Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Hier presenteren we een protocol karakteriseren nucleosoom deeltjes op het niveau van de single-molecuul met behulp van statische en time-lapse atomaire kracht microscopie (AFM) beeldvormende technieken. De beschreven methode van oppervlakte functionalization zorgt voor de opname van de structuur en de dynamiek van nucleosomes in hoge resolutie op nanoschaal.

Abstract

Chromatine, oftewel een lange keten van nucleosoom subeenheden, is een dynamisch systeem dat voorziet in deze kritieke processen zoals DNA replicatie en transcriptie te nemen plaats in eukaryote cellen. De dynamiek van nucleosomes toegang biedt tot de DNA van replicatie en transcriptie machineries en kritisch bijdraagt aan de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de chromatine functies. Studies van de single-molecuul zoals atomaire kracht microscopie (AFM) imaging hebben aanzienlijk bijgedragen aan ons huidige begrip van de rol van nucleosoom structuur en dynamiek. Het huidige protocol beschrijft de stappen waardoor hoge resolutie beeldvormingstechnieken van de AFM te bestuderen van de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Het protocol wordt geïllustreerd door de AFM gegevens die zijn verkregen voor de nucleosomes van de centromeer waarin H3 Histon wordt vervangen door haar tegenhanger centromeer eiwit een (RETOREN-A). Het protocol begint met de vergadering van mono-nucleosomes met behulp van een methode van continue verdunning. De voorbereiding van het mica substraat met aminopropyl silatrane (APS-mica) die wordt gebruikt voor de beeldvorming nucleosoom matiemaatschappij is van cruciaal belang voor de AFM visualisatie van nucleosomes beschreven en de procedure voor het voorbereiden van het substraat wordt verstrekt. Nucleosomes gestort op het oppervlak van de APS-mica zijn eerste beeld met behulp van statische AFM, die een momentopname van de nucleosoom bevolking vangt. Uit analyses van deze beelden, dergelijke parameters zoals de grootte van DNA gewikkeld rond de nucleosomes kunnen worden gemeten en dit proces is ook gedetailleerd. De time-lapse AFM imaging procedure in de vloeistof wordt beschreven voor de high-speed time-lapse AFM die verschillende frames kan vangen van nucleosoom dynamiek per seconde. Ten slotte is de analyse van de dynamiek van de nucleosoom waardoor de kwantitatieve karakterisering van de dynamische processen beschreven en geïllustreerd.

Introduction

In eukaryote cellen is DNA zeer verkorte en georganiseerd in de chromosomen. 1 het eerste niveau van de organisatie van het DNA in een chromosoom is de vergadering van de nucleosomes in welke 147 bp van DNA is strak gewikkeld rond een kern van Histon octamer. 2 , 3 nucleosoom deeltjes monteren op een lange DNA-molecuul vormen een chromatine-array die wordt dan georganiseerd tot een zeer compact chromosoom eenheid ontstaat. 4 de demontage van de chromatine geeft de toegang tot het DNA dat vereist is door kritische cellulaire processen zoals gene transcriptie en genoom replicatie, suggereert dat chromatine is een zeer dynamisch systeem gratis. 5 , 6 , 7 inzicht in de dynamische eigenschappen van DNA op verschillende niveaus van de chromatine is uitermate belangrijk voor het ophelderen van genetische processen op moleculair niveau waar fouten tot celdood of de ontwikkeling van ziekten zoals kanker leiden kunnen. 8 is een eigenschap van de chromatine van groot belang is de dynamiek van nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 de hoge stabiliteit van deze deeltjes is toegestaan voor de karakterisering van het structurele door kristallografische technieken. 2 wat deze studies ontbreken zijn de dynamische details van nucleosomes zoals het mechanisme van DNA uitpakken vanuit de kern van Histon; de dynamische route die is vereist voor replicatie en schrijffouten en andere processen. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 bovendien speciale eiwitten remodelleert factoren genoemd is gebleken om de demontage van nucleosomal deeltjes17; de intrinsieke dynamiek van nucleosomes is echter de kritieke factor in dit proces dat tot het gehele demontage proces bijdraagt. 14 , 16 , 18 , 19

Single-molecuul technieken zoals single-molecuul fluorescentie19,20,21, optische overlapping (pincet)13,18,22,23 en AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 zijn instrumentaal in het begrip van de dynamiek van nucleosomes. Tussen deze methoden, AFM profiteert van diverse unieke en aantrekkelijke functies. AFM maakt het mogelijk om te visualiseren en karakteriseren van individuele nucleosomes evenals de langere matrices27. AFM beelden, kunnen belangrijke kenmerken van nucleosoom structuur zoals de lengte van DNA de Histon kern gewikkeld worden gemeten 10,14,26,28; een parameter die centraal staat in de karakterisering van nucleosoom uitpakken dynamiek. Verleden AFM studies is nucleosomes zeer dynamische systemen en dat DNA spontaan vanuit de kern Histon14 uitpakken kuntgebleken. De spontane uitpakken van DNA van nucleosomes was direct gevisualiseerd door AFM actief zijn in de modus time-lapse wanneer de beeldvorming wordt gedaan in waterige oplossingen 14,26,29.

