Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

Published: February 2, 2019 doi: 10.3791/58791
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 2
1Cell & Molecular Biology Program, University of Arkansas, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas, 3Ralph E. Martin Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

Summary

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

Abstract

פיגומים מהונדסים נגזר מטריצה חוץ-תאית (ECM) יש עניין משמעותי מונע ברפואה על הפוטנציאל שלהם ב לזירוז פצע הסגר וריפוי. מיצוי של מטריצה חוץ-תאית fibrogenic תא תרבויות במבחנה יש פוטנציאל לדור של ה-ECM של שורות תאים אנושיים - ואת פוטנציאל ספציפי לחולה, מזעור הנוכחות של epitopes xenogeneic אשר יש הפריע במישור הקליני הצלחה של מוצרים קיימים כמה ECM. אתגר משמעותי בייצור במבחנה של ECM מתאימים להשתלה הוא ECM הייצור על ידי תרבית תאים הוא בדרך כלל של תשואה נמוכה יחסית. בעבודה זאת, מתוארים פרוטוקולי לייצור של ECM על ידי תאים בתרבית בתוך הולופייבר ההקרבה ממברנה פיגומים. הולופייבר ממברנות תרבותי עם שורות תאים פיברובלסט במדיום תא קונבנציונאלי, התפרקה לאחר תרבית תאים להניב הליכי משנה רציף של ECM. הסיבים ECM וכתוצאה מכך המיוצר על ידי שיטה זו יכולה להיות decellularized, lyophilized, טיוח זה מתאים לאחסון, השרשה.

Introduction

פיגומים כירורגי מושתלת הם אביזר של תיקון הפצע, עם למעלה ממיליון רשתות שינוי של פולימר סינטטי מושתל ברחבי העולם בכל שנה על דופן הבטן תיקון לבד1. עם זאת, בעקבות ההשתלה פולימרים חומרים סינתטיים באופן מסורתי בשימוש פבריקציה נוספת של פיגומים אלה נוטים לעורר תגובה גוף זר, והתוצאה היא דלקת ברישול לפונקציה של השתל, הצטלקות של רקמת2 . עוד יותר, כמו החומרים השולט סינתטי רשת (קרי, פוליפרופילן) הם לא ניכרת שופצה על ידי הגוף, הם חלים באופן כללי על רקמות בו צלקות יכול להיות נסבל, הגבלת התועלת הקלינית שלהם כלפי הטיפול רקמות עם מיומנויות תפקוד כגון שרירים. אמנם יש הרבה מוצרים כירורגי אשר הוחלו בהצלחה קליני, יצרן האחרונים נזכר של סינתטיים כירורגי רשתות וסיבוכים של רקמות בין זנים שתלים להדגיש את החשיבות של הגדלת שתל הביו, הצגת ה-FDA לחדק תקנות על ניתוח mesh יצרני3,4. השרשה של פיגומים שמקורם ברקמות של המטופלים מפחיתה את התגובה החיסונית, אך יכול לגרום תחלואה משמעותית תורם-אתר5. מטריצה חוץ-תאית (ECM) פיגומים המיוצר במבחנה הם חלופה אפשרית, כמוצג פיגומים ECM decellularized הביו מעולה, במיוחד במקרה של ECM עצמיים שתלים6.

