Summary
Målet med denne protokol er produktion af hele ekstracellulære matrix fibre indskyde nemlig sår reparation, som er egnet til præklinisk evaluering som en del af en regenerativ stillads implantat. Disse fibre er produceret af kulturen i fibroblaster på hule fibre membraner og udvindes ved opløsning af membraner.
Abstract
Manipuleret stilladser afledt af ekstracellulære matrix (ECM) har drevet betydelig interesse i medicin for deres potentiale i fremskynde sår lukning og healing. Udvinding af ekstracellulære matrix fra fibrogenic celle kulturer i vitro har potentiale for generation af ECM fra menneskelige- og potentielt patient-specifikke cellelinjer, minimere forekomsten af xenogene epitoper, som har hindret den kliniske succes af nogle eksisterende ECM produkter. En betydelig udfordring i in vitro- produktion af ECM egnet til implantation er at ECM produktion af cellekultur er typisk relativt lavt udbytte. I dette arbejde, er protokoller beskrevet til produktion af ECM af celler kulturperler inden for hellige hule fiber membran stilladser. Hule fibre membraner er kulturperler med fibroblast cellelinjer i en konventionel celle medium og opløst efter cellekultur at give kontinuerlig tråde af ECM. De resulterende ECM fibre fremstillet af denne metode kan decellularized og frysetørret, gør dem egnet til opbevaring og implantation.
Introduction
Implantable kirurgisk stilladser er et armatur af sår reparation, med over en million syntetisk polymer masker implanteret på verdensplan hvert år for bugvæggen reparation alene1. Men efter implantation syntetiske materialer polymerer traditionelt anvendes i fremstilling af disse stilladser har tendens til at fremprovokere en udenlandsk organ svar, resulterer i inflammation skadelige til funktionen af implantatet og ardannelse i væv2 . Yderligere, da de fremherskende syntetiske mesh materialer (dvs., polypropylen) ikke er mærkbart ombygget af kroppen, de er generelt gælder for væv hvor ardannelse kan tolereres, begrænse deres kliniske anvendelighed mod behandling af væv med højere-ordens funktion såsom muskel. Mens der er mange kirurgiske mesh produkter, der er blevet anvendt med kliniske succes, seneste producent, der minder om af syntetisk kirurgiske masker og komplikationer fra interspecies væv implantater fremhæve betydningen af maksimering af implantat biokompatibilitet, at spørge FDA til at stramme reglerne på kirurgisk mesh producenter3,4. Implantation af stilladser afledt af patienternes egne væv reducerer denne immunrespons, men kan resultere i betydelige donor-site sygelighed5. Ekstracellulær matrix (ECM) stilladser fremstillet in vitro- er et muligt alternativ, som decellularized ECM stilladser udstiller fremragende biokompatibilitet, især i tilfælde af autolog ECM implantater6.
På grund af de begrænsede mængder af patient væv til at høste til autolog implantation og risikoen for at hæmme funktion på webstedet donor, evnen til at producere ECM scaffolds in vitro- fra kulturen af human cellelinjer eller, hvis det er muligt, en patient egne celler er et attraktivt alternativ. De primære udfordringer i fremstilling af betydelige mængder af ECM i vitro er binding af disse vanskeligt at fange molekyler. I tidligere arbejde, vi har bevist, at ECM kan være fremstillet ved dyrkning af ECM-secernerende fibroblaster i opoffrende polymere skum, der er opløst efter perioden kultur til udbytte ECM, som kan være decellularized for implantation7, 8,9,10. ECM fremstillet i skum tendens til at vedtage den interne arkitektur af skum, hule fibre membraner (HFMs) blev undersøgt som en opoffrende stillads til produktion af tråde af ECM. Beskrevet heri er metoder opgave for lab skala fremstilling af cellemembraner kultur kvalitet hule fibre og udvinding af bulk ekstracellulære matrix fibre fra den samme efter en periode med fibroblast kultur. Denne statiske kultur tilgang er let adoptere af laboratorier som indeholder standard pattedyr celle kultur udstyr. ECM produceret af denne tilgang kunne anvendes mod en række kliniske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. produktionen af ekstracellulære Matrix bruger opoffrende hule fibre membraner
Forsigtig: N-methyl-2-pyrrolidon er en irriterende opløsningsmiddel og reproduktive giftstoffet. Udsættelse for NMP kan forårsage irritation af hud, øjne, næse og hals. Solvens-resistente personlige værnemidler skal anvendes, når håndtering NMP. Brug af NMP bør udføres i et stinkskab.