De komst van de snelle time-lapse instrumentatie van de AFM (HS-AFM) maakte het mogelijk om te visualiseren van het proces nucleosoom uitpakken op de milliseconde tijdschaal 14,15,24. Recente studies van de30 van HS-AFM 16,van centromeer specifieke nucleosomes geopenbaard verschillende nieuwe functies van de nucleosomes vergeleken met het canonieke type. Centromeer nucleosomes vormen van een centromeer, een klein deel van het chromosoom cruciaal voor chromosoom segregatie31. In tegenstelling tot canonieke nucleosomes in bulk chromatine bevat de kern Histon van centromeer nucleosomes RETOREN-A Histon in plaats van Histon H332,33. Als gevolg van deze substitutie Histon, is DNA inwikkeling in centromeer nucleosomes ~ 120 bp in plaats van de 147 ~ bp voor canonieke nucleosomes; een verschil dat tot verschillende morphologies van de centromeer en canonieke nucleosomes leiden kan arrays34, suggereren dat centromeer chromatine ondergaat hogere dynamiek in vergelijking met het grootste deel een. De nieuwe dynamiek weergegeven door centromeer nucleosomes HS-AFM16,30 studies illustreren de unieke kans geboden door de techniek van deze single-molecuul te visualiseren direct de structurele en dynamische eigenschappen van nucleosomes. Voorbeelden van deze functies zal kort worden besproken en geïllustreerd aan het einde van het papier. Deze vooruitgang geboekt als gevolg van de ontwikkeling van nieuwe protocollen voor AFM beeldvorming van nucleosomes, alsmede de wijzigingen van bestaande methoden. Het doel van het protocol hier beschreven is vooruitgang te boeken deze spannende in single-molecuul AFM nucleosoom studies toegankelijk voor iedereen die graag gebruik maken van deze technieken in hun onderzoek van de chromatine. Veel van de beschreven technieken zijn van toepassing op problemen buiten de studie van nucleosomes en kunnen worden gebruikt voor onderzoek van de andere eiwitten en DNA systemen van belang. Een paar voorbeelden van dergelijke toepassingen kunnen worden gevonden in publicaties35,36,,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 en vooruitzichten van AFM studies verschillende biomoleculaire systemen worden gegeven in29,50,51,53,,54Beoordelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. continu verdunning vergadering van Mono-nucleosomes

  1. Genereren en zuiveren van een ongeveer 400 bp DNA substraat dat een af-gecentreerde Widom 601 nucleosoom positionering van de reeks bevat. 55
    Opmerking: Als u wilt beperken de ongewenste vorming van di-nucleosomes, elke 'arm' flankerend de positionering volgorde mag niet meer dan ~ 150 bp.
    1. Gebruik van de plasmide pGEM3Z-601 samen met de ontworpen inleidingen en versterken van het substraat-DNA met PCR. Voor de 423 bp substraat met 122 en 154 bp arm lengtes hier gebruikt, gebruik vooruit (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') en omgekeerde (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') inleidingen.
    2. Toevoegen met het reactiemengsel aan een thermische cycler buizen voorverwarmd tot 95 ° C. Voer het volgende programma 33 cycli na een initiële denaturatie voor 5 min op 95 ° C: 30 s denaturatie bij 95 ° C, 30 s gloeien bij 49 ° C, 35 s uitbreiding bij 72 ° C. Stel een definitieve verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten na de 33 cycli.
    3. Het zuiveren van het DNA uit het PCR-mengsel met behulp van een commercieel beschikbare PCR zuivering Kit. Wanneer het DNA uit het PCR Schoonmaakbeurt kolom eluerende, 10 mM Tris buffer (pH 7.5) in plaats van de kit geboden elutie buffer gebruiken
      Opmerking: Neem extra zorg niet over te dragen van de buffers tussen de zuivering stappen. Een besmette eluens kan problemen veroorzaken stroomafwaarts wanneer meting DNA concentratie en/of de startende zoutconcentratie van het mengsel van de vergadering nucleosoom kunt wijzigen.
  2. Bepalen van de concentratie van DNA door het meten van de extinctie van gezuiverde DNA op 260 nm.
    1. Een leeg op de UV-VIS spectrofotometer met behulp van alleen de 10 mM Tris pH 7.5 elutie buffer verzamelen. Een meting van het gezuiverde DNA te verzamelen.
  3. Met de concentratie bepaald, aliquoot 25 pmol van het gezuiverde DNA in een 0,6 mL microfuge buis en breng dit in een vacuüm centrifuge totdat de oplossing nauwelijks zichtbaar is; Dit is meestal 30 min tot 1 h.
    Opmerking: Het DNA substraat is nu klaar voor nucleosoom montage. Anders, het protocol kan hier worden onderbroken en het DNA opgeslagen bij-20 ° C tot gebruik.
  4. Plaats van de microfuge buis met de 25 pmol DNA op het ijs en voeg de nucleosoom montage onderdelen in tabel 1, in de aangegeven volgorde. Wanneer alle onderdelen zijn toegevoegd, verwijderen van het mengsel uit het ijs en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 30 min.
    Opmerking: Het is cruciaal dat het zoutgehalte van de buffer voorraad Histon wordt beschouwd wanneer de NaCl berekening die onontbeerlijk is om de uiteindelijke concentratie van 2 M. 15 , 56
  5. Monteer de nucleosomes door het verminderen van de zoutconcentratie van 2 M van het mengsel tot 200 mM met behulp van een continu tarief verdunning. 57
    1. Vul een spuit met 100 µL van verdunning buffer met 10 mM Tris pH 7.5 en plaats deze op een spuitpomp.
    2. Direct de naald van de spuit via een vooraf geperforeerde gat in de dop van de microfuge buis, zorgen voor contact wordt gemaakt met het mengsel van de vergadering (Figuur 1).
    3. Voer de spuitpomp met een snelheid van 0,75 µL/min gedurende 120 minuten.
      Opmerking: De resulterende oplossing voor 100 µL bevat 250 nM nucleosomes en 200 mM NaCl.
    4. Breng het mengsel aan een 10 K MWCO dialyse knop en dialyze tegen 200 mL van een vooraf gekoeld (4 ° C) laag zout buffer met 10 mM Tris pH 7.5, EDTA van 0,25 mM en 2,5 mM NaCl, voor 1 uur bij 4 ° C.
  6. Om te beoordelen de Histon inhoud van de vergadering nucleosoom, bereiden u een discontinue SDS-pagina gel met een 15% scheiden en 6% stapelen als eerder beschreven30.
    1. Aliquot 10-20 µL van de nucleosoom stock aan een microfuge buis en 4 x Laemmli monster Buffer toevoegen aan een werkende concentratie van 1-2 x. 58
    2. Als een besturingselement, herhaal dit preparaat in een aparte microfuge buis voor 1-2 µg de Histon voorraad. Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende ~ 5 min.
    3. Laden van de monsters in aangrenzende rijstroken met elkaar op de gel. Monster buffer aan de ongebruikte rijstroken om zelfs band migratie toevoegen.
    4. De gel op 65 V uitvoeren, totdat de kleurstof voorkant door het stapelen van gel beweegt. Wanneer het scheiden gel is bereikt, oplopen tot 150 V en uitgevoerd totdat de kleurstof voorkant volledig uit de gel is gemigreerd.
    5. Ontmantelen van de Elektroforese van eenheid en de gel zachtjes overbrengen in een kleuring container gevuld met dd H2O. Laat de gel zitten voor 5 min met zachte agitatie. Herhaal dit proces tweemaal meer met verse dd H2O elke keer gebruikt.
      Opmerking: De Coomassie vlek gebruikt in dit protocol vereist niet de typische fixing stappen die nodig zijn voor Coomassie vlekken (Zie Tabel van materialen). Als een ander Coomassie preparaat wordt gebruikt, wijzig de fixing stappen waar nodig.
    6. Het water uit de laatste spoeling verwijderen en toevoegen van net genoeg vlek ter dekking van de gel. Laat de gel zitten met zachte agitatie voor ten minste 1 uur.
      Opmerking: Voor de agitatie, de kleuring container kan geplaatst worden op elk toestel dat bevordert de beweging van de vlek over de gel terwijl ook de gel gedekt in vloeistof.
    7. Verwijderen van de vlek uit de container en spoel de gel met dd H2O. vervangen de dd H2O en geniet van de gel voor 30 min met zachte agitatie. (De gel moet worden weergegeven als dat aangegeven in Figuur 2, met duidelijke scheiding van de bands Histon.)
  7. De nucleosomes bij 4 ° C bewaren tot gebruik.
    Opmerking: Wanneer opgeslagen in deze voorwaarden, nucleosomes stabiel blijven voor enkele maanden. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. functionalization van Mica oppervlak voor statische AFM beeldvorming van Nucleosomes

