Summary
Le but du présent protocole est la production de fibres de matrice extracellulaire ensemble ciblé pour la réparation de la plaie qui conviennent à l’évaluation préclinique dans le cadre d’un implant d’échafaudage régénératrice. Ces fibres sont produites par la culture de fibroblastes sur membranes fibres creuses et extraite par la dissolution des membranes.
Abstract
Échafaudages modifiées dérivées de la matrice extracellulaire (mec) ont entraînée directement visées par la médecine pour leur potentiel dans le déroulement des plaies fermeture et guérison. Extraction de matrice extracellulaire de fibrogène cell cultures in vitro a le potentiel de génération d’ECM de lignées cellulaires humaines - potentiellement axée sur le patient, réduisant au minimum la présence d’épitopes xénogéniques qui entrave la clinique succès de certains produits existants d’ECM. Un défi important dans in vitro production d’ECM adapté pour l’implantation, c’est que la production de ECM par culture cellulaire est généralement de rendement relativement faible. Dans cet ouvrage, les protocoles sont décrits pour la production d’ECM de cellules cultivées au sein de fibres creuses sacrificiel membrane échafaudages. Membranes fibres creuses sont cultivés avec des lignées de cellules de fibroblaste dans un milieu cellulaire conventionnel et dissous après culture de cellules pour produire des fils continus d’ECM. Les fibres de ECM résultantes produites par cette méthode peuvent être decellularise et lyophilisés, rendant appropriés pour le stockage et l’implantation.
Introduction
Les échafaudages chirurgicaux implantables sont un pilier de cicatrisation, à mailles de polymère synthétique plus 1 million implantés dans le monde entier chaque année pour la paroi abdominale réparation seul1. Cependant, après l’implantation, les polymères synthétiques utilisés traditionnellement dans la fabrication de ces échafaudages ont tendance à provoquer une réaction au corps étranger, ayant pour résultat l’inflammation délétère à la fonction de l’implant et la cicatrisation des tissus2 . En outre, comme les matériaux prédominant maille synthétique (c.-à-d., polypropylène) ne sont pas sensiblement remodelés par l’organisme, ils sont généralement applicables aux tissus où la cicatrisation peut être tolérée, limitant leur utilité clinique vers le traitement des tissus ayant des fonctions d’ordre supérieur comme le muscle. Bien qu’il existe de nombreux produits de treillis chirurgical qui ont été appliquées avec succès clinique, fabricant récent rappels de chirurgical synthétique mailles et complications des implants de tissus inter-espèces soulignent l’importance de maximiser l’implant biocompatibilité, ce qui incite à la FDA pour serrer les règlements sur la chirurgie de maillage fabricants3,4. Implantation des échafaudages provenant de tissus de patients propre réduit cette réponse immunitaire, mais peut se traduire par d’importants donateurs-site morbidité5. Matrice extracellulaire (ECM) échafaudages produites in vitro sont une alternative possible, comme les échafaudages ECM decellularise pièce excellente biocompatibilité, particulièrement dans le cas d’ECM autologue6implants.
En raison de la disponibilité limitée des tissus du patient à la récolte pour l’implantation autologue et le risque d’empêcher la fonction sur le site de donateurs, la capacité de produire des ECM échafaudages in vitro de la culture de lignées cellulaires humaines ou, si possible, un patient les cellules propres est une alternative intéressante. Les défis principaux dans la fabrication de grosses sommes d’ECM dans vitro est la séquestration de ces molécules de difficile-à-capture. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que ECM peut être produit en cultivant les fibroblastes qui sécrètent ECM sacrificiel mousses polymères qui sont dissous après la période de culture de rendement ECM, qui peut être decellularized pour implantation7, 8,9,10. Comme ECM produites dans les mousses ont tendance à adopter l’architecture interne des mousses, membranes fibres creuses (HFMs) ont été étudiés comme un échafaudage sacrificiel pour la production de fils des ECM. Décrit ci-après sont méthodes chargés de laboratoire à l’échelle de fabrication des membranes cellulaires culture qualité fibres creuses et l’extraction des fibres de la matrice extracellulaire en vrac de la même après une période de culture de fibroblastes. Cette approche de la culture statique est facilement adoptable par les laboratoires contenant du matériel de culture des cellules de mammifères standard. ECM produite par cette approche pourrait être appliquée vers une variété d’applications cliniques.