- Forberedelse af polysulfone polymer løsning til hule fibre membraner
- 70 g af polysulfone pellets (Molekylær vægt 35 kD) i en vejer båden ved hjælp af en Analysevægt.
- 314 mL (323.3 g) af N-methyl-2-pyrrolidon (NMP) overføres til en ren borosilicate kolbe.
- Placer en røre bar i kolben med NMP og sted kolbe på omrører. Indstillet omrøreren til en moderat sats af rotation.
- Bruge en tør tragt til langsomt indflette den forberedt 70 g polysulfone i kolben med NMP.
- Tillad polymer "dope" løsning at røre i tre dage ved stuetemperatur, eller indtil homogeniseret.
- Indstilling concentricity og rengøring af hule fiber membran spindedyse
Bemærk: Spindevorter er kommercielt tilgængelige; korrekte spindedyse dimensioner er afgørende for vellykket membran fabrikation og er opført i Tabel af materialer. Håndtere spindedyse meget forsigtigt, da spindedyse nålen er særligt skrøbelige.- Brug en skruetrækker eller bore med en passende skruetrækker bit til omhyggeligt demontere spindedyse.
- Forsigtigt flow acetone gennem ind- og udløb af spindedyse, indsamle enhver acetone og resterende polymer i et glas bægerglas til bortskaffelse.
- Fastgør det øverste organ for spindedyse med nålen opad i en tabel skruestik.
- Sted outlet (nederst) kroppen af spindedyse på overkroppen.
- Flyt outlet kroppen af en spindedyse sideværts mens du holder overkroppen fast på skruestikken, indtil spindedyse nålen er direkte i midten af selve outlet.
- Forsigtigt og langsomt genindsætte de skruer, der forbinder de to organer af en spindedyse mens at nålen synlige på spindedyse outlet forbliver centreret.
- Fabrikation af polysulfone hule fibre membraner
- Forberede en "bore løsning" der indeholder 45 mL N-methyl-2-pyrrolidon og 255 mL deioniseret vand og danner en 15% blanding af NMP med deioniseret vand.
- Montere en koncentrisk hule fiber membran spindedyse 8 cm over overfladen af en stuetemperatur vand fra hanen bad.
- Tilslut spindedyse polymer indfaldende og bore indløb af en spindedyse på to separate stål trykbeholdere, der har et indre rumfang på mindst 350 mL. Begge fartøjer skal have kontraventiler på deres forretninger.
- Forbinde hver af trykbeholdere til regulatorer af separate N2 gasflasker
- Brug en tragt til at indsætte rede dope løsning (~ 315 mL) i trykbeholderen tilsluttet polymer indløb af en spindedyse. Sikre, at toppen af fartøjet er tætsluttende lukket.
- Brug en tragt til at indsætte den forberedte bore løsning (300 mL) i trykbeholderen tilsluttet bore indløb af en spindedyse. Sikre, at toppen af fartøjet er tætsluttende lukket.
- Åbne kontraventil for boring fartøj først, derefter polymer fartøj andet. Hvis spindedyse er tilstrækkeligt rene, vil bore løsning begynde at streame ud af stikkontakten i spindedyse.
- Presse begge fartøjer til 1 PSI. Bekræft visuelt, at både polymer og boring løsninger spændende spindedyse, med en kontinuerlig hvid glødetrådens fældningen som kombinerede streams kontakt vandbadet.
- Brug lange pincet til at guide den spirende fiber under rullerne midt i badet, og derefter vind den spirende fiber omkring et roterende hjul, forbundet til en motor.
- Indstille udbredelsen hjul og motor til at rotere med en hastighed på ca. to meter pr. minut.
- Foretage mindre justeringer af tilsynsmyndigheder eller udbredelsen hjulet hastighed efter behov indtil en steady-state flow er opnået. Den spirende fiber bør danne en 90° vinkel med overfladen af vandbadet.
- Tæt N2 cylinder regulatorer og trykbeholder kontraventiler og frigøre udbredelsen hjulet motor efter alle polymer og bore løsning er blevet ekstruderet fra fartøjer.
- Fjerne rede hule fibre membraner og placere dem i et bad med deioniseret vand i tre dage, udveksle deioniseret vand en gang om dagen for at fjerne resterende opløsningsmiddel.
- Sterilisere hule fibre membraner ved autoklavering dem ved 121 ° C i 30 minutter eller ved at nedsænke dem for en dag i 70% ethanol.
- Celle såning af hule fibre membraner
Bemærk: Alle celle kultur procedurer bør udføres inden for et kabinet biosikkerhed.- Behandle hule fibre membraner med en 20 µg/mL opløsning af kvæg plasma fibronektin i PBS (pH = 7.4) at fremme celle vedhæftet fil.
- Vejer 1 mg pulveriserede bovin plasma fibronektin i en vejer båden og opløse den i 1 mL steril PBS (pH = 7.4) i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Inkubér 1 mg/mL bovin plasma fibronektin løsning i rugemaskinen i 30 minutter. Føje løsningen til 49 mL steril PBS i en steril 50 mL konisk centrifugeglas.
- Inkuber fibre i den forberedte 50 mL af kvæg plasma fibronektin i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 1 time. Huske fibronektin løsningen til senere brug og opbevares i en steril 50 mL konisk centrifugeglas på 4 ° C.
- Brug steril microscissors til at skære fibrene til ønskede længde (< 6 cm).
- Frø fibroblastceller direkte til lumina i hule fibre membraner på en seeding tæthed af 100.000 celler pr. fiber ved hjælp af en 21-gauge kanyle med 1 mL sprøjte.
Bemærk: Et muligt mål for at forberede cellesuspension til indlæsning i sprøjten er en suspension tæthed af 100.000 celler for hver 30 microliters af medium. - Placere seks seedede fibre i en 6 cm diameter petriskål. Tillad seedede fibrene til inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i fem minutter.
- Fjerne den seedede fibre fra inkubation og kultur dem i op til 3 uger i DMEM/F-12 der indeholder endelige koncentration på 50 µg/mL L-ascorbinsyre og 150 µg/mL L-ascorbinsyre syre 2-fosfat (frisklavet og sterile filtreret), 5 ng/mL TGF-B1 (fra sterile filtreret delprøver opbevares ved-20 ° C), og 1% penicillin-streptomycin i en 6 cm petriskål inden for en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Exchange celle medium hver to dage.
- Behandle hule fibre membraner med en 20 µg/mL opløsning af kvæg plasma fibronektin i PBS (pH = 7.4) at fremme celle vedhæftet fil.
- Udvinding af ekstracellulære matrix fra kulturperler hule fibre membraner
- Sted kulturperler fibre i individuelle scintillation hætteglas med pincet.
- Læg op til 5 mL af NMP i hvert hætteglas ved hjælp af et glas pipette.
- Fordybe den hule fibre i NMP, udfører alt tre udveksling af NMP. Langsomt Opsug den gamle NMP med 1 mL pipette til at forhindre rivning af uddraget ECM.
Bemærk: Når du tilføjer frisk NMP, det er nyttigt at vippe hætteglasset og tillade NMP løbe ned ad siderne, ellers den resterende ECM stillads er udsat for at vride, hvilket kan forårsage at rive. - Fjerne NMP og skylles den resulterende ECM tråd 3 gange i ionbyttet vand.
- Klip en 1/32-tommer tyk ark af silikonegummi til en længde på 3 inches, bredde af 1 tomme og skære en 8 mm med 4 mm rektangulære mug i midten af længden af gummi.
- Placere den rede stykke af gummi på en standard 3-tommer af 1-tommer mikroskopi dias og autoklavering ved 121 ° C i 30 minutter.
- Lægge hver ECM fiber side om side i 8 mm af 4 mm silikone skimmel, indtil der er ikke synlig åben plads.
- Placerer formen i et 50 mL konisk centrifugeglas og fryse ved-80 ° C indtil helt frosset.
- Lyophilize frosne ECM mesh natten over eller indtil fuldstændig tør. Gemme trådnet ved 4° C indtil klar til decellularization.
2. decellularization af ekstracellulære Matrix
- Der fremstilles en opløsning af 1% (w/w%) sodium dodecyl sulfat (SDS) i ionbyttet vand.
- Inkuber udpakkede ekstracellulære matrix i formen i 1% SDS i 24 timer ved stuetemperatur på en rocker med blid agitation.
- Skyl udvundet ekstracellulære matrix tre gange i sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med blid agitation, ved hjælp af 3 mL PBS pr skyl.
Bemærk: Skylninger bør udføres forsigtigt for at minimere rivning af rede stilladser. - Forberede 1 L DNAse/RNAse fordøjelsen buffer.
Bemærk: DNAse/RNAse fordøjelsen buffer kan opbevares i flere måneder ved 4° C.- Veje 1,54 g Tris HCl, 308 mg af MgCl2og 56 mg CaCl2 i separat vejer bådene.
- Kombinere Tris HCl, MgCl2og CaCl2 med 1 L deioniseret vand i en stor kolbe med strandbar rør og rør, indtil alle komponenter er opløst.
- Sterile filter fordøjelsen buffer med et 0,22 µm filter i en steril 1 L borosilicate flaske og opbevares ved 4° C.
- Forberede 5 mL af DNAse/RNAse fordøjelsen løsning.
Bemærk: Fordøjelse løsning bør anvendes inden for 24 timer på forberedelse.- 0,125 mg (50 kU) af DNAse afvejes I en vejer båd og tilsættes 5 mL af fordøjelsen buffer.
- Tilføje 75 µL af RNAse A stamopløsning til fordøjelsen buffer.
- Fyld hver mug med fordøjelsen løsning og inkuberes ved 4 ° C i 6 timer.
- Opsug fordøjelsen løsning og skylles tre gange i steril PBS.
- Opsug PBS og inkuberes stilladser overnatning i 10% penicillin-streptomycin i PBS ved 4° C.
- Opsug penicillin-streptomycin og skyl stilladser tre gange i steril PBS.
- Placerer formen i et 50 mL konisk centrifugeglas og fryse ved-80 ° C.
- Lyophilize den decellularized ECM mesh natten over eller indtil fuldstændig tør.
- Overføre de frysetørrede stilladser inden for Biosikkerhed hætte til en steril beholder ved 4° C indtil brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket produktion af ekstracellulære matrix fra opoffrende stilladser er betinget af passende stillads fabrikation, cellekultur og opløsningsmidler skyl procedurer. Fabrikation af hule fibre membraner udføres ved hjælp af en tør-jet våd-spinning system samlet fra kommercielt tilgængelige komponenter (figur 1) som bruger ekstrudering af polymer løsning gennem annulus af et kommercielt tilgængelige stål spindedyse (indre diameter = 0,8 mm, ydre diameter = 1,6 mm) til at generere en spirende tube polymer løsning, som udfældes i en hule fiber membran ved kontakt med et vandbad.
Et eksempel proces for ECM udtræk fra HFMs er illustreret i figur 2. Figur 3A viser en tværgående tværsnit af polysulfone HFMs fabrikeret under denne protokol, udstiller ydre og indre lag af finger-lignende porer karakteristisk for en asymmetrisk membran. I denne protokol, er celler seedet specifikt i den indre lumen af membranen og kulturperler i 6 cm diameter petriskåle (figur 3B), med celler tendens til at formere sig på alle overflader af membranen. Kulturperler membraner kan derefter blive udsat for batch NMP og deioniseret vand skylle i standard glas scintillationshætteglas (figur 3 c), producerer gennemsigtige tråde af ECM (figur 3D). ECM-producerende celler forbliver levedygtige inde i HFMs i 3-ugers periode af kulturen (figur 4).
HFMs kulturperler i tre uger med primære rotte skeletmuskulatur fibroblaster (RSMF) blev opløst via tre udveksling af N-methyl-2-pyrrolidon, hvorefter de blev skylles tre gange i ionbyttet vand. Den udpakkede matrix, normalt er gennemskinneligt udseende når hydreret (figur 5A), vil have tendens til at sky ved hydrering, hvis ikke underkastes passende opløsningsmiddel skylning på grund af tilstedeværelsen af resterende polymer. Det bør også bemærkes, at ECM resterende efter opløsningen af membranen er lidt skrøbelig, der kræver pleje i håndtering med fine pincet. ECM fibre samles til masker og derefter frysetørret udviser en off-white farve og fibrøst udseende med en grov langsgående justering (figur 5B).
