Summary
Структурно похожие белки часто оказывают различные биологические функции. Обмена эквивалентной регионов этих белков с целью создания химерных белки представляет собой новаторский подход для выявления критических белков регионов, которые отвечают за их функциональных различий.
Abstract
Цель настоящего протокола включает в себя дизайн химерных белков, в которых отдельных регионах белка заменяются их соответствующих последовательностей в структурно аналогичных белка, с целью определения функциональной значимости этих регионов. Такие химер генерируются с помощью вложенных протокол постановки ПЦР с использованием перекрывающихся фрагментов ДНК и адекватно разработан грунтовки, а затем их выражение в рамках млекопитающих системы для обеспечения родной вторичной структуры и столб-поступательные изменения.
Функциональная роль различных региона обозначается затем потеря активности Химера в assay соответствующей индикации. В следствие определены регионы, укрывательство набор важнейших аминокислот, который может далее экранируется дополнительных методов (например , сайт Направленный мутагенез) для увеличения молекулярного разрешения. Хотя ограничиваться случаями, в которых можно найти структурно связанные белком с различными функциями, химерных белки с успехом используются для выявления критических привязки регионов в белках, таких как цитокинов и цитокина рецепторов. Этот метод особенно подходит в тех случаях, в которых белка функциональных регионов не будут четко определены и представляет собой ценный первый шаг в направленной эволюции подходов к сузить области интереса и уменьшить затраты скрининга.
Introduction
Несколько видов белков, в том числе цитокинов и факторы роста, группируются в семьях, члены которых разделяют подобные трехмерной структуры, но часто оказывают различные биологические функции1,2. Это функциональное разнообразие обычно является следствием небольшие различия в аминокислотный состав внутри молекулы активных сайтов3. Выявление таких участков и функциональных детерминанты не только предлагают ценную эволюционной но также для разработки более конкретных агонисты и ингибиторы4. Однако большое количество различий в составе остатков, часто встречаются между структурно похожие белки усложняет эту задачу. Даже несмотря на то, что строительство большой библиотеки, содержащие сотни мутантов в настоящее время это возможно, оценки каждый один остаток вариации и комбинации из них по-прежнему остается сложным и отнимает много времени усилий5.
Методы оценки функциональной значимости регионов больших белка, таким образом, значение для уменьшения числа возможных остатков к управляемым число6. Усеченные белки были наиболее часто используемых подход к решению этой проблемы. Соответственно регионы считаются функционально актуальны, если функцию белка под исследования зависит от удаления конкретного региона7,8,9. Однако главным недостатком этого метода является, что удаления может повлиять на вторичную структуру белка, приводит к сворачиванию, агрегации и невозможность для изучения предполагаемого региона. Хорошим примером является усеченная версия цитокина oncostatin M (OSM), в котором внутреннего исключения, больше, чем 7 остатков привело к смятых мутантов, которые не могут быть в дальнейшем учился10.
Поколение химерных белков является альтернативной и новаторский подход, который позволяет анализ крупных областей белка. Цель данного метода является обмен регионы интереса в протеине, структурно связанных последовательностей в другой белок, чтобы оценить вклад замененных разделов для конкретных биологических функций. Широко используется в области сигнализации приемные устройства для определения функциональных областях11,12, химерных белки являются особенно полезными для изучения белков семей с мало аминокислоты личность, но сохраняется вторичной структуры. Соответствующие примеры можно найти в классе, интерлейкина-6 (IL-6) типа цитокинов, таких как интерлейкина-6 и цилиарной нейротрофических факторов (6% последовательности идентификаторов)13 или лейкемия ингибирующего фактор (LIF) и OSM (20% удостоверение)6, на котором основан после протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. химерных белка дизайн
- Выберите подходящий белка (донор) для обмена регионов с протеина интереса (получателя) доноров белка должно быть структурно похожи, идеально принадлежащих к той же семье белков, но не хватает биологической активности использоваться как индикация. Если не структурно похожие белки, как известно, потенциальные кандидаты могут быть определены с помощью автоматизированного инструмента как инструмент поиска выравнивание вектора (VAST)14,15
- Доступ белка банк данных (PDB)16 Европейский веб-сайт (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), ввести имя протеина интереса в поле поиска в верхнем правом углу и нажмите «Поиск». Условии, что кристаллическая структура доступен, не вниз PDB идентификатор (PDB ID; например 1evs для OSM).