בגלל המוגבל של הרקמה החולה כדי לקצור להשתלה עצמיים הסיכון של הפגיעה פונקציה באתר התורם, היכולת לייצר ECM פיגומים במבחנה מתוך התרבות של שורות תאים אנושיים, או, במידת האפשר, של החולה התאים עצמו הוא חלופה אטרקטיבית. האתגרים העיקריים בייצור של כמויות ניכרות של ECM במבחנה הוא פחמיות של מולקולות אלה קשה ללכידת. בעבודה הקודמת, הראו כי ה-ECM יכול להיות מיוצר על ידי culturing מפריש ECM fibroblasts ב קצף פולימריים ההקרבה זה הם התפרקה לאחר תקופת תרבות כדי ECM התשואה אשר יכול להיות decellularized עבור ההשתלה7, 89,,10. ECM מיוצר קצף נוטים לאמץ את הארכיטקטורה הפנימית של קצף, הולופייבר ממברנות (HFMs) היו חקר בדומה לפיגום ההקרבה לייצור חוטי ECM. כפי שיתואר בהמשך אתה שיטות המוטל על מעבדה קנה המידה של הייצור של תאים תרבות איכות הולופייבר ממברנות ומתקני הפקת בצובר מטריצה חוץ-תאית סיבים מאותו לאחר תקופה של פיברובלסט תרבות. גישה זו תרבות סטטית היא ברצון לאימוץ על ידי מעבדות המכיל ציוד תרבות רגיל בתרבית של תאים. יכול להיות מיושם ECM המיוצר על ידי גישה זו כלפי מגוון רחב של יישומים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור של מטריצה חוץ-תאית באמצעות ממברנות ההקרבה הולופייבר

התראה: N-מתיל-2-pyrrolidone הוא הממס מעצבן ו toxicant הרבייה. חשיפה NMP עלול לגרום גירוי העור, העיניים, האף והגרון. ציוד מגן אישי עמידים הממס אמור לשמש בעת טיפול NMP. השימוש NMP צריכה להתבצע בתוך ברדס fume.

