Samtidige målinger av intracellulær kalsium og membran potensialet i fersk isolert og intakt musen Cerebral endotelet

Summary

Demonstrert her er protokoller for (1) ferske isolere intakt cerebral endothelial “rør” og (2) samtidig måling av endothelial kalsium og membran potensial under endotelet-avledet hyperpolarization. Videre tillater disse metodene farmakologiske tuning av endothelial celle kalsium og elektriske signalene som individuelle eller interaktive eksperimentelle variabler.

Abstract

Cerebral arterier og deres respektive mikrosirkulasjonen levere oksygen og næringsstoffer til hjernen via blod flyte regulering. Endotelceller linje lumen blodkar og kommandoen endringer i vaskulær diameter for å møte de metabolske behovet av neurons. Primære endothelial-avhengige signalveier av hyperpolarization membran potensial (V_m) og nitrogenoksid vanligvis operere parallelt å megle vasodilatasjon og dermed øke blodstrøm. Selv om integrert å koordinere vasodilatasjon over flere millimeter vaskulær lengde, har komponenter i endotelet-avledet hyperpolarization (EDH) vært historisk vanskelig å måle. Disse komponentene av EDH innebærer intracellulær Ca^{2 +} [Ca^{2 +}]_jeg øker og påfølgende aktivering av små – og middels konduktans Ca^{2 +}-aktivert K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanaler.

Her presenterer vi en forenklet illustrasjon av isolering av fersk endotelet fra musen cerebral arterier; samtidig måling av endothelial [Ca^{2 +}]_jeg og V_m med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis; og en kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter under fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Bakre hjerne arterier fra sirkel av Willis fjernes uten den bakre kommunikasjon og basilar arteriene. Enzymatisk fordøyelsen av renset bakre hjerne arteriell segmenter og påfølgende føden forenkler fjerning av adventitia, perivascular nerver og glatt muskelceller. Resulterende bakre hjerne arteriell endothelial “rør” er deretter festes under et mikroskop og undersøkt ved hjelp av et kamera, photomultiplier rør, og en til to electrometers under kontinuerlig superfusion. Kollektivt kan denne metoden samtidig måle endringer i endothelial [Ca^{2 +}]_jeg og V_m diskret mobilnettet steder, i tillegg til spredning av EDH gjennom gapet veikryss til millimeter avstander langs den intakt endotelet. Denne metoden er forventet å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjonene underliggende mekanismene av blod flyte i normal og syke hjernen.

Introduction

Blodstrøm gjennom hjernen er regulert av samordning av vasodilatasjon blant cerebral arterier og arterioler i vaskulære nettverk¹. Endotelceller fôr cerebral motstand arterier kommandoen endringer i vaskulær diameter som trengs for å oppfylle metabolske neurons^1,2,3. Spesielt i endotelet-avledet hyperpolarization (kjent som EDH), intracellulær Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_jeg) og elektriske signalene i endotelceller koordinere vasodilatasjon blant endotelceller og deres rundt glatte muskelcellene gjennom gapet veikryss for arteriell avslapning⁴. Fysiologiske initiering av EDH sekvensielt innebærer stimulering av G_q-kombinert reseptorer (GPCRs), en økning i [Ca^{2 +}]_jeg, og aktivering av endothelial små og middels Ca^{2 +}-aktivert K⁺ (SK_Ca/IK_Ca) kanaler hyperpolarize cerebral endothelial membran potensial (V_m)^5,6,7. Dermed er intime forholdet mellom endothelial [Ca^{2 +}]_jeg og V_m integrert i blodet flyt regulering og uunnværlig til kondisjons- og cerebrovascular funksjon^6,8. Gjennom bredere litteratur, har flere studier rapportert foreningen av vaskulær endotelial dysfunksjon med utviklingen av kroniske sykdommer (f.eks hypertensjon, diabetes, hjertesvikt, koronarsykdom, kroniske nyre-svikt, perifer karsykdom)^9,10, angir betydningen av studere endothelial funksjon i fysiologiske samt patologiske forhold.

