Summary

Samtidige målinger av intracellulær kalsium og membran potensialet i fersk isolert og intakt musen Cerebral endotelet

Published: January 20, 2019
doi:

Summary

Demonstrert her er protokoller for (1) ferske isolere intakt cerebral endothelial “rør” og (2) samtidig måling av endothelial kalsium og membran potensial under endotelet-avledet hyperpolarization. Videre tillater disse metodene farmakologiske tuning av endothelial celle kalsium og elektriske signalene som individuelle eller interaktive eksperimentelle variabler.

Abstract

Cerebral arterier og deres respektive mikrosirkulasjonen levere oksygen og næringsstoffer til hjernen via blod flyte regulering. Endotelceller linje lumen blodkar og kommandoen endringer i vaskulær diameter for å møte de metabolske behovet av neurons. Primære endothelial-avhengige signalveier av hyperpolarization membran potensial (Vm) og nitrogenoksid vanligvis operere parallelt å megle vasodilatasjon og dermed øke blodstrøm. Selv om integrert å koordinere vasodilatasjon over flere millimeter vaskulær lengde, har komponenter i endotelet-avledet hyperpolarization (EDH) vært historisk vanskelig å måle. Disse komponentene av EDH innebærer intracellulær Ca2 + [Ca2 +]jeg øker og påfølgende aktivering av små – og middels konduktans Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler.

Her presenterer vi en forenklet illustrasjon av isolering av fersk endotelet fra musen cerebral arterier; samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis; og en kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter under fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Bakre hjerne arterier fra sirkel av Willis fjernes uten den bakre kommunikasjon og basilar arteriene. Enzymatisk fordøyelsen av renset bakre hjerne arteriell segmenter og påfølgende føden forenkler fjerning av adventitia, perivascular nerver og glatt muskelceller. Resulterende bakre hjerne arteriell endothelial “rør” er deretter festes under et mikroskop og undersøkt ved hjelp av et kamera, photomultiplier rør, og en til to electrometers under kontinuerlig superfusion. Kollektivt kan denne metoden samtidig måle endringer i endothelial [Ca2 +]jeg og Vm diskret mobilnettet steder, i tillegg til spredning av EDH gjennom gapet veikryss til millimeter avstander langs den intakt endotelet. Denne metoden er forventet å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjonene underliggende mekanismene av blod flyte i normal og syke hjernen.

Introduction

Blodstrøm gjennom hjernen er regulert av samordning av vasodilatasjon blant cerebral arterier og arterioler i vaskulære nettverk1. Endotelceller fôr cerebral motstand arterier kommandoen endringer i vaskulær diameter som trengs for å oppfylle metabolske neurons1,2,3. Spesielt i endotelet-avledet hyperpolarization (kjent som EDH), intracellulær Ca2 + ([Ca2 +]jeg) og elektriske signalene i endotelceller koordinere vasodilatasjon blant endotelceller og deres rundt glatte muskelcellene gjennom gapet veikryss for arteriell avslapning4. Fysiologiske initiering av EDH sekvensielt innebærer stimulering av Gq-kombinert reseptorer (GPCRs), en økning i [Ca2 +]jeg, og aktivering av endothelial små og middels Ca2 +-aktivert K+ (SKCa/IKCa) kanaler hyperpolarize cerebral endothelial membran potensial (Vm)5,6,7. Dermed er intime forholdet mellom endothelial [Ca2 +]jeg og Vm integrert i blodet flyt regulering og uunnværlig til kondisjons- og cerebrovascular funksjon6,8. Gjennom bredere litteratur, har flere studier rapportert foreningen av vaskulær endotelial dysfunksjon med utviklingen av kroniske sykdommer (f.eks hypertensjon, diabetes, hjertesvikt, koronarsykdom, kroniske nyre-svikt, perifer karsykdom)9,10, angir betydningen av studere endothelial funksjon i fysiologiske samt patologiske forhold.