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Protocol
1. production de matrice extracellulaire à l’aide de Membranes fibres creuses sacrificiel
Attention : Le N-méthyl-2-pyrrolidone est un solvant irritant et toxique pour la reproduction. Exposition à NMP peut causer une irritation de la peau, yeux, nez et gorge. Résistant aux solvants Equipement de protection individuelle doit être utilisé lors de la manipulation NMP. Utilisation du NMP doit être effectuée au sein d’une hotte aspirante.
- Préparation de la solution de polymère polysulfone pour membranes fibres creuses
- Peser 70 g de pastilles de polysulfone (poids moléculaire de 35 kD) dans un bateau de pesée à l’aide d’une balance analytique.
- Transférer (323,3 g) 314 mL de N-méthyl-2-pyrrolidone (NMP) dans une fiole de borosilicate propre.
- Placer une barre de remuer dans la fiole par fiole NMP et place sur l’agitateur. Régler l’agitateur à un taux modéré de rotation.
- Utiliser un entonnoir sec à introduire doucement le prêt 70 g de polysulfone dans la fiole avec NMP.
- Laisser la solution de polymère « dope » à remuer pendant trois jours à température ambiante, ou jusqu'à ce que homogénéisé.
- Définition de concentricité et le nettoyage de la filière de membranes fibres creuses
Remarque : Les filières sont disponibles dans le commerce ; filière correct dimensions sont essentielles à la fabrication de la membrane avec succès et sont énumérées dans la Table des matières. Gérer la filière très doucement, l’aiguille de la filière étant particulièrement fragile.- Utiliser un tournevis ou percer avec une mèche de tournevis approprié à démonter avec précaution la filière.
- Doucement couler de l’acétone par le biais de l’entrée et la sortie de la filière, en collectant tout polymère acétone et résiduel dans un bécher en verre pour l’élimination.
- Fixez le haut du corps de la filière avec l’aiguille vers le haut dans un étau de table.
- Placer le corps de la prise de courant (en bas) de la filière sur le haut du corps.
- Se déplacer latéralement le corps de sortie de la filière tout en tenant le haut du corps fixé sur l’étau jusqu'à ce que l’aiguille de la filière se trouve directement dans le centre de l’organe de prise de courant.
- Soigneusement et lentement remonter les vis reliant les deux corps de la filière tout en veillant à ce que l’aiguille visible à la sortie de la filière est bien centrée.
- Fabrication de membranes fibres creuses polysulfone
- Préparer une « solution d’alésage » contenant 45 mL de N-méthyl-2-pyrrolidone et 255 mL d’eau désionisée, formant un mélange de 15 % du NMP avec de l’eau désionisée.
- Monter une filière de membranes fibres creuses concentriques 8 cm au-dessus de la surface d’un bain d’eau du robinet à température ambiante.
- Connecter l’entrée de polymère de la filière et l’entrée de l’alésage de la filière à deux appareils à pression en acier séparées ayant un volume intérieur au moins 350 mL. Les deux navires doivent disposer de clapets dans leurs points de vente.
- Chacun des navires pression connecter aux organismes de réglementation des bouteilles de gaz séparés N2
- Utilisez un entonnoir pour insérer la solution préparée dope (~ 315 mL) dans le récipient à pression connecté à l’entrée de polymère de la filière. Veiller à ce que la partie supérieure du navire est hermétiquement scellée.
- Utiliser un entonnoir pour insérer les préparés alésage (300 mL) de solution dans le réservoir de pression connecté à l’entrée de l’alésage de la filière. Veiller à ce que la partie supérieure du navire est hermétiquement scellée.
- Ouvrir le clapet pour le navire alésage tout d’abord, puis le navire de polymère deuxième. Si la filière est suffisamment propre, la solution d’alésage commencera à diffuser de la sortie de la filière.
- Mettre sous pression les deux vaisseaux de 1 PSI. Vérifier visuellement que solutions de polymère et de calibre sont sortie de la filière, avec un filament blanc continu précipitants comme les flux combinés contact avec l’eau du bain.
- Utiliser des pinces longues pour guider la fibre naissante sous les rouleaux dans le centre de la salle de bain et puis enrouler la fibre naissante autour d’une roue tournante, connectée à un moteur.
- Régler la roue réceptrice et le moteur pour tourner à un rythme d’environ deux mètres par minute.
- Apporter des ajustements mineurs aux régulateurs ou vitesse de roue tendeur au besoin jusqu'à ce qu’un flux stationnaire est atteint. La fibre naissante doit former un angle de 90° avec la surface de l’eau du bain.