  1. Een 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS stamoplossing in gedeïoniseerd water bereiden zoals beschreven. 30 winkel 1 mL aliquots van deze oplossing bij 4 ° C tot gebruik.
    Opmerking: De aliquots kunnen worden opgeslagen voor meer dan een jaar bij 4 ° C. 59
  2. Een werkoplossing APS 1:300 voorbereiden op mica wijziging door het oplossen van 50 µL van de 50 mM APS voorraad in 15 mL dd H2O.
    Opmerking: Deze werkoplossing kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor meerdere dagen.
  3. Snijd stroken van 1 x 3 cm breed van mica van hoge kwaliteit mica bladen (Zie Tabel van materialen voor mica hier gebruikt).
    1. Controleer of het stuk past wanneer diagonaal in een cuvet geplaatst. Hiermee kunt u dat het topje van scherp pincet, een scheermesje of plakband, klieven lagen van het mica totdat zowel zijden zijn vers gekloofd en het stuk zo dun als ~0.1 mm (figuur 3A is). Onmiddellijk plaats van het mica stuk in de APS gevuld cuvette en incubeer gedurende 30 min (figuur 3B).
  4. Het stuk mica overbrengen in een cuvet gevuld met dd H2O en weken voor 30 s (Figuur 3 c). Volledig droog beide zijden van de APS-mica strip onder een stroom van argon.
    Opmerking: Een nonwoven cellulose en polyester cleanroom wipe (aanbevolen wipe gedetailleerde in materialen) kunnen worden gebruikt als hulpmiddel bij het water vanaf de rand van het mica wicking bij het drogen.
  5. Gebruik de droge mica strip is nu voor de bereiding van de monsters. Anders slaat het stuk in een schone, droge cuvette (figuur 3D).
    Opmerking: Extra opslagruimte in een vacuüm voor 1-2 h wordt aanbevolen wanneer het milieu vochtig. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

3. bereiding van nucleosoom monsters op APS-Mica statische AFM Imaging

  1. Dubbele plakband van toepassing op verschillende magnetische pucks en plaats ze naar de kant.
  2. Snijd het APS-mica substraat naar het gewenste formaat (1 x 1 cm vierkantjes voor de MM AFM instrument gebruikt hier). Plaats deze stukken in een schone petrischaal en overdekte droog.
  3. Maak drie verdunningen van het geassembleerde nucleosomes (laatste nucleosoom concentraties van 0,5, 1,0 en 2,0 nM) met behulp van een 0,22 µm gefilterd buffer met 10 mM HEPES pH 7.5 en 4 mM MgCl2.
    Opmerking: Als u wilt beperken het verlies van nucleosomes bij de lage eindconcentratie, de verdunningen moeten gebeuren tegelijkertijd, onmiddellijk voorafgaand aan de depositie op de APS-mica.
  4. 5-10 µL van het monster van de verdunde nucleosoom stort in het midden van de APS-mica stuk, en laat Incubeer gedurende twee minuten. Spoel zachtjes het monster met 2-3 mL dd H2O om alle onderdelen van de buffer te verwijderen. Na elke ~0.5 mL dd H2O gebruikt, schud zachtjes de mica om te verwijderen van de overtollige spoelwater.
    Opmerking: Een wegwerp injectiespuit wordt aanbevolen voor deze spoeldouche stap.
  5. Droog de gedeponeerde steekproef onder een lichte stroom van schone argon gas.
    Opmerking: Het monster is nu klaar om de image worden gemaakt of kan worden opgeslagen in een vacuüm kabinet of exsiccator gevuld met argon. Monsters voorbereid en opgeslagen zoals beschreven hebben zijn beeld één jaar na voorbereiding zonder verlies van kwaliteit. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