  1. הכנה של פתרון פולימר פוליסולפון ממברנות הולופייבר
    1. שוקל 70 גר' כדורי פוליסולפון (משקל מולקולרי של 35 kD) בסירה שוקלים באמצעות איזון האנליטי.
    2. העברה מ ל 314 (323.3 גרם) של N-מתיל-2-pyrrolidone (NMP) בקבוקון בורוסיליקט נקי.
    3. מקום בר מערבבים הבקבוק עם הבקבוק NMP ומקום על בחישה. הגדר מערבב את קצב מתון של הסיבוב.
    4. השתמש משפך יבש לאט להכניס את 70 גר' פוליסולפון מוכן הבקבוק עם NMP.
    5. לאפשר את הפתרון פולימר "סמים" לעורר במשך שלושה ימים בטמפרטורת החדר, או עד הומוגני.
  2. הגדרת concentricity וניקוי של spinneret ממברנה הולופייבר
    הערה: Spinnerets הם זמינים מסחרית; מידות spinneret נכונה קריטית מוצלחים ממברנה ייצור ומפורטות בטבלה של חומרים. לטפל בעדינות את spinneret, כמו spinneret המחט שביר במיוחד.
    1. עם מברג או לקדוח עם קצת מברג המתאים לפרק בזהירות את spinneret.
    2. בעדינות לזרום אצטון דרך כניסת עודפים של spinneret, איסוף כל פולימר אצטון, ממסר בתוך זכוכית עבור סילוק.
    3. ובטוח הגוף העליון של spinneret המחט פונה כלפי מעלה במלחציים טבלה.
    4. מקום בגוף עודפים (למטה) spinneret על גבי הגוף העליון.
    5. להזיז את הגופה עודפים של spinneret רוחבית תוך החזקת הגוף העליון קבוע על המלחציים עד המחט spinneret היא ישירות במרכז הגוף עודפים.
    6. לאט ובזהירות להוסיף מחדש את בורגי חיבור שני הגופים של spinneret תוך הקפדה כי המחט גלוי משקע החשמל spinneret נשאר ממורכז.
  3. ייצור של ממברנות הולופייבר פוליסולפון
    1. להכין "פתרון משעמם" המכיל 45 מ של N-מתיל-2-pyrrolidone, 255 מ ל מים יונים, ויוצרים תערובת 15% של NMP עם מים יונים.
    2. הר של spinneret ממברנה הולופייבר קונצנטריים 8 ס"מ מעל פני השטח של אמבט ברז מים בטמפרטורת החדר.
    3. חבר לים פולימר של spinneret, מפרצון נשא של spinneret שני מיכלי לחץ פלדה נפרד בעל אמצעי אחסון פנימי לפחות 350 מ. כלי שני חייב להיות בדיקת שסתומים לרכישות.
    4. להתחבר בכל אחד מהכלים לחץ הרגולטורים גלילי גז2 N נפרדים
    5. להשתמש משפך להוספת הפתרון סמים מוכן (~ 315 מ"ל) לתוך כלי לחץ מחובר לים פולימר של spinneret. ודא כי העליון של הכלי בחוזקה חתום.
    6. שימוש משפך כדי להוסיף את מוכנה נשא פתרון (300 מ ל) לתוך כלי לחץ מחובר לים נשא של spinneret. ודא כי העליון של הכלי בחוזקה חתום.
    7. פתח שסתום הסימון עבור הספינה נשא קודם, ואז הספינה פולימר שנית. אם spinneret הוא מספיק נקי, הפתרון נשא יתחיל זרם מתוך השקע spinneret.
    8. לדחוס את שני כלי 1 PSI. מבחינה ויזואלית לאשר כי פתרונות פולימרים וגם משעמם. יוצאים spinneret, עם פילמנט רציף לבן, מאיצים הזרמים בשילוב מגע לאמבט מים.
    9. להשתמש מלקחיים ארוכות כדי להנחות סיבים nascent תחת הגלילים במרכז של האמבטיה, ואז הרוח סיבים nascent סביב הגלגל מסתובב מחובר מנוע.
    10. הגדר את הגלגל take-up ואת מנוע כדי לסובב בשיעור של-2 מטר לדקה.
    11. לבצע התאמות קלות הרגולטורים או מהירות גלגל take-up לפי הצורך עד זרם מצב יציב מושגת. סיבים nascent יוצרות זווית 90 מעלות עם פני השטח של האמבט במים.
    12. סגור N2 צילינדר הרגולטורים ואת הלחץ כלי בדוק שסתומים םיצחה המנוע גלגל take-up אחרי כל פתרון פולימרים וחומרים נשא יש כבר extruded מכלי הדם.
    13. להסיר את הקרומים הולופייבר מוכן ולמקם אותם לתוך אמבט מים יונים במשך שלושה ימים, החלפת מים יונים פעם אחת ביום כדי להסיר שאריות ממס.