Примечание: Если структурных данных не доступен в PDB, модель гомологии белка может быть порождена такого инструмента, как швейцарский-модель17 вместо, используя доступные пошаговые протоколы18. - Доступ к ОБШИРНОЙ веб-сайт (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). В случае, если доступен идентификатор PDB, прокрутите вниз до раздела «Получить предварительно вычисленных результатов», imput PDB ID в поле «Показать аналогичные структуры для» и нажмите «Перейти». На следующем экране нажмите на «Оригинальные ОБШИРНЫЕ» и затем «Всю цепь» чтобы увидеть список идентификаторов PDB для потенциальных кандидатов-структурно похожи.
- Если PDB ID недоступна, но была создана модель гомологии, прокрутите вниз до раздела «Поиск с новой структурой» и нажмите на ссылку «ПОДАВЛЯЮЩЕЕ Поиск». Загрузите файл PDB модели, нажав кнопку «Browse» рядом с «Отправить PDB-файл», выбрав файл и нажав кнопку «Отправить».
- После PDB файл загружается, нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать ОБШИРНЫЕ вычисления. После того, как производится расчет, нажмите на «Всю цепь» в домены, чтобы увидеть PDB идентификаторы структурно похожие белки.
- Оцените биологические функции интереса (например активации рецептора, Ферментативная активность, активность фактора транскрипции) лучших кандидатов, либо экспериментально в системе индикация выбора или через поиск литературы. Выберите доноров белка с различные функции по сравнению с протеина интереса.
- Доступ белка банк данных (PDB)16 Европейский веб-сайт (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), ввести имя протеина интереса в поле поиска в верхнем правом углу и нажмите «Поиск». Условии, что кристаллическая структура доступен, не вниз PDB идентификатор (PDB ID; например 1evs для OSM).
- Получите белка аминокислотных последовательностей белков получателей и доноров из базы данных ссылка последовательности (RefSeq)19 .
- Доступ к разделу гена в RefSeq веб-страницы (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), введите имя протеина интереса в поле поиска и нажмите кнопку «Поиск». Нажмите на имя гена для желаемого вида в списке результатов.
- Перейдите в раздел RefSeq, чтобы увидеть все документально изоформ. Нажмите на идентификатор последовательности для изоформы интерес (начиная с Нм), прокрутите вниз и нажмите на «CD» выделить регионе белка кодирование гена. В правом нижнем углу экрана нажмите на «FASTA» и скопируйте последовательности гена.
- Сохраните последовательность ДНК, используя подходящий ДНК, программное обеспечение для редактирования. При использовании свободно доступных ApE20, откройте программу, вставьте скопированные последовательности в поле пустым, выберите имя последовательности и нажмите «Сохранить».
Примечание: Повторите шаги 1.2.1. для 1.2.3. для одного или более доноров белки выбран.
- Выберите регионы белков должен быть заменен в различных химерных конструкции.
- Разделите белка последовательность интереса в отдельных структурных регионах. В идеале разные домены для белка в вопросе будет были описаны в литературе. Если это не так, существование сохранены структурных особенностей (спиралей, петли) должны оцениваться в шагах 1.3.1.1. для 1.3.1.4.
- Скачать структурных данных протеина интереса с веб-сайта PDB (см. шаг 1.1.1.). Доступ к странице PDB для протеина и загрузка PDB-файл, нажав кнопку «Скачать» в правой части экрана.
- Откройте файл PDB в молекулярной визуализации системы как PyMOL (https://pymol.org/). В PyMOL, отображение последовательности нуклеотидов (нажав дисплей > последовательность на), скрыть структурных данных по умолчанию (, выбрав H рядом с PDB ID, «все») и выберите представление «мультфильм» четко визуализировать протеина структурного особенности (нажав S рядом с PDB ID и выбора «карикатура»).
- Нажмите на последовательности нуклеотидов в верхней части экрана, чтобы выделить различные части молекулы, отмечая вниз аминокислоты, соответствующий каждой структурной особенностью.
- Аннотируйте отдельных структурных регионов на последовательности ДНК в Апе. Чтобы сделать это, откройте последовательности ДНК из шага 1.2.3. нуклеотидов, кодирования для аминокислот в регионе, щелкните правой кнопкой мыши на выделение, выберите выберите «Новая функция» дать ему имя и цвет. Повторите этот процесс для каждого структурного региона, выявленных на предыдущем шаге.