4. statische AFM beeldvorming van Nucleosomes

  1. Monteren van een tip van de AFM op de houder van de tip. Een tip die een constante van de lente van ~ 40 N/m en een resonantiefrequentie tussen 300 en 340 kHz heeft gebruikt (Zie de Tabel van materialen voor de uitkragingen hier gebruikt).
  2. Monteer het monster dat is bereid in sectie 3 op het podium van de AFM dat evenwel niet tot het contact met het oppervlak van de steekproef.
  3. Plaatst u de laser op de uitkraging totdat het totaal maximaal is en de verticale en laterale doorbuiging waarden in de buurt van nul aan te passen.
  4. Afstemmen van de sonde van de AFM te vinden zijn resonantiefrequentie en aanpassen van de amplitude van de schijf en de grootte van de afbeelding ingesteld op 100 x 100 nm. Klik op de engage knop om te beginnen met de aanpak.
  5. Zodra naderde, geleidelijk optimaliseren de Amplitude Setpoint totdat het oppervlak van het monster wordt duidelijk gezien. Het verhogen van de grootte van de scan van 1 x 1 µm en de resolutie van 512 x 512 pixels. Klik op de capture knop gevolgd door de engage knop om te beginnen Beeldacquisitie.
    Opmerking: De afbeeldingen in Figuur 4 tonen de soepele achtergrond die kan worden verwacht wanneer imaging van deze monsters.
  6. Open de opgeslagen beelden met behulp van de software van de analyse van de instrumenten van AFM voor het analyseren van het monster nucleosoom.
    1. Plat de afbeelding met behulp van een polynomiale lijn aftrekken of een soortgelijke functie.
    2. De kleurentabel aan de laagste waarde voor de minimum en maximum de hoogste waarde instellen Een register bijhouden van deze waarden voor elke afbeelding als ze nodig zullen zijn in een latere stap.
      Opmerking: Als deze waarden niet gewend bent, hoogte gegevens worden onjuist in de latere analyse zoals dwarsdoorsneden van nucleosoom kernen als plateaus van gelijk, in plaats van verschillende hoogte verschijnen zal.
    3. Exporteer de afbeelding als een TIFF-afbeelding in de oorspronkelijke grootte. -Selecteer de gewenste opties om op te slaan van de afbeelding met een rand of schaal bars.
    4. Open de afbeelding in analysesoftware staat voor de lengte van omtrek metingen.
    5. Stel de x-, y- en z schalen waarop de afbeelding worden afgestemd.
    6. Als een binnenlengte kalibratie, meten en registreren van de contour lengte van gratis DNA van het ene eind naar het andere. Voor deze kalibratiefactor, gebruikt u de metingen voor het genereren van een histogram en passen met een normale (Gauss) verdeling. Verdeel het piek-center (x-c) door de lengte van het substraat in basenparen.
      Opmerking: Deze waarde is de afbeelding specifieke omrekeningsfactor van nanometer voor base paren van DNA.
    7. Meten en registreren van de contour lengte van beide armen voor elke nucleosoom uit het vrije uiteinde van de arm naar het midden van de kern, voor samenhang (figuur 5A).
    8. Voor elke kern nucleosoom, verzamelen twee volledige breedte op halve maximumwaarden (FWHM) van een loodrechte pair voor core doorsnede metingen (figuur 5B gemiddelde van de twee metingen van de FWHM en de helft van de resulterende waarde van elke geleding nucleosoom aftrekken correct is voor de gemeten lengte vanaf de afslag/entry DNA naar het midden van de kern die is niet deel van de lengte van de arm.
    9. Verdeel elke arm lengte door de berekende kalibratiefactor (stap 4.5.6) te verkrijgen van arm lengtes in DNA-basenparen.
    10. Bereken de hoeveelheid DNA verpakken door af te trekken de nucleosoom arm som van de totale basenpaar lengte van het onverpakt substraat. Deze waarden worden uitgezet als een histogram en passen de piek(en) met een normale (Gauss) verdeling te verkrijgen van de gemiddelde verpakt basenparen van DNA voor de nucleosoom bevolking.
    11. Bereken de gemiddelde nucleosoom hoogte van de gemeten doorsneden. Dit plot als een histogram en passen de piek(en) met een normale (Gauss) verdeling te verkrijgen van de hoogte van de nucleosoom bevolking.

5. time-Lapse AFM beeldvorming van nucleosoom Dynamics

  1. Monteer de tip van de AFM op de houder van de tip. Een sonde met een lente-constante van ongeveer 0.1 N/m en een resonantiefrequentie van 7-10 kHz kan worden gebruikt (Zie de lijst van de materialen voor de uitkragingen hier gebruikt).
  2. Een stuk van 1 x 1 cm van de APS-mica hechten aan een magnetische puck met behulp van dubbel-stick tape en bevestig de puck op het instrument van de AFM.
  3. Verdun de nucleosomes tot een 1 nM concentratie in een gefilterde imaging buffer met 10 mM HEPES pH 7.5 en 4 mM MgCl20,22 µm.
  4. Kluisje 5-10 µL van de verdunde nucleosoom in het midden van het mica stuk voor 2 min. spoelen de gedeponeerde monster met 20µL van de imaging buffer twee keer. Na de tweede spoel, houden een druppel van imaging buffer op het oppervlak.
  5. Gebruik van de camera bovenaanzicht om te vinden de tip en de benadering van het oppervlak handmatig tot de tip ~ 100-500 is µm van het oppervlak.
  6. Het toevoegen van extra imaging buffer om het gat tussen de tip en de oppervlakte te vullen. In dit voorbeeld is ongeveer 50 µL van imaging buffer is voldoende om het gat te vullen. Vind een resonantie piek voor naar de wenk.
  7. Begin de computer-gestuurde benadering naar de oppervlakte. Toen naderde, beginnen beeldbewerking met een 1-2 µm gebied Selecteer een ~ 500 nm interessegebied. Met dit interessegebied geselecteerd, passen de overname Gegevensdensiteit op 512 x 512 pixels.
  8. Instelpunt kruisspanning en rijden amplitude parameters om beeldkwaliteit te verbeteren. Een gratis amplitude van 10 nm of minder en een scanfrequentie van ~ 2 Hz kan worden gebruikt om kwaliteitsbeelden te vangen. Een voorbeeld van nucleosoom dynamiek gevangen met behulp van time-lapse AFM is weergegeven in Figuur 6.

6. Hogesnelheidstrein Time-Lapse AFM beeldvorming van nucleosoom Dynamics

Opmerking: De onderstaande protocol is bedoeld voor het instrument van de HS-AFM ontwikkeld door de groep van Ando (Kanazawa Universiteit, Kanazawa, Japan). 60