- Fermer le N2 cylindre régulateurs et la cuve sous pression clapets anti-retour et débrayer le moteur de roue réceptrice après que toutes les solution de polymère et d’alésage a été expulsée, les vaisseaux.
- Enlever les membranes fibres creuses préparés et placez-les dans un bain d’eau désionisée pendant trois jours, échangeant eau désionisée une fois par jour pour enlever le solvant résiduel.
- Stériliser les membranes à fibres creuses à l’autoclave à 121 ° C pendant 30 minutes ou en les immergeant pendant une journée dans l’éthanol à 70 %.
- Cellule ensemencement des membranes fibres creuses
Remarque : Toutes les méthodes de culture cellulaire doivent être effectuées au sein d’une cabinet de biosécurité.- Traiter les membranes fibres creuses avec une solution de 20 µg/mL de plasma bovin la fibronectine dans du PBS (pH = 7,4) pour promouvoir la fixation des cellules.
- Peser à 1 mg de fibronectine plasmatique bovine en poudre dans un bateau de pesée et dissoudre dans 1 mL de PBS stérile (pH = 7,4) dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL.
- La solution de la fibronectine plasmatique bovine 1 mg/mL dans l’incubateur incuber 30 minutes. Ajoutez la solution au 49 mL de PBS stérile dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 mL.
- Incuber les fibres dans les prêt 50 mL de plasma bovin la fibronectine dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 1 heure. Se rappeler de la solution de la fibronectine pour utilisation ultérieure et l’entreposer dans un tube à centrifuger conique stérile de 50 mL à 4 ° C.
- Microciseaux stérile permet de couper les fibres à la longueur souhaitée (< 6 cm).
- Cellules de fibroblaste de graines directement dans les lumière des vaisseaux des membranes fibres creuses à une densité de semis de 100 000 cellules par fibre à l’aide d’une aiguille de calibre 21 avec la seringue de 1 mL.
Remarque : Une cible possible pour la préparation de la suspension cellulaire pour le chargement dans la seringue est une densité de suspension de 100 000 cellules pour chaque 30 microlitres de médium. - Placer six fibres ensemencées dans une boîte de pétri de 6 cm de diamètre. Laisser les fibres ensemencés à incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant cinq minutes.
- Enlever les fibres ensemencés d’incubation et leur culture pendant 3 semaines en DMEM/F-12 contenant la concentration finale de 50 µg/mL d’acide L-ascorbique et 150 µg/mL L-ascorbique acide 2-phosphate (fraîchement préparé et stérile filtrée), 5 ng/mL TGF-β1 (à partir de stérile filtrés aliquots stockés à-20 ° C) et 1 % la pénicilline-streptomycine dans un 6 cm boîte de pétri dans une étuve à2 CO 5 % à 37 ° C. Milieu cellulaire change tous les deux jours.
- Traiter les membranes fibres creuses avec une solution de 20 µg/mL de plasma bovin la fibronectine dans du PBS (pH = 7,4) pour promouvoir la fixation des cellules.
- Extraction de matrice extracellulaire de membranes fibres creuses cultivées
- Lieu cultivé fibres flacon à scintillation individuels à l’aide de pinces.
- Placez jusqu'à 5 mL du NMP dans chaque flacon à l’aide d’une pipette de verre.
- Immerger les fibres creuses en NMP, d’un total de trois circonscriptions de NMP. Lentement, aspirer le vieux PGEN à l’aide d’une pipette 1 mL pour éviter le déchirement des extrait ECM.
Remarque : Lorsque vous ajoutez le NMP fraîche, il est utile d’incliner le flacon et permettent le NMP courir sur les côtés, sinon l’échafaud ECM restant est soumis de cisaillement qui peut causer la déchirure. - Supprimer le NMP et rincé le fil ECM qui en résulte 3 fois dans l’eau désionisée.
- Couper une feuille épaisse de 1/32 de pouce de caoutchouc de silicone pour une longueur de 3 pouces, largeur de 1 pouce et couper un 8 mm par le moule rectangulaire de 4 mm dans le centre de la longueur de caoutchouc.
- Placer l’éprouvette préparée du caoutchouc sur un standard 3-pouces par diapositive 1 pouce microscopie et stériliser à 121 ° C pendant 30 minutes.
- Poser chaque fibre ECM côte à côte dans le 8 mm par le moule silicone 4 mm jusqu'à ce qu’il n’y a aucun espace libre visible.
- Placer le moule dans un tube à centrifuger conique 50 mL et congeler à-80 ° C jusqu'à ce que complètement gelé.
- Lyophiliser congelé maille ECM du jour au lendemain ou jusqu'à ce que complètement sec. Stocker la maille à 4° C jusqu’au moment de décellularisation.
2. décellularisation de matrice extracellulaire
- Préparer une solution de 1 % (w/w%) dodécylsulfate de sodium (SDS) dans l’eau désionisée.
- Extrait de matrice extracellulaire dans le moule en 1 % SDS incuber 24 heures à température ambiante sur un balancier avec agitation douce.
- Rinçage extrait de la matrice extracellulaire trois fois en stérile saline tamponnée au phosphate (PBS) avec agitation douce, à l’aide de 3 mL de PBS par rinçage.
NOTE : Rinçages devraient être effectuées doucement pour minimiser le déchirement des échafaudages préparés. - Préparer 1 L de DNAse/RNAse digestion tampon.
NOTE : DNAse/RNAse digestion tampon peut être conservé pendant plusieurs mois à 4° C.- Peser de 1,54 g de Tris HCl, 308 mg de MgCl2et 56 mg de CaCl2 bateaux de pesée séparée.
- Combinez les Tris HCl, MgCl2et CaCl2 avec 1 L d’eau déionisée dans un gros ballon avec une barre de remuer et remuer jusqu'à ce que tous les composants sont dissous.
- Filtre stérile le tampon de la digestion avec un filtre de 0,22 µm dans un flacon stérile de borosilicate 1 L et la conserver à 4° C.
- Préparer 5 mL de solution de digestion de DNAse/RNAse.
NOTE : Solution de Digestion doit être utilisée dans les 24 heures de préparation.- Peser de 0,125 mg (50 kU) de DNAse I dans une pesée en bateau et ajouter 5 mL de tampon de la digestion.
- Ajouter 75 µL de la solution mère de RNAse A vers le tampon de la digestion.
- Remplissez chaque moule avec la solution de digestion et incuber à 4 ° C pendant 6 heures.
- Aspirer la solution de digestion et rincer trois fois dans du PBS stérile.
- Aspirer le PBS et incuber les échafaudages nuit à 10 % la pénicilline-streptomycine dans du PBS à 4° C.
- Aspirer la pénicilline-streptomycine et rincer les échafaudages trois fois dans du PBS stérile.
- Placer le moule dans un tube à centrifuger conique 50 mL et congeler à-80 ° C.
- Lyophiliser le maillage ECM decellularise du jour au lendemain ou jusqu'à ce que complètement sec.
- Transférer les échafaudages lyophilisés dans une hotte de sécurité biologique dans un récipient stérile à 4° C en cours d’utilisation.
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Representative Results
Production réussie de la matrice extracellulaire des échafaudages sacrificiels est subordonnée à la fabrication d’échafaudages appropriés, culture cellulaire et les procédures de solvant de rinçage. Fabrication des membranes fibres creuses est réalisée en utilisant un système d’extrusion par voie humide sec-jet assemblé à partir des composants disponibles dans le commerce (Figure 1) qui utilise l’extrusion de la solution de polymère par le biais de l’espace annulaire d’un acier disponible dans le commerce filière (diamètre intérieur = 0,8 mm, diamètre extérieur = 1,6 mm) pour générer un tube naissant de la solution de polymère qui précipite dans une membrane en fibres creuses au contact d’un bain d’eau.
Un processus d’exemple pour l’extraction de l’ECM de HFMs est illustré à la Figure 2. Figure 3 a montre qu'une section transversale de polysulfone HFMs fabriqués en vertu de ce protocole, présentant des couches extérieures et intérieures des pores de doigt comme caractéristiques d’une membrane asymétrique. Dans le présent protocole, les cellules sont ensemencées spécifiquement dans la lumière interne de la membrane et cultivées en pétri 6 cm de diamètre (Figure 3 b), avec qui tend à se répandre sur toute la surface de la membrane des cellules. Membranes cultivées peuvent ensuite subir lot NMP et eau désionisée rinçage en flacons scintillation en verre standard (Figure 3), produisant des fils translucides d’ECM (Figure 3D). Cellules productrices d’ECM restent viables à l’intérieur de la HFMs tout au long de la période de 3 semaines de culture (Figure 4).
HFMs cultivées pendant trois semaines avec le muscle squelettique primaires de rat fibroblastes (Empoussièrement) ont été dissous par l’intermédiaire de trois circonscriptions de la N-méthyl-2-pyrrolidone, après quoi elles ont été rincées trois fois dans l’eau désionisée. La matrice extraite, étant normalement translucide en apparence lorsque hydraté (Figure 5 a), aura tendance à cloud sur hydratation sinon soumis à rinçage solvant approprié en raison de la présence de polymère résiduelle. Il est à noter également que l’ECM qui reste après la dissolution de la membrane est un peu fragile, nécessitant des soins en manipulation avec une pince fine. Fibres d’ECM assemblés en mailles et puis lyophilisé présentent une couleur blanc cassé et l’aspect fibreux avec un alignement longitudinal brut (Figure 5 b).
Figure 1 : flux de processus illustré pour effectuer le cast membranes fibres creuses. Les membranes fibres creuses sont fabriqués en utilisant la méthode de séparation omniprésent phase induit par non solvant (pin) en utilisant un système préparé à partir des composants disponibles dans le commerce répertoriées dans le tableau des matériaux spécifiques. Polysulfone en NMP (17,8 w/w%) et solutions d’alésage de NMP (15 w/w% NMP dans l’eau) sont extrudées à partir séparé inox bateaux par pressurisé N2 dans une filière, générant une membrane en fibres creuses naissant à la sortie de la filière qui précipite entièrement lors du contact avec la baignoire de précipitation de l’eau du robinet. Fibres creuses naissant est manuellement guidé sous et sur les guides et a permis de recueillir sur une roue tournante de releveur motorisé à raison de 2,3 mètres par minute. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustrated production d’ECM de membranes fibres creuses cultivées. Les membranes fibres creuses sont ensemencées avec des fibroblastes et cultivées pendant trois semaines, suivi d’échange de NMP 3 x et l’échange d’eau déionisée 3 x. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Culture et extraction de l’ECM. Les membranes fibres creuses mésoporeux asymétrique (A) ont été cultivés pendant trois semaines avec les cellules Empoussièrement DMEM/F-12 avec l’acide ascorbique complétée et TGF-β (B). Fibres creuses cultivées (C, D en haut) ont été dissous par l’intermédiaire de 3 circonscriptions de la n-méthyl-2-pyrrolidone puis rincés trois fois dans l’eau désionisée, résultant dans des filets continues de ECM (D, en bas). Fort grossissement au microscope électronique à balayage de la surface de fibre ECM (E)à balayage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : viabilité sur membranes fibres creuses cellulaire. Membranes fibres creuses représentant cultivé avec des cellules d’EMPOUSSIÈREMENT pour trois semaines ont été sectionnés longitudinalement à l’aide d’un rasoir fin pour révéler la surface Luminale des HFMs et soumis à la mort en direct-coloration avec Calcéine AM et EthD-1. La coloration de viabilité révèle une couche confluente de cellules viables avec négligeable fluorescence EthD-1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Assemblée d’implant ECM. Discussions individuelles de la matrice extracellulaire (n = 30) issus de culture de l’EMPOUSSIÈREMENT des cellules ont été placés dans la longueur dans un moule silicone (A) et decellularized par 1 % SDS, suivie par un traitement à la DNAse I, RNAse A et la pénicilline-streptomycine. ECM decellularise était alors lyophilisé, ce qui donne un maillage blanc cassé avec un aspect fibreux et l’architecture longitudinale (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les procédés décrits permettent la production de masse ECM biomatériaux in vitro à l’aide de membranes fibres creuses fondues par un système de filage humide sec-jet permettant une production bon marché en vrac des membranes ainsi que du matériel de culture cellulaire standard. Alors que les membranes fabriquées dans le présent protocole sont destinées à l’usage en culture cellulaire, le système décrit peut être adapté pour la production de membranes à des fins de séparation, avec pore taille distribution et hollow fibre dimensions réglables en faisant varier dimensions de la filière, polymère utilisé, "dope" Gonzalez et portaient le débit, la vitesse de l’adoption et des conditions environnementales. 13 si le protocole détaillé emploie les membranes fibres creuses, en principe, n’importe quelle culture cellulaire dissolvable échafaudages avec des propriétés de transport appropriés tels que les cellules ouvertes mousses pourraient être utilisés, comme indiqué dans le précédent travail7, 8,,9. Cette approche générale semble utile pour la fabrication d’échafaudages ECM par des échafaudages sacrificiels qui peuvent reproduire plus fidèlement l’architecture interne des tissus. Produits par le présent protocole, en particulier les implants présentent un alignement brut (Figure 5 b), qui peut être particulièrement bénéfique à la reconstruction des tissus hautement alignés comme les tendons, les ligaments et les muscles squelettiques.
Un échange régulier de moyen et, en particulier, la supplémentation en moyen avec l’acide ascorbique et le TGF-β est cruciale pour la production d’ECM, comme l’acide ascorbique est une enzyme essentielle dans la biosynthèse du collagène et TGF-β induit la synthèse de plusieurs protéines ECM10 . En outre, un rinçage complet de ECM avec NMP doit être effectué, sinon polymère résiduelle reste dans l’ECM extraite, apparaissant comme une pellicule blanche au cours de l’eau de rinçage. Il faut pour pas trop agiter ECM au cours de la dissolution de la membrane, car elle est relativement fragile. Recueillies échafaudages ECM destinées à l’implantation doivent être soumis à une étape de décellularisation comme décrit pour supprimer des épitopes xénogéniques pour minimiser une réaction au corps étranger hôte potentiel.
L’importance de cette technique réside dans sa production d’un échafaudage biocomplex de matrice extracellulaire ensemble qui peut être transformé par les processus de cicatrisation du corps. En utilisant cette approche pour produire l’ECM de lymphocytes spécifiques d’une espèce cible, il peut être possible de réduire au minimum la réaction au corps étranger qui entrave l’efficacité clinique de cette classe de biomatériaux ; à l’aide de cellules spécifiques à un individu, la réaction au corps étranger peut être réduite davantage. Cette approche permet également la production de ECM ciblée vers les tissus particuliers, avec des rapports récents suggérant que l’ECM de tissu-spécifique pourrait être particulièrement efficace dans certaines applications12. Comme ce protocole permet la production d’ECM à travers diverses lignées cellulaires, les implants ECM de la combinaison de plusieurs types de cellules (par exemple , musculaire, nerveux, endothélial) pourrait être utilisé pour adapter les implants pour se rapprocher plus fidèlement la structure et la chimie complexité des tissus cibles. Alors que les mailles de l’ECM présentées ici ont été initialement conçues comme échafaudages pour la cicatrisation, ils peuvent aussi avoir utiliser comme plates-formes pour les enquêtes sur les interactions cellule-ECM, durotaxis et biodétection. En particulier, cette approche donne l’enquêteur la capacité de produire des ECM de types spécifiques de cellules d’intérêt qui peut permettre de mieux comprendre l’importance biologique de tissu-spécifique ECM structure, composition et fonction.
Les améliorations potentielles pour les techniques de production de ECM présentées ici pourraient inclure mesurent-vers le haut par l’utilisation de bioréacteurs dynamiques et pré conditionnés comme exploration d’architectures et les matériaux alternatifs échafaudage sacrificiel. En particulier, transition vers un processus de suppression d’échafaudage sans solvant permettrait d’améliorer la sécurité des procédés d’extraction ; échafaudages sacrificielles composés de matériaux qui sont dégradables par les enzymes, comme la cellulose régénérée, peuvent permettre d’extraction sans solvant ECM14. Alors que la résistance à la traction de ces matériaux est inférieur à celui des matières synthétiques, il existe plusieurs pistes pour l’amélioration de ces échafaudages, y compris l’exploration de diverses conditions de culture, des formulations de médias et géométries échafaudage sacrificiel. Les progrès récents de génie génétique pourraient être mis à profit pour produire des lignées de cellules profibrotiques, qui, en combinaison avec les plateformes pour la capture de l’ECM, pourraient permettre la production d’échafaudages satisfaisant les exigences cliniques. Systèmes de culture dynamique plus, existants tels que les bioréacteurs à membranes fibres creuses boucle débit continue facilitent des taux élevés d’éléments nutritifs échangent propices à une plus grande et plus rapide la production ECM et peuvent être d’un intérêt particulier en s’appuyant sur ce utilisation de technique de production de plus grandes quantités d’ECM pour la recherche biologique et clinique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Recherche rapporté dans cette publication a été financée par le National Institute of Arthritis et les troubles musculo-squelettiques et les maladies de la peau de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R15AR064481, la Fondation nationale des sciences (CMMI-1404716), ainsi que la Institut de Biosciences de l’Arkansas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
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