Vaskulære endotelet er integrert produksjon av hyperpolarization, vasodilatasjon og vevsperfusjon og dermed undersøkelse av innfødte mobilnettet egenskapene er avgjørende. Som en generell studie er utarbeidelsen av musen arteriell endothelial røret modellen publisert før Skjelettmuskel^11,12, gut¹³, lunge¹⁴, og nylig for hjernen⁶. Studier samtidig [Ca^{2 +}]_jeg og V_m målinger er spesielt publisert for Skjelettmuskel arteriell endotelet^15,16 samt lymfatisk fartøy endotelet¹⁷. I tillegg til primære studier utnytte endothelial tube tilnærming, kan en omfattende gjennomgang av sine fordeler og ulemper⁸ bli konsultert om eksperimentell verktøyet er passende for en bestemt studie. I korte trekk en fordel er at fysiologiske hovedkomponentene i endothelial celle funksjon beholdes (, Ca^{2 +} tilstrømningen og intracellulær utgivelse, hyperpolarization V_m opp til han potensialet for K⁺ via SK_Ca/IK_Ca aktivering og endothelial intercellulære kobling via gapet veikryss) uten confounding faktorer som perivascular nerve inndata, glatt muskel spenning-gated kanal funksjon og contractility, blodsirkulasjonen, og hormonelle påvirkninger⁸. I kontrast, brukte celle kultur tilnærminger introdusere betydelige endringer i morfologi¹⁸ og ion kanal uttrykk¹⁹ på en måte som kan sterkt Beskytt sammenligninger fysiologiske observasjoner fastslått ex vivo eller i vivo. Begrensninger omfatter mangel på integrasjon med andre viktige komponenter for å regulere blodstrøm, som glatt muskel og begrenset fleksibilitet i en eksperimentell tidsplan, som denne modellen er optimalt testet innenfor 4 h intakt vaskulær segmentet isolasjon fra dyret.

Fra en tidligere video protokoll forfattet av Socha og Segal¹² og eksperimentelle bruer i midlertidige^6,15,16, viser vi herved isolering av fersk endotelet fra bakre hjerne arterier og samtidig måling av endothelial [Ca^{2 +}]_jeg og V_m med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis. I tillegg innebærer dette eksperimentet kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter i fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Vi valgte den bakre arterien cerebri, som det gir isolert endotelet med den strukturelle integriteten (celler koblet gjennom gapet veikryss) og tilstrekkelig størrelse (bredde ≥50 µm, lengde ≥300 µm) mottakelig for intra- og intercellulære signalering langs og blant endotelceller. I tillegg studier av gnager bakre hjerne arterien er vesentlig representert i litteratur og omfatter undersøkelse av grunnleggende endothelial signalnettverk mekanismer, vaskulære utvikling/aldring og patologi^{20, 21 , 22}. eksperimentelle programmet forventes å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjon (og dysfunksjon) og vil dermed gi betydelige fremskritt i forståelsen av blod flyte gjennom aldring og utvikling av nevrodegenerative sykdommer.

Protocol

Før du gjennomfører følgende eksperimenter, sikre at alle dyr omsorg bruker og protokoller er godkjent av dyr institusjon og bruke Committee (IACUC) og utføres i samsvar med National Research Council’s “Guide og bruk av Forsøksdyr” (8th utgave, 2011) og ANKOMME retningslinjene. IACUC av Loma Linda universitetet har godkjent alle protokoller som brukes for dette manuskriptet for mannlige og kvinnelige C57BL/6 mus (alder rekkevidde: 3 til 30 mo). 1. utstyr og mate…

Representative Results

Skjematisk demonstrasjon av protokollen beskrevet ovenfor er vist i vedlagte tallene. En hjerne isolert fra en ung voksen mann C57BL/6N mus (5 måneder) vises i figur 1A. Bakre hjerne arterier er forsiktig isolere fra sirkel av Willis, fjernet uten bindevev, og kutt i segmenter (figur 1B-D). Fra delvis fordøyde arteriell segmenter, er intakt endothelial røret produsert og sikret på glass cover slip med feste p…

Discussion

I lys av nyere utviklingen^6,15,16,17viser vi nå metoden for å isolere musen cerebral arteriell endotelet i forberedelse til samtidig måling av [Ca^{2 +}] _jeg og V_m underliggende EDH konsekvent for ~ 2 h på 37 ° C. Selv om teknisk vanskelig, kan vi måle celle-til-celle kopling også (se referanse⁶figur 1). På denne måten kan vi måle …

Materials

Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
NaCl	Sigma	S7653
MgCl2	Sigma	M2670
CaCl2	Sigma	223506
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P9541
NaOH	Sigma	S8045
ATP	Sigma	A2383
HCl	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Collagenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dithioerythritol	Sigma	D8255
Papain	Sigma	P4762
Elastase	Sigma	E7885
BSA	Sigma	A7906
Propidium iodide	Sigma	P4170
DMSO	Sigma	D8418
Fura-2 AM dye	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Plexiglas superfusion chamber	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)	Warner Instruments	PM6 or PH6
Compact aluminum stage	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Stereomicroscopes	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources	Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Phase contrast objectives	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
Vibration isolation table	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g
Amplifiers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
Function generator	EZ Digital, Seoul, South Korea	FG-8002
Data Acquision System	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B or C
Inline Heater	Warner Instruments	SH- 27B
Valve Controller	Warner Instruments	VC-6
Inline Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Electronic Puller	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 or P-1000
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades	Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps	FST	Dumont #5 & Dumont #55