Примечание: Выбор нуклеотидов может дважды проверили, нажав ORFs > перевести, а затем нажмите OK, чтобы обеспечить, что они код для правильного аминокислотной последовательности. - Выравнивание последовательностей остатки двух белков, используя инструмент выравнивания протеина (например Clustal Омега21).
Примечание: Поскольку химер должны производиться в системе млекопитающих выражения, эти последовательности должен включать белки сигнал пептиды.- Получить полный аминокислотных последовательностей доноров и рецептор белков в ApE, путем открытия последовательностей ДНК из шага 1.2.3., выбрав их и нажав ORFs > перевести.
- Доступ к странице Clustal Омега (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) и imput аминокислотных последовательностей двух белков, затем прокрутите вниз и нажмите кнопку «Отправить». Каждой последовательности должны быть продолжил линией текста с ' > ProteinName' быть должным образом определены...
- Извлеките файл выравнивания, нажав на вкладку «Файл выравнивание загрузки» и сохранить его. Этот файл может быть открыт любой программы для редактирования текста.
- С помощью выравнивание файла в качестве ссылки, аннотации соответствующих структурных регионах доноров белка в их последовательности ДНК (см. шаг 1.3.2.).
- Решите, какие регионы белка для обмена в химерных белков и разрабатывать соответствующие нуклеотидные последовательности для химер.
Примечание: В отсутствие подробной информации о функциональной значимости различных регионов, предлагается выбрать крупных замен например весь петли или спиралей оценить, какие из них имеют влияние на функции белка. Этот первый исследовательский эксперимент может затем второй раунд химерных белка дизайн, сосредоточены на меньшие замен в соответствующих регионах.- Создайте копию аннотированный ДНК последовательности белка рецептора из шага 1.3.2. и переименовать его как химерных белка. Откройте переименованный последовательности ДНК в ApE, выделите и удалите нуклеотидной последовательности кодирования для региона обменялись и заменить его соответствующего региона в протеине доноров (копируется с аннотированной последовательности, созданной на шаге 1.3.3.), а затем сохраните изменения.
Примечание: Создать новую копию и повторите этот шаг для каждого разные Химера разработаны.
- Создайте копию аннотированный ДНК последовательности белка рецептора из шага 1.3.2. и переименовать его как химерных белка. Откройте переименованный последовательности ДНК в ApE, выделите и удалите нуклеотидной последовательности кодирования для региона обменялись и заменить его соответствующего региона в протеине доноров (копируется с аннотированной последовательности, созданной на шаге 1.3.3.), а затем сохраните изменения.
- Разделите белка последовательность интереса в отдельных структурных регионах. В идеале разные домены для белка в вопросе будет были описаны в литературе. Если это не так, существование сохранены структурных особенностей (спиралей, петли) должны оцениваться в шагах 1.3.1.1. для 1.3.1.4.
2. Подготовка молекулярное клонирование
- Выберите вектор плазмиды, подходит для выражения системы выбора. Для млекопитающих выражения высокий выражение вектор как pCAGGS22 или серии вектор pcDNA рекомендуется.
- Для энзима ограничения based клонирование продемонстрировал в этом протоколе, убедитесь, что места уникальные ограничения, присутствует в нескольких клонирования сайта (MCS) вектора совместимы с протеина интереса. Чтобы сделать это, откройте последовательности ДНК химерных конструкций с ApE, нажмите ' ферменты > фермент селектор ' и убедитесь, что по крайней мере два места ограничения в MCS отсутствуют в последовательности (Отображение нулевой рядом с их именем).
- Дизайн терминала грунтовки с помощью редактора ДНК, таких как обезьяна.
- Создайте новый файл ДНК (файл > Новая) и инициировать N-терминальный грунт с лидером последовательности (3-9 дополнительных пар оснований, например AAAGGGAAA), последовал первый ограничение сайта, выбранного вектора MCS (6-8 пар оснований, например TTAATTAA для Голд), необязательные разделители (например , GCTAGCGCATCGCCACC в векторе pCAGGS используется в примере) и пар оснований первоначальный 18-27 гена интереса (например ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG для OSM).
- В новом файле ДНК, C-терминала грунтовка последовательность начинается с окончательным 18-27 пар гена интереса (например CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA для гена с тегом 6xHistidine C-терминала), следуют необязательные разделители (например TAGCGGCCGC в pCAGGS вектор), вторым ограничением сайт выбрал (например GGCGCGCC для AscI) и лидер последовательность (например AAAGGGAAA). Выделите всю последовательность, щелкните правой кнопкой мыши и выберите реверс-дополнения для получения обратного грунтовка.