    14. לחטא את הקרומים הולופייבר מאת autoclaving אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או על-ידי הטבעית עליהם ליום אחד ב- 70% אתנול.
  4. תא זריעה של ממברנות הולופייבר
    הערה: כל תא לתרבות הליכים צריכה להתבצע בתוך ארון אבטחה.
    1. לפנק את הקרומים הולופייבר עם פתרון µg 20/mL של פלזמה שור fibronectin PBS (ה-pH = 7.4) כדי לקדם את התא מצורף.
      1. שוקל 1 מ ג של אבקת פלזמה שור fibronectin בסירה שוקלים, לפזר זאת בתוך 1 מ"ל של PBS סטרילי (ה-pH = 7.4) צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי.
      2. תקופת דגירה הפתרון fibronectin פלזמה שור 1 מ"ג/מ"ל בחממה של 30 דקות. הוסף את הפתרון מ 49 ל סטרילי PBS בשפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 50 מ.
      3. דגירה הסיבים 50 מ ל מוכן של פלזמה שור fibronectin באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך שעה. זוכר את הפתרון fibronectin לשימוש מאוחר יותר ללא בחנות שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 50 מ ל- 4 מעלות צלזיוס.
    2. השתמש microscissors סטרילי כדי לחתוך את סיבי האורך הרצוי (< 6 ס מ).
    3. תאי פיברובלסט זרע ישירות לתוך לומינה כמות הולופייבר-צפיפות זריעה של 100,000 תאים לכל סיבים באמצעות מחט 21-מד עם מזרק 1 מ"ל.
      הערה: מטרה מעשית להכנת התא-התליה לטעינה במזרק היא צפיפות השעיה של 100,000 תאים עבור כל microliters 30 של מדיום.
    4. מניחים 6 סיבים הזריעה לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס מ. לאפשר את הסיבים הזריעה. דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך חמש דקות.
    5. הסר את הסיבים הזריעה הדגירה ולאחר תרבות אותם עד 3 שבועות ב DMEM/F-12 המכילים ריכוזים הסופי של 50 חומצה אסקורבית L µg/mL ו 150 µg/mL אסקורבית L חומצה 2-פוספט (טרי מוכן וסטרילי מסונן), 5 ננוגרם למ"ל TGF-β1 (מ סטרילי סינון aliquots המאוחסן ב-20 ° C), ו- 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 6 ס מ פטרי בתוך חממה2 CO 5% ב 37 º C. Exchange תא בינוני כל יומיים.
  5. מיצוי של מטריצה חוץ-תאית של ממברנות בתרבית הולופייבר
    1. מקום תרבותי סיבים לתוך המבחנה נצנוץ בודדים באמצעות מלקחיים.
    2. למקם עד 5 מ ל NMP כל מבחנה באמצעות פיפטה של זכוכית.
    3. לטבול הסיבים חלול NMP, ביצוע בסך הכל שלושה חילופי NMP. לאט לאט וארוקן את NMP הישן באמצעות פיפטה 1 מ"ל כדי למנוע קריעת ECM שחולצו.
      הערה: בעת הוספת NMP טריים, זה מועיל להטות את המבחנה, לאפשר את NMP לדרוס את הצדדים, אחרת לגרדום ECM הנותרים הוא נתון להטיה אשר עלול לגרום קורע.
    4. הסר NMP ושטף את החוט ECM וכתוצאה מכך 3 פעמים במים יונים.
    5. לחתוך גיליון עבה 1/32 אינץ של גומי סיליקון באורך של 3 ס"מ, רוחב של 1 אינץ ' ו קיצוץ של 8 מ מ 4 מ מ עובש מלבני במרכז האורך של גומי.
    6. מקם את פיסת גומי על גבי סטנדרטי 3 אינץ על ידי שקופיות מיקרוסקופ 1 אינץ ו אוטוקלב מוכן ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    7. להניח כל סיב ECM לצד זה ב- 8 מ מ על ידי עובש סיליקון 4 מ מ עד אין מרחב פתוח גלוי.
    8. מניחים את התבנית לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל, להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס עד קפוא לגמרי.
    9. Lyophilize רשת ECM קפוא למשך הלילה או עד יבש לחלוטין. לאחסן את רשת השינוי ב 4° C עד מוכן decellularization.

