contourner la nécessité d’une deuxième réaction de PCR (p. ex. utilisateur36 ou Gibson Assemblée37) et la ligature (p. ex. séquence et indépendante de la ligature de clonage (SLIC)38 ou Assemblée en-fusion 39). tout en nécessitant différents réactifs et stratégies de conception d’amorce, lecteurs ayant accès à ces méthodes sont encouragés à appliquer pour accélérer considérablement la génération de constructions chimériques après avoir suivi les principes de conception de base détaillées à l’étape 1 du présent protocole.

Dans l’ensemble, l’application de cette méthode peut fournir des indications précieuses quant aux mécanismes de quel autre protéine fonctions biologiques ont lieu, impliquant en particulier des protéines ou des interactions acides nucléiques-protéines et constituent un outil utile pour identifier et préciser les relations structure-fonction unique au sein d’une famille de protéines6.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la société Max Planck et la clinique Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Allemagne). Cadre de cette recherche a été publiée dans le Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Antonino Giuseppe, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Les lignes AB et du D-helix en site de liaison III d’humain Oncostatine M (MSO) sont nécessaires pour l’activation des récepteurs OSM. J. Biol. chem., 2018 ; 18:7017-7029. © les auteurs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labcycler thermocycler Sensoquest 011-103 Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000C  DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladder ThermoFisher Scientific SM0241
GeneRuler DNA Ladder Mix ThermoFisher Scientific SM0331
AscI restriction enzyme New England Biolabs R0558
PacI restriction enzyme New England Biolabs R0547
Phusion Hot Start II DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F-549S
dNTP set (100 mM) Invitrogen 10297018
T4 DNA ligase Promega M1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit Macherey-Nagel 740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock ThermoFisher Scientific MHS6278-202857165
LE agarose Biozym 840004
Primers Sigma-Aldrich Custom order
Human Oncostatin M cDNA Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

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References

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