- Праймеры дизайн для каждого из пограничных регионов химерных конструкции.
- Откройте последовательности ДНК химеры (создана на шаге 1.3.4.1.) и выделить область 30 пар в зоне, где оригинальный и вставленных последовательности находятся в контакте, включающей 15 пар оснований каждой последовательности. Скопируйте региона (щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Copy») и вставьте его в новый файл ДНК; Эта последовательность будет вперед грунтовка.
- Сделайте копию вперед грунт, созданный в предыдущем шаг и переименовать его как обратный грунт. Выделите последовательность праймера, щелкните правой кнопкой мыши и выберите реверс-дополнения для создания последовательности обратный грунт.
- Повторите шаги 2.3.1. и 2.3.2. для каждой контактной зоны в химерных последовательности ДНК. Как правило два набора праймеров реверса обязаны генерировать одну химера, если замена происходит на N-терминала или регионах C-терминала.
- Заказывайте терминал и внутренней праймеры от поставщика синтеза олигонуклеотида.
Отмечает: С помощью высоко очищенный терминала грунтовки (например ВЭЖХ очищенная) может иметь положительное влияние в протокол успеха. Обессоленной внутренней праймеры обычно обеспечивают хорошие результаты. - Получите шаблон последовательности генов донора и рецептора.
Примечание: Используя плазмид, содержащие открытые чтения фреймов (ORFs) этих последовательностей как шаблон значительно облегчает процедуру и рекомендуется. В качестве альтернативы комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) генерируется из строки ячейки, известный выразить эти гены можно использовать как шаблон для последующих шагов.
3. полимеразная цепная реакция (ПЦР) амплификация фрагментов отдельных ДНК, образуя Химера
- Подготовка индивидуальных смесь реакции PCR для каждого из фрагментов, составляющих химерных белка. Типичная химерных белка потребует три отдельных фрагментов: часть N-терминала, региона вставляются и части C-терминала.
Отмечает: Используйте высококачественный ДНК-полимеразы (например Phusion High Fidelity ДНК-полимеразы), чтобы избежать внедрения мутаций в последовательности. Реакции PCR можно настроить в вечернее и запустить на ночь.- Набор, отцентрифугировать 1,5 мл трубки на льду и пипетки различные реагенты PCR смесей в порядке, указанном в таблице 1, обеспечивают правильный грунты и шаблоны используются для каждой реакции PCR (см. таблицу 2).
- Ярлык две Трубы тонкостенные 0.2 мл ПЦР для каждой реакции и передачи 20 мкл соответствующего смеси ПЦР в каждой тюбике. Передача ПЦР трубы в Термоциклер ПЦР и инициировать протокол, подробно изложены в таблице 3.
Примечание: отжига температура должна быть по крайней мере 5 градусов ниже, чем температура плавления дизайн праймеров.
- Во время ПЦР, подготовьте 100 мл геля агарозы 1% в буфер Tris-ацетат-ЭДТА (ТЭ). Для этой цели весят 1 g агарозы, смешать со 100 мл TAE буфера в стеклянную колбу и СВЧ пока агарозы полностью растворится, закрученной колбу каждые 30-40 секунд. Разрешить охлаждения до примерно 50 ° C, добавить 2-3 мкл бромид ethidium (или эквивалентный краситель ДНК) и залить в каппу для геля с желаемой хорошо Расчески.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: бромид ethidium — известный мутаген, обеспечить использование надлежащих средств защиты. - После завершения реакции PCR, мкл 4 6 x ДНК загрузки буфера в каждой тюбике. Вставьте в устройство электрофореза геля агарозы 1%, накрыть буфер TAE и тщательно загрузить образцы в гель наряду с трапом молекулярного веса.
Примечание: во время загрузки, предпочтительнее оставить пустым полос между выборками для облегчения восстановления ДНК потом. - Побегите гель на 80-120 V на 20-45 минут.
Примечание: банды под 1000 пар может обычно быть electrophoresed примерно за 20 минут на 120 V, в то время как более крупные группы потребует больше времени. - Выключите устройство электрофореза, вывезти геля агарозы и визуализировать амплифицированного ДНК полос под ультрафиолетовым светом. С помощью лезвия бритвы, вырезать из отдельных фрагментов ДНК от геля и передавать их метками 2 мл отцентрифугировать трубы.