2. decellularization של מטריצה חוץ-תאית

  1. להכין פתרון של 1% (w/w%) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) במים יונים.
  2. תקופת דגירה שחולצו מטריצה חוץ-תאית, כייר ב 1% מרחביות של 24 שעות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה עם עצבנות עדין.
  3. שטיפה חילצה מטריצה חוץ-תאית שלוש פעמים בתוך סטרילי באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם עצבנות עדין, באמצעות 3 מ"ל של PBS לכל שטיפה.
    הערה: שטיפות יש לבצע בעדינות כדי למזער את קריעת פיגומים מוכן.
  4. להכין 1 ליטר DNAse/RNAse עיכול המאגר.
    הערה: DNAse/RNAse עיכול מאגר ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 º C.
    1. שוקלים 1.54 g של טריס HCl, 308 מ ג של MgCl2ו 56 מ"ג CaCl2 ספינות שוקלים נפרדים.
    2. לשלב טריס HCl, MgCl2CaCl2 עם 1 ליטר מים יונים בבקבוקון גדולה עם בר מערבבים ומערבבים עד שכל הרכיבים הם התפרקה.
    3. מסנן סטרילי המאגר העיכול עם מסנן מיקרומטר 0.22 לתוך הבקבוק בורוסיליקט 1 ליטר סטרילי החנות ב 4 º C.
  5. להכין 5 מיליליטר DNAse/RNAse עיכול פתרון.
    הערה: פתרון עיכול אמור לשמש תוך 24 שעות מרגע ההכנה.
    1. שוקל 0.125 מ"ג (50 kU) של DNAse אני שוקל סירה ולהוסיף 5 מ של מאגר לעיכול.
    2. להוסיף µL 75 RNAse A פתרון מניות המאגר לעיכול.
  6. למלא עובש לכל פתרון מערכת העיכול, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות.
  7. האחות הפתרון עיכול ולשטוף שלוש פעמים ב- PBS סטרילי.
  8. האחות של PBS, דגירה פיגומים לילה ב- 10% פניצילין-סטרפטומיצין ב- PBS ב 4 º C.
  9. האחות של הפניצילין-סטרפטומיצין ולשטוף פיגומים שלוש פעמים ב- PBS סטרילי.
  10. מניחים את התבנית לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס.
  11. Lyophilize את רשת ה-ECM decellularized למשך הלילה או עד יבש לחלוטין.
  12. העברת פיגומים lyophilized בתוך ברדס אבטחה במיכל סטרילי ב 4° C הממתינות לשימוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפקה מוצלחת של מטריצה חוץ-תאית של פיגומים ההקרבה נמדדת לפי לגרדום המתאים פבריקציה נוספת, תרבית תאים ושגרות שטיפה הממס. ייצור כמות הולופייבר מתבצעת באמצעות הזרקת יבש רטוב-ספינינג מערכת התכנסו from רכיבים זמינים מסחרית (איור 1) אשר משתמשת ההבלטה של פולימר פתרון באמצעות טבעת פלדה זמינים מסחרית spinneret (הקוטר הפנימי = 0.8 מ מ, קוטר חיצוני = 1.6 מ מ) כדי ליצור צינור המתהווה של פתרון פולימר אשר ארגונייט שוקע לתוך קרום הולופייבר לאחר יצירת קשר עם אמבט מים.

תהליך דוגמה לחילוץ ECM מ HFMs מודגם באיור2. איור 3A מראה שחתך רוחבי של HFMs פוליסולפון מפוברק תחת פרוטוקול זה, מפגין שכבות החיצוני והפנימי של האצבע כמו נקבוביות האופייניים קרום אסימטרי. ב פרוטוקול זה, תאים נזרע בפרט לומן הפנימי של הקרום, תרבותי בתוך צלחות פטרי בקוטר 6 ס מ (איור 3B), עם תאים נוטה להתרבות על כל המשטחים של הקרום. ממברנות תרבותי יכול ואז יהיה נתון אצווה NMP ושטיפה במים יונים בבקבוקונים נצנוץ זכוכית רגילה (איור 3C), הפקת חוטי שקוף ECM (דמות תלת-ממד). תאים מייצרי ECM מורדם בתוך HFMs לאורך כל תקופת 3 שבועות של תרבות (איור 4).

HFMs תרבותי במשך שלושה שבועות עם החולדה הראשית שרירי השלד fibroblasts (RSMF) היו מומס באמצעות שלושה חילופי N-מתיל-2-pyrrolidone, אחרי אשר הם היו לשטוף שלוש פעמים במים יונים. המטריצה שחולץ, בדרך כלל להיות שקוף מראה כאשר hydrated (איור 5A), נוטים להעיב על הידרציה אם לא נתון המתאים הממס שטיפה בשל נוכחותם של פולימר שיורית. יש גם לציין כי ה-ECM שנותרו לאחר התפרקות של הקרום הוא קצת שברירית, הדורשים טיפול בטיפול עם מלקחיים משובחים. סיבי ECM לצרפן רשתות שינוי, אז lyophilized התערוכה של תפר חוט רקמה אופווייט צבע ומראה סיבי עם האורך ברוטו יישור (איור 5B).