Vaskulære endotelet er integrert produksjon av hyperpolarization, vasodilatasjon og vevsperfusjon og dermed undersøkelse av innfødte mobilnettet egenskapene er avgjørende. Som en generell studie er utarbeidelsen av musen arteriell endothelial røret modellen publisert før Skjelettmuskel11,12, gut13, lunge14, og nylig for hjernen6. Studier samtidig [Ca2 +]jeg og Vm målinger er spesielt publisert for Skjelettmuskel arteriell endotelet15,16 samt lymfatisk fartøy endotelet17. I tillegg til primære studier utnytte endothelial tube tilnærming, kan en omfattende gjennomgang av sine fordeler og ulemper8 bli konsultert om eksperimentell verktøyet er passende for en bestemt studie. I korte trekk en fordel er at fysiologiske hovedkomponentene i endothelial celle funksjon beholdes (, Ca2 + tilstrømningen og intracellulær utgivelse, hyperpolarization Vm opp til han potensialet for K+ via SKCa/IKCa aktivering og endothelial intercellulære kobling via gapet veikryss) uten confounding faktorer som perivascular nerve inndata, glatt muskel spenning-gated kanal funksjon og contractility, blodsirkulasjonen, og hormonelle påvirkninger8. I kontrast, brukte celle kultur tilnærminger introdusere betydelige endringer i morfologi18 og ion kanal uttrykk19 på en måte som kan sterkt Beskytt sammenligninger fysiologiske observasjoner fastslått ex vivo eller i vivo. Begrensninger omfatter mangel på integrasjon med andre viktige komponenter for å regulere blodstrøm, som glatt muskel og begrenset fleksibilitet i en eksperimentell tidsplan, som denne modellen er optimalt testet innenfor 4 h intakt vaskulær segmentet isolasjon fra dyret.

Fra en tidligere video protokoll forfattet av Socha og Segal12 og eksperimentelle bruer i midlertidige6,15,16, viser vi herved isolering av fersk endotelet fra bakre hjerne arterier og samtidig måling av endothelial [Ca2 +]jeg og Vm med Fura-2 fotometri og intracellulær skarpe elektroder, henholdsvis. I tillegg innebærer dette eksperimentet kontinuerlig superfusion salt løsninger og farmakologiske agenter i fysiologiske forhold (pH 7.4, 37 ° C). Vi valgte den bakre arterien cerebri, som det gir isolert endotelet med den strukturelle integriteten (celler koblet gjennom gapet veikryss) og tilstrekkelig størrelse (bredde ≥50 µm, lengde ≥300 µm) mottakelig for intra- og intercellulære signalering langs og blant endotelceller. I tillegg studier av gnager bakre hjerne arterien er vesentlig representert i litteratur og omfatter undersøkelse av grunnleggende endothelial signalnettverk mekanismer, vaskulære utvikling/aldring og patologi20, 21 , 22. eksperimentelle programmet forventes å gi en høy gjennomstrømming analyse av cerebral endothelial funksjon (og dysfunksjon) og vil dermed gi betydelige fremskritt i forståelsen av blod flyte gjennom aldring og utvikling av nevrodegenerative sykdommer.

Protocol

Før du gjennomfører følgende eksperimenter, sikre at alle dyr omsorg bruker og protokoller er godkjent av dyr institusjon og bruke Committee (IACUC) og utføres i samsvar med National Research Council’s “Guide og bruk av Forsøksdyr” (8th utgave, 2011) og ANKOMME retningslinjene. IACUC av Loma Linda universitetet har godkjent alle protokoller som brukes for dette manuskriptet for mannlige og kvinnelige C57BL/6 mus (alder rekkevidde: 3 til 30 mo). 1. utstyr og mate…

Representative Results

Skjematisk demonstrasjon av protokollen beskrevet ovenfor er vist i vedlagte tallene. En hjerne isolert fra en ung voksen mann C57BL/6N mus (5 måneder) vises i figur 1A. Bakre hjerne arterier er forsiktig isolere fra sirkel av Willis, fjernet uten bindevev, og kutt i segmenter (figur 1B-D). Fra delvis fordøyde arteriell segmenter, er intakt endothelial røret produsert og sikret på glass cover slip med feste p…

Discussion

I lys av nyere utviklingen6,15,16,17viser vi nå metoden for å isolere musen cerebral arteriell endotelet i forberedelse til samtidig måling av [Ca2 +] jeg og Vm underliggende EDH konsekvent for ~ 2 h på 37 ° C. Selv om teknisk vanskelig, kan vi måle celle-til-celle kopling også (se referanse6figur 1). På denne måten kan vi måle …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Charles Hewitt for utmerket kundestøtte ved opprettelse av utstyr og rekvisita som trengs for gjeldende protokollene. Vi takker Dr. Sean M. Wilson og Christopher G. Wilson, fra LLUB senter for Perinatal biologi, for å gi oss med en ekstra invertert mikroskop og electrometer, henholdsvis. Denne forskningen har blitt støttet av National Institutes of Health grant R00-AG047198 (EJB) og Loma Linda University School of Medicine nye fakultetet oppstart midler. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.