Примечание: Свести к минимуму время экспозиции УФ света во избежание повреждения ДНК. - Использование ПЦР очистки комплект для очистки различных фрагментов ДНК (см. Таблицу материалы).
- 500 мкл буфера NTI, представленной в комплект к каждой трубе, содержащий фрагмент гель. Переезд в thermomixer на 50-55 ° C и тряски на 1000 об/мин, до тех пор, пока гель полностью раствориться в буфер.
- Каждое решение передать столбец помечены комплект, спина в microcentrifuge (30-60, 11000 x g) и отбросить проточные. 700 мкл буфера мытья NT3 комплект, центрифуга снова под те же параметры и отбросить проточные. Центрифуга столбцы снова для 1-2mins на 11000 x g сухой кварцевый мембрана внутри столбца.
- Перевести столбец с меткой 1,5 мл отцентрифугировать, накапайте 30 мкл нуклеиназы свободной воды в столбце, пусть стоять за 1 минуту и центрифуги 30-60 на 11000 x g элюировать ДНК.
- Подсчитать количество ДНК, восстановлены путем измерения оптической плотности образца на 260 Нм и 340 Нм в спектрофотометр (см. Таблицу материалы). Концентрации ДНК рассчитывается путем вычитания 340 Нм при чтении из 260 Нм рис, затем умножением на ДНК в вымирания коэффициент (50 мкг/мл)23.
Отмечает: Дополнительные измерения в 230 Нм и 280 Нм позволяют оценить чистоту ДНК: 260/280 и 260/230 соотношения выше 1.8 в целом рассматриваются как чисто для ДНК. Протокол может быть приостановлено после этого шага, хранение eluted дна на 4 ° C (кратковременно) или от-20 ° C (долгосрочные).
4. ПЦР-амплификации создания химерных ДНК последовательности
- Настройка 50 мкл реакции PCR предохранитель отдельных составляющих Химера. Выполните те же шаги, подробно изложены в 3.1, используя N- и C-терминала праймеры наряду с 10 нг каждого из ДНК фрагментов полученных в шаге 3.7.
Примечание: Реакции PCR можно задать в вечернее и запустить на ночь. - Повторите шаги с 3,2 до 3,7 восстановить и количественно очищенная ДНК фрагмента в 30 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Этот фрагмент содержит химерных последовательности ДНК, обрамленная ограничения сайтов, включенных в терминал грунтовки.
5. Включение химерных ДНК в вектора выражения
- Лейбл две 1,5 мл отцентрифугировать трубы и пипетки, различные реагенты в порядке, указанных в таблице 4, добавив 1 мкг выбранного выражения вектор в одной из труб и 1 мкг восстановленного фрагмента ДНК в другой. Инкубируйте 1-4 ч при 37 ° C для выполнения пищеварения с выбранной энзимами ограничения.
Отмечает: Убедитесь, что оба энзимов ограничения совместимы с буфером занятых. В случае, если они требуют совершенно разных буферов, сначала выполнить эти шаги только с одним из ферментов и повторить. Время, необходимое для пищеварение может варьироваться в зависимости от энзимов ограничения выбраны: обратитесь к инструкциям производителя для получения подробной информации. - Повторите шаги 3.2 до 3,7 очистить и восстановить переваривается ДНК фрагмента и выражение вектор в 30 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Подсчитать количество ДНК, восстановлены, как раньше.
- Рассчитайте количество дна вставки необходимых для молярное соотношение 3:1 вставить/вектор в реакции перешнуровки, используя следующее уравнение.
Вставка (нг) = молярное соотношение * вектор (нг) * Размер пластины (bp) / размер вектора (bp)
Примечание: Молярная соотношения различных Вставка/вектор может быть проверена, хотя обычно соотношении 3:1 достаточно получить адекватные результаты. - Настройка 20 мкл реакции перешнуровки в 1,5 мл отцентрифугировать с 40 нг выражения векторная сумма химерных ДНК, рассчитанных в шаге 5.3, буфер и T4 ДНК лигаза в порядке, указанных в таблице 5и Инкубируйте на ночь на 16 ° C.