Figure 1
איור 1: זרימת תהליך מאויר ליציקת ממברנות הולופייבר. הולופייבר ממברנות מיוצרים באמצעות שיטת ההפרדה בכל מקום שאינו ממיס השלב המושרה (פיטמי) באמצעות מערכת מקריסטלים של רכיבים זמינים מסחרית המפורטים בטבלה של חומרים מסוימים. פוליסולפון ב NMP (17.8 w/w%) ו NMP נשא פתרונות (15 w/w% NMP במים) הם extruded מכלי נירוסטה נפרדות על-ידי N בלחץ2 לתוך spinneret, יצירת קרום הולופייבר nascent משקע החשמל spinneret, אשר באופן מלא ארגונייט שוקע לאחר יצירת קשר עם האמבטיה משקעים מי ברז. הולופייבר המתהווה באופן ידני מודרכת מתחת ומעל מדריכים, מותר לגבות על גלגל מסתובב take-up ממונע בשיעור של 2.3 מטר לדקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מאויר הייצור של ה-ECM מ הולופייבר בתרבית ממברנות. הולופייבר הממברנות הן נזרע עם fibroblasts ותרבותית במשך שלושה שבועות, ואחריו חילופי NMP 3 x וחילופי יונים מים 3 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תרבות, הפקת ECM. Mesoporous א-סימטרי הולופייבר ממברנות (א) היו תרבותי במשך שלושה שבועות עם תאים RSMF DMEM/F-12 עם חומצה אסקורבית שהושלם ו- TGF-β (B). סיבים חלולים בתרבית (למעלהC, D ) היו מומס באמצעות חילופי 3 ב- n-מתיל-2-pyrrolidone, ואז לשטוף שלוש פעמים במים יונים, וכתוצאה מכך הליכי משנה רציף של ECM (יח, התחתון). בהגדלה סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים micrograph של המשטח סיבים ECM (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תא הכדאיות על ממברנות הולופייבר. ממברנות הולופייבר נציג תרבותי עם תאים RSMF במשך שלושה שבועות. longitudinally היו למחלקה באמצעות תער בסדר כדי לחשוף את השטח luminal של HFMs ונחשפו חי-מת מכתים עם Calcein AM ו- EthD-1. הכדאיות מכתים חשף שכבה confluent של התאים קיימא עם זריחה EthD-1 זניח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הרכבה של השתל ECM. הליכי משנה בודדים מטריצה חוץ-תאית (n = 30) נגזר מן התרבות של RSMF תאים הונחו לאורכו לתוך תבנית סיליקון (א) , decellularized על-ידי 1% מרחביות ואחריו טיפול עם DNAse אני, RNAse A ו פניצילין-סטרפטומיצין. Decellularized ECM היה lyophilized ואז, מניב של רשת תפר חוט רקמה אופווייט עם המראה סיביים, אדריכלות האורך (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התהליכים המתוארים מאפשרים הייצור של צובר ECM biomaterials במבחנה באמצעות ממברנות הולופייבר להטיל על-ידי מערכת ספינינג רטוב יבש-סילון ומאפשר לייצור זול בצובר של ממברנות, כמו גם ציוד תרבות תא סטנדרטי. בעוד הקרומים מפוברק פרוטוקול זה מיועדות לשימוש בתרבית תאים, המערכת המתוארת ניתן להתאים גם לייצור של ממברנות למטרות ההפרדה, עם נקבוביות הפצה, חלול סיבים מידות גודל tunable על ידי שינוי spinneret מידות, פולימר המשמש, סמים, נשא את קצב הזרימה, מהירות take-up ואת התנאים הסביבתיים. 13 על פי פרוטוקול מפורט מעסיקה הולופייבר ממברנות, באופן עקרוני כל תרבות תא נמסים לגרדום עם תחבורה הולם מאפיינים כגון תאים פתוח קצף יכול לשמש, כפי שמתואר ב- עבודה קודמת7, 8,9. גישה כללית זו מופיעה שימושי עבור הייצור של ה-ECM פיגומים על ידי פיגומים ההקרבה אשר יותר בנאמנות לחקות את הארכיטקטורה הפנימית של רקמות. השתלים המיוצרים על ידי פרוטוקול זה בפרט התערוכה יישור ברוטו (איור 5B), אשר עשוי להיות תועלת מסוימת לקראת שיקומה של רקמות מיושר מאוד כגון הגידים, הרצועות, שרירי השלד.