Materials

Glucose Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) G7021
NaCl Sigma S7653
MgCl2 Sigma M2670
CaCl2 Sigma 223506
HEPES Sigma H4034
KCl Sigma P9541
NaOH Sigma S8045
ATP Sigma A2383
HCl ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) A466250
Collagenase (Type H Blend) Sigma C8051
Dithioerythritol Sigma D8255
Papain Sigma P4762
Elastase Sigma E7885
BSA Sigma A7906
Propidium iodide Sigma P4170
DMSO Sigma D8418
Fura-2 AM dye Invitrogen, Carlsbad, CA, USA F14185
Recirculating chiller (Isotemp 500LCU) ThermoFisher Scientific 13874647
Plexiglas superfusion chamber  Warner Instruments, Camden, CT, USA RC-27
Glass coverslip bottom (2.4 × 5.0 cm) ThermoFisher Scientific 12-548-5M
Anodized aluminum platform (diameter: 7.8 cm)  Warner Instruments PM6 or PH6
Compact aluminum stage  Siskiyou, Grants Pass, OR, USA 8090P
Micromanipulator Siskiyou  MX10
Stereomicroscopes  Zeiss, NY, USA Stemi 2000 & 2000-C
Fiber optic light sources  Schott, Mainz, Germany & KL200, Zeiss Fostec 8375
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA Ts2
Phase contrast objectives  Nikon Instruments Inc  (Ph1 DL; 10X & 20X)
Fluorescent objectives  Nikon Instruments Inc 20X (S-Fluor), and 40X (Plan Fluor)
Nikon inverted microscope Nikon Instruments Inc Eclipse TS100
Microsyringe pump controller (Micro4 )  World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA SYS-MICRO4
Vibration isolation table Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA  Micro-g
Amplifiers Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Headstages  Molecular Devices HS-2A & HS-9A
Function generator  EZ Digital, Seoul, South Korea FG-8002
Data Acquision System Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA Digidata 1550A
Audible Baseline Monitors Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA  BM-A-TM
Digital Storage Oscilloscope Tektronix, Beaverton, Oregon, USA  TDS 2024B
Fluorescence System Interface, ARC Lamp + Power Supply, Hyperswitch, PMT Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA IonOptix Systems
Temperature Controller   Warner Instruments TC-344B or C
Inline Heater  Warner Instruments SH- 27B
Valve Controller  Warner Instruments VC-6
Inline Flow Control Valve Warner Instruments  FR-50
Electronic Puller  Sutter Instruments, Novato, CA, USA P-97 or P-1000 
Microforge Narishige, East Meadow, NY, USA  MF-900
Borosilicate Glass Tubes (Trituration) World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA 1B100-4
Borosilicate Glass Tubes (Pinning) Warner Instruments G150T-6
Borosilicate Glass Tubes (Sharp Electrodes) Warner Instruments GC100F-10
Syringe Filter (0.22 µm)   ThermoFisher Scientific 722-2520
Glass Petri Dish + Charcoal Sylgard Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA DD-90-S-BLK
Vannas Style Scissors (3 mm & 9.5 mm) World Precision Instruments 555640S, 14364
Scissors 3 & 7 mm blades Fine Science Tools (or FST), Foster City, CA, USA Moria MC52 & 15000-00
Sharpened fine-tipped forceps  FST Dumont #5 & Dumont #55

References

  1. Longden, T. A., Hill-Eubanks, D. C., Nelson, M. T. Ion channel networks in the control of cerebral blood flow. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (3), 492-512 (2016).
  2. Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. A critical role for the vascular endothelium in functional neurovascular coupling in the brain. Journal of the American Heart Association. 3 (3), e000787 (2014).
  3. Iadecola, C., Yang, G., Ebner, T. J., Chen, G. Local and propagated vascular responses evoked by focal synaptic activity in cerebellar cortex. Journal of Neurophysiology. 78 (2), 651-659 (1997).
  4. Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: role of conducted vasodilation. Acta Physiologica (Oxford, England). 202 (3), 271-284 (2011).
  5. Garland, C. J., Dora, K. A. EDH: endothelium-dependent hyperpolarization and microvascular signalling. Acta Physiologica (Oxford, England). 219 (1), 152-161 (2017).
  6. Hakim, M. A., Buchholz, J. N., Behringer, E. J. Electrical dynamics of isolated cerebral and skeletal muscle endothelial tubes: Differential roles of G-protein-coupled receptors and K+ channels. Pharmacology Research & Perspectives. 6 (2), e00391 (2018).
  7. Marrelli, S. P., Eckmann, M. S., Hunte, M. S. Role of endothelial intermediate conductance KCa channels in cerebral EDHF-mediated dilations. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (4), H1590-H1599 (2003).
  8. Behringer, E. J. Calcium and electrical signaling in arterial endothelial tubes: New insights into cellular physiology and cardiovascular function. Microcirculation. 24 (3), (2017).
  9. Endemann, D. H., Schiffrin, E. L. Endothelial dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (8), 1983-1992 (2004).
  10. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  11. Socha, M. J., Hakim, C. H., Jackson, W. F., Segal, S. S. Temperature effects on morphological integrity and Ca2+ signaling in freshly isolated murine feed artery endothelial cell tubes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (3), H773-H783 (2011).
  12. Socha, M. J., Segal, S. S. Isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries. Journal of Visualized Experiments. (81), (2013).
  13. Ye, X., Beckett, T., Bagher, P., Garland, C. J., Dora, K. A. VEGF-A inhibits agonist-mediated Ca2+ responses and activation of IKCa channels in mouse resistance artery endothelial cells. The Journal of Physiology. , (2018).
  14. Norton, C. E., Segal, S. S. Calcitonin gene-related peptide hyperpolarizes mouse pulmonary artery endothelial tubes through KATP channel activation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular. , (2018).
  15. Behringer, E. J., Segal, S. S. Membrane potential governs calcium influx into microvascular endothelium: integral role for muscarinic receptor activation. The Journal of Physiology. 593 (20), 4531-4548 (2015).
  16. Behringer, E. J., Segal, S. S. Impact of Aging on Calcium Signaling and Membrane Potential in Endothelium of Resistance Arteries: A Role for Mitochondria. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (12), 1627-1637 (2017).
  17. Behringer, E. J., et al. Calcium and electrical dynamics in lymphatic endothelium. The Journal of Physiology. 595 (24), 7347-7368 (2017).
  18. Simmers, M. B., Pryor, A. W., Blackman, B. R. Arterial shear stress regulates endothelial cell-directed migration, polarity, and morphology in confluent monolayers. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiolog. 293 (3), H1937-H1946 (2007).
  19. Sandow, S. L., Grayson, T. H. Limits of isolation and culture: intact vascular endothelium and BKCa. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (1), H1-H7 (2009).
  20. Diaz-Otero, J. M., Garver, H., Fink, G. D., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Aging is associated with changes to the biomechanical properties of the posterior cerebral artery and parenchymal arterioles. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), H365-H375 (2016).
  21. Kochukov, M. Y., Balasubramanian, A., Abramowitz, J., Birnbaumer, L., Marrelli, S. P. Activation of endothelial transient receptor potential C3 channel is required for small conductance calcium-activated potassium channel activation and sustained endothelial hyperpolarization and vasodilation of cerebral artery. Journal of the American Heart Association. 3 (4), (2014).
  22. Zhang, L., Papadopoulos, P., Hamel, E. Endothelial TRPV4 channels mediate dilation of cerebral arteries: impairment and recovery in cerebrovascular pathologies related to Alzheimer’s disease. British Journal of Pharmacology. 170 (3), 661-670 (2013).
  23. Socha, M. J., Domeier, T. L., Behringer, E. J., Segal, S. S. Coordination of intercellular Ca2+ signaling in endothelial cell tubes of mouse resistance arteries. Microcirculation. 19 (8), 757-770 (2012).

Play Video

Cite This Article
Hakim, M. A., Behringer, E. J. Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium. J. Vis. Exp. (143), e58832, doi:10.3791/58832 (2019).

View Video