Примечание: Перевязка эффективность как правило увеличивается, выполняя реакции на ночь на 16 ° C, но альтернативно реакция может быть инкубировали втечение 2 ч при комнатной температуре. - Преобразование в 5-10 мкл лигирование смесь в химически сведущее Escherichia coli (E. coli) подготовила следующие стандартные протоколы24 растут в выбор плит и выбрать один колоний для расширения и плазмида ДНК изоляция в соответствии с установленными протоколами25.
Примечание: Штамм E. coli XL1-синий был нанят для этого протокола, но могут также использоваться другие варианты E. coli . - Дайджест 1 мкг изолированных плазмид с соответствующим энзимами ограничения следуя инструкциям в шаге 5.1 и оценить наличие ДНК группы размер, соответствующий химерных последовательности электрофорезом геля агарозы (см. шаги 3,2-3,5).
Примечание: Рекомендуется, что вставленные последовательность проверяется посредством службы секвенирования ДНК. - После проверки успешной последовательности плазмиды могут быть произведены в больших количествах и используемых в системе млекопитающих выражения следующие устоявшиеся протоколы26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С двумя членами семьи интерлейкина-6 цитокина, OSM и LIF, которые были предметом недавно опубликованное исследование6будет примером строительства и создания химерных белка (рис. 1). Рисунок 2 показывает трехмерную структуру этих белков. Обе молекул принять характерным вторичная структура класса я цитокинов, с четырьмя спиралей (называется A-D) Упакованные в связку и соединены петлями28. Соответствие аминокислоты структур человека белков можно увидеть в рисунке 3A. В этом примере цикл БК Регион OSM был обмен соответствующей последовательности LIF создавать химеры OSM-Лиф с аминокислотной последовательности, как показано на рисунке 3B.
Для этого были получены цель, последовательности ДНК OSM и лиф и кодирования аминокислоты региона соответствующего цикла до н.э. был определен как цитокинов и заменить (рис. 4). 6-гистидина был дополнительно включен в C-конечная для облегчения очистки течению белка. Далее, был выбран подходящий вектор для млекопитающих выражение (pCAGGS), и уникальные ограничения сайтов в пределах несколько клонирования сайта были выбранного (Голд и AscI) после того, что они не присутствовали в последовательности химерных гена (см. шаг 2.1.1.).
Праймеры были разработаны, как показано в Таблица 4. N-терминальный вперед OSM грунтовка включены ведущих последовательность 9 пар оснований, следуют Голд ограничение сайта, плазмида конкретных распорка и первоначальный 27 низкопробных пар OSM. C-терминал обратный грунтовка включены ведущих последовательности следуют на сайте ограничение AscI , распорки и 27 последний низкопробных пар гена, что в данном конкретном случае соответствует гистидина C-терминала. Кроме того в прямом и обратном направлениях необходимы 30-пары праймеров, охватывающих точки соединения цикла до н. Э.
Первый шаг амплификации PCR состоял из трех отдельных реакций. N-терминальный OSM фрагмент, который требует N-терминальный OSM вперед и до н.э. начало обратный грунты, используемые OSM как шаблон. Петля LIF до н.э. был получен через до н.э. начало вперед и до н.э. обратный грунтовки конец с помощью LIF как шаблон. C-терминал OSM фрагмент используется до н.э. конец вперед и обратный грунтовки OSM C-терминал, а также OSM как шаблон. Соответственно, эти три фрагментов, с ожидаемой Размеры 385, 75 и 321 пар оснований можно увидеть на рис. 5A после разделения в гель агарозы 1%.
Эти очищенного фрагменты были затем используется как шаблон в второй реакции PCR, наряду с N-терминальный OSM вперед и C-терминала OSM обратный грунтовки. В результате этого усиления, соответствующий OSM-LIF последовательности гена цикла до н.э. и показан на рис. 5B. Этот шаг последовал очистки, 4-часовой пищеварение фрагмента гена и выбранной плазмида, электрофорез геля и очистки, ночь лигирование на 16 ° C и превращение в E. coli XL1-синий. Индивидуальных плазмиды были изолированы и экранируется Пищеварение энзима ограничения для правильной вставки фрагмента ДНК (рис. 6). Наконец положительные ответы были отправлены для виртуализации, чтобы убедиться, что последовательность соответствует предполагаемой Химера цикла OSM-лиф до н.э. прежде чем приступить к выражение протеина, очистки и тестирования в функциональных анализов6.