המרת רגיל של מדיום, ובעיקר, תוספת של בינוני עם חומצה אסקורבית, TGF-β הוא חיוני כדי לייצור ECM, כמו חומצה אסקורבית הוא אנזים חיוני ביוסינטזה קולגן, TGF-β גורם הסינתזה של חלבונים ECM שונים10 . בנוסף, שטיפה יסודית של ECM עם NMP חייב להתבצע, אחרת פולימר שיורית יישארו ב- ECM שחולץ, מופיעה בסרט לבן במהלך שטיפות במים. יש לנקוט כדי לא יתר על המידה להתסיס ECM במהלך התפרקות קרום, כפי שהוא שביר יחסית. חייב להיות נתון שנאספו פיגומים ECM מיועד השרשה צעד decellularization כמתואר להסיר epitopes xenogeneic כדי למזער את תגובת גוף זר המארח הפוטנציאלי.

המשמעות של שיטה זו נעוץ בייצור לפיגום נוסחת ביו-קומפלקס של מטריצה חוץ-תאית כל אשר יכול להיות שופצה התהליכים של הגוף עצמו, ריפוי פצע. באמצעות גישה זו כדי לייצר ECM של תאים ספציפיים זן היעד, ייתכן שתהיה אפשרות למזער את התגובה גוף זר אשר מעכבת את היעילות הקלינית של המעמד הזה של biomaterials; באמצעות תאים מסוים לאדם מסוים, התגובה גוף זר עשויה להיות פחת נוסף. גישה זו מאפשרת גם לייצור של ECM המיועדים רקמות מסוים, עם דיווחים אחרונים רומז כי רקמות ספציפיות ECM עשוי להיות יעיל במיוחד ביישומים מסוימים12. כמו זה פרוטוקול מאפשר לייצור ECM על פני שורות תאים שונים, שתלים שילוב ECM של מספר סוגי תאים (למשל שריר, לחוץ, אנדותל) יכול לשמש כדי להתאים שתלים כדי לקרב יותר בנאמנות את המבנה ואת כימית המורכבות של רקמות המטרה. בעוד רשתות ה-ECM המובאת כאן נועדו במקור כמו פיגומים לתיקון הפצע, הם יכולים גם להיות שימוש כמו פלטפורמות עבור חקירות אינטראקציות סלולרי-ECM, durotaxis ו- biosensing. בפרט, גישה זו משאיל החוקר את היכולת לייצר ECM של סוגי תאים ספציפיים של עניין ייתכן המאפשרים תובנות חדשות המשמעות הביולוגית של רקמות ספציפיות ECM מבנה, הרכב ותפקוד.