Figur 1: illustreret procesforløbet til støbning hule fibre membraner. Hule fibre membraner er fremstillet ved hjælp af den allestedsnærværende ikke opløsningsmiddel inducerede fase adskillelse metode (NIP) ved hjælp af et system udarbejdet fra kommercielt tilgængelige komponenter fremgår af tabel for bestemte materialer. Polysulfone i NMP (17,8 w/w%) og NMP boring løsninger (15 w/w% NMP i vand) er ekstruderet fra separate rustfrit stål fartøjer af tryk N2 i en spindedyse, generere en spirende hule fiber membran på spindedyse outlet, som fuldt udfældes ved kontakt med vand fra hanen nedbør bad. Spirende hule fibre er manuelt styret under og over vejledninger og lov til at indsamle på en roterende motoriseret udbredelsen hjul med en sats på 2,3 meter pr. minut. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: illustreret fremstilling af ECM fra kulturperler hule fibre membraner. Hule fibre membraner er seedet med fibroblaster og kulturperler i tre uger, efterfulgt af udveksling af NMP 3 x og exchange deioniseret vand 3 x. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kultur og udvinding af ECM. Asymmetrisk mesoporøse hule fibre membraner (A) var kulturperler i tre uger med RSMF celler i DMEM/F-12 med suppleret ascorbinsyre og TGF-β (B). Kulturperler hule fibre (C, D top) blev opløst via 3 udvekslinger i n-methyl-2-pyrrolidon derefter skylles tre gange i ionbyttet vand, hvilket resulterer i løbende tråde af ECM (D, nederst). Høj forstørrelse scanning elektronmikroskopi Mikrograf af ECM fiber overflade (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: cellernes levedygtighed på hule fibre membraner. Repræsentative hule fibre membraner kulturperler med RSMF celler, for tre uger var på langs i snit ved hjælp af en fin barbermaskine til at afsløre den luminale overflade af HFMs og underkastes levende døde farvning med Calcein AM og EthD-1. Levedygtighed farvning afslørede en sammenflydende lag af levedygtige celler med ubetydelig EthD-1 fluorescens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: montering af ECM implantat. Enkelte ekstracellulære matrix tråde (n = 30) stammer fra kultur af RSMF celler blev placeret på langs i en silikone formen (A) og decellularized af 1% SDS efterfulgt af behandling med DNAse jeg, RNAse A og penicillin-streptomycin. Decellularized ECM blev derefter frysetørret, giver en off-white mesh med fibrøst udseende og langsgående arkitektur (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De processer, der er beskrevet aktiverer produktionen af bulk ECM biomaterialer in vitro- ved hjælp af hule fibre membraner støbt af en tør-jet våde spinning system giver mulighed for billig bulk produktionen af membraner samt standard celle kultur udstyr. Mens membraner fabrikeret i denne protokol er beregnet til brug i cellekultur, kan systemet beskrevet også være tilpasset til fremstilling af membraner til adskillelse formål, med pore distribution og hule fibre størrelsesdimensioner afstemmelige af varierende spindedyse dimensioner, polymer, der anvendes, dope og bar strømningshastighed, udbredelsen hastighed og miljøforhold. 13 selv om protokollen detaljeret beskæftiger hule fibre membraner, i princippet alle opløselige cellekultur stillads med passende transport egenskaber såsom åbne celle skum kunne anvendes, som det fremgår tidligere arbejdet7, 8,9. Denne generelle tilgang vises nyttig for produktionen af ECM stilladser af opoffrende stilladser, som mere trofast kan efterligne den interne arkitektur af væv. Implantater produceret af denne protokol, navnlig udviser en grov justering (figur 5B), som kan være til særlig gavn mod genopbygning af stærkt tilpasset væv som sener, ledbånd og skeletmuskulatur.
Regelmæssig udveksling af medium og, især, tilskud af medium med ascorbinsyre og TGF-β er afgørende for produktion af ECM, som ascorbinsyre er et vigtigt enzym i kollagen biosyntese og TGF-β inducerer syntesen af flere ECM proteiner10 . Derudover grundig afskylning af ECM med NMP skal udføres, ellers resterende polymer vil forblive i den udpakkede ECM, optræder som en hvid film under vand skylninger. Pleje skal tages til ikke overdrevent agitere ECM under membran opløsning, da det er relativt skrøbeligt. Indsamlede ECM stilladser bestemt til implantation skal underkastes en decellularization trin som beskrevet for at fjerne xenogene epitoper for at minimere en potentiel vært fremmedlegeme svar.
Betydningen af denne teknik ligger i sin produktion af en biocomplex stillads af hele ekstracellulære matrix, som kan være ombygget af kroppens egen sårheling processer. Ved at bruge denne fremgangsmåde til at producere ECM fra celler specifikke til en målart, kan det være muligt at minimere den udenlandske kroppen reaktion, som hindrer den kliniske effektivitet af denne klasse af biomaterialer; ved hjælp af celler specifikke til en individuel, kan fremmedlegeme svar mindskes yderligere. Denne tilgang giver også mulighed for produktion af ECM målrettet mod særlige væv, med de seneste rapporter tyder på, at væv-specifikke ECM kan være særligt effektive i visse programmer12. Da denne protokol giver mulighed for fremstilling af ECM på tværs af forskellige cellelinjer, implantater, kombinere ECM fra flere celletyper (fx muskel, nervøs, endotel) kan bruges til at skræddersy implantater for at mere trofast tilnærme struktur og kemiske kompleksiteten af målvæv. Mens ECM maskerne præsenteres her var oprindeligt tænkt som stilladser for sår reparation, kan de også har brug som platforme for undersøgelser af celle-ECM interaktioner, durotaxis og biosensing. Især egner denne tilgang investigator evnen til at producere ECM fra bestemte celletyper af interesse, som kan give mulighed for ny indsigt i den biologiske betydning af væv-specifikke ECM struktur, sammensætning og funktion.
Potentielle forbedringer til ECM produktionsteknikker præsenteres her kunne omfatte opskalering via brugen af dynamisk og pre aircondition bioreaktorer samt udforskning af alternative opoffrende stillads materialer og arkitekturer. Især ville overgangen til en solventless stillads fjernelse proces forbedre sikkerheden ved udpakningen; hellige stilladser består af materialer, der er nedbrydelige ved enzymer, såsom folier af celluloseregenerater, kan give mulighed for solventless ECM udvinding14. Mens trækstyrke af disse materialer er under de af syntetiske materialer, findes der flere muligheder for forbedring af disse stilladser, herunder udforskning af forskellige dyrkningsbetingelser, medier formuleringer og opoffrende stillads geometrier. Seneste genteknologi fremskridt kunne udnyttes til at producere pro-fibrotisk cellelinjer, som i kombination med platforme for ECM capture kunne aktiverer produktionen af stilladser opfylder kliniske krav. Yderligere, eksisterende dynamisk kultur systemer såsom kontinuerlig flow-loop hule fiber membran bioreaktorer lette høje priser af næringsstof udveksle bidrager til større og hurtigere ECM produktion, og kan være af særlig interesse i at udnytte dette teknik til produktion af større mængder af ECM for biologisk forskning og klinisk brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af det nationale Institut for gigt og bevægeapparat og hudsygdomme af National Institutes of Health under award nummer R15AR064481, National Science Foundation (CMMI-1404716), samt den Arkansas Biosciences Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/32 inch thick silicone rubber | Grainger | B01LXJULOM | |
| 20 mL Scintillation Vials, Borosilicate glass, Disposable - VWR | VWR | 66022-004 | With attached white urea cap and cork foil liner |
| 3 inch by 1 inch microscopy slides | VWR | 75799-268 | |
| 4C refrigerator | Thermo Fisher Scientific | FRGG2304D | Any commercial 4C refrigerator will suffice. |
| 50 mL tubes | VWR | 21008-178 | |
| 6-well cell culture plates | VWR | 10062-892 | Alternative brands may be used |
| Acetone | VWR | E646 | Alternative brands may be used |
| Bore vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Bovine Plasma Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010018 | Comes as 1 mg of lyophilized protein |
| CaCl2 | VWR/Amresco | 97062-590 | |
| Cell Culture Incubator w/ CO2 | Any appropriate CO2-supplied mammalian cell incubator will suffice. | ||
| Disposable Serological Pipets, Glass - Kimble Chase | VWR | 14673-208 | Alternative brands may be used |
| DMEM/F-12, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Warm in water bath at 37°C for 30 minutes prior to use |
| DNase I | Sigma-Aldrich | DN25-10MG | |
| Dope vessel | McMaster-Carr | 89785K867 | 6 ft 316 steel tubing |
| Ethanol | VWR | BDH1160 | Dilute to 70% for sterilization |
| Fetal Bovine Serum, qualified, US origin - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | Mix with growth media at 10% concentration (50mL in 500mL media) |
| Four 1/4-inch to 1" reducing unions | Swagelok | SS-1610-6-4 | One reducing union for each inlet and outlet of each vessel |
| Freeze-dryer/lyophilizer | Labconco | 117 (A65312906) | Any lyophilizer will suffice. |
| Hexagonal Antistatic Polystyrene Weighing Dishes - VWR | VWR | 89106-752 | Any weigh boat will suffice |
| Hollow fiber membrane immersion bath | 34L polypropylene tubs may be used or large bath containers can be fabricated from welded steel sheets | ||
| Hollow Fiber Membrane Spinneret | AEI | http://www.aei-spinnerets.com/specifications.html | Made to order. Inner diameter = 0.8 mm, outer diameter = 1.6 mm |
| Hot plate/stirrer | VWR | 97042-634 | |
| Human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-25G | |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
| L-glutamine (200 mM) - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Mix with growth media at 1% concentration (5mL in 500mL media) |
| MgCl2 | VWR/Alfa Aesar | AA12315-A1 | |
| Minus 80 Freezer | Thermo Fisher Scientific | UXF40086A | Any commercial -80C freezer will suffice. |
| N2 gas cylinders (two) | |||
| NIH/3T3 cells | ATCC | CRL-1658 | Alternative fibrogenic cell lines may be used. |
| N-methyl-2-pyrrolidone | VWR | BDH1141 | Alternative brands may be used |
| Penicillin/Streptomycin Solution - Gibco | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Mix with growth media at 0.1% concentration (0.5 mL in 500mL media) |
| Polysulfone | Sigma-Aldrich | 428302 | Any polysulfone with an average Mw of 35,000 daltons may be used |
| Portable Pipet-Aid Pipetting Device - Drummond | VWR | 53498-103 | Alternative brands may be used |
| PTFE tubing (1/4-inch inner diameter) | McMaster-Carr | 52315K24 | Alternative brands may be used. |
| Rat skeletal muscle fibroblasts | Independently isolated from rat skeletal muscle. Alternative fibrogenic cell lines may be used. | ||
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4642 | |
| Silicone sheet | McMaster-Carr | 1460N28 | |
| Take-up motor | Greartisan | B071GTTSV3 | 200 RPM DC Motor |
| Tris HCl | VWR/Amresco | 97063-756 | |
| Two needle valves | Swagelok | SS-1RS4 |
References
- Cobb, W. S., Kercher, K. W., Heniford, B. T. The argument for lightweight polypropylene mesh in hernia repair. Surgical Innovation. 12 (1), 63-69 (2005).
- Morais, J. M., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. Biomaterials/Tissue Interactions: Possible Solutions to Overcome Foreign Body Response. The AAPS Journal. 12 (2), 188-196 (2010).
- Simon, P., et al. Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFT® in pediatric patients. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 23 (6), 1002-1006 (2003).
- FDA strengthens requirements for surgical mesh for the transvaginal repair of pelvic organ prolapse to address safety risks. , Food and Drug Administration. (2016).
- Kartus, J., Movin, T., Karlsson, J. Donor-site morbidity and anterior knee problems after anterior cruciate ligament reconstruction using autografts. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery. 17 (9), 971-980 (2001).
- Lu, H., Hoshiba, T., Kawazoe, N., Chen, G. Autologous extracellular matrix scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 32 (10), 2489-2499 (2011).
- Wolchok, J. C., Tresco, P. A. The isolation of cell derived extracellular matrix constructs using sacrificial open-cell foams. Biomaterials. 31 (36), 9595-9603 (2010).
- Roberts, K., Schluns, J., Walker, A., Jones, J. D., Quinn, K. P., Hestekin, J., Wolchok, J. C. Cell derived extracellular matrix fibers synthesized using sacrificial hollow fiber membranes. Biomedical Materials. 13 (1), (2017).
- Hurd, S. A., Bhatti, N. M., Walker, A. M., Kasukonis, B. M., Wolchok, J. C. Development of a biological scaffold engineered using the extracellular matrix secreted by skeletal muscle cells. Biomaterials. 49, 9-17 (2015).
- Kasukonis, B. M., Kim, J. T., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Development of an infusion bioreactor for the accelerated preparation of decellularized skeletal muscle scaffolds. Biotechnology Progress. 32 (3), 745-755 (2016).
- Murad, S., et al. Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (5), 2879-2882 (1981).
- Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
- Feng, C. Y., Khulbe, K. C., Matsuura, T., Ismail, A. F. Recent progresses in polymeric hollow fiber membrane preparation, characterization and applications. Separation and Purification Technology. 111, 43-71 (2013).
- Domb, A. J., Kost, J., Wiseman, D. Handbook of Biodegradable Polymers. , CRC Press. (1998).