Рисунок 1 : Схематическое представление химерных белка поколения. (A) процесс химерных проектирования: после выбора регионов для обмена, последовательность желаемого химеры и необходимые праймеры построены с помощью ДНК, программное обеспечение для редактирования. (B) изображены основные шаги в поколение химерных белков. Два шага амплификации PCR производят химерных генная последовательность, которая затем переваривается с соответствующим энзимами ограничения и лигируют в выражении vector. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Структурное сходство между OSM и LIF. Представление структуры кристалла OSM29 (PDB: 1EVS) и LIF30 (PDB: 2Q7N), а также приблизительное представление разработанных химеры. Эти цитокины принимают четыре винтовой расслоение конформации присоединились петли. Это исследование был первоначально опубликован в журнал биологической химии. Адриан Сегарра, ж. м., Шиндлер, н., Gajawada, P., Lörchner, ч., Браун, т. & Pöling, Дж. Цикл AB и D-спирали в привязки сайта III М человеческого Oncostatin (OSM) для активации рецептора OSM. J. Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © Авторы6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Сравнение OSM и LIF аминокислотных последовательностей. (A) выравнивание полнометражного аминокислотных последовательностей человека OSM и LIF, с выделены региона цикла до н. Э. Звездочками (*) указывает полностью сохранившихся остатков, двоеточия (:) соответствуют аминокислоты с сильно аналогичными свойствами и точки (.) обозначает те с слабо сходные черты. (B) аминокислотной последовательности цикла химеры OSM до н.э., с регионом до н.э. петля OSM, заменить его эквивалент LIF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Последовательность ДНК химеры цикла OSM до н. Э. Последовательность химерных OSM белка. Региона, вставленных из ЛИФА выделен оранжевым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Фрагменты амплификации дна Химера цикла OSM до н. Э. (A) результате первого амплификации PCR, с полосы, соответствующие регионе N-терминальный (пер. 2), цикл до н.э. (переулок 3) и C-терминала региона (пер. 4). (B) в результате второй амплификации PCR, в котором три полосы, полученные в первые усилители объединяются для создания OSM Химера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Вставка цикла Химера OSM до н.э. в вектор плазмиды. Пищеварение энзима ограничения сгенерированный плазмид, с Нижняя полоса присутствует на ~ 700 пар оснований, указывающий правильную ориентацию последовательности гена Химера OSM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Реагент | Складе концентрация | Объем (в 50 мкл) |
| Стерильная вода | до 50 мкл | |
| Буфер ПЦР | 10 X | 5 МКЛ |
| дНТФ | 10 мм | 1 МКЛ |
| ДМСО | 100% | 1.5 МКЛ |
| Форвард грунтовка | 10 МКМ | 1 МКЛ |
| Обратный грунтовка | 10 МКМ | 1 МКЛ |
| Шаблон ДНК | Переменная | При необходимости для 2,5-12,5 нг плазмидной ДНК |
| Phusion высокая точность ДНК-полимераза | 2 единицы/мкл | 0.5 МКЛ |
Таблица 1: Реактивы, необходимые для ПЦР реакционной смеси.
| N-концевого фрагмента | Химерных вставки | C-терминала фрагмент | |
| Форвард грунтовка | N-терминальный вперед | Первый перехода вперед | Второй узел вперед |
| Обратный грунтовка | Первый узел обратного | Второй узел обратного | C-терминала реверс |
| Шаблон ДНК | Получатель | Доноры | Получатель |
Таблица 2: Грунтовка и шаблоны, необходимые для создания стандартного химерных белка.
| Шаг цикла | Температура | Время | Количество циклов |
| Первоначальный денатурации | 98 ºC | 30 лет | 1 |
| Денатурация | 98 ºC | 301 | 23-25 |
| Отжиг | 68 ° C * | 25S | 23-25 |
| Расширение | 72 ° C | 30 лет на kilobase | 23-25 |
| Окончательное расширение | 72 ° C | 300S | 1 |
| Удерживайте | 4 ° C | ∞ | 1 |
| * Минимум 5 ° c ниже, чем температура плавления грунтовка | |||
Таблица 3: ПЦР протокол, используемый для того чтобы усилить химерных фрагменты и полный химерных белка.