שיפורים פוטנציאלי של טכניקות הייצור ECM המובאת כאן עשוי לכלול הסולם באמצעות השימוש ריאקטורים דינמי, מיזוג מראש, כמו גם לחקר חומרים חלופיים לגרדום ההקרבה, ארכיטקטורות. בפרט, המעבר תהליך הסרת לגרדום solventless היה לשפר את הבטיחות של תהליך החילוץ; פיגומים ההקרבה מורכב חומר שאינו מתכלה על ידי אנזימים, כגון תאית regenerated, עשוי לאפשר מיצוי ECM solventless14. חוזק מתיחה של חומרים אלה הוא מתחת לאלה של חומרים סינתטיים, קיימים מספר אפיקים שיפור של פיגומים אלו, כולל חקר שונים תנאי התרבות, המדיה ניסוחים, וגיאומטריה העולה לגרדום. יכול להיות ממונף ההתקדמות הנדסה גנטית לייצר תא pro-fibrotic קווי, אשר בשילוב עם פלטפורמות עבור לכידת ECM עשוי לאפשר הייצור של פיגומים סיפוק דרישות קליניים. תרבות דינמית נוספת הקיימת כמו לולאה זרימה רציפה הולופייבר ממברנה ריאקטורים להקל על שיעור גבוה של חומרי מזון חילופי להצטיינות ייצור ECM גדול יותר, מהירה יותר מערכות עשוי להיות עניין מיוחד תוך מינופם השתמש טכניקה לייצור כמויות גדולות יותר של ה-ECM למחקר ביולוגי וקלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ומחלות עור של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר R15AR064481, הקרן הלאומית למדע (CMMI-1404716), כמו גם מכון החיים ארקנסו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/32 inch thick silicone rubber Grainger B01LXJULOM
20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR VWR 66022-004 With attached white urea cap and cork foil liner
3 inch by 1 inch microscopy slides VWR 75799-268
4C refrigerator Thermo Fisher Scientific FRGG2304D Any commercial 4C refrigerator will suffice.
50 mL tubes VWR 21008-178
6-well cell culture plates VWR 10062-892 Alternative brands may be used
Acetone VWR E646 Alternative brands may be used
Bore vessel McMaster-Carr 89785K867 6 ft 316 steel tubing
Bovine Plasma Fibronectin Thermo Fisher Scientific 33010018 Comes as 1 mg of lyophilized protein
CaCl2 VWR/Amresco 97062-590
Cell Culture Incubator w/ CO2 Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice.
Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase VWR 14673-208 Alternative brands may be used
DMEM/F-12, HEPES Thermo Fisher Scientific 11330032 Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use
DNase I Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dope vessel McMaster-Carr 89785K867 6 ft 316 steel tubing
Ethanol VWR BDH1160 Dilute to 70% for sterilization
Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco Thermo Fisher Scientific 26140079 Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media)
Four 1/4-inch to 1" reducing unions Swagelok SS-1610-6-4 One reducing union for each inlet and outlet of each vessel
Freeze-dryer/lyophilizer Labconco 117 (A65312906) Any lyophilizer will suffice.
Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR VWR 89106-752 Any weigh boat will suffice
Hollow fiber membrane immersion bath 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets
Hollow Fiber Membrane Spinneret AEI http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm
Hot plate/stirrer VWR 97042-634
Human TGF-β1 PeproTech 100-21
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-25G
L-Ascorbic acid 2-phosphate Sigma-Aldrich A8960-5G
L-glutamine (200 mM) - Gibco Thermo Fisher Scientific 25030081 Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media)
MgCl2 VWR/Alfa Aesar AA12315-A1
Minus 80 Freezer Thermo Fisher Scientific UXF40086A Any commercial -80C freezer will suffice.
N2 gas cylinders (two)
NIH/3T3 cells ATCC CRL-1658 Alternative fibrogenic cell lines may be used.
N-methyl-2-pyrrolidone VWR BDH1141 Alternative brands may be used
Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco Thermo Fisher Scientific 15140122 Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media)
Polysulfone Sigma-Aldrich 428302 Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used
Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond VWR 53498-103 Alternative brands may be used
PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) McMaster-Carr 52315K24 Alternative brands may be used.
Rat skeletal muscle fibroblasts Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used.
RNase A Sigma-Aldrich R4642
Silicone sheet McMaster-Carr 1460N28
Take-up motor Greartisan B071GTTSV3 200 RPM DC Motor
Tris HCl VWR/Amresco 97063-756
Two needle valves Swagelok SS-1RS4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
  2. Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
  3. Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
  4. FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
  5. Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
  6. Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
  7. Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
  8. Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
  9. Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
  10. Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
  11. Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
  12. Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
  13. Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
  14. Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 144 לגרדום רפואה הנדסי רגנרטיבית רקמות סיבים קרום מטריצה חוץ-תאית
ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roberts, K., Kim, J. T., White, S.,… More

Roberts, K., Kim, J. T., White, S., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture. J. Vis. Exp. (144), e58791, doi:10.3791/58791 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter