Summary

Yalıtım ve insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücre erken Doğum ve terim bebekler karakterizasyonu

Published: January 26, 2019
doi:

Summary

İnsan göbek kordonu (UC) sonucu olarak preterm, terim perinatal dönemde elde edilebilir ve teslimat postterm. Bu protokol için biz yalıtım ve UC kaynaklı mezenkimal kök hücre (UC-MSCs) karakterizasyonu fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik açıklar.

Abstract

Mezenkimal kök hücre (MSCs) önemli bir tedavi potansiyel var ve Biyomedikal alanında artan ilgi çekmek. MSCs aslında izole ve kemik iliği (BM) ile karakterize, sonra yağ dokusu, synovium, cilt, diş hamuru ve gibi plasenta, fetal ekleri dahil olmak üzere dokularda elde göbek kordon kanı (UCB) ve (UC) göbek kordonu. MSCs türdeş olmayan hücre nüfus (1) plastik Standart kültür koşulları, (2) yüzey marker ifade CD73 bağlılığı kapasiteli olan+/CD90+/CD105+/CD45/CD34/CD14/CD19 /HLA-DR fenotipleri ve adipositler, osteocytes ve olarak şu anda hücresel terapisi (ISCT) için uluslararası toplum tarafından tanımlanan kondrosit, (3) trilineage farklılaşma. BM MSCs en çok kullanılan kaynak olsa da, BM aspirasyon invaziv doğası onun erişilebilirlik etik sınırlar. MSCs yayılması ve ayırt etme kapasitesini elde BM Genel olarak donör yaş ile düşüş. Buna ek olarak, fetal MSCs UC elde edilen güçlü yayılması ve ayırt etme kapasitesi gibi avantajlara sahip. Bu genellikle tıbbi atık olarak kabul edilir gibi UC örnekleme için etik endişe vardır. İnsan UC amniyon boşluğu büyüme gebelik 4-8 hafta devam ile geliştirmeye başlar ve 50-60 cm uzunluğunda erişene dek büyüyen tutar ve tüm yeni doğan teslim süresi sırasında ayrılmış olabilir. Dirençli hastalıklar Patofizyoloji bir anlayış kazanmak için UC kaynaklı MSCs (UC-MSCs) üzerinden çeşitli gestasyonel yaş teslim bebekler kullandık. Bu protokol için yalıtım ve karakterizasyonu UC-MSCs fetusa/bebeklerde üzerinden 19-40 hafta gebelik açıklanmaktadır.

Introduction

Mezenkimal kök hücre (MSCs) ilk olarak izole edilmiştir ve kemik iliği (BM)1,2 karakterize ama ayrıca çok çeşitli dokuların yağ dokusu, synovium, cilt, diş hamuru ve fetal ekleri dahil olmak üzere elde edilebilir 3. MSCs çoğalırlar ve adipositler, osteocytes ve kondrosit ayırmak bir türdeş olmayan hücre nüfus olarak tanınıyor. Buna ek olarak, MSCs yaralanma sitelere geçiş, bastırmak ve bağışıklık yanıtı, modüle yeteneğine sahip ve tadilat ve onarım yaralanma. Şu anda, farklı kaynaklardan gelen MSCs karşı dirençli hastalıklar, Greft – versus – host hastalığı, kalp krizi ve beyin enfarktüsü4,5 de dahil olmak üzere bir dizi hücre tedavisi için bir kaynak olarak ilgi çekti var .

BM MSCs en iyi karakterize kaynağı olsa da, BM aspirasyon invasiveness erişilebilirlik etik sınırlar. MSCs yayılması ve ayırt etme kapasitesini elde BM Genel olarak donör yaş ile düşüş. Buna ek olarak, fetal MSCs gibi plasenta, göbek kordon kanı (UCB), fetal ekleri elde edilen ve göbek kordonu (UC) örnekleme ve sağlam yayılması ve ayırt etme kapasitesi6 ile ilgili daha az Etik kaygılar da dahil olmak üzere avantajları var , 7. ise plasenta fetomaternal kabul genellikle tıbbi atık olarak atılır fetal ekleri arasında UCB ve UC fetal bir organ olarak kabul edilir. Buna ek olarak, plasenta ve UCB örneklenmiş olup ise plasenta ve UC toplanan ve yenidoğan doğumdan sonra işlenen yeni doğan teslimat, tam şu anda toplanan gerek. Buna göre UC hücre terapisi8,9için umut verici bir MSC kaynağıdır.

İnsan UC amniyon boşluğu progresif genişlemesi 4-8 hafta gebelik ile geliştirmeye başlar, 50-60 cm uzunluğunda kadar büyümeye devam ediyor ve yeni doğan teslim10bütün döneminde ayrılmış olabilir. Dirençli hastalıklar Patofizyoloji bir anlayış kazanmak için UC kaynaklı MSCs (UC-MSCs) üzerinden çeşitli gestasyonel yaş11,12, teslim bebekler kullanın. Bu protokol için yalıtmak ve UC-MSCs fetusa/bebeklerde 19-40 hafta gebelik karakterize nasıl açıklar.

Protocol

İnsan örnekleri kullanım için bu çalışmada Kobe Üniversitesi Lisansüstü Tıp Fakültesi (onay No 1370 ve 1694) Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve onaylanmış kılavuzlarınıza uygun olarak yapılmıştır. 1. yalıtım ve UC-MSCs kültürü Not: UC-MSCs kültürlü, başarılı bir şekilde izole edilmiş ve genişletilmiş (daha fazla geçiş sayı 4) 200’den fazla gelen UCs bu protokole tabi. 200’den fazla arasında UCs, % 100 gö…

Representative Results

UC koleksiyonundan yordamlar MSC kültürüne Şekil 1′ de özetlenmiştir. UC yaklaşık 5-10 cm uzunluğunda tüm yenidoğan sezaryenle teslim dan toplanabilir. UC 4-8 hafta gebelik geliştirmeye başlar ve Şekil 2′ de gösterildiği gibi 50-60 cm uzunluğunda, kadar büyümeye devam ediyor. İki damar (A), bir damar (V), kordon astar (CL) ve Wharton’ın Jelly (WJ) UC içinde Şekil 3 ve <strong c…

Discussion

MSCs dokular çeşitli ayrılmış olabilir ve tüm express aynı fenotipik işaretleri yapmak hücre türdeş olmayan nüfus vardır. Burada, biz, erken Doğum ve terimi bebeklerin kılavuzları koleksiyonu ve UC diseksiyon ve yalıtım ve UC-MSCs kültürünü sağlayan bir protokol sıraladı. Bu iletişim kuralı başarıyla gelen fetusa/bebeklerde 19-40 gebelik haftasından itibaren teslim ve zorlu hastalık patofizyolojisi bazı yönlerini temsil ettikleri gösterdi ISCT ölçüt19 yerine ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu iş için Scientific Research (C) Grants-in-Aid tarafından desteklenmiştir (sayı vermek: 25461644) ve genç bilim adamları (B) (sayılar vermek: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) JSP’ler KAKENHI in.

Materials

50mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton’s jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton’s Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Play Video

Cite This Article
Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

View Video