| Реагент | Складе концентрация | Объем (в 50 мкл) |
| Стерильная вода | до 50 мкл | |
| Энзима ограничения буфера * | 10 X | 5 МКЛ |
| Шаблон ДНК | Переменная | При необходимости для 1 мкг ДНК |
| Фермент #1 | Переменная | 1 МКЛ |
| Фермент #2 | Переменная | 1 МКЛ |
| * Убедитесь, что оба фермента совместимы с буфером выбранных | ||
Таблица 4: Компоненты реакции пищеварения энзима ограничения.
| Реагент | Складе концентрация | Объем (в 20 мкл) |
| Стерильная вода | до 20 мкл | |
| T4 ДНК лигаза буфер | 20; | 2 МКЛ |
| ДНА вектора | Переменная | При необходимости для 40 нг ДНК |
| Вставка ДНК | Переменная | При необходимости для молярное соотношение 3:1 |
| T4 ДНК лигаза | Переменная | 1-2 МКЛ |
Таблица 5: Реактивы, необходимые для реакции перешнуровки.
| Имя | Грунтовка последовательность |
| N-терминальный OSM вперед грунт (Голд) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-терминала HisTag обратный грунт (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| До н.э. начало цикла вперед | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| До н.э. петля начать обратный | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| До н.э. конец цикла вперед | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| Обратный конец цикла до н.э. | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Таблица 6: Грунтовки используется в поколении химеры цикла OSM до н. Э.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поколение химерных белков представляет универсальный метод, который может выйти за пределы усеченным белков на вопросы как модульность cytokine рецептор связывания доменов13. Дизайн химерами является ключевым шагом в такого рода исследований и требует тщательного рассмотрения. Предварительные исследования для установления функциональной домены обычно требуют замены регионов на первом этапе, в то время как меньшие замены переменной длины более подходят для детального изучения одного региона. Особое внимание следует уделять присутствие малых сохранены мотивы в семье белков в этот шаг, так как они часто свидетельствует о функциональных сайтов31,32. Личный опыт показывает, что более чем один раунд химерных белка дизайн может быть необходимо сузить область ключевых функциональных, с каждого раунда требует значительных время (недель до месяцев) от первоначального проектирования для тестирования функционального анализа.
Покуда существует структурно аналогичных протеина к протеину интереса, но обладая различные биологические функции, метод применим к любой последовательности интерес, хотя он должен быть оптимизирован для каждого конкретного Гена из-за своей опоры на ПЦР усиление. В частности гены, обладающие GC-богатые регионы может оказаться особенно сложные задачи, поскольку известны эти типы последовательностей снижает эффективность усиления33. Эти вопросы обычно может быть решена различными способами, например, добавление различных добавок (например , Бетаин) реакции, использование специализированных ДНК-полимеразы буферов или модификация отжига параметры34. Следовательно он обычно требуют некоторых проб и ошибок прежде чем найти адекватные условия для гена интереса.
Протокол основан на классической энзима ограничения-методы на основе клонирования, которые обычно доступны для каждого типа лаборатории, но оно может быть далее адаптирована воспользоваться более продвинутые методы клонирования. Например, с помощью шлюза клонирования, которая облегчает клонирование же Вставка в нескольких различных векторов (например если различные выражения системы должны испытываться параллельно), просто потребует особое attB рекомбинация сайтов в месте ограничения сайтов подробно этот протокол35. Другие новые методики клонирования может обойти необходимость второй реакции PCR (например пользователя36 или Гибсон Ассамблеи37) и перевязки (например последовательности и перевязка независимые клонирования (SLIC)38 или Ассамблеи-фьюжн 39). требуя различных реагентов и стратегии проектирования грунт, читателям доступ к этим методам предлагается применять их значительно ускорить поколения химерных конструкций после следующие основные принципы подробно в шаге 1 настоящего Протокола.
В целом применение этого метода может предоставить ценную информацию относительно механизмов, какие другие белка биологические функции занять место, в частности с участием протеин протеина или белков и нуклеиновых кислот взаимодействий и представляет собой полезный инструмент для идентифицировать и указать уникальные структуры функция отношения внутри семьи протеина6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Общество Макса Планка и Schüchtermann-клиника (Бад-Ротенфельде, Германия). Часть этого исследования была опубликована в журнал биологической химии. Адриан Сегарра, ж. м., Шиндлер, н., Gajawada, P., Lörchner, ч., Браун, т. & Pöling, Дж. Цикл AB и D-спирали в привязки сайта III М человеческого Oncostatin (OSM) для активации рецептора OSM. J. Chem. биол. 2018; 18:7017-7029. © Авторы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