  1. APS-mica voorbereiden op vloeibare imaging.
    1. Het glazen staafje hechten aan de AFM scanner podium met het glazen staafje - scanner lijm (Zie Tabel van materialen). Laat deze droog voor een minimum van 10 min.
    2. Maken ~0.1 mm dikke circulaire stukken van mica met een diameter van 1,5 mm door ponsen hen van een grotere mica blad. De HS-AFM mica glas rod lijm gebruiken (Zie Tabel van materialen) dit mica stuk hechten aan het glazen staafje op de HS-AFM en droog, ongerepte voor een minimum van 10 minuten. Klieven lagen met behulp van een drukgevoelige tape totdat een goed gekloofd laag te op de tape zien is.
    3. Verdunnen 1 µL van 50 mM APS voorraad in 99 µL van dd H2O om een 500 µM APS oplossing te maken. Stort 2.5 µL van deze oplossing op het oppervlak van de vers gekloofd mica en laat gedurende 30 minuten functionalize.
      Opmerking: Om te voorkomen dat tijdens het functionalizing van het oppervlak drogen, de dop van een tube van 50 mL conische centrifuge kunt passen met een vochtige filterpapier stuk en geplaatst over de scanner. De APS-voorraad wordt verdund 3 keer minder voor vloeibare imaging dan voor statische denkbaar om te controleren de dynamiek naar een wisselkoers die kan worden waargenomen bij AFM.
    4. Spoel de mica met 20 µL van dd H2O door het toepassen van verschillende ~ 3 µL gespoeld. Verwijder water volledig na elke spoeling door het plaatsen van een nonwoven veeg aan de rand van het mica. Na de laatste spoeling, ~ 3 µL van dd H2O plaats op het oppervlak en laat het zitten voor een minimum van 5 min te verwijderen elke nonspecifically afhankelijke APS.
  2. Plaats van de sonde in de HS-AFM houder en plaats de houder in het werkgebied van de AFM met het topje naar boven. Spoel de houder met behulp van ~ 100 µL van dd H2O gevolgd door twee ~ 100 µL gespoeld van 0,22 µm gefilterd nucleosomes imaging buffer die bevat 10 mM HEPES pH 7.5 en 4 mM MgCl2.
  3. Met de spoelen gedaan, door de kamer te vullen met ~ 100 µL van nucleosoom imaging buffer, dompelen de tip. Pas de ' Freischwinger '-positie totdat het wordt geraakt met de laser. Spoel de APS-mica met 20 µL van gefilterde nucleosoom imaging buffer, met behulp van ~ 4 µL per spoeling.
  4. 1 µL van de voorraad van de vergadering nucleosoom verdund in 250 µL van gefilterde nucleosoom imaging buffer voor een definitieve nucleosoom concentratie van 1 nM. 2.5 µL met deze tweevoudige verdunning storten op het oppervlak en laat het zitten voor 2 min. Spoel het oppervlak met ~ 4 µL van nucleosoom imaging buffer twee keer. Na de laatste spoeling, laat het oppervlak bedekt met imaging buffer.
    Opmerking: Als het oppervlak is niet gespoeld na neerlegging van het monster nucleosoom, het oppervlak zal snel worden overvol.
  5. De scanner en het monster op de top van de houder van de tip zo ingesteld dat het monster gezicht naar beneden. Om te beginnen met de aanpak, de functie auto-aanpak met een instelpunt amplitude, As dicht bij de gratis oscillation amplitude A0.
    Opmerking: Idealiter eens = 0.95 een0, maar op 82% van een0 werkt zo goed als voorzichtig.
  6. Pas de instelpunt totdat het oppervlak wordt goed bijgehouden.
    Opmerking: Om te minimaliseren van de overdracht van energie van de AFM tip aan het monster nucleosoom, de amplitude van de uitkraging moet worden klein gehouden, met amplitudes zo laag als 1 nm optimaal.
  7. Instellen van het afbeeldingsgebied ongeveer 150 x 150 nm tot 200 x 200 nm met overname gegevenssnelheid van ~ 300 ms per frame imaging.
    Opmerking: De grootte van deze afbeelding is meestal voldoende om vast te leggen van de dynamiek van verschillende nucleosomes tegelijk. Een minder bevolkte oppervlak kan verzoeken om wijzigingen van deze parameters. De voorgestelde framesnelheid volstaat om vast te leggen nucleosoom dynamiek zoals looping, glij- en uitpakken, o.a. (Zie vertegenwoordiger resultaten sectie hieronder).

7. analyse van nucleosoom Dynamics gevangen met behulp van Time-Lapse AFM

  1. Omzetten in de beelden van het gegevenstype van de HS AFM (ASD) TIFF-afbeeldingen.
    1. De beelden met behulp van het systeem van de AFM analysesoftware ofwel vlak of lijn functies gebruiken totdat de achtergrond uniform contrast is afvlakken.
    2. Het afbeeldingscontrast (kleurenschaal) ingesteld op automatisch.
      Opmerking: Het contrast kan handmatig worden aangepast voor presentatiedoeleinden maar niet voor analyse. Hierdoor hoogte detail verloren in de geconverteerde afbeeldingen.
    3. Het geselecteerde bereik van beelden als een MOV-bestand opslaan. Hef de selectie van de bar van de schaal en de grenzen van de opties voor opslaan.
      OPMERKINGEN: Doe niet analyse van beelden die schaal bars in het frame hebben. Deze de grootte van de afbeelding veranderen en zal resulteren in onjuiste metingen.
    4. Het MOV-bestand converteren naar TIFF-afbeeldingen met behulp van een geschikte software (Zie Tabel van materialen). Gebruik de dezelfde framesnelheid voor conversie als werd gebruikt bij het maken van het MOV-bestand.
  2. Openen de beelden in een staat van deze meting meting-software voor arm lengte omtrek metingen, type (Zie Tabel van materialen).
    1. Instellen van de afmetingen van de afbeelding naar overeenkomen met die waarin het was gevangen.
    2. Meet de omtrek lengte voor elke nucleosoom arm vanaf het einde van de arm naar het midden van de nucleosoom kern en de metingen opnemen in een werkblad (figuur 4A).
    3. Meet de lengte van het onverpakt substraat van het DNA in de frames na een nucleosoom unwraps. Gebruik dit voor een specifieke kalibratie van de film van de nm/bp-verhouding die wordt gebruikt voor nucleosoom inwikkeling van berekeningen
    4. Twee dwarsdoorsnede profielen voor de nucleosoom kern en twee voor de blote DNA (figuur 4B) verzamelen.
    5. De dwarsdoorsnede profielen importeren naar een spreadsheet-software en normaliseren van de percelen door de laagste waarde van de z van alle punten in het profiel af te trekken.
    6. Bereken de hoogte en de volle breedte op halve maximum (FWHM) voor elke doorsnede en de gemiddelden van de twee profielen voor elk frame.
  3. Aftrekken van de helft van de waarde van de FWHM van elk van de nucleosoom armen zijn perceel als een scatterplot samen met de berekende som van de armen.
    1. Bereken de lengte van de gemiddelde omtrek vanaf de DNA-metingen gemaakt voor het DNA in frames na de nucleosoom uitgepakt.
    2. De kalibratiefactor nm/bp bepalen door de gemiddelde omtrek lengte van de gratis DNA door de basenpaar lengte van het DNA-substraat te verdelen. Gebruik deze waarde te berekenen nucleosoom inwikkeling in elk frame, zoals beschreven in paragraaf 5.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mono-nucleosomes waren eerst voorbereid op AFM imaging experimenten met behulp van een continu verdunning vergadering methode (Figuur 1). De voorbereide nucleosomes werden vervolgens gecontroleerd met behulp van de discontinue SDS-pagina (Figuur 2). Een mica oppervlak werd vervolgens matiemaatschappij met APS, die nucleosomes op het oppervlak vangt met behoud van een goede achtergrond voor hoge resolutie afbeeldingen (Figuur 3). Nucleosomes werden gestort op APS-mica en werden vervolgens beeld met behulp van statische AFM imaging. Als een besturingselement voor de montage en de afzetting, H3 mono-nucleosomes waren voorbereid en beeld met behulp van statische AFM. Een afbeelding van de H3 mono-nucleosomes (figuur 4A) verstrekt een momentopname van de bevolking nucleosoom zoals het bestond momenten voordat depositie, bevestigen dat de nucleosomes met succes werden geassembleerd. De 2 nM nucleosoom afzetting verstrekt een uniforme verdeling van nucleosoom en DNA deeltjes over het oppervlak en zeer weinig tot geen verdringing werd waargenomen.

Met de H3 control vergadering een succes, werden de gepresenteerde methoden vervolgens toegepast op de studie van RETOREN-A nucleosomes. Statische AFM beeldvorming van dit voorbeeld (figuur 4B) bleek dat de vergadering een succes was. Om aan te tonen van de invloed van nucleosoom concentratie op de dichtheid van het oppervlak deeltje, de RETOREN-A nucleosomes werden gedeponeerd bij 1 nM (figuur 4B), vergeleken met de 2 nM gebruikt voor H3 (figuur 4A). Dit resulteerde in een verminderde oppervlakte partikel dichtheid voor het monster RETOREN-A tot ongeveer de helft dat voor H3 proeven. Van de statische beelden van de AFM, de hoogte en beurt aantal mono-nucleosomes werden gekenmerkt (Figuur 5). Zowel de hoek tussen de gratis DNA-armen en de lengte van de gratis DNA armen werd gebruikt om te bepalen van dat het aantal DNA draait in de individuele nucleosoom.

Time-lapse AFM beeldvorming van de nucleosomes in buffer werd gebruikt voor het visualiseren van het algehele spontane uitpakken gedrag van de nucleosomes (Figuur 6). Het meten van de hoek tussen nucleosoom wapens en de contour lengte van de armen die is toegestaan voor het nummer van de beurt te bepalen in de frames tijdens deze uitpakken (Figuur 6 B-C). Als het nummer van de beurt van de nucleosoom afneemt, is een overeenkomstige daling in het volume van de kern nucleosoom ook waargenomen (Figuur 6 c). High-Speed time-lapse AFM werd vervolgens gebruikt om de sonde van de meer ingewikkelde nucleosoom dynamiek die werden gemist met behulp van standaard time-lapse imaging. De mogelijkheid van deze techniek om de dynamiek te vangen over een lange periode van tijd was essentieel voor de visualisatie van een interlokale translocatie van een RETOREN-A nucleosoom kern (Figuur 7), die gevangen in de loop van ~ 1200 frames genomen werd. Deze techniek was ook kritisch in het vastleggen van de zeldzame overdracht van een RETOREN-A nucleosoom kern van één DNA substraat naar een andere (Figuur 8). De snelle opname beeldsnelheid (~ 300 ms/frame) visualisatie van dit dynamische evenement mogelijk gemaakt, zoals het duurde slechts verschillende frames om te voltooien.

Tabel 1: reagentia die nodig zijn voor de continue zout gradiënt nucleosoom vergadering. Elk van de genoemde onderdelen wordt toegevoegd aan de microfuge buis met het gezuiverde DNA. Dit moet gebeuren in de volgorde waarin de reagentia worden vermeld in de tabel, met water en NaCl toegevoegd eerst, gevolgd door de H2A/H2B dimeer en de Histon tetrameer laatst toegevoegd. Als vooraf gevouwen Histon octamers worden gebruikt moeten, op dezelfde verhouding wat betreft de tetrameer hierboven toevoegen. * Neem nota van de NaCl inhoud in elk van de voorraden histone en aanpassen van de 5 M NaCl om toe te voegen derhalve de finale [NaCl] moet gelijk zijn aan 2M.  (Zie tabel van materialen).

Figure 1
Figuur 1: Van de spuitpomp gebruikt voor microscale nucleosoom montage schematische. Het mengsel van de vergadering is gepositioneerd om te worden in contact met het einde van de naald van de spuit. Als de verdunning wordt buffer geleverd door de spuitpomp aan het mengsel van de vergadering dat de concentratie van NaCl daalt, bevordering van nucleosoom vergadering. Dit cijfer is aangepast van Stumme-Diers et al. 30 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: SDS-pagina van geassembleerde nucleosomes. Rijstroken 1 en 2 bevatten de H3-octamer en de RETOREN-A-vergadering van histones, respectievelijk. Rijstroken 3 en 4 bevatten de geassembleerde H3-nucleosomes en de gemonteerde RETOREN-A nucleosomes, respectievelijk. Vergelijking van de geassembleerde nucleosomes de Histon alleen besturingselementen in rijstroken, bevestigen dat de nucleosomes correct werden geassembleerd. Het schema van de cartoon boven elke baan geeft aan welke Histon onderdelen aanwezig zijn. Dit cijfer is aangepast van Stumme-Diers et al. 30 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: schematische voorstelling van het proces ter voorbereiding van APS matiemaatschappij mica voor AFM beeldvorming van nucleosomes. (A) een stukje mica ~0.1 mm in dikte heeft beide kanten vers gekloofd. (B) het gekloofd mica stuk snel diagonaal wordt geplaatst in een cuvet met de APS-oplossing en is ingesteld op Incubeer gedurende 30 min. (C) de volgende APS functionalization stap, het APS-mica stuk wordt overgedragen aan een cuvet gevuld met dd H2 O voor een 30 s spoeling. (D) de APS-mica stuk wordt opgeslagen in een cuvet tot gebruik.   Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: voorbeeld AFM beelden van H3 en CNEP-A nucleosomes. (A) de voorbeeldafbeelding van H3 mono-nucleosomes gestort op APS-mica, gevangen met behulp van statische AFM. Elke lichte blob is een deeltje van de kern nucleosoom met de begeleidende DNA regio's verschijnen als noodle-achtige wapens. De lange noodle-achtige functies zijn gratis DNA-deeltjes, die niet gekoppeld met een kern van Histon zijn. Voor dit beeld, werd een 2 nM nucleosoom concentratie gebruikt, wordt voorzien van een uniforme verdeling over het oppervlak, weinig tot geen verdringing. (B) deze nucleosoom monster werd gedeponeerd bij 1 nM en wordt veel minder gevuld dan de 2 nM gebruikt in (A). Hieruit blijkt dat het directe effect dat nucleosoom verdunning op de oppervlakte dichtheid van nucleosomes heeft. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: visuele voorstelling van de analyse gebruikt voor het karakteriseren van de onmiddellijke verpakking en de hoogte van de deeltjes nucleosoom. (A) A representatieve nucleosoom deeltje van beelden zoals die in figuur 3 aangegeven. De contour lengte van elke nucleosoom arm wordt gemeten vanaf het einde van de arm naar het midden van de kern (gestippelde groene lijnen).  Plotten doorsnede profielen (rode en blauwe lijnen) van een nucleosoom produceren de krommen getoond in (B) van deze krommen, hoogte en breedte detail van deeltje kan worden bepaald.  (C) Schematische voorstelling van de verschillende verpakt Staten van de nucleosomes. (D) elke verpakt staat wordt gekenmerkt met behulp van de hoek tussen de armen van DNA, het aantal draaiingen van DNA en de bp verpakt DNA. Schaal Bar = 20 nm. Dit percentage is aangepast van Lyubchenko et al. 24 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6. Voorbeeld van time-lapse AFM beelden vastleggen van de spontane uitpakken van nucleosomes. (A) A-serie van opeenvolgende AFM beelden van de spontane uitpakken proces van nucleosomes gevangen door het scannen van de continue in de buffer. De grootte van elk frame is 200 nm en beelden werden gevangen in een tempo van ~ 170 s per frame. (B) als het uitpakken proces vordert in elk frame, de lengte van de arm van de verhoging van de nucleosoom, (C) wat resulteert in een afname van de DNA draait rond de nucleosoom. Dit nummer beurt kan worden bepaald uit de gemeten arm lengtes (zwart) of de hoek tussen de nucleosoom takken (rood). Zoals de beurt nummer afneemt, een vermindering van nucleosoom volume (blauwe kromme, rechteras) ook wordt waargenomen. Elk frame is 200 x 200 nm in grootte. Dit percentage is aangepast van Lyubchenko et al. 24 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7. Demonstratie van de hoge capaciteit van high-speed time-lapse AFM voor lange afbeelding overname keer (A) A galerij van afbeeldingen geselecteerd uit meer dan 1200 kaders tonen het gedrag van de translocatie van een RETOREN-A nucleosomes-kern. Elk beeld werd gevangen bij een tarief van ~ 300 ms/frame. (B) Contour metingen van de lengte van het ene eind van het substraat van DNA tot de RETOREN-A-kern te karakteriseren dit lange translocatie proces worden gebruikt. Schaal Bar = 25 nm. Dit percentage is aangepast van Stumme-Diers et al. 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8. Voorbeeld van een dynamische nucleosoom kern overdracht vastgelegd met high-speed time-lapse AFM (figuur overgenomen van Stumme-Diers et al. 16 (A) geselecteerde frames aan te tonen de spontane overdracht van een RETOREN-A nucleosoom kern van één DNA substraat naar de andere. Dit proces heeft plaatsgevonden binnen verschillende frames die zijn opgenomen tegen een tarief van ~ 300 ms/frame. (B) een schematische voorstelling van het proces van de overdracht weergegeven in (A). Schaal Bar = 25 nm. Dit percentage is aangepast van Stumme-Diers et al. 16 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol dat hierboven beschreven is vrij eenvoudig en bieden zeer reproduceerbare resultaten, hoewel een paar belangrijke kwesties kunnen worden benadrukt. Matiemaatschappij APS-mica is een belangrijk substraat voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Een hoge stabiliteit van APS-mica is een van de belangrijke kenmerken van dit substraat waarmee men het imaging substraat van tevoren gereedmaakt voor gebruik dat kan worden gebruikt ten minste twee weken na voorbereid. 59 , 61 echter het oppervlak kan worden beschadigd door dampen van lijm als het wordt gebruikt voor montage op de metalen puck mica. Daarom is het aanbevolen om het gebruik van dubbele stick tape voor het mica montage zoals beschreven in het protocol (sectie 2). In gevallen wanneer het gebruik van lijm noodzakelijk is, bijvoorbeeld, dat sommige gebruikers gebruik lijm voor de montage van mica op metalen schijven voor imaging in vloeibare, de volgende procedure aangepast ten opzichte van de ene beschreven in punt 6.1.3 voor de bereiding van de monsters voor HS-AFM imaging wordt aanbevolen . Mica is vastgelijmd aan de metalen schijf of ander stevig materiaal en gekloofd nadat de lijm is gestold. Klap de mica met argon om potentiële dampen van de lijm. Vervolgens de mica kan worden cleaved met een scotch tape en de APS mica werkoplossing geplaatst ter dekking van de vers gekloofd mica strip. De hoeveelheid van de oplossing hangt af van de grootte van de strip mica. Toestaan APS inspelen voor 30 min. Om te minimaliseren van verdamping, de reactie worden uitgevoerd in een natte petrischaal. Gebruik de volgende procedure: Soak lab wipe papier en plaats is aan de onderkant van de petrischaal. Plaats een 5 mm dikke kunststof schijf op de natte doekjes en zet de metalen schijf met gelijmde mica op het vermijden van contact met water onderin de petrischaal. Na 30 min, verwijder de vergadering mica/schijf en spoel het oppervlak mica met dd water en Pipetteer zoals beschreven in punt 6.1.3. Het oppervlak is klaar voor de monster-afzetting. De APS-concentratie moet worden aangepast in experimenten met DNA, hoewel werkoplossing APS (1:300) in punt 2.2 beschreven een goed uitgangspunt moet. In het protocol beschreven punt 6.1.3 waarin de procedure voor de beeldvorming van nucleosomes bij HS-AFM wordt beschreven, de drievoudige hogere concentratie van APS (1:100) werd gebruikt.

Het protocol beschreven is gebaseerd op mica functionalization met APS. Dit is de meest robuuste, zeer reproduceerbaar en eenvoudige procedure. Het enige nadeel is dat APS, aminopropyl silatrane is niet commercieel beschikbaar. Echter, de procedure van de APS-synthese is ongecompliceerd en het protocol voor zijn synthese wordt in detail beschreven. 59 als de synthese-procedure problematisch, verkrijgbare reagens is, aminopropyltriethoxy, silane (APTES) kan worden gebruikt voor mica functionalization (AP-mica). Hetzelfde papier het protocol voorziet in de opstelling van de AP-mica met behulp van dampen van APTES. De procedure werd getest en gebruikt voor beeldvorming van topologisch verschillende soorten DNA 35,36,,50,62,,63 en verschillende eiwit-DNA complexen met inbegrip van nucleosomes. 27 , 50 , 64 ook APS-mica, AP-mica weken stabiel is en kan worden bereid in partijen van tevoren; de AP-mica oppervlak is zo glad als APS-mica en tamelijk ongevoelig voor de samenstelling van de buffer, zodat de monsters kunnen worden voorbereid in de bufferoplossingen met pH-waarden tot pH10 en sterke van de Ionische tussen 1 en 200 mM van NaCl. 59 , 65 het enige nadeel bij het gebruik van de AP-mica is de mogelijkheid van aminopropyl silane te hydrolyseren en te assembleren in aggregaten op het oppervlak tijdens time-lapse beeldvorming in water, hoewel dit proces is vrij traag met de aggregaten die kunnen worden onderscheiden op het oppervlak, dus met een hoge resolutie beelden van DNA kunnen worden verkregen. 35 de hydrolyse van silatrane deel is zeer traag, dus geen zichtbare aggregaten zijn gezien tijdens langdurige imaging; 26 , 35 , 56 , 66 , APS-mica daarom de voorkeur substraat in vergelijking met de AP-mica als beeldvorming in water in dienst is. Reproduceerbaarheid met behulp van APTES, is de distillatie van het reagens raadzaam bij de voorbereiding van de AP-mica. Het protocol voor de distillatie van de APTES wordt beschreven in paper 59.

AFM, werkt als een enkel molecuul techniek, met nucleosoom concentraties op het bereik van de nanomolar en die nucleosomes spontaan bij dergelijke lage concentraties distantiëren kunnen. Volgens onze gegevens 25, de dissociatie-proces voltrekt zich in tientallen minuten suggereren dat het monster voor AFM studies moet worden voorbereid enkel voorafgaand aan de afzetting. Sommige wasmiddelen bijvoorbeeld 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) verhogen de stabiliteit nucleosoom, zodat de nucleosomes verhogen hun leven door verschillende ordes van grootte 25, maar het gebruik van detergentia moet gebeuren met de nodige voorzichtigheid. We toonden in 25 dat stabilisatie van nucleosomes gaat gepaard met de verandering van de specificiteit van de reeks, zodat de nucleosoom zelfs met het gebruik van dergelijke reeks specifieke motief als Widom 601 sjabloon, monteren zonder een specificiteit van binding aan de 601 volgorde.

Er zijn een aantal belangrijke kwesties met de voorgestelde methode ten opzichte van andere AFM methoden voor de bereiding van de monster. Eerst, APS-mica en AP-mica substraten zijn stabiel weken en kunnen worden bereid in partijen van tevoren; de oppervlakken zijn glad en tamelijk ongevoelig voor de samenstelling van de buffer zodat de monsters kunnen worden voorbereid in een met pH-waarden tot pH10 en sterke van de Ionische tussen 1 en 200 mM van NaCl bufferoplossingen. 59 , 65 geen van de bestaande methoden overeenkomt met deze eigenschappen. Ten tweede, AFM is de techniek van een enkel molecuul en vereist een weinig monster. Het beschreven protocol werkt met nanoschaal bedragen van het preparaat. Ten derde, in time-lapse AFM studies en de HS-AFM data-acquisitie is er een aanzienlijke hoeveelheid tijd die nodig is voor het genereren en karakteriseren van de grote gegevenssets verworven. De hier beschreven methode is zeer geschikt voor het analyseren van honderden afbeeldingen van de AFM.

De sample voorbereiding methodologie is niet beperkt tot nucleosoom type monsters. Eerder het is ongevoelig voor het type van de eiwit-DNA complexen en heeft reeds toegepast op een aantal eiwitten herkennen specifieke opeenvolgingen van DNA, bijvoorbeeld beperkingen enzymen 67,68,69, single-stranded DNA bindende eiwitten 44,45,56,,70,71 samen met complexe eiwit systemen die betrokken zijn bij DNA-replicatie 47,72 en recombinatie68,73. Belangrijker, is HS-AFM vereffend met deze systemen te volgen de dynamiek van deze systemen.  Deze studies maken het mogelijk om de ontwikkelde methodologie van toepassing op de karakterisatie van nucleosoom arrays als voorgesteld in en verheldering van de rol van dergelijke centromeer specifieke proteïnen als centromeer eiwit B (RETOREN-B) of C (RETOREN-C) in de centromeer vergadering en het begrip van hun rol in de ontwikkeling van vele kankers33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Auteur bijdragen: YLL en MSD ontworpen het project; MSD gemonteerd nucleosomes. MSD en ZS uitgevoerd AFM experimenten en data analyses. Alle auteurs schreef en het manuscript bewerkt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Biochemie kwestie 143 AFM time-lapse nucleosoom chromatine dynamica structuur histonen single - molecuul DNA epigenetica imaging
De structuur en de dynamiek van Nucleosomes met behulp van Atomic Force microscopie Imaging